專利名稱：干癬或特應(yīng)性皮炎的治療藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及將抗體作為有效成分的干癬或特應(yīng)性皮炎的治療藥物。
背景技術(shù)：
雖然干癬和特應(yīng)性皮炎的發(fā)病原因還不清楚，但變應(yīng)性皮膚疾病在其中占一定地位。對于特應(yīng)性皮炎，已知各種遺傳性、環(huán)境性要因的復(fù)合性且復(fù)雜的相互作用起到發(fā)病的重要作用，但對于準(zhǔn)確的發(fā)病機(jī)理幾乎還不了解(非專利文獻(xiàn)I)。作為有參與發(fā)病或進(jìn)展的可能性的各種要因、誘因，目前為止對很多因素進(jìn)行了研究，這其中也包括對人類皮膚常駐菌中以金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)為始的細(xì)菌的探討。但是，迄今為止，得到的結(jié)論為這些細(xì)菌不是發(fā)病或病情漸趨惡化的要因。對于干癬的發(fā)病機(jī)理未被進(jìn)一步了解，治療也遲遲沒有進(jìn)展(非專利文獻(xiàn)2)。其結(jié)果是，到目前為止，雖然促進(jìn)細(xì)菌的繁殖但對變應(yīng)機(jī)制起作用的腎上腺皮質(zhì)類固醇激素，作為干癬的有效治療藥被頻繁使用。報(bào)告稱,金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)為通性嫌氣性革蘭氏陽性球菌，是存在于人的皮膚、毛孔、鼻腔內(nèi)的常駐菌，從創(chuàng)傷部位等侵入到人體內(nèi)，成為引發(fā)各種化膿性疾患、肺炎、敗血病、腦膜炎等的原因。另外，報(bào)告稱金黃色葡萄球菌的毒素為引發(fā)食物中毒或毒性休克癥綜合癥的原因。許多蛋白質(zhì)在細(xì)菌菌體、病毒等微生物中進(jìn)行表達(dá)。目前，已經(jīng)嘗試從這些蛋白質(zhì)中挑選認(rèn)為有用的特定的抗原蛋白質(zhì)分子，主要制備單克隆抗體，然后將該抗體應(yīng)用到醫(yī)療中等。然而，利用識別在細(xì)菌等的表面上表達(dá)的單個抗原分子的抗體，對于作為目標(biāo)的細(xì)胞本身進(jìn)行特異性識別方面識別存在限制。目前，主要使用抗生素來預(yù)防或治療細(xì)菌、病毒等的感染疾病等。另外，使用弱毒化病毒制備的疫苗給藥，以導(dǎo)致在生物體內(nèi)產(chǎn)生針對病毒的抗體，該抗體用來預(yù)防或治療病毒感染疾病。但是，抗生素存在的問題是需要根據(jù)細(xì)菌選擇適當(dāng)?shù)目股?，并會形成耐性菌。另外，需要考慮菌苗的安全性，菌苗所適用的感染疾病就受到了限制。現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)I :Bieber T, Novak N Pathogenesis of atopic dermatitis newdevelopments. Current Allergy and Asthma Reports 2009,9 291—294非專利文獻(xiàn)2 WippeI-Slupetzky, K. Stingl，G Future perspectives in thetreatment of psoriasis Current Problems in Dermatology. 2009,38 :172-89

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供干癬或特應(yīng)性皮炎的治療藥物，該治療藥物含有抗金黃色葡萄球菌抗體，特別是含有作為有效成分針對在金黃色葡萄球菌的表面上表達(dá)的蛋白質(zhì)整體的綜合性抗體。本發(fā)明人等考慮干癬和特應(yīng)性皮炎的原因可能是由于皮膚常駐菌即金黃色葡萄球菌的皮膚感染以及金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的毒素引起的皮膚搔破部位的糜爛等皮膚癥狀，通過使用蛋白質(zhì)交聯(lián)固定試劑固定的微生物用作抗原的綜合性抗表面抗原抗體制作法(專利申請2008-324257)制備抗金黃色葡萄球菌抗體，對于是否可以使用該抗金黃色葡萄球菌抗體治療干癬和特應(yīng)性皮炎進(jìn)行了銳意的探討。本發(fā)明人等認(rèn)為，金黃色葡萄球菌所產(chǎn)生的毒素是將末梢血中的T細(xì)胞活化的超級抗原，在該識別下，首先設(shè)立了金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的毒素是干癬和特應(yīng)性皮炎的厭惡因子的假說。本發(fā)明人通過將使用甲醛對金黃色葡萄球菌的菌體表面進(jìn)行固定處理后的產(chǎn)物直接作為抗原使用并對動物進(jìn)行免疫，制備了針對固定的抗原蛋白質(zhì)分子整體的綜合性多克隆抗體。而且，在病灶部位持續(xù)涂敷抗金黃色葡萄球菌表面抗體。其結(jié)果發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌從病灶部位徹底被排除，可以用于干癬或特應(yīng)性皮炎的治療，直至完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明如下[I] 一種干癬或特應(yīng)性皮炎的治療藥物，其含有作為有效成分的抗金黃色葡萄球菌抗體。[2]如[I]的干癬或特應(yīng)性皮炎的治療藥物，其中，抗金黃色葡萄球菌抗體為含有針對在金黃色葡萄球菌的表面上表達(dá)的蛋白質(zhì)分子整體的抗體的綜合性抗金黃色葡萄球菌表面抗體，通過以下步驟制備(a)用蛋白質(zhì)交聯(lián)固定試劑處理金黃色葡萄球菌，從而通過分子內(nèi)交聯(lián)固定在所述金黃色葡萄球菌的表面上表達(dá)的蛋白質(zhì)；(b)將使用該蛋白質(zhì)交聯(lián)固定試劑固定的所述金黃色葡萄球菌作為免疫原給予動物；(C)從動物獲取抗體。[3]如[2]的干癬或特應(yīng)性皮炎的治療藥物，其中，蛋白質(zhì)交聯(lián)固定試劑選自包括甲醛、多聚甲醛和戊二醛的組。[4]如[2]的干癬或特應(yīng)性皮炎的治療藥物，其中，蛋白質(zhì)交聯(lián)固定試劑是I 38% (v/v)的福爾馬林。[5]如[2] [4]中任一項(xiàng)的干癬或特應(yīng)性皮炎的治療藥物，其中，使用蛋白質(zhì)交聯(lián)固定試劑的固定化進(jìn)行10分鐘 48小時。[6]如[2] [5]中任一項(xiàng)的干癬或特應(yīng)性皮炎的治療藥物，其中，給予所述免疫原的所述動物是雞。[7]如[6]的干癬或特應(yīng)性皮炎的治療藥物,其中,所述抗體是由已經(jīng)給予所述免疫原的雞所產(chǎn)出的雞蛋中獲取。本說明書包括本申請的優(yōu)先權(quán)的基礎(chǔ)即日本國專利申請2009-260031號說明書及/或附圖所記載的內(nèi)容。


圖I是表示對特應(yīng)性皮炎患者的效果的照片(其I);圖2是表示對特應(yīng)性皮炎患者的效果的照片(其2);圖3是表示對患特應(yīng)性皮炎犬的效果的照片(其I);圖4是表示對患特應(yīng)性皮炎犬的效果的照片(其2);圖5是表示對患特應(yīng)性皮炎犬的效果的照片(其3);
圖6是表示對干癬患者的效果的照片。
具體實(shí)施例方式下面，詳細(xì)說明本發(fā)明。本發(fā)明的干癬或特應(yīng)性皮炎的治療藥物含有作為有效成分的抗金黃色葡萄球菌抗體。該抗金黃色葡萄球菌抗體可以使用金黃色葡萄球菌的全部或部分并用公知的方法制備。本發(fā)明的抗金黃色葡萄球菌抗體可以是多克隆抗體，也可以是單克隆抗體?？菇瘘S色葡萄球菌抗體不只是完全抗體，也含有其功能性片段?？贵w的功能性片段是抗體的一部分(部分片段)，是指保持一個以上對抗體的抗原的作用的片段，具體而言，可以列舉F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、二硫鍵Fv、單鏈Fv (scFv)、及它們的聚合物等[D. J. King. ,Applications andEngineering of Monoclonal Antibodies. ,1998T. J. International Ltd]。另外，使用單克隆抗體時，可以只使用一種單克隆抗體，也可以使用識別的表位不同的兩種以上，例如，兩種、三種、四種或五種單克隆抗體。此外，本發(fā)明的抗金黃色葡萄球 菌抗體也含有以使對人的異種抗原性降低等為目的人為地改變后的遺傳因子轉(zhuǎn)換型抗體，例如，嵌合抗體、人源化(Humanized)抗體。作為這種抗體可以列舉嵌合抗體、人源化抗體、人抗體，其都可以使用任一公知的方法來制造。優(yōu)選以下的綜合性表面抗體即多克隆抗體。綜合性表面抗體是將使用甲醒對金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的菌體表面進(jìn)行固定處理的片段直接用作抗原進(jìn)行制備。通過將使用甲醛對金黃色葡萄球菌的菌體表面進(jìn)行了固定處理的片段直接用作抗原而制備抗體，可以對金黃色葡萄球菌綜合性地制備抗體。此處，所謂對金黃色葡萄球菌綜合性地制備抗體，是指針對在金黃色葡萄球菌的表面上表達(dá)的大量的抗原蛋白質(zhì)分子整體一次制備抗體，將得到的抗體稱為綜合性抗金黃色葡萄球菌表面抗體。綜合性抗金黃色葡萄球菌表面抗體是含有針對在金黃色葡萄球菌的表面上表達(dá)的大量抗原蛋白質(zhì)的各種抗體的多克隆抗體。根據(jù)本發(fā)明的方法，只將固定的金黃色葡萄球菌給予動物，就可以獲得含有針對表面蛋白質(zhì)分子整體的抗體的綜合性抗金黃色葡萄球菌表面抗體。此處，并不要求這種針對表面蛋白質(zhì)分子整體的抗體要包括針對在金黃色葡萄球菌的表面上表達(dá)的所有的蛋白質(zhì)的抗體，但希望包括針對大部分大量存在的表面蛋白質(zhì)的抗體。綜合性抗金黃色葡萄球菌抗體可以用以下方法制備。首先，使用蛋白質(zhì)分子內(nèi)交聯(lián)固定試劑固定金黃色葡萄球菌。作為蛋白質(zhì)分子內(nèi)交聯(lián)固定試劑，可以列舉甲醛、多聚甲醛、戊二醛等醛。優(yōu)選地，使用福爾馬林即35 38%、優(yōu)選37 %的甲醛水溶液進(jìn)行固定。在使用這些蛋白質(zhì)分子內(nèi)交聯(lián)固定試劑作為固定試劑時，試劑滲透到金黃色葡萄球菌細(xì)胞中，分子中的醛基與金黃色葡萄球菌表面的蛋白質(zhì)的氨基(α -氨基或賴氨酸殘基的ε-氨基)或SH基結(jié)合，從而形成分子間交聯(lián)，蛋白質(zhì)進(jìn)行凝固改性。由于交聯(lián)，蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)被破壞，阻礙了酶活性、輸送、分泌等各種的生物活性。蛋白質(zhì)分子內(nèi)交聯(lián)固定試劑的作用是蛋白質(zhì)分子的交聯(lián)反應(yīng)，所以，固定作用對于脂質(zhì)等物質(zhì)不起作用，脂質(zhì)等會流出。在使用福爾馬林即市售的35 38%的甲醛水溶液時，固定化可以使用I 38%(v/v)的福爾馬林、優(yōu)選2 20% (v/v)的福爾馬林、更優(yōu)選5 10% (v/v)的福爾馬林進(jìn)行。所用的福爾馬林可以使用蒸餾水、生理鹽水、緩沖液等進(jìn)行制備。將金黃色葡萄球菌均質(zhì)化，向該均質(zhì)化的顆粒Ig中添加5 20ml福爾馬林。將福爾馬林加入到均質(zhì)化的金黃色葡萄球菌中進(jìn)行固定，并進(jìn)行攪拌，然后在4 30°C下靜置30分鐘 48小時以上。存活的金黃色葡萄球菌因在短時間的福爾馬林處理而失活，但在本發(fā)明的方法中，不僅需要將金黃色葡萄球菌失活，而且福爾馬林的處理還需要達(dá)到使金黃色葡萄球菌的表面上表達(dá)的蛋白質(zhì)分子產(chǎn)生分子內(nèi)交聯(lián)程度。只要將固定的均質(zhì)化金黃色葡萄球菌根據(jù)需要用生理鹽水或緩沖液進(jìn)行稀釋、懸浮并與公知的輔助劑混合，將其作為免疫原給予動物即可。使用的動物可以列舉小鼠、大鼠、海貍鼠、兔、羊、山羊、馬、牛等哺乳動物，雞、鴕鳥等鳥類。其中，優(yōu)選例如雞等鳥類，因?yàn)榭梢缘玫胶蠭gY抗體的雞蛋。 使用免疫原對動物的免疫可以按照公知的方法進(jìn)行。例如，一般的方法是通過將免疫原注射到動物的腹腔內(nèi)或皮下來進(jìn)行。免疫可以只進(jìn)行一次，但理想的是每2 10日進(jìn)行多次給藥。另外，也可以在初次給藥后每5 10日進(jìn)行多次追加免疫。下面列舉金黃色葡萄球菌的免疫原制備方法。下面的方法為一個例子，不限定于這些方法。通過離心分離收集金黃色葡萄球菌，并形成顆粒狀，將該顆粒加入到福爾馬林中，通過攪拌使其分散，靜置30分鐘。然后，使用粗濾紙過濾，除去殘?jiān)?。然后回收濾液進(jìn)行離心分離，然后向顆粒中添加磷酸緩沖液，將其用作免疫原。本發(fā)明的綜合性抗表面抗體組合物可以從進(jìn)行了免疫的動物的血清中獲得。另夕卜，在進(jìn)行免疫的動物是雞的情況下，可以從雞產(chǎn)出的雞蛋中獲得。在最終免疫后，經(jīng)過約三個月獲得含有高抗體效價的抗體的雞蛋。在雞蛋的蛋黃中含有IgY，在蛋清中含有IgA和IgM。從全蛋中回收抗體時，在綜合性抗體組合物中含有IgY、IgA和IgM，從蛋黃中回收時，含有IgY。使用雞蛋制備本發(fā)明的抗體組合物時，可以使用全蛋，也可以只使用蛋黃。將得到的雞蛋打開，將蛋黃及蛋白一起進(jìn)行攪拌，或只攪拌蛋黃，將其粉末化。此時，由于抗體為蛋白質(zhì)，不耐熱，若超過70°C，則失去其活性，因此，優(yōu)選在60°C以下進(jìn)行。優(yōu)選地，干燥通過冷凍干燥、噴霧干燥或溫風(fēng)干燥在60°C以下進(jìn)行，用以進(jìn)行粉末化。對于粉末化后的雞蛋，如果需要，進(jìn)一步使用粉碎機(jī)將其制成細(xì)粒粉末。用該方法獲得的粉末中含有蛋黃的油成分，因此，粉末有濕氣。這種脂肪含量也可以通過使用超低溫臨界法將其完全脫脂來除去。將從雞蛋中獲得的綜合性抗表面抗體組合物稱為雞蛋抗體。獲得的抗體的抗體效價可以使用ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定法)、EIA(酶免疫測定法)、RIA(放射免疫測定法)、熒光抗體法等進(jìn)行測定?？贵w效價只要使用從動物提取的血清測定即可。另外，在使用雞蛋的情況下，只要從雞蛋抽出抗體并測定抽出物中的抗體效價即可。對本發(fā)明的金黃色葡萄球菌的綜合性抗體，能夠用于干癬和特應(yīng)性皮炎的預(yù)防或治療。本發(fā)明的綜合性抗金黃色葡萄球菌抗體包括針對在金黃色葡萄球菌的表面上表達(dá)的蛋白質(zhì)分子整體的抗體，因此，可以增強(qiáng)對金黃色葡萄球菌的攻擊力，使金黃色葡萄球菌滅絕，將其排除、預(yù)防。
含有作為有效成分的綜合性抗金黃色葡萄球菌抗體的干癬、特應(yīng)性皮炎的預(yù)防或治療藥物，例如通過給藥動物來使用。該抗體組合物可以通過口服、鼻吸入以及向靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下和腹腔內(nèi)注射或非腸道途徑來給藥。尤其是，可以通過以軟膏等涂敷劑的方式涂敷到皮膚的患處或使用液劑噴霧到皮膚的患處而進(jìn)行局部給藥。該軟膏作為載體含有脂肪、脂肪油、羊毛脂、凡士林、石臘、血瓊脂基質(zhì)(plastibase)、臘、硬膏劑、樹脂、塑料、乙二醇類、高級乙醇、甘油、水或乳化劑、懸浮劑。本發(fā)明的醫(yī)藥組合物的給藥量根據(jù)癥狀、年齡、體重等而不同，通常為口服給藥情況下，成人一日約O. Olmg lOOOOmg，可以將這些量分一次或多次給藥。干癬、特應(yīng)性皮炎的預(yù)防或治療用抗體組合物，也可以含有通常在制藥領(lǐng)域中使用的載體、稀釋劑、賦形劑。例如，使用乳糖、硬脂酸鎂等作為片劑的載體、賦形劑。本發(fā)明的干癬或特應(yīng)性皮炎的治療藥物能夠適用于患有干癬或特應(yīng)性皮炎的動
物，還能夠適用于人或猴子、犬、貓等玩賞的動物等。通過使用含有本發(fā)明的抗金黃色葡萄球菌抗體的治療藥物，能夠從干癬和特應(yīng)性皮炎的患處排除金黃色葡萄球菌，可以抑制由金黃色葡萄球菌毒素引起的皮膚搔破部位的糜爛等皮膚癥狀的惡化。根據(jù)下面的實(shí)施例具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明不限定于這些實(shí)施例。實(shí)施例I將金黃色葡萄球菌作為抗原制作綜合性抗體(I)抗原的制備培養(yǎng)金黃色葡萄球菌的種菌，制作金黃色葡萄球菌的冷凍顆粒。金黃色葡萄球菌的種菌使用MicroBiologics公司的種菌(從關(guān)東化學(xué)株式會社購入)。在用量15ml的具塞試管中放入約3mg已解凍的金黃色葡萄球菌的顆粒，并向其中加入5%的福爾馬林溶液5ml，用塞密封。用試管攪拌機(jī)進(jìn)行多次攪拌(總計(jì)約10分鐘)使其均等地?cái)U(kuò)散溶解。使顆粒完全溶解于5%福爾馬林溶液中，并固定金黃色葡萄球菌的表面抗原。進(jìn)行孵育，在孵育結(jié)束后靜置30分鐘。將溶解有顆粒的5%福爾馬林溶液置于離心分離器中，用移液管抽吸I. 5ml離心分離后的溶液中含有沉渣的下部溶液。使用粗濾紙或過濾器進(jìn)行自然過濾或抽吸過濾后，進(jìn)行離心分離，廢棄上層清液，降低福爾馬林濃度。使沉淀溶解到生理鹽水中，將其用作給藥抗原。在乳化泵中使上述抗原Iml和白油慢慢混合，制作乳劑，將該乳劑給予動物。(2)免疫將在(I)中制作的乳劑O. 5ml注射到5周齡的雄性雞的腹股溝部皮下。此時，為了減少對雞的侵害，將給藥的抗原組合物加熱至雞的體溫即37°C。初次給藥后每7日使用兩次同量的乳劑進(jìn)行追加免疫。將免疫后的雞產(chǎn)出的雞蛋的全蛋打開進(jìn)行攪拌。使用大和科學(xué)制造噴霧干燥器GA22型、熱風(fēng)干燥器和粉碎機(jī)制造干燥的雞蛋粉末。噴霧干燥器的溫度設(shè)定為60°C以下。用ELISA進(jìn)行抗體效價的測定。
實(shí)施例2人的特應(yīng)性皮炎的治療對于用實(shí)施例I記載的方法制作的雞蛋抗體，測定閾值。將多克隆抗體以重量比I 5%混合到凡士林軟膏中，制造治療用軟膏劑，并將其涂敷到特應(yīng)性皮炎患者的患處。閾值測定的結(jié)果為，在任何濃度下都可以抑制由金黃色葡萄球菌毒素(SA毒素)引起的強(qiáng)烈的瘙癢感以及發(fā)紅。而且，以重量比5%的多克隆抗體混合到凡士林軟膏中，對其繼續(xù)進(jìn)行探討。向10名特應(yīng)性皮炎患者涂敷軟膏。每日涂敷I 2次。兩周左右開始出現(xiàn)效果，2 3個月顯示效果顯著。表I表示效果確認(rèn)試驗(yàn)的結(jié)果。如表I所示，改善以上的病例為90%，顯示非常高的有效率。·[表 I]效果確認(rèn)試驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種干癬或特應(yīng)性皮炎的治療藥物，其中，含有作為有效成分的抗金黃色葡萄球菌抗體。
2.如權(quán)利要求I所述的干癬或特應(yīng)性皮炎的治療藥物，其中，抗金黃色葡萄球菌抗體為含有針對在金黃色葡萄球菌的表面上表達(dá)的蛋白質(zhì)分子整體的抗體的綜合性抗金黃色葡萄球菌表面抗體，通過以下步驟制備(a)用蛋白質(zhì)交聯(lián)固定試劑處理金黃色葡萄球菌，從而通過分子內(nèi)交聯(lián)固定在所述金黃色葡萄球菌的表面上表達(dá)的蛋白質(zhì)；(b)將使用該蛋白質(zhì)交聯(lián)固定試劑固定的所述金黃色葡萄球菌作為免疫原給予動物；(C)從動物獲取抗體。
3.如權(quán)利要求2所述的干癬或特應(yīng)性皮炎的治療藥物，其中，蛋白質(zhì)交聯(lián)固定試劑選自包括甲醛、多聚甲醛和戊二醛的組。
4.如權(quán)利要求2所述的干癬或特應(yīng)性皮炎的治療藥物，其中，蛋白質(zhì)交聯(lián)固定試劑是I 38% (v/v)的福爾馬林。
5.如權(quán)利要求2 4中任一項(xiàng)所述的干癬或特應(yīng)性皮炎的治療藥物，其中，使用蛋白質(zhì)交聯(lián)固定試劑的固定化進(jìn)行10分鐘 48小時。
6.如權(quán)利要求2 5中任一項(xiàng)所述的干癬或特應(yīng)性皮炎的治療藥物，其中，給予所述免疫原的所述動物是雞。
7.如權(quán)利要求6所述的干癬或特應(yīng)性皮炎的治療藥物，其中，所述抗體是由已經(jīng)給予免疫原的雞所產(chǎn)出的雞蛋中獲取。
全文摘要
本發(fā)明提供含有作為有效成分的抗金黃色葡萄球菌抗體的干癬或特應(yīng)性皮炎的治療藥物。該干癬或特應(yīng)性皮炎的治療藥物含有作為有效成分的包括針對在金黃色葡萄球菌的表面上表達(dá)的蛋白質(zhì)分子整體的抗體的綜合性抗金黃色葡萄球菌表面抗體，該綜合性抗金黃色葡萄球菌表面抗體通過以下步驟制備(a)用蛋白質(zhì)交聯(lián)固定試劑處理金黃色葡萄球菌，從而通過分子內(nèi)交聯(lián)固定在所述金黃色葡萄球菌的表面上表達(dá)的蛋白質(zhì)；(b)將使用該蛋白質(zhì)交聯(lián)固定試劑固定的所述金黃色葡萄球菌作為免疫原給予動物；(c)從動物獲取抗體。
文檔編號A61P37/08GK102724999SQ20108006043
公開日2012年10月10日 申請日期2010年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月13日
發(fā)明者七里真義 申請人:株式會社幸福醫(yī)科