專利名稱：為再生而制備的無細胞有機組織及其生產方法
為再生而制備的無細胞有機組織及其生產方法 說明書
_2] 發(fā)明的
背景技術：
本發(fā)明涉及用于制備用于再生(revitalization)(尤其是用于引入活細胞)的人 或動物來源的無細胞有機組織(acellular organic tissue)的方法,其包括為無細胞有機 組織的表面提供多個孔的階段，所述多個孔朝向所述組織內部延伸，其中所述多個孔由一 個或更多個針產生。本發(fā)明還涉及所制備的用于再生(尤其是用于引入活細胞)的人或動物來源的無 細胞有機組織，其包含孔，所述孔是用電針產生的刺孔(puncture)，并且從所述組織的表面 朝向其內部延伸。
現有技術醫(yī)學界中(且更具體地說，在外科領域中)公知，能夠使用可植入活體的組織是日 益重要的，以滿足更換器官的一部分或完整器官的不斷增長的需要。在實驗室中制備并且隨后植入宿主(無論是動物或是人)中的生物代用品的生產 屬于醫(yī)療技術，并且被稱為組織工程。根據已知的技術，在實驗室中通過將細胞插入到由無機支持物(通常稱為“支架 (scaffold) ”)組成的基質中來進行要移植之組織的制備。被插入以替代要被治療器官中缺損的所述“支架”有利于細胞的三維組織 (organization),直至組織(tissue)完全形成。顯然，所述支架必須發(fā)生降解過程，直至完全消失，并且被再生的組織所替代，所 述支架中植入的細胞有助于該過程?？捎萌斯ぶЪ芎涂稍醋匀撕蛣游锏奶烊恢Ъ?來自“供體”)來獲得用該系統(tǒng)所獲 得的植入物，例如食管壁。很多出版物論述人工組織，且其中以下出版物可值得一提Tiaw K. S. et al. in " Laser surface modification of poly (epsilon-caprolactone) (PCL) membrane for tissue engineering applications" (Biomaterials 26 (2005)763-769)； Tejas S. Karande et al. in " Diffusion in Musculoskeletal Tissue Engineering Scaffolds Design Issues Related to Porosity, Permeability, Architecture, and Nutrient Mixing " (Annals of Biomedical Engineering, Vol. 32, no.12, December 2004, p. 1728-1743) ；Tejas S. Karande and C. Mauli Agrawal in " Functions and Requirements of Synthetic Scaffolds in Tissue Engineering" (" Nanotechnology and Tissue Engineering The Scaffolds " , 2008CRC Press, Taylor&Francis Group, 6000Broken Sound Parkway NW, Suite 300，BOCA RATON, FL 33487-2742USA，p. 53-86)； Curtis D. Chin et al. in" A microfabricated porous collagen-based scaffold as prototype for skin substitutes" (Biomed Microdevices(2008)10 :459_467)。所描述的合成組織具有人工產生的結構多孔性，可以以預先確定的方式配置以在組織內部獲得足夠的遷移。僅最近的出版物提及這樣的陳述圓柱形孔(在多孔組織中連續(xù)制成)有助于充 分地改善細胞穿透。人或動物來源的支架已經具有有機組織的天然多孔性，其具有類似海綿之孔的均 勻外觀。為了能夠使用源自供體的支架并隨后將其植入人，必需事先以這樣的方式處理組 織，以完全清除結締組織纖維之間所存在的所有細胞，并連續(xù)地重新引入屬于宿主的人細 胞，以避免排斥反應。用于制造支架(即始于從供體中取組織的無細胞基質)的技術是已知的并因此將 不在本文中詳盡地描述，因其基本在于將要處理的組織浸入含有酶物質的液體中，所述酶 物質能夠消化和破壞組織中所包含的活細胞，而同時保持結締組織纖維完整。一旦已獲得準備好接受取自宿主之細胞的人或動物來源的無細胞組織，將所述組 織或支架置于所謂的“培養(yǎng)皿(Petri capsule)”(每個生物實驗室中使用的小容器，將要 再生的組織被放置在其底部)中或放置在類似的裝置中。通過引入培養(yǎng)在培養(yǎng)基中的宿主干細胞而進行再生，所述培養(yǎng)基使細胞獲得營 養(yǎng)、存活、增殖和擴散。實質上，開始時位于組織上表面的干細胞移動通過所述組織上表面的天然間隙， 所述間隙之前被供體的細胞所占據。給定的時間間隔之后，在受控的溫度下以及在培養(yǎng)基中所含有的營養(yǎng)物質存在 下，活細胞在組織的間隙中重新定位，這使得所述組織準備好被植入宿主的器官中?？勺⒁獾降氖牵话銇碚f，用于再生支架的細胞是干細胞，其將會或者已經分化， 并且將承擔將要植入再生組織之器官的特定功能。植入經所述處理之組織的成敗取決于所 述組織內部細胞的毛細擴散。如果所述擴散難以發(fā)生或者淺表而不深入，所移植的組織不能被再生并傾向于壞 死，這意味著移植將會失敗。上文中清楚地顯示要滿足的幾乎不能放棄的關鍵和重要條件是組織在其所有部 分中尤其是在其全部深度上深入再生。目前，即便制備和再生處理發(fā)生足夠長的時間，也不能獲得確保成功移植的某些結果。這是由于必須在支架中植入之活細胞的穿透不充分深入。實際上，該缺陷大幅限 制制備適于移植之組織的可能性，因為不能被深入穿透的非常厚的組織在移植之后無法完 全再生。因此，顯而易見的是，上文中所描述的技術僅適于移植厚度非常有限(例如，不超 過約0. Imm)的組織。為了克服該缺陷，以本申請人的名義提交的文件WO 2008/146106A2描述了 這樣的方法，根據該方法，為無細胞有機組織提供孔，以有利于細胞擴散通過全部組 織。專利US 5，112，354描述骨部分的穿孔(perforation),其意在提高暴露于脫礦質劑 (demineralizing agent)的表面，并且有利于與為了骨誘導而引入的間充質細胞相互作用。根據所述文件，盡管與傳統(tǒng)技術相比有大幅的改進，制備以引入細胞為目的的簡單組織穿孔仍然花費相對長的時間以達到細胞的均勻穿透，尤其是在非常厚和延伸的組織 的情況中。因此，從細胞在組織內部遷移的角度來看，人或動物來源組織的天然多孔性連同 按照文件WO 2008/146106A2中的描述所制成的孔還不是最佳的。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供人或動物來源的無細胞有機組織及其生產方法，所述無細胞 有機組織很容易被活細胞所定植，并且能夠克服上述缺陷。更具體地說，本發(fā)明的目的是提供無細胞有機組織，這樣當用干細胞再生所述組 織時，與現有技術相比，所述細胞更易于進入和穿透結締組織纖維所形成的網中的每一個 間隙，以基本重現失活之前組織的狀況。本發(fā)明的另一個目的是當引入意在制備用于移植之組織的活細胞時，在再生無細 胞支架所必須的處理時間上獲得更明顯和大幅的降低。因此，本發(fā)明的一個目的是開發(fā)用于產生無細胞有機組織的方法，所述無細胞有 機組織是以改進的形式制備的，用于均勻和快速地引入再生的細胞。本發(fā)明的一些目的是通過開篇時所描述類型的方法實現的，其中從組織的外部表 面朝向所述組織內部延伸的孔至少部分相交，因此形成至少部分彼此相連通的孔。換句話說，可用本發(fā)明方法獲得的組織具有多個孔，并且單個孔沿其延伸與一個 或更多個其他孔相連通，因此形成網狀結構。相連通之孔構成的網大幅升高填充再生細胞 的速度。此外，所述網狀結構有利于細胞的均勻擴散。在最簡單的情況下，所述相連通的孔是基本直的，用針通過所述組織的外部表面 產生，以使所述孔相交。還可考慮使用彎針。現有技術中提及的文件均未公開增強屬于組織結構多孔性之孔的互連孔。相反， 論述人工組織的文獻考慮結構孔隙率(并且僅在一種情況(Curtis D. Chin的文章)中，進 一步應用彼此分開的圓柱形孔)要在可獲得的細胞穿透程度上得以滿足。以這樣的方式產生根據本發(fā)明提供的孔其深度至少部分地延伸進入所述組織的 厚度，但優(yōu)選延伸進入所述組織的幾乎整個厚度，在一些具體的情況中，延伸進入所述組織 的整個厚度。優(yōu)選在與穿孔的表面相反的一側保留薄的非穿孔層，以阻止所引入的細胞流出。有利地，所述孔沿其所有側均勻地延伸通過整個組織?？捎冕樅投喾N方法通過要處理之組織的厚度來產生所述孔，前提是所述孔的實施 不引起所述孔附近之結締組織的任何變質或改變(撕裂、壞死、厚度降低或升高、液體含量 的改變、凝固)，并且在任何情況下不引起支架整體的變質或改變。根據本發(fā)明的一個尤其有利的實施方案，所述組織還具有與所述孔的至少一部分 相連通的儲藏腔(reservoir cavity)。所述儲藏腔可被認為是凹槽(recess),即作為要被 引入所述組織之細胞的儲備庫，與體內的細胞儲備庫(例如，腸的上皮細胞儲備)相當。如果要被引入所述組織的細胞不再簡單地施加在組織的表面，而是還引入在所述 組織中產生的與所提供孔的至少一部分相連通的儲藏腔中，則可進一步改善細胞分布的均 勻性并且進一步加速所述細胞穿透整個組織。
對于施加至組織(并且引入所述儲藏腔)的細胞，生成與所述孔至少一部分相連 通的儲藏腔升高了孔的網之進入點的數目。有利地，所述儲藏腔在組織的表面上以使所述組織更易于被細胞所填充，即確保 所述細胞易于進入。所述儲藏腔優(yōu)選均勻地分布。在任何情況下，所產生之孔的直徑必須足以使細胞易于進入所述孔并使周圍的組 織再生。對于細胞的大小，其直徑應當至少為50iim。還必須根據維持所述組織之結構完整性的需要而進行直徑的選擇，同時確保快速 穿透和完全填充所述孔?？稍诋a生所述孔之前或之后制備所述儲藏腔。優(yōu)選在生成所述儲藏室腔之后施加通道以確保組織的穩(wěn)定性。所述儲藏腔是基本圓柱形的，直徑高至約1mm。具有700 ii m至1mm直徑的儲藏腔 尤其適合該目的?？勺鳛橛镁哂泻线m直徑的相應的針所產生的孔而很容易地生成所述基本 圓柱形的儲藏腔。很明顯，所述儲藏腔的直徑必須不削弱所述組織的結構。所述儲藏腔的 直徑應當大于連通它們的通道的直徑，這樣所述儲藏腔可充當細胞儲庫，并且所述通道不 進一步轉化為其他儲藏腔(這削弱組織本身的結構)。儲藏腔的深度取決于組織的特征，并 且本領域技術人員可根據需要很容易地對其進行優(yōu)化。這同樣適用于通道與儲藏腔之間的距離。甚至可考慮單個儲藏腔之間約200 的距離，以及更長或更短的距離。必須根據在穿透速度和組織穩(wěn)定性上的需要來選擇理想的距離。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方案中，所述孔具有彼此不同的直徑。這同樣適用 于所述儲藏腔，其甚至可在所述組織內部具有不同的直徑。必須通過在升高穿透速度(這 當然隨直徑的升高而升高)和避免由于過多穿孔而削弱組織結構之需要之間的折中來確 定直徑分布的選擇。改變組織內部孔直徑的可能性提供了調節(jié)加速的穿透與組織穩(wěn)定性之 間平衡的更高靈活性。為了有效地避免孔和/或儲藏腔之形成過程中的壞死問題，所述多個孔和/或儲 藏腔優(yōu)選地用與電源相連的一個或更多個金屬針產生，所述電源引起每個針的尖端通過這 樣強度和波形的電流以供應一定量的能量，所述能量足以打開臨近所述針的所述尖端的連 接所述有機組織的分子的鍵，例如已在所提及的文件WO 2008/146106A2中描述的那樣。通過這種方式，每個孔是所述針的尖端進入打開所述分子的鍵而留下的空間并產 生所述孔。應當理解的是，還可以以其他方式產生所述孔和/或所述儲藏腔，例如機械地產 生。對于組織中所制成的孔/儲藏腔的品質來說，通過向每個針的尖端應用高頻電壓 (通常為4MHz)產生弱的但卻足以打開結締組織之分子之間的鍵的電流流通而獲得最佳結 果，以使孔不破壞所述分子本身。優(yōu)選使用帶電(上文中所指定的具有4MHz波頻率的電 壓)的針產生所述孔和/或儲藏腔。所述電壓優(yōu)選為200 230伏。有利地，所應用的正 弦電壓波是失真正弦波，因此具有至少一次、二次和三次諧波。優(yōu)選地調節(jié)每個針的尖端上可獲得的電流以使其包括在2至2. 5mA之間。
符合邏輯并且顯而易見的是，產生多個相交的孔意味著產生所移植細胞進入組織 深部的新通道，這確保所述組織本身的完全再生。用于再生的無細胞有機組織的制備可包括引入多種材料(例如，清洗溶液、營養(yǎng) 溶液、不同類型的細胞(例如，來自不同供體或不同類型的自體細胞，要分化或已分化的細 胞)等)的步驟。有利地，在吸入系統(tǒng)(suction system)的輔助下將這些材料引入所述孔 中，所述吸入系統(tǒng)包含適于協助所述材料進入所述孔的驅動裝置(drive mechanism)。所述吸入系統(tǒng)可由蠕動泵組成。根據本發(fā)明所制備的用于再生的組織如同可沿所 述孔滲透液體和細胞的海綿。在組織具有通孔并且因此在穿孔表面的對側不具有非穿孔之 層的情況中，在生物可降解的膜上安排所述組織，所述膜具有液體可穿透但細胞不可穿透 的微孔，因此阻止細胞在吸入階段流出。有利地，使用根據控制系統(tǒng)移動和傾斜的針或針陣列產生所述孔，所述控制系統(tǒng) 由確保以預先確定的密度形成孔相交的算法所操控，即形成確定數目的孔之間彼此相交的 點。上文中描述的方法可用于所有類型的有機組織?？捎眠m于將來使用組織的所有類 型的細胞來再生具有相連通之孔的無細胞組織。本發(fā)明的組織幾乎不限制要移植之組織的厚度，因為可使相連通的孔存在于所述 組織的整個厚度和整個表面，這確保完全再生。這是由于這樣的事實要重新引入到無細胞 支架(優(yōu)選進入存儲腔)中的活細胞可達到所述組織的每個部分。本發(fā)明還包括為再生(尤其是用于引入活細胞)而制備的人或動物來源的無細胞 有機組織，其包含用針產生的并且從所述組織的表面朝向其內部延伸的穿孔，其中所述孔 至少部分地相交并且因而至少部分地彼此連通。根據上述方法的一些變化形式，所述組織還可包含儲藏腔。根據本發(fā)明制備的所 述組織中的孔和/或儲藏腔具有上文中描述的特征以及尤其是直徑、深度和距離。本發(fā)明的結構變化形式是所附權利要求書的主題。在作為非限制性實例而提供的 本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的描述中，將會更詳細地強調本發(fā)明的另一些特征和細節(jié)。附圖簡述現在參照附圖舉例說明本發(fā)明，其中-

圖1顯示為再生而制備的具有相連通之孔的無細胞有機組織的截面示意圖；-圖2顯示為再生而制備的具有儲藏腔和孔的無細胞有機組織的頂視圖；-圖3顯示圖2的組織沿圖2的III-III線的截面。
具體實施例方式如圖1所示，以2標注整個無細胞有機組織，其具有在交叉點6相交并且因而彼此 相連通的多個孔4。在所示的實例中，所有的孔4相對于組織2的表面8都是傾斜的。然而，可以考慮 部分的孔與組織2的表面8垂直。顯而易見的是，必須在支架2的整個表面8上重復穿透/穿孔，以在要植入的組織 2的整個厚度中和在整個可用的表面上獲得均勻分布的孔4。圖2顯示本發(fā)明的另一個實施方案的頂視圖，其中無細胞有機組織12不僅具有孔14(為了清楚起見，僅在圖2的截面中(即，在圖3中)顯示所述孔)，而且還具有儲藏腔 20。可觀察到大孔形式的多個儲藏腔20，其在組織12的表面18上具有圓形截面。最后，圖3顯示，在沿圖2的III-III線的截面中孔14如何彼此相連通并與儲藏 腔20相連通。按照上文中的解釋，一旦已在無細胞組織2、12中制成一系列的孔4、14(并且，如 果必要的話，一系列的儲藏腔20)，很明顯的是，所述沒有細胞的組織可排列在培養(yǎng)皿或類 似的裝置中，此時在其中引入未來宿主的活細胞(通常為干細胞類型)。在培養(yǎng)基中合適地培養(yǎng)所述干細胞，并且使其很容易地且快速地進入所提供的所 有孔4、14中，從而確保要移植的完整組織的完全和有效的再生。典型的過程組織如下稱為支架的沒有細胞并因而預先處理的有機組織2、12優(yōu) 選地置于平面的表面上并在其上伸展。將針通電流以為要處理之組織的分子供應一定量 的能量，其恰好足以破壞參與電流通過之分子之間的鍵，而周圍的域不受任何撕裂或破壞 作用、壞死、厚度降低或升高或者液體含量的改變、凝固或其他變質作用(degenerative effect)的影響。實質上，分子的鍵的這種打開等同于產生實際上具有與每個針的直徑相同的微孔 4、14，在任何情況下，考慮所述針的最小直徑不能低于再生細胞的直徑。如此足夠緩慢地引入所述針，以使在其前進過程中，其尖端遵循已由電流通過并 且由隨后的分子的鍵破壞而制備的孔。通過選擇具有合適直徑的針，可以以相同的方式產生存儲器20，優(yōu)選但不嚴格必 需在產生所述孔之前產生所述儲藏腔?？字W絡的形成是尤其重要和有用的，因為將被重新引入的細胞可深入地穿透所 述組織，并在孔的壁中扎根，增殖并因而非?？焖俚卦偕械挠袡C組織?？梢岳斫獾氖牵景l(fā)明的方法和組織實現本發(fā)明的所有目的，獲得完美且有效的 再生，因而消除必須進行之移植的任何失敗風險。此外，該再生過程甚至比已知技術發(fā)生的 更快并且具有更均勻的細胞擴散。實施時，可進行本文中未描述的本發(fā)明方法和組織的另一些改變或構建變化形 式。必須考慮通過本發(fā)明保護所有所述改變或構建變化形式，只要它們落入以下表述 的權利要求的范圍之內即可。當任何權利要求中提及的技術特征跟隨附圖標記時，包括這些附圖標記的唯一目 的是提高權利要求的可理解性，因此這樣的附圖標記對所述附圖標記以舉例的方式確定的 每個元件的保護沒有任何限制性作用。
權利要求
1.制備用于再生的尤其是用于引入活細胞的人或動物來源的無細胞有機組織的方法， 其包括為所述無細胞有機組織(2 ;12)提供多個孔(4 ；14)的步驟，所述多個孔(4 ；14)通 過所述組織的表面(8 ；18)產生并朝向所述組織(2 ;12)內部延伸，其中所述多個孔(4 ；14) 由一個或更多個針產生，其特征在于所述孔(4;14)至少部分地相交，從而形成至少部分地 彼此連通的孔(4;14)。
2.根據權利要求1的方法，其特征在于其還包括這樣的步驟，其中在所述組織(12)中 產生與所述孔(14)的至少一部分相連通的儲藏腔(20)。
3.根據權利要求1或2的方法，其特征在于所述孔和/或儲藏腔由與電源相連接的一 個或更多個金屬針產生，所述電源使得每個針的尖端通過電流，其強度和波形使得所提供 能量的量足以在所述針的尖端附近打開連接所述有機組織的分子的鍵。
4.根據權利要求3的方法，其特征在于所述電流由具有4MHz波頻率的電壓確定，其中 所應用的正弦電壓波是失真正弦波，并因此具有至少一次、二次和三次諧波。
5.根據前述權利要求中任一項的方法，其特征在于所述孔(4;14)具有至少50i!m的 直徑。
6.根據權利要求2至5中任一項的方法，其特征在于所述儲藏腔(20)是基本圓柱形 的，并且具有高至1mm的直徑。
7.根據前述權利要求中任一項的方法，其特征在于所述孔(4;14)具有不同的直徑。
8.根據權利要求2至7中任一項的方法，其特征在于所述儲藏腔(20)具有不同的直徑。
9.根據前述權利要求中任一項的方法，其特征在于其包括這樣的步驟，其中在吸入系 統(tǒng)的輔助下將多種物質引入所述孔(4;14)中，其中所述物質優(yōu)選地選自清洗溶液、營養(yǎng)溶 液和/或活細胞。
10.為再生尤其是為引入活細胞而制備的人或動物來源的無細胞有機組織(2;12)，所 述組織包含孔(4 ;14)，所述孔是由針產生的并且從所述組織的表面(8 ；18)朝向其內部延 伸的刺孔，其特征在于所述孔(4;14)至少部分地相交，并因此是至少部分地彼此連通的孔 (4 ;14)。
11.根據權利要求10的無細胞有機組織，其特征在于其還包含與所述孔(4；14)的至 少一部分相連通的儲藏腔(20)。
12.根據前述權利要求中任一項的無細胞有機組織，其特征在于所述孔(4；14)具有至 少50 y m的直徑。
13.根據權利要求11或12中任一項的無細胞有機組織，其特征在于所述儲藏腔(20) 是基本圓柱形的并且具有高至1_的直徑。
14.根據權利要求10至13中任一項的無細胞有機組織，其特征在于所述孔(4；14)具 有不同的直徑。
15.根據權利要求11至14中任一項的無細胞有機組織，其特征在于所述儲藏腔(20) 具有不同的直徑。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于制備用于再生(尤其是用于引入活細胞)的人或動物來源的無細胞有機組織的方法，其包括為無細胞有機組織(2；12)提供多個孔(4；14)的階段，所述多個孔(4；14)通過其表面(8；18)產生并朝向所述組織(2；12)內部延伸，其中所述多個孔(4；14)由一個或更多個針產生。所述孔(4；14)部分相交，從而形成彼此部分連通的孔(4；14)。本發(fā)明還涉及所制備的用于再生(尤其是用于引入活細胞)的人或動物來源的相應的無細胞有機組織(2；12)，其包含孔(4；14)，所述孔是用針產生的刺孔，并且從所述組織的表面(8；18)朝向其內部延伸。所述孔(4；14)至少部分相交并且因此是彼此部分連通的孔(4；14)。
文檔編號A61L27/36GK102665777SQ201080054047
公開日2012年9月12日 申請日期2010年10月29日 優(yōu)先權日2009年10月29日
發(fā)明者毛里齊奧·馬爾扎羅 申請人:特利亞生物技術有限公司