專利名稱：使用經(jīng)寡核苷酸修飾的納米顆粒作為載體來遞送治療劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含經(jīng)寡核苷酸修飾的納米顆粒和治療劑的治療劑遞送組合物。
背景技術(shù)：
治療劑在水溶液中的溶解度對于將其吸收和轉(zhuǎn)運至其作用位點十分重要，并且是其作為治療劑的有效性和對其劑型進(jìn)行設(shè)計時的主要因素。疏水治療劑的溶解傳統(tǒng)上是通過可與所述治療劑一起產(chǎn)生膠體溶液的助溶劑、乳狀液和表面活性劑來實現(xiàn)。但是，各種方法均有相關(guān)的缺點。例如，助溶劑的濃度必須在與其應(yīng)用相關(guān)毒性的可接受程度內(nèi)進(jìn)行使用，并且這些助溶劑一般限于醇類溶液。疏水治療劑可以納米尺度的溶膠形式分散于水溶液中。但是，這些分散液一般在溶解狀態(tài)下的有效期十分有限。治療劑可以分散于乳狀液中，但此形式的遞送尚未廣泛使用。最后，表面活性劑微團(tuán)被用于治療劑的臨床遞送，但是它們具有很多不足之處。例如，遞送取決于從所述微團(tuán)中釋放治療劑。另外，表面活性劑微團(tuán)可刺激粘膜并且某些微團(tuán)可具有溶血作用。
發(fā)明概要本文描述了一種包含寡核苷酸和治療劑的納米顆粒組合物，所述組合物可用于所述治療劑的細(xì)胞內(nèi)遞送。在一個實施方案中，提供了一種包含經(jīng)寡核苷酸修飾的納米顆粒和治療劑的藥物遞送組合物，與所述治療劑連接于所述經(jīng)寡核苷酸修飾的納米顆粒的情況下相比，在所述治療劑不連接于所述經(jīng)寡核苷酸修飾的納米顆粒的情況下所述治療劑的可遞送水平明顯更低，并且在所述經(jīng)寡核苷酸修飾的納米顆粒中的寡核苷酸與連接于該納米顆粒之上的治療劑的比率足以將所述治療劑轉(zhuǎn)運至細(xì)胞中。在多個不同方面，所述治療劑為低分子量治療劑。在一些實施方案中，所述治療劑是疏水性的。在一些方面，所述的治療劑是親水性的。在一些方面，提供了進(jìn)一步包含可檢測標(biāo)記物的組合物。在相關(guān)方面，所述可檢測標(biāo)記物是熒光團(tuán)。在本申請所涵蓋的進(jìn)一步實施方案中，所述寡核苷酸和所述治療劑被各自獨立地直接連接于所述納米顆粒。在多個不同的實施方案中，所述治療劑被連接于所述寡核苷酸，所述寡核苷酸被連接于所述納米顆粒。在相關(guān)方面，所述治療劑被共價地連接于所述寡核苷酸，所述寡核苷酸被連接于所述納米顆粒。在其它方面，所述治療劑被非共價地連接于所述寡核苷酸，所述寡核苷酸被連接于所述納米顆粒。本發(fā)明涵蓋的實施方案還包括所述納米顆粒表面的寡核苷酸與治療劑的比率為至少約I個寡核苷酸分子2個治療劑分子的實施方案。本發(fā)明所提供的組合物還包括進(jìn)ー步包含另外的治療劑的組合物。在ー些方面，所述另外的治療劑被連接于所述經(jīng)寡核苷酸修飾的納米顆粒。在其它方面，所述另外的治療劑被連接于另外的經(jīng)寡核苷酸修飾的納米顆粒。在進(jìn)ー步方面，所述另外的治療劑未被連接于所述經(jīng)寡核苷酸修飾的納米顆粒并且其自由地穿越細(xì)胞膜。
還提供了治療疾病的方法，所述方法包括對哺乳動物施用治療有效量的本發(fā)明組合物的步驟。在一些實施方案中，提供了包含本發(fā)明的組合物的試劑盒。附圖
簡述圖I所示為PEG-Cy5_DNA納米偶聯(lián)物(左)和PEG_Cy5偶聯(lián)物(右)的細(xì)胞攝取。圖2 所示為(A)PTX-DNA-金納米顆粒(AuNP)、DNA-AuNP 和紫杉醇(paclitaxel)在PBS緩沖液中(η = 3)的水合粒徑。這些顆?；蚧衔镆?5ηΜ的紫杉醇當(dāng)量濃度懸浮于PBS緩沖液中以用于動態(tài)光散射(DLS)測量；(B)PTX-DNAOAuNPS的TEM圖像。標(biāo)尺條為20nmo圖3所示為PTX-DNA-AuNP (黒色三角)、紫杉醇(紅色方框)和化合物I (藍(lán)色環(huán)形)在與紫杉醇等價劑量下的細(xì)胞毒性概況，MCF7、SK0V-3和MES-SA/Dx5細(xì)胞分別顯示于上、中和下區(qū)(η = 6) ο圖4所示為DNA-AuNP在MCF7 (左)和MES_SA/Dx5 (右)細(xì)胞中孵育48小時后對其進(jìn)行的 MTT 分析(η = 6)，該 DNA-AuNP 包含 O. 064,0. 32、I. 6、8、40、200、IOOOnM 的寡核苷酸當(dāng)量濃度。發(fā)明詳述經(jīng)寡核苷酸功能化的納米顆粒(ON-NP)是由經(jīng)寡核苷酸殼進(jìn)行功能化的納米顆粒(NP)核組成的ー類獨特的偶聯(lián)物。它們很易于穿越細(xì)胞膜而無需另外的毒性轉(zhuǎn)染試劑。重要的是，這些結(jié)構(gòu)并不僅僅作為核酸遞送的媒介物發(fā)揮作用，而且還表現(xiàn)出由于它們的多價表面而產(chǎn)生的協(xié)作特性。本發(fā)明提供了用于治療劑的改良遞送的基于納米顆粒的載體。所述治療劑涵蓋了與不連接經(jīng)寡核苷酸功能化的納米顆粒時相比較，在連接于經(jīng)寡核苷酸功能化的納米顆粒時能夠更為有效地穿越細(xì)胞膜的治療劑。本領(lǐng)域先前已經(jīng)被公開的使用寡核苷酸和治療劑進(jìn)行功能化的納米顆粒被明確地排除于本發(fā)明的范圍之外。ON-NP的一個令人驚奇的特性是其進(jìn)入廣泛多種細(xì)胞類型的能力。在迄今為止被檢測的所有細(xì)胞類型(下文表I)中已經(jīng)表明ON-NP可以被直接加入細(xì)胞培養(yǎng)基井隨后被細(xì)胞以較高數(shù)量進(jìn)行攝取。使用電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)對攝取進(jìn)行的定量表明，盡管內(nèi)化顆粒的數(shù)量隨著細(xì)胞類型、濃度和孵育時間而變化，ON-NP的細(xì)胞內(nèi)化是這些材料的一個基本特性。在寡核苷酸表面負(fù)載超過約ISpmol cm—2的情況下，細(xì)胞攝取可超過每細(xì)胞一百萬個0N-NP。當(dāng)將ON-NP同其它類型的NP進(jìn)行比較的時候寡核苷酸的多價排列對于細(xì)胞攝取的重要性更加突出。例如，HeLa細(xì)胞僅僅對數(shù)千個檸檬酸鹽覆蓋的金顆粒進(jìn)行內(nèi)化，與之相比在近似同等的條件下對超過一百萬的ON-NP進(jìn)行了內(nèi)化。在藥物遞送應(yīng)用的情況下，ON-NP的高攝取特性和高細(xì)胞內(nèi)濃度非常有用。ON-NP的超常攝取使其適合于在細(xì)胞內(nèi)濃縮治療劑的方法，而在所述治療劑未與ON-NP相連接時，這些細(xì)胞攝取所述治療劑的水平較低。盡管ON-NP的攝取極高，它們在迄今所測試的細(xì)胞類型中未表現(xiàn)出毒性(參見下文表I)。這一特性由于降低了脫靶效應(yīng)而對于治療劑遞送的應(yīng)用十分重要。
細(xì)胞類型命名或來源
乳腺SKBR3、MDA-MB-321、AU-565
腦U87、LN229
膀胱HT-1376、5637、T24
結(jié)腸LS513
子宮頸HeLa、SiHa
皮膚C166、KB、MCF、IOA
腎臟MDCK
血液Sup Tl、Jurkat
白血病K562
肝臟HepG2腎臟293T
卵巢CHO
巨噬細(xì)胞RAW 264.7
海馬神經(jīng)元原代大鼠
星形細(xì)胞原代大鼠
膠質(zhì)細(xì)胞原代大鼠
膀胱原代人類
紅細(xì)胞原代小鼠
外周血單核細(xì)胞原代小鼠
T細(xì)胞原代人類
P胰島原代小鼠
皮肢原代小鼠
表I所述NP的表面可作為用于連接例如但不限于，寡核苷酸、蛋白、肽、抗體、抗體片段和小分子的骨架。當(dāng)在細(xì)胞培養(yǎng)物中進(jìn)行測試的時候，所產(chǎn)生的偶聯(lián)物被內(nèi)化并且定位于核周區(qū)域，而非在使用ON-NP情況下的細(xì)胞質(zhì)中。由于其定位，這些顆粒具有增強(qiáng)的基因沉默能力(目標(biāo)蛋白表達(dá)降低>75%)。這ー開發(fā)對藥物遞送的應(yīng)用是有幫助的，因為NP可經(jīng)多種部分修飾以改變所產(chǎn)生的偶聯(lián)物的特性。例如但不限于，通過使用N-羥基丁ニ酰亞胺(NHS)酯對NP表面的寡核苷酸進(jìn)行末端化處理可將抗體和其它蛋白共價固定于所述微粒。這些生物分子通?？捎糜谠隗w外和體內(nèi)靶向輸送納米顆粒，并且是基于NP的藥物遞送系統(tǒng)中的有用元件本文中應(yīng)注意，除非上下文另有明確指示，否則在本說明書和附加權(quán)利要求中使用的単數(shù)形式“一”和“所述”包括了復(fù)數(shù)個指示物。應(yīng)進(jìn)一歩注意，術(shù)語“連接”和“偶聯(lián)”和“功能化”也可以在本文中互換使用并意指寡核苷酸和治療劑與納米顆粒的締合。還應(yīng)當(dāng)注意，本文所使用的術(shù)語“約”應(yīng)理解為意指近似?！半s交”意指兩個或三個核酸鏈之間根據(jù)沃森-克里克DNA互補(bǔ)性、Hoogstein結(jié)合或本領(lǐng)域已知的其它序列特異性結(jié)合規(guī)則通過氫鍵而進(jìn)行的相互作用。雜交可在本領(lǐng)域已知的不同嚴(yán)苛度條件下進(jìn)行。治療劑本文使用的“治療剤”、“藥物”和“活性剤”意指任何用于治療或診斷用途的化合物。本文所使用的這些術(shù)語應(yīng)理解為意指被施用于患者以進(jìn)行病狀治療的任何化合物，與其在缺少本發(fā)明的納米顆粒進(jìn)行施用時相比，所述化合物在連接于本發(fā)明的納米顆粒時可更有效地穿越細(xì)胞膜。作為本發(fā)明的一部分而被涵蓋的治療劑明確地不包括本文所定義的寡核苷酸。此外，盡管應(yīng)理解本文所公開的寡核苷酸可能具有基因調(diào)控活性，但是此活性并不構(gòu)成本發(fā)明的ー個方面。治療劑包括但不限于親水性和疏水性化合物。因此，本發(fā)明所涵蓋的治療劑包括但不限于類藥物分子、蛋白、肽、抗體、抗體片段、適配體和小分子。蛋白治療劑包括但不限于肽、酶、結(jié)構(gòu)性蛋白、受體和其它細(xì)胞或循環(huán)蛋白以及其片段和衍生物，上述蛋白的異常表達(dá)引起ー種或多種紊亂。作為ー個特定的實施方案，所述治療劑還包括化療劑。在多個不同的實施方案中，所述治療劑還包括放射性材料。在多個不同的方面，蛋白治療劑包括細(xì)胞因子或造血因子，其包括但不限于IL-I a、IL-1 β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5，1L_6、IL_11、集落刺激因子-I (CSF-I)、M_CSF、SCF、GM-SCF、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、ΕΡ0、干擾素-a (IFN-α )、復(fù)合干擾素、IFN-β、IFN-Y、、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12，1L-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、促血小板生成素(TPO)、血管生成素，如Ang-l、Ang-2、Ang-4、Ang-Y、人類血管生成素樣肽、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血管生長素、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-I、骨形態(tài)發(fā)生蛋白_2、骨形態(tài)發(fā)生蛋白_3、骨形態(tài)發(fā)生蛋白_4、骨形態(tài)發(fā)生蛋白_5、骨形態(tài)發(fā)生蛋白_6、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7、骨形態(tài)發(fā)生蛋白_8、骨形態(tài)發(fā)生蛋白_9、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-10、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-11、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-12、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-13、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-14、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-15、骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體IA、骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體IB、腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子、纖毛神經(jīng)營養(yǎng)因子、纖毛神經(jīng)營養(yǎng)因子受體、細(xì)胞因子誘導(dǎo)的嗜中性粒細(xì)胞趨化因子I、細(xì)胞因子誘導(dǎo)的嗜中性粒細(xì)胞趨化因子2 a、細(xì)胞因子誘導(dǎo)的嗜中性粒細(xì)胞趨化因子20、^內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、內(nèi)皮素
I、表皮生長因子、上皮細(xì)胞源性嗜中性粒細(xì)胞引誘物、成纖維細(xì)胞生長因子4、成纖維細(xì)胞生長因子5、成纖維細(xì)胞生長因子6、成纖維細(xì)胞生長因子7、成纖維細(xì)胞生長因子8、成纖維細(xì)胞生長因子Sb、成纖維細(xì)胞生長因子Sc、成纖維細(xì)胞生長因子9、成纖維細(xì)胞生長因子10、酸性成纖維細(xì)胞生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子a I、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營 養(yǎng)因子a 2、生長相關(guān)蛋白、生長相關(guān)蛋白a、生長相關(guān)蛋白P、生長相關(guān)蛋白Y、肝素結(jié)合性表皮生長因子、肝細(xì)胞生長因子、肝細(xì)胞生長因子受體、胰島素樣生長因子I、胰島素樣生長因子受體、胰島素樣生長因子受體II、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白、角質(zhì)細(xì)胞生長因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受體a、神經(jīng)生長因子、神經(jīng)生長因子受體、神經(jīng)營養(yǎng)因子_3、神經(jīng)營養(yǎng)因子_4、胎盤生長因子、胎盤生長因子2、血小板源性內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、血小板源性生長因子、血小板源性生長因子A鏈、血小板源性生長因子AA、血小板源性生長因子AB、血小板源性生長因子B鏈、血小板源性生長因子BB、血小板源性生長因子受體a、血小板源性生長因子受體P、前B細(xì)胞生長刺激因子、干細(xì)胞生長因子受體、了即(包括了即0、了即1、了即2)、轉(zhuǎn)化生長因子a、轉(zhuǎn)化生長因子0、轉(zhuǎn)化生長因子3 I、轉(zhuǎn)化生長因子P I. 2、轉(zhuǎn)化生長因子P 2、轉(zhuǎn)化生長因子P 3、轉(zhuǎn)化生長因子P 5、潛在轉(zhuǎn)化生長因子P I、轉(zhuǎn)化生長因子P結(jié)合蛋白I、轉(zhuǎn)化生長因子P結(jié)合蛋白II、轉(zhuǎn)化生長因子3結(jié)合蛋白III、I型腫瘤壞死因子受體、II型腫瘤壞死因子受體、尿激酶型纖溶酶原激活因子受體、血管內(nèi)皮生長因子，以及嵌合蛋白和其生物或免疫活性片段。本文使用的術(shù)語“小分子”指的是可被任選地衍生化的化學(xué)化合物(例如模擬肽)或任何其它天然或合成的低分子量有機(jī)化合物。這樣的小分子可以是治療上可遞送的物質(zhì)或可經(jīng)進(jìn)一步衍生化以輔助遞送?！暗头肿恿俊敝傅氖欠肿恿康陀?000道爾頓的化合物，通常介于300與700道爾頓之間。在多個不同方面，低分子量化合物為約100、約150、約200、約250、約300、約350、約400、約 450、約 500、約 550、約 600、約 650、約 700、約 750、約 800、約 850、約 900、約 1000 或
更多道爾頓。術(shù)語“類藥物分子”為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知，并且包括意指具有可以使其適用于藥物的特征的化合物，例如但不限于作為藥物中的活性劑。因此，例如但不限于，類藥物分子是通過有機(jī)化學(xué)的工藝或通過分子生物學(xué)或生物化學(xué)工藝而合成的分子，并且在一些方面是本文所定義的小分子。在多個不同的方面，類藥物分子還表現(xiàn)出對一種或一些特定蛋白的選擇性相互作用并且是生物可利用的和/或能夠獨自地穿透細(xì)胞膜或在與本發(fā)明的組合物或方法進(jìn)行組合后穿透細(xì)胞膜。根據(jù)本發(fā)明所述，在一些方面所述治療劑包括小分子(即，具有低于1000道爾頓的分子量的化合物，通常介于300與700道爾頓之間)。本文所使用的“疏水”應(yīng)被理解為意指本發(fā)明所涵蓋的活性劑在水溶液中的溶解度為略溶(30到100份的溶劑可溶解I份的溶質(zhì)，或活性劑)、微溶(100到1000份的溶劑可溶解I份的溶質(zhì))、極微溶(1000到10，000份的溶劑可溶解I份的溶質(zhì))，或基本不溶(超過10，000份的溶劑可溶解I份的溶質(zhì))[例如參見美國藥典(USP 24/NF 19)，UnitedStates Pharmacopeial Convention, Inc. , 2000年,在此其全部以引用方式并入本文]。本發(fā)明還涵蓋了溶解度高于上述溶解度的藥物，但是其在所需劑量下需要或受益于增溶劑的輔助以便在所需的速度和所需的概況下將所述藥物以溶解態(tài)從藥劑單位中進(jìn)行遞送。通常，這樣的藥物可包括具有中度或高度溶解度但需要高載藥量的藥物。本文所使用的“高載藥量”指的是劑量単位包含30%或更多所述藥物，其中劑量單位是與納米顆粒相締合的藥物量。
在多個不同的實施方案中，美國專利第7，667，004(在此其全部以引用方式并入本文)中所描述的治療劑被涵蓋可用于本文所述組合物和方法中并且包括但不限于烷基化劑、抗生素劑、抗代謝劑、激素劑、植物源性劑和生物制劑。烷基化劑的實例包括但不限于，ニ氯こ基胺(氮芥，例如苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、ニ氯甲基ニこ胺、美法侖(melphalan)、尿喃唳氮芥)、氮丙唳(例如，噻替派(thiotepa))、燒基酮磺酸鹽(例如，白消安(busulfan))、亞硝基脲(例如，卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(Iomustine)、鏈脲佐菌素(streptozocin))、非典型燒基化劑(克瘤靈(altretamine)、達(dá)卡巴嗪(dacarbazine)和丙卡巴月井(procarbazine))、鉬化合物(例如卡鉬和順鉬)。抗生素劑的實例包括但不限于蒽環(huán)類(例如，小紅莓(doxorubicin)、柔紅霉素(daunorubicin)、表阿霉素(epirubicin)、伊達(dá)比星(idarubicin)和蒽ニ酮)、絲裂霉素C (mitomycin C)、博萊霉素(bleomycin)、放線菌素D (dactinomycin)、普卡霉素(plicatomycm)?？勾x劑的實例包括但不限于，氟尿嘧啶(5-FU)、氟尿苷(5-FUdR)、甲氨蝶呤、瘤可維(Ieucovorin)、輕基脲、硫鳥嘌呤(6-TG)、巰嘌呤(6-MP)、阿糖胞苷、噴司他丁(pentostatin)、憐酸氟達(dá)拉濱(f ludarabine phosphate)、克拉屈濱(cladribine)(2-CDA)、天冬酰氨酶、甲磺酸伊馬替尼(imatinib mesylate)(或GLEEVEC )和吉西他濱 Qgemcitabine)。激素劑的實例包括但不限于，合成雌激素(例如己烯雌酚)、抗雌激素(例如，它莫西芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、氟甲睪酮和雷洛昔芬(raloxifene))、抗雄激素(比卡魯胺(bicalutamide)、尼魯米特(nilutamide)、氟他胺(fIutamide))、芳香化酶抑制劑(例如，氨魯米特(aminoglutethimide)、阿那曲唑(anastrozole)、四氮唑)、酮康唑(ketoconazole)、醋酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、亮丙瑞林(Ieuprolide)、醋酸甲地孕酮和米非司酮(mifepristone)。植物源性劑的實例包括但不限于，長春花堿類vinca alkaloids (例如，長春新堿(vincristine)、長春花堿(vinblastine)、長春地辛(vindesine)、長春利定(vinzolidine)和長春瑞濱(vinorelbine))、表鬼臼毒素類(例如，足葉こ式(VP-16)和替尼泊苷(teniposide) (VM-26))、喜樹堿化合物類(例如20 (S)喜樹堿、拓?fù)涮婵?topotecan)、魯比替康(rubitecan)和伊立替康(irinotecan))、紫杉燒類(例如紫杉醇和歐洲紫杉醇(docetaxel))。生物制劑的實例包括但不限于，免疫調(diào)控蛋白，諸如細(xì)胞因子，針對腫瘤抗原的單克隆抗體、腫瘤抑制基因和癌癥疫苗。可被用于與本發(fā)明的組合物和方法相結(jié)合的白介素的實例包括但不限于，白介素2 (IL-2)和白介素4(IL-4)、白介素12(IL-12)?？杀挥酶膳c本發(fā)明的組合物和方法相結(jié)合的干擾素的實例包括但不限于，干擾素α、干擾素β和干擾素Y。細(xì)胞因子的實例包括但不限于，促紅細(xì)胞生成素(epoietin a )、粒細(xì)胞-CSF (非格司亭(filgrastin))和粒細(xì)胞巨卩遼細(xì)胞-CSF(沙格司亭(sargramostim))。除細(xì)胞因子之外的其它免疫調(diào)控劑包括但不限于卡介苗(bacillus Calmette-Guerin)、左旋咪唑和奧曲月太(octreotide)。此外，在多個不同的方面，術(shù)語治療劑可包含一種或多種這樣的化合物，或一種或多種這樣的化合物與任何其它活性劑的組合物。特別地排除于術(shù)語“治療劑”的范圍之外的是本文所述寡聚核苷酸。在多個不同的實施方案中，提供了本文中所公開的組合物和方法，其中所述納米顆粒包含多種治療劑。在一個方面，提供了組合物和方法，其中所述多種治療劑被特異性地連接于一種納米顆粒。在另一個方面，所述多種治療劑被特異性地連接于多于一種納米顆粒。 被涵蓋進(jìn)行使用的化療劑包括但不限于，烷基化劑，包括氮芥，諸如二氯甲基二乙胺、環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、美法侖和苯丁酸氮芥；亞硝基脲，諸如卡莫司汀(BCNU)、洛莫司 汀(CCNU)和司莫司汀(semustine)(甲基-CCNU);乙烯亞胺/甲基三聚氰胺類，諸如三亞乙基亞胺(TEM)、三乙烯、三乙烯硫代磷酰胺(噻替派)、六甲卩密胺(hexamethylmelamine)(HMM，克瘤靈)；燒基磺酸鹽，諸如白消安；三嗪，諸如達(dá)卡巴嗪(DTIC);抗代謝劑，包括葉酸類似物，諸如甲氨蝶呤和三甲曲沙(trimetrexate),卩密唳類似物,諸如5_氟尿卩密唳、氟脫氧尿苷、吉西他濱、胞喃唳阿拉伯糖苷(AraC,阿糖胞苷)、5_阿扎胞苷(5_azacytidine)、2,2，- 二氟脫氧胞苷，嘌呤類似物，諸如6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、硫唑嘌呤、2’ -脫氧柯福霉素(2，-deoxycoformycin)(噴司他丁 )、紅-9-(2-輕基_3_壬基)腺嘌呤(EHNA)、磷酸氟達(dá)拉濱和2-氯脫氧腺苷(克拉屈濱，2-CdA);天然產(chǎn)物，包括抗絲裂藥物，諸如紫杉醇、長春花堿類(包括長春花堿(VLB)、長春新堿和長春瑞濱)、多西他賽(taxotere)、雌莫司汀(estramustine)和磷酸雌莫司??；表鬼臼毒素類，諸如足葉乙甙和替尼泊苷；抗生素諸如放線菌素D、道諾霉素(daunomycin)(柔紅霉素(rubidomycin))、阿霉素、米托蒽醌(mitoxantrone)、伊達(dá)比星、博萊霉素、普卡霉素(plicamycin)(米拉霉素(mithramycin))、絲裂霉素C和放線菌素(actinomycin);酶類諸如L-天冬氨酰酶；生物反應(yīng)修飾劑諸如干擾素a、IL-2、G-CSF和GM-CSF ;其它藥劑，包括鉬配位復(fù)合物諸如順鉬和卡鉬、蒽二酮類諸如米托蒽醌、經(jīng)取代尿素諸如羥基脲、甲基肼衍生物包括N-甲基肼(MIH)和丙卡巴肼、腎上腺皮質(zhì)激素抑制劑諸如米托坦(mitotane) (o, p' -DDD)和氨魯米特；激素類和拮抗劑類，包括腎上腺皮質(zhì)留類拮抗劑諸如潑尼松(prednisone)及等效物、地塞米松(dexamethasone)和氨魯米特；黃體酮諸如己酸羥孕酮、醋酸甲羥孕酮和醋酸甲地孕酮；雌激素諸如己烯雌酚和炔雌醇等效物；抗雌激素諸如他莫昔芬，雄激素包括丙酸睪丸酮和氟甲睪酮/等效物；抗雄激素，諸如氟他胺、促性腺激素釋放激素類似物和亮丙瑞林；以及非甾類抗雄激素諸如氟他胺?？捎糜诒景l(fā)明的材料和方法的治療劑可由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所確定。例如但不限于，且如本文中所示例，人們可實施常規(guī)的體外測試以確定一種治療劑在連接于經(jīng)寡核苷酸功能化的納米顆粒時與未連接于所述經(jīng)寡核苷酸功能化的納米顆粒時相比較，是否能夠更有效地穿透細(xì)胞的細(xì)胞膜。在一個實施方案中，提供了方法和組合物，其中治療劑在連接于經(jīng)寡核苷酸功能化的納米顆粒時與未連接于所述經(jīng)寡核苷酸功能化的納米顆粒時相比較，其能夠穿透細(xì)胞膜的有效程度高出約1%。在多個不同的方面，治療劑在連接于經(jīng)寡核苷酸功能化的納米顆粒時與未連接于所述經(jīng)寡核苷酸功能化的納米顆粒時相比較，其穿透細(xì)胞膜的有效程度能夠高出約2%、約3%、約4%、約5 %、約6 %、約7 %、約8 %、約9 %、約10 %、約11%、約 12%、約 13 %、約 14%、約 15 %、約 16 %、約 17 %、約 18 %、約 19 %、約 20 %、約 21%、約 22 %、約 23 %、約 24 %、約 25 %、約 26 %、約 27 %、約 28 %、約 29 %、約 30 %、約 31 %、約 32 %、約 33 %、約 34 %、約 35 %、約 36 %、約 37 %、約 38 %、約 39 %、約 40 %、約 41 %、約 42 %、約 43 %、約 44 %、約 45 %、約 46 %、約 47 %、約 48 %、約 49 %、約 50 %、約 51 %、約 52 %、約 53 %、約 54 %、約 55 %、約 56 %、約 57 %、約 58 %、約 59 %、約 60 %、約 61 %、約 62 %、約 63 %、約 64 %、約 65 %、約 66 %、約 67 %、約 68 %、約 69 %、約 70 %、約 71 %、約 72 %、約 73 %、約 74 %、約 75 %、約 76 %、約 77 %、約 78 %、約 79 %、約 80 %、約 81 %、約 82%、約 83%、約 84%、約 85%、約 86%、約 87%、約 88%、約 89%、約 90%、約 91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、 約97%、約98%、約99%、約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約10倍、約20倍、約30倍、約40倍、約50倍、約60倍、約70倍、約80倍、約90倍或約100倍或更高。在另ー個實施方案中，提供了方法和組合物，其中治療劑在連接于經(jīng)寡核苷酸功能化的納米顆粒時與未連接于所述經(jīng)寡核苷酸功能化的納米顆粒時相比較，其能夠穿透細(xì)胞膜的有效程度低約I %。在多個不同的方面，治療劑在連接于經(jīng)寡核苷酸功能化的納米顆粒時與未連接于所述經(jīng)寡核苷酸功能化的納米顆粒時相比較，其能夠穿透細(xì)胞膜的有效程度低約2%、約3%、約4%、約5%、約6%、約7%、約8%、約9%、約10%、約11%、約12%、約 13 %、約 14 %、約 15 %、約 16 %、約 17 %、約 18 %、約 19 %、約 20 %、約 21 %、約 22 %、約 23 %、約 24 %、約 25 %、約 26 %、約 27 %、約 28 %、約 29 %、約 30 %、約 31 %、約 32 %、約 33 %、約 34 %、約 35 %、約 36 %、約 37 %、約 38 %、約 39 %、約 40 %、約 41 %、約 42 %、約 43 %、約 44 %、約 45 %、約 46 %、約 47 %、約 48 %、約 49 %、約 50 %、約 51 %、約 52 %、約 53 %、約 54 %、約 55 %、約 56 %、約 57 %、約 58 %、約 59 %、約 60 %、約 61 %、約 62 %、約 63 %、約 64 %、約 65 %、約 66 %、約 67 %、約 68 %、約 69 %、約 70 %、約 71 %、約 72 %、約 73 %、約 74 %、約 75 %、約 76 %、約 77 %、約 78 %、約 79 %、約 80 %、約 81 %、約 82 %、約 83%、約 84%、約 85%、約 86%、約 87%、約 88%、約 89%、約 90%、約 91%、約 92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約10倍、約20倍、約30倍、約40倍、約50倍、約60倍、約70倍、約80倍、約90倍或約100倍或更低。在多個不同的實施方案中，提供了包含經(jīng)寡核苷酸修飾的納米顆粒和治療劑的藥物遞送組合物，所述治療劑在其未與所述經(jīng)寡核苷酸修飾的納米顆粒相連接情況下的可遞送水平顯著低于在所述治療劑與所述經(jīng)寡核苷酸修飾的納米顆粒相連接情況下的遞送，并且其中在所述經(jīng)寡核苷酸修飾的納米顆粒上的寡核苷酸與連接于所述納米顆粒的治療劑之間的比率足以將所述治療劑轉(zhuǎn)運至細(xì)胞中。本文所使用的“比率”指的是寡核苷酸與治療劑的數(shù)字比較。例如但不限干，I I指的是每ー個連接于納米顆粒的治療劑分子對應(yīng)ー個寡核苷酸分子。在ー些方面，所述寡核苷酸與所述治療劑的比率為至少約I : 2。在多個不同的方面，納米顆粒表面的所述寡核苷酸與所述治療劑的比率為約I : 3、約I : 4、約I : 5、約
權(quán)利要求
1.一種藥物遞送組合物，其包含經(jīng)寡核苷酸修飾的納米顆粒和治療劑，與所述治療劑在連接于所述經(jīng)寡核苷酸修飾的納米顆粒時的遞送相比，所述治療劑在未與所述經(jīng)寡核苷酸修飾的納米顆粒的連接時的遞送水平顯著較低，其中所述組合物具有與治療劑分子相比的若干寡核苷酸分子，其比率足以將所述治療劑轉(zhuǎn)運至細(xì)胞中。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的組合物，其中所述治療劑是低分子量治療劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述治療劑是疏水性的。
4.根據(jù)權(quán)利要求I至3中任一項所述的組合物，其中所述治療劑是親水性的。
5.根據(jù)權(quán)利要求I至4中任一項所述的組合物，其進(jìn)ー步包含可檢測的標(biāo)記物。
6.根據(jù)權(quán)利要求I至5中任一項所述的組合物，其中所述治療劑是選自表2中的藥劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求I至6中任一項所述的組合物，其中所述寡核苷酸和所述治療劑被獨立地直接連接于所述納米顆粒。
8.根據(jù)權(quán)利要求I至6中任一項所述的組合物，其中所述治療劑被連接于所述寡核苷酸，所述寡核苷酸被連接于所述納米顆粒。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述治療劑被共價連接于所述寡核苷酸，所述寡核苷酸被連接于所述納米顆粒。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述治療劑被非共價連接于所述寡核苷酸，所述寡核苷酸被連接于所述納米顆粒。
11.根據(jù)權(quán)利要求I至10中任一項所述的組合物，其中所述比率是寡核苷酸與治療劑的數(shù)量比較。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物，其中所述納米顆粒表面的所述寡核苷酸與所述治療劑的比率為至少約I個寡核苷酸分子2個治療劑分子。
13.根據(jù)權(quán)利要求I至12中任一項所述的組合物，其進(jìn)ー步包含另外的治療劑。
14.根據(jù)權(quán)利要求I至13中任一項所述的組合物，其中所述另外的治療劑被連接于所述經(jīng)寡核苷酸修飾的納米顆粒。
15.根據(jù)權(quán)利要求I至14中任一項所述的組合物，其中所述另外的治療劑被連接于第ニ種經(jīng)寡核苷酸修飾的納米顆粒。
16.根據(jù)權(quán)利要求I至15中任一項所述的組合物，其中所述另外的治療劑未連接于所述經(jīng)寡核苷酸修飾的納米顆粒并且自由地穿越細(xì)胞膜。
17.ー種用于治療疾病的方法，其包括對哺乳動物施用治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求I至16中任一項所述的組合物的步驟。
18.—種試劑盒，其包含根據(jù)權(quán)利要求I至16中任一項所述的組合物。
全文摘要
公開了包含經(jīng)寡核苷酸修飾的納米顆粒和治療劑的藥物遞送組合物。具體地說，所公開的組合物包含與治療劑分子呈一定比率的若干寡核苷酸分子，從而可將治療劑分子充分轉(zhuǎn)運至細(xì)胞中。所述治療劑包括疏水性和親水性的治療劑。還描述了治療劑在組合物中的不同連接。
文檔編號A61K9/16GK102625697SQ201080048673
公開日2012年8月1日 申請日期2010年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月1日
發(fā)明者大衛(wèi)·A·吉拉約翰, 查德·A·米爾金, 韋斯頓·L·丹尼爾 申請人:西北大學(xué)