專利名稱：誘導硬組織再生的材料的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及誘導硬組織(例如骨或軟骨等)再生的材料，其包含富血小板血漿和明膠β-TCP海綿。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)上，進行自體骨移植以通過從自身健康部位獲取骨和將該骨移植于骨缺損部位來使骨折部位的骨愈合和切除良性骨瘤后等的骨缺損部位的重構(gòu)。但是，由于對健康部位的侵入，并發(fā)癥以大約30%的高比率發(fā)生，如骨供給位置的感染和殘余疼痛、骨供給位置附近的神經(jīng)損傷等。在骨愈合和骨缺損面積大的情況下，大量的自體骨是必須的，不合格的自體骨供給位置有時會造成臨床問題。
為避免自體骨移植和補償自體骨量不足，已使用利用磷酸鈣和β-磷酸三鈣(β -TCP)的人工骨。但是，由于人工骨本身沒有骨誘導能力，其適用位置僅限于在良好骨再生環(huán)境下的較小骨缺損，因為成骨潛力不如自體骨，其花費一些時間以獲得動力強度，因此要求在手術(shù)后限制負荷和長時間休息成為問題。在這樣的背景下，已廣泛研究適用于大范圍骨愈合和骨缺損的具有骨誘導能力的骨再生技術(shù)。近年來，已開發(fā)出培養(yǎng)自身骨髓間質(zhì)干細胞并將這些細胞與人工骨組合而移植到骨缺損部位中的技術(shù)，并已報道了臨床應用(非專利文獻I)。但是，其缺乏廣泛應用性，因為積累了各種問題需要專用設施，如可進行細胞培養(yǎng)的潔凈室(細胞處理中心)，這使市立醫(yī)院實際上難以使用該技術(shù)，具有多分化潛能的間質(zhì)細胞具有癌變危險，分化誘導不一定完夫寸。此外，作為使用生長因子的骨再生治療，通過基因重組生產(chǎn)的骨生成蛋白-2(BMP-2)在1997年被歐洲和美國的食品藥品管理局批準用于椎體融合，并在美國臨床應用。但是，近年來，其有效性和安全性受到質(zhì)疑。例如，報道證明，在使用BMP-2的腰椎椎體間融合中，固定椎體和移植骨的再吸收以高頻率發(fā)生而顯著降低骨愈合速率。此外，報道了通過可用于評測軟組織的MRI確認的腰椎周緣組織中的炎性反應，和在頸固定的癥例中觀察到的重度并發(fā)癥，如咽水腫導致的呼吸困難、吞咽困難和頸部的異常腫大(非專利文獻2和3)。其原因被認為是軟組織和生命器官中的水腫變化，該變化是由從施用位置擴散到周緣組織的大量人造生長因子的施用誘發(fā)的抗原-抗體反應造成。此外，由于BMP-2昂貴，其增加了幾十萬日元的手術(shù)成本，對患者造成經(jīng)濟負擔。富血小板血漿(也稱作PRP)是通過低速離心分離而從外周血中除去紅血球而得的濃縮血小板血楽·。PRP含有大量生長因子，如包含在血小板中的血小板衍生生長因子(roGF)、轉(zhuǎn)化生長因子β (TGF-β )、成纖維細胞生長因子(FGF)、胰島素樣生長因子(IGF)等，并已知通過它們的協(xié)同作用表現(xiàn)出如血管生成、骨生成、促進創(chuàng)傷愈合之類的效應。還已經(jīng)證實，PRP和適當給藥系統(tǒng)材料，如明膠水凝膠等的聯(lián)合使用在長骨和頭蓋骨缺損模型中表現(xiàn)出骨生成活性(專利文獻1，非專利文獻4和5)。但是，PRP單獨的作用不足以在大范圍骨缺損、解剖學未融合骨和用于將脊椎骨接合到一起的脊椎融合術(shù)中提供充分的骨生成，具有促進分化和誘導成骨細胞的三維結(jié)構(gòu)的支架必不可少?，F(xiàn)有技術(shù)文獻 專利文獻
專利文獻 I: JP-A-2005-211477 專利文獻 2: JP-A-2004-123576。非專利文獻
非專利文獻 I: Morishita T, et. , Artif. Organs, 2006 非專利文獻 2: Lohn McClellan 等人，J. Spinal Disord. Tech. , 2006 非專利文獻3: Ben B等人，Spine, 2006 非專利文獻 4: Hokugo A 等人，Tissue Eng. , 2005
非專利文獻5: Hokugo A等人，Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol.Endod. , 2007。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的問題
本發(fā)明的問題是提供用于硬組織如骨或軟骨等的再生的新型材料，其提供衍生自富血小板血漿的生長因子的緩釋作用和用于組織再生的良好支架功能，并在安全性和實用性方面優(yōu)異。 解決問題的方式
為解決上述問題，本發(fā)明人已制備誘導硬組織再生的材料，其包含通過將作為生長因子給藥系統(tǒng)用材料優(yōu)異的明膠和作為具有生物吸收性和生物降解性的陶瓷的β -TCP顆粒加工成海綿狀形式而獲得的明膠β -TCP海綿和包含在所述海綿中的從患者自己血中提純的富血小板血漿(PRP)。他們已證實，該材料在大鼠脊椎融合術(shù)模型中顯著增強骨生成。本發(fā)明基于上述發(fā)現(xiàn)而作出，并提供含有富血小板血漿和明膠β-TCP海綿的誘導硬組織再生的材料。待施用本發(fā)明的材料的硬組織是需要再生用支架的骨或軟骨組織等，還包括牙齒領域中的那些，如牙槽骨等。本發(fā)明的誘導硬組織再生的材料促進骨生成和軟骨生成。此外，本發(fā)明的誘導硬組織再生的材料還促進血管生成。本發(fā)明的誘導硬組織再生的材料優(yōu)選用于需要支架的硬組織如骨或軟骨等的再生，因為明膠β-TCP海綿發(fā)揮用于組織再生的良好細胞支架的功能。但是，其施用位置不限于硬組織，其可以是與硬組織，如骨或軟骨等接觸的軟組織。具體而言，甚至在與骨或軟骨接觸的軟組織，如腱、韌帶等的移植手術(shù)的情況下，該材料也通過其血管生成促進作用誘導腱和韌帶的再生。因此，本發(fā)明中還包括用于誘導與硬組織接觸的軟組織再生的這種用途。本發(fā)明中所用的富血小板血漿優(yōu)選來自要被施以誘導硬組織再生的材料的對象。 要被施以本發(fā)明的誘導硬組織再生的材料的對象不限于人，并包括全部哺乳動物。 本發(fā)明中所用的明膠β -TCP海綿優(yōu)選具有大約10-500 μ m的孔徑，明膠β -TCP海綿中的明膠優(yōu)選是交聯(lián)的。通過對含有β-TCP和明膠的組合物施以交聯(lián)和凍干來形成上述交聯(lián)。交聯(lián)和凍干的次序可以任意，可以將交聯(lián)后的組合物凍干，或可以對凍干的組合物施以交聯(lián)。發(fā)明效果
本發(fā)明中所用的PRP有利地不具有 與治療有關的倫理問題和與使用血液制品有關的風險，如病毒感染、免疫不相容性等，因為其容易由被施以誘導硬組織再生的材料的對象的血液獲得。此外，本發(fā)明中所用的明膠β-TCP海綿以緩釋方式釋放PRP中所含的組分如生長因子等，以促進骨生成、軟骨生成和血管生成，以及發(fā)揮用于組織再生的良好細胞支架的功能，由此能實現(xiàn)顯著的骨再生。


圖I示意性顯示在大鼠脊椎后外側(cè)融合模型的橫突4和5之間的移植。圖2顯示左和右橫突4、5的矢狀切面重建圖像。圖3是顯示橫突之間的骨量的圖。圖4是顯示3點彎曲試驗的結(jié)果的圖。圖5顯示PRP海綿模型的橫突4、5之間的組織圖像。在橫突之間的軟骨中觀察到骨化樣的變化。在[比較]中，無移植組(術(shù)后8周)觀察到橫突之間的韌帶成分，但沒有觀察到骨和軟骨成分，其中箭頭始終顯示為，左橫突4，右橫突5，右上圖顯示番紅O染色圖像。本說明書包括優(yōu)先權(quán)申請No. 2009-241041的說明書中描述的內(nèi)容。
具體實施例方式本發(fā)明涉及誘導硬組織再生的材料，其含有富血小板血漿(PRP)和明膠β -TCP海綿。I.富血小板血漿(PRP)
本發(fā)明的“富血小板血漿(PRP) ”是通過低速離心分離從外周血中除去紅血球而得的濃縮血小板血衆(zhòng)。PRP含有大量生長因子，如包含在血小板中的血小板衍生生長因子(PDGF)、轉(zhuǎn)化生長因子β (TGF-β )、干細胞衍生因子(SDF)-I、胰島素樣生長因子(IGF)等，并已知通過它們的協(xié)同作用表現(xiàn)出如血管生成、骨生成、促進創(chuàng)傷愈合之類的效應。關于用于制備PRP的離心條件，可以適當?shù)馗鶕?jù)要使用的離心分離機的種類確定用于有效除去血細胞成分的旋轉(zhuǎn)數(shù)和時間。根據(jù)需要，可以通過在除去血細胞成分后再離心來濃縮血小板?；蛘撸部梢酝ㄟ^使用膜的血液分離機制備PRP。本發(fā)明中所用的PRP優(yōu)選衍生自需要施用本發(fā)明的誘導硬組織再生的材料的對象的自身血。但是，當該對象具有重度貧血或基礎疾病以致難以獲得血樣時，可以使用由他人血液提純的富血小板血漿。2.明膠 β-TCP 海綿
本發(fā)明中所用的明膠β-TCP海綿是由明膠和β-TCP顆粒構(gòu)成的多孔海綿狀結(jié)構(gòu)。2. I 明膠
本發(fā)明中所用的明膠可通過經(jīng)各種處理如堿水解、酸水解、酶水解等使可獲自各種動物物種，如牛、豬、魚等的身體的任何部位，如皮、骨、腱等的膠原或用作膠原的物質(zhì)變性而獲得。盡管明膠的性質(zhì)隨所用材料和處理方法而改變，但可以使用任何具有這樣的性質(zhì)的明膠作為本發(fā)明中的明膠β-TCP海綿材料。顯示明膠性質(zhì)的尺度的實例包括等電點、分子量、ζ電勢等。例如，市售明膠包括Sigma Ltd.制造的A型明膠和Wako Pure Chemical Industries, Ltd.制造的明膠，水溶液中的4電勢如下
Sigma Ltd.制造的A型明膠大約O至大約5 mV
Wako Pure Chemical Industries, Ltd.制造的明膠大約-5 至大約-2 mV。ζ電勢是顯示物質(zhì)(明膠)的靜電荷水平的尺度。本發(fā)明中所用的特別優(yōu)選的明膠具有下列性質(zhì) 為通過堿水解處理由膠原獲得的酸性明膠，
在非還原條件下通過SDS-PAGE測得的大約10-大約200，000道爾頓的分子量，和 大約-15至大約-20 mV的水溶液中ζ電勢。優(yōu)選地，此外，可以使用來源于牛骨的I型膠原通過堿處理制成的酸性明膠，其可獲自Nitta Gelatin Inc.，等電點(IEP)為5. O。盡管由酸處理制成的堿性明膠也可獲自Nitta Gelatin Inc.(作為樣品IEP 9.0), ζ電勢如下所示極其不同。酸性明膠(NittaGelatin Inc.樣品 IEP 5. O):大約-15 至大約-20 mV 堿性明膠(Nitta Gelatin Inc.樣品 IEP 9. O):大約 +12 至大約 +15 mV。2. 2 β -TCP ( β -磷酸三鈣)
本發(fā)明中所用的β-TCP (磷酸三鈣)是可生物降解的陶瓷，其一直以來廣泛用作人工骨材料。多孔β-TCP的壓縮強度為大約3Μ Pa，其比生物骨(對松質(zhì)骨而言大約7Μ Pa)弱，但對臨床應用而言卻足夠強。β -TCP在體內(nèi)逐漸分解并釋放鈣離子和磷酸離子以實現(xiàn)利于通過成骨細胞合成作為骨構(gòu)成成分的羥磷灰石的環(huán)境。也就是說，β-TCP不僅發(fā)揮給藥系統(tǒng)的載體或骨化用支架的功能，還積極促進骨生成、軟骨生成、血管生成等。因此，β-TCP提供良好的支架材料，其提高通過與明膠混合而得的明膠海綿的動力強度，同時積極促進骨生成、軟骨生成、血管生成等。本發(fā)明中所用的β-TCP的尺寸、孔隙率、孔徑等可以為任意，并可以使用任意種類的β-TCP顆粒。例如，可以使用市售β-TCP-100 (粉碎品)TaiheiChemical Industrial Co. , Ltd.制造，OSferion (注冊商標):OLYMPUS CORPORATION 制造
坐寸ο2. 3明膠β -TCP海綿的結(jié)構(gòu)
以干重量計，本發(fā)明的明膠β-TCP海綿中的明膠和β-TCP的比率為10:1-1:10，優(yōu)選5:1-1:5。本發(fā)明的明膠β -TCP海綿類似于具有許多平均孔徑為10-500 μ m的超細孔的海綿。由于具有包括許多超細孔的結(jié)構(gòu)，該海綿在移植后使周圍細胞易于進入其中，并可發(fā)揮用于組織再生的支架材料的功能。此外，可以向粘附的細胞提供充足營養(yǎng)和氧，由此能夠?qū)崿F(xiàn)正常細胞生長和分化。本發(fā)明的明膠β-TCP海綿中的超細孔的平均孔徑的下限為10 μ m，其上限為500 μ m。當其小于10 μ m時，由于細胞無法進入組織工程學載體，細胞粘附性變得極差，且粘附的細胞不能三維地伸展。當其超過500 μ m時，由于細胞密度變低，組織和器官不能再生。優(yōu)選下限為50 μ m，優(yōu)選上限為200 μ m。在本發(fā)明的明膠β-TCP海綿中，明膠是交聯(lián)的。評測交聯(lián)水平(交聯(lián)度)的指數(shù)是水含量。水含量是相對于海綿重量的溶脹的明膠β-TCP海綿中水的重量百分比。當水含量高時，該明膠β-TCP海綿的交聯(lián)度降低，海綿容易降解。也就是說，該明膠β-TCP海綿在體內(nèi)的酶降解性隨水含量而改變，且水含量影響PRP的緩釋(逐漸釋放)。本發(fā)明的明膠β -TCP海綿優(yōu)選具有90%-99. 8%的水含量。當水含量低于90%時，有時損害適合移植的撓性，移植到體內(nèi)后生物降解可能耗費長時間，且生理活性物質(zhì)可能留在載體中而不以緩釋方式釋放。當其超過99. 8%時，可能發(fā)生的情況是，載體不能在培養(yǎng)基或緩沖液中保持其強度或生理活性物質(zhì)逐漸釋放僅I至3天的短時期。更優(yōu)選的下限是95%，更優(yōu)選的上限是98%。 2.4明膠β-TCP海綿的制造方法
通過對含有明膠和β-TCP的組合物施以交聯(lián)和凍干來獲得本發(fā)明中所用的明膠β-TCP海綿。具體而言，將β-TCP添加到明膠中。隨后使明膠交聯(lián)。交聯(lián)方法不受特別限制，例如，可以提到真空熱脫水法、干熱法、Y射線輻射法、紫外輻射法、電子束照射法、X-射線輻射法、使用交聯(lián)劑的方法等。其中，使用交聯(lián)劑的方法是優(yōu)選的，因為如下所述，明膠一旦以海綿狀成形，則可以以相同交聯(lián)度交聯(lián)甚至直至海綿內(nèi)部。所用交聯(lián)劑不受特別限制，并且可以使用例如戊二醛、水溶性碳二亞胺如EDC等，和在環(huán)氧丙烷、二環(huán)氧化合物、羥基、羧基、氨基、硫醇基團、咪唑基等之間產(chǎn)生化學鍵的縮合劑(乙二醇二縮水甘油醚、聚乙二醇二縮水甘油醚、多甘油多縮水甘油醚、甘油多縮水甘油醚、六亞甲基二異氰酸酯等)。優(yōu)選的是戊二醛?？梢栽趦龈芍盎騼龈芍筮M行交聯(lián)。具體而言，例如，如下獲得海綿狀成形產(chǎn)品通過在均質(zhì)器等中劇烈攪拌含β-TCP的明膠水溶液以使該溶液發(fā)泡、進行交聯(lián)反應、將該反應混合物澆鑄在模具中，將其冷凍并進一步凍干，或通過在均質(zhì)器等中劇烈攪拌含β -TCP的明膠水溶液以使該溶液發(fā)泡、將該反應混合物澆鑄在模具中、冷凍并進一步凍干以獲得海綿狀成形產(chǎn)品，將該海綿狀成形產(chǎn)品在具有合適濃度的戊二醛溶液中浸泡給定時間以進行交聯(lián)(參見JP-A-2005-211477)。為了停止通過可與氨基反應的戊二醛的交聯(lián)反應，例如，只需要使具有氨基的低分子物質(zhì)，如乙醇胺、甘氨酸等與其接觸，或可以添加PH 2. 5或更低的水溶液。為完全除去用于該反應的交聯(lián)劑和低分子物質(zhì)，所得明膠β -TCP海綿可以用蒸餾水、乙醇、2-丙醇、丙酮等洗滌并再凍干。可以通過攪拌發(fā)泡和凍干步驟形成作為支架材料重要的海綿結(jié)構(gòu)。也就是說，通過冷凍步驟生成的無數(shù)冰晶通過凍干變成孔，并可以形成具有所需孔隙率和孔徑的多孔海綿結(jié)構(gòu)。此外，為避免海綿狀結(jié)構(gòu)在用交聯(lián)劑如戊二醛等處理的初始階段中的溶脹，可以在處理前施用熱交聯(lián)處理等。此外，在通過交聯(lián)劑進行交聯(lián)時，優(yōu)選通過處理反應末端來除去毒性。例如，在戊二醛處理后，可以通過用甘氨酸水溶液等洗滌以將反應末端失活來除去毒性。明膠β-TCP海綿可以以任何形狀形成并可以以例如圓柱形、棱柱形、片形、盤形、球形、粒形等成形。圓柱形、棱柱形、片形和盤形常用作嵌入片，或也可以在粉化后作為粒子使用。此外，也可以在注射中施用球形和粒形。作為明膠β -TCP海綿，可以使用市售產(chǎn)品(例如增強β -TCP明膠海綿MedGel (注冊商標)、Scaffold 或 MedGel (注冊商標)、SP (MedgeD)03.本發(fā)明的誘導硬組織再生的材料
本發(fā)明中的“硬組織”是指具有硬細胞間質(zhì)的組織，包括骨、軟骨和牙齒。本發(fā)明的用于誘導硬組織再生的材料用作誘導硬組織再生的材料，因為其含有對骨生成、軟骨生成、血管生成等具有再生促進作用的PRP和作為組織再生支架優(yōu)異的明膠β-TCP海綿。其特別優(yōu)選用作誘導缺損骨或軟骨組織的再生的材料。如上所述，盡管本發(fā)明的誘導硬組織再生的材料優(yōu)選用作誘導需要細胞支架的 缺損骨或軟骨組織的再生的材料，但其適用區(qū)域不限于硬組織，還可以是與硬組織，如骨或軟骨等接觸的軟組織。具體而言，甚至在與骨或軟骨接觸的軟組織，如腱、韌帶等的移植手術(shù)的情況下，該材料也通過PRP的血管生成促進作用誘導腱和韌帶的再生。因此，在本發(fā)明中還包括用于誘導與硬組織接觸的軟組織再生的這種用途。本發(fā)明的誘導硬組織再生的材料可廣泛用于醫(yī)學和獸醫(yī)學領域，包括整形外科和牙科領域，其施用對象不限于人，包括全部哺乳動物。通過將PRP添加到上述明膠β -TCP海綿中，制備本發(fā)明的誘導硬組織再生的材料?？梢酝ㄟ^例如將PRP逐滴添加到上述凍干的明膠β -TCP海綿中、或?qū)⒚髂zβ -TCP海綿浸潰在PRP中以使海綿浸滲有PRP來獲得含PRP的明膠β -TCP海綿。這種浸潰操作通常在4-37°C下在15分鐘-I小時內(nèi)，優(yōu)選在4-25°C下在15-30分鐘內(nèi)結(jié)束，在此期間PRP使該海綿溶脹，PRP中所含的生長因子等與海綿中的明膠分子相互作用，由此生長因子等與明膠分子形成復合體，由此通過物理相互作用將PRP固定在明膠β-TCP海綿中。它們之間的靜態(tài)相互作用以及其它相互作用，如疏水鍵、氫鍵等被認為極大有助于形成PRP和明膠分子之間的復合體。PRP相對于明膠β -TCP海綿的重量比(干重量)優(yōu)選在大約I倍至大約10000倍的范圍內(nèi)。更優(yōu)選地，PRP相對于明膠β -TCP海綿表現(xiàn)出大約2倍至大約5000倍，更優(yōu)選大約10倍至大約1000倍的重量比。本發(fā)明的誘導硬組織再生的材料直接包埋于(施加到)患部中并可設計成具有適合各用途的適當劑型。也就是說，可以根據(jù)其施用位置將明膠β-TCP海綿成形為具有所需形式，如圓柱形、棱柱形、片形、盤形、球形、粒形等?？梢愿鶕?jù)疾病嚴重程度和對象的年齡、體重等適當調(diào)節(jié)本發(fā)明的誘導硬組織再生的材料中的PRP劑量。對人而言，成年患者的劑量通常選自大約O. I-大約500mL，優(yōu)選大約I-大約50mL的范圍，這可施用于患部或其附近。在通過單次給藥獲得的效果不足時，可以多次進行給藥。根據(jù)需要，本發(fā)明的誘導硬組織再生的材料可含有其它適當藥劑和可藥用載體。這種藥劑和載體的實例包括促進血管生成和骨再生的藥劑、成骨細胞活化劑或破骨細胞抑制劑、促進細胞生長和分化的支架載體、它們的組合等。4.本發(fā)明的誘導硬組織再生的材料的作用 4. I PRP緩釋作用由于本發(fā)明的誘導硬組織再生的材料表現(xiàn)出PRR緩釋作用和穩(wěn)定化作用，其少量即可長時間發(fā)揮PRP中所含的各種生長因子等的功能。因此，可以在局部施用位置有效發(fā)揮生長因子等的血管生成促進功能和骨生成、軟骨生成能力。緩釋的機制是基于PRP中所含的各種生長因子等物理固定在海綿中的明膠β-TCP上的事實。本發(fā)明人此前已通過使用生物吸收性高分子水凝膠而嘗試了生長因子、細胞因子、單核因子、淋巴因子、其它生理活性物質(zhì)等的緩釋，并成功實現(xiàn)通過其它材料無法實現(xiàn)的具有生理活性的生長因子等的緩釋和該緩釋持續(xù)期的控制。在本發(fā)明中，PRP中所含的生長因子等被認為由于類似機制以緩釋方式從明膠β-TCP中釋放。固定在明膠β-TCP上的生長因子等卻不從該海綿釋放。隨著明膠β-TCP海綿在體內(nèi)的降解，明膠β-TCP分子變得可溶于水，這造成固定在明膠β-TCP分子上的生長因子等的釋放。也就是說，明膠β-TCP海綿的降解能夠控制生長因子等的緩釋?？梢酝ㄟ^在明膠β-TCP海綿制造過程中控制交聯(lián)度來改變明膠β-TCP海綿的可降解性。此外，由于PRP中所含的各種生長因子等與明膠β-TCP相互作用，它們的體內(nèi)穩(wěn)定性，例如抗酶降解性等得到改進。此 夕卜，由于明膠β -TCP海綿隨生長因子等的緩釋一起消失，因而不會在身體上抑制歸因于細胞生長和分化的骨再生過程。 4. 2血管生成促進作用以及骨生成和軟骨生成促進作用
本發(fā)明的誘導硬組織再生的材料中所含的PRP含有各種生長因子等，并提供各種作用，如血管生成促進作用、骨生成促進作用、軟骨生成促進作用、創(chuàng)傷愈合促進作用、皮膚潰瘍治療作用等(如上所述)。如下述實施例中所示，本發(fā)明人已經(jīng)證實，本發(fā)明的誘導硬組織再生的材料具有顯著的骨再生作用。骨化據(jù)報道涉及血管生成，并且與骨生成和軟骨生成促進作用、以及PRP的各種作用如血管生成促進作用等的貢獻結(jié)合地，促進缺損區(qū)域中的組織再生并實現(xiàn)良好的骨再生。4. 3作為支架材料的作用
本發(fā)明的誘導硬組織再生的材料包含交聯(lián)明膠(以β -TCP海綿為主要成分)并具有許多有給定孔徑的超細孔的基材。因此，該材料使細胞易進入，而發(fā)揮再生支架材料的功能。此外，由于PRP成分靜電結(jié)合到基材表面上并隨基材分解以緩釋方式釋放，其可長時間作用于細胞，由此顯著提高成骨作用。可以通過調(diào)節(jié)明膠交聯(lián)度來控制緩釋速率。也就是說，本發(fā)明的誘導硬組織再生的材料可同時起到再生用支架材料和再生促進劑這兩種作用。
實施例下面參照實施例更詳細說明本發(fā)明，但本發(fā)明不受這些實施例的限定。
實施例I.富血小板血漿(PRP)的制備
通過腹腔內(nèi)注射戊巴比妥(250μυ，將SD大鼠(雄性，8周齡，240-290 g，SHIMIZULaboratory Supplies Co. , Ltd. , Kyoto)全身麻醉,打開胸腔,使用21G針從心臟取血(5CC)。將血液轉(zhuǎn)移到預先裝有A⑶-A溶液(W/V%’ 檸檬酸O. 85，檸檬酸三鈉2. 32，葡萄糖2. 59) (2 CC)的15 cc離心管中。該離心管在離心機(KN-70，KUBOTA CORPORATION制造)中以1500 rpm離心10分鐘。在離心后，用14G SurfIo針吸取上層中的透明血清部分，并轉(zhuǎn)移到另一離心管中并以3000 rpm離心10分鐘。用14G SurfIo針吸取上層中的血清部分，留下200yL，攪拌剩余溶液以得到富血小板血漿(PRP) (200yL)o將切割成2mm立方體的明膠β -TCP海綿(β -TCP-增強明膠海綿MedGel (注冊商標)Scaffold (MedGEL CO.，LTD.)，總共20mg)浸在所得PRP (200 μ L)中并在4°C下靜置整夜。作為對照，將相同量和形狀的明膠β-TCP海綿浸在磷酸鹽緩沖鹽水(下稱PBS，200 μ L)中并在4°C下靜置整夜。2.大鼠脊椎后外側(cè)融合模型
通過腹腔內(nèi)注射戊巴比妥(250yL)，將SD大鼠(雄性，8周齡，240-290 g，SHIMIZULaboratory Supplies Co. , Ltd. , Kyoto)全身麻醉?？v切背中部的皮膚40mm。在中線左右5厘米處，縱切脊椎旁肌肉25mm，并使第四和第五腰椎的橫突(下稱橫突4、5)在兩側(cè)都露出。使用具有 0. 5mm 直徑尖端的鋼條(0SADASUCCESS-40M, 0S-40MV, 0SADA, INC.制造)，、將該橫突的背側(cè)皮質(zhì)骨鉆孔直至證實來自骨髓的出血。在橫突4、5之間移植下示材料，并用3-0尼龍線(公司制造)縫合切開的脊椎旁肌肉與皮膚。要移植的材料是I :PRP浸潰的明膠β -TCP海綿(下稱PRP海綿)，2 =PBS (磷酸鹽緩沖鹽水)浸潰的明膠β -TCP海綿(MedGel(注冊商標)Scaffold (MedGEL CO. , LTD.):下稱PBS海綿)，3 :單獨的PRP，4 :自體髂骨，和無移植組，總共5組。在單獨PRP模型3中，在橫突之間僅噴施200 μ L的PRP。作為4的自體髂骨，以5X2X2 _的尺寸獲取與預定移植位置同側(cè)的髂骨頂端。圖I示意性顯示在大鼠脊椎后外側(cè)融合模型中的橫突4、5之間的移植。3.骨生成的評測和機械強度的評測
在術(shù)后8周，通過戊巴比妥的高劑量給藥，使大鼠安樂死，并分離腰椎。使用μ CT (微焦 2D/3D X-射線 CT 裝置，ScanXmate-E090S40, Comscantiecno Co. , Ltd.制造)，形成橫突4、5的矢狀面重建圖像，并評測橫突之間的愈合的有無。此外，基于所得圖像并使用圖像分析軟件(Comscantecno Co. , Ltd.制造的FanCT verl. 3),僅提取橫突之間的部分并測量骨量。此后，通過3點彎曲試驗機(TOKYO TESTING MACHINE, LSC-200/30-2)進行腰椎的3點彎曲試驗。腰椎在正面朝上的情況下固定在跨距40mm的夾具上，并使用圓柱形夾具(直徑5mm)以10mm/min的速度向第4/5腰椎椎間盤前方加壓。分組比較在移位距離為IOmm時的時間點的載荷。然后，用4%低聚甲醛在4°C下固定組織I周。組織用0. 5M EDTA (乙二胺四乙酸)溶液脫鈣2周并在20%蔗糖中浸泡2天。制備橫突4、5之間的冷凍組織切片(厚度12 μ m)并用蘇木精曙紅和番紅O染色(軟骨基質(zhì)被染紅)。4.結(jié)果
圖2顯示左和右橫突4、5的矢狀切面重建圖像的結(jié)果。發(fā)現(xiàn)PRP海綿模型和自體髂骨模型表現(xiàn)出左和右橫突之間的愈合趨勢。此外，PRP海綿模型與自體髂骨模型相比表現(xiàn)出橫突前后徑的顯著增大。PBS海綿、單獨PRP和無移植模型沒有表現(xiàn)出橫突之間的增大并且沒有發(fā)現(xiàn)骨愈合趨勢。圖3顯示橫突4、5之間的骨量。PRP海綿模型與其它模型相比表現(xiàn)出骨量的顯著增大。圖4顯示3點彎曲試驗的結(jié)果。PRP海綿模型與其它組相比表現(xiàn)出平均59. 6倍的強度。圖5顯示PRP海綿模型的橫突4、5之間的組織圖像。在圖像中，在橫突之間，骨基質(zhì)和透明軟骨成分混合在一起，觀察到類似于軟骨內(nèi)骨化的現(xiàn)象。通過番紅O染色，透明軟骨周圍的一部分表現(xiàn)出紅色染色圖像，證實其是軟骨基質(zhì)。為了比較，顯示無移植組的橫突4、5之間的組織圖像(術(shù)后8周)。如圖5中所示，觀察到橫突之間的韌帶成分，但沒有觀察到骨和軟骨成分。5.結(jié)論
由上述結(jié)果證實，PRP和明膠β -TCP海綿的組合實現(xiàn)超過自體骨移植的極高的骨或軟骨生成能力，顯著加強骨愈合部位的機械強度。參考例.明膠β-TCP海綿的制造 作為明膠，使用Nitta Gelatin Inc.制造的酸處理產(chǎn)品(酸處理明膠)。作為β-TCP，使用 β-TCP-100(粉碎品，Taihei Chemical Industrial Co. , Ltd.)。也可以使用 OSferion。將該酸處理的明膠溶解在蒸餾水中以產(chǎn)生3重量％明膠水溶液。向所得明膠水溶液(60mL)中加入β -TCP (I. 8克)并加入O. 16重量％戊二醛水溶液(O. 4mL),該混合物在均質(zhì)器中在5000 rpm下攪拌3分鐘以便發(fā)泡。將該發(fā)泡的明膠β -TCP水溶液澆鑄在12cmX12 cm模具中，在4°C下靜置12小時以進行交聯(lián)反應，此后將該溶液在_40°C下冷凍并凍干而獲得海綿。所得海綿用O. IN甘氨酸水溶液進行3次I小時洗滌，進一步用水洗滌，再凍干而得到明膠β-TCP海綿。本說明書中引用的所有出版物、專利和專利申請全文經(jīng)此引用并入本文。產(chǎn)業(yè)適用性
本發(fā)明中所用的富血小板血漿不需要特殊設施和設備，因為其可通過被施以誘導硬組織再生的材料的對象的自身血的離心而提純。因此，可以在許多設施中實施本發(fā)明。此外，由于使用來源于自身血的富血小板血漿，與基因重組生長因子相比，副作用的可能性極低。此外，由于明膠β -TCP海綿僅包含臨床用材料并對人體具有高安全性，因而本發(fā)明的誘導硬組織再生的材料預計極快投入臨床使用。本發(fā)明的普及顯著降低以往通常進行的收集自體骨的需要，并且成骨促進作用可實現(xiàn)早期負載和早期康復。因此，其益處無法估量。
權(quán)利要求
1.誘導硬組織再生的材料，包含富血小板血漿和明膠β-TCP海綿。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的材料，其中硬組織是骨或軟骨組織。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2的材料，其促進骨生成或軟骨生成。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2的材料，其促進血管生成。
5.根據(jù)權(quán)利要求I至4任一項的材料，其中富血小板血漿來自要被施以誘導硬組織再生的材料的對象。
6.根據(jù)權(quán)利要求I至5任一項的材料，其中明膠β-TCP海綿具有10-500 μ m的孔徑。
7.根據(jù)權(quán)利要求I至6任一項的材料，其中明膠β-TCP海綿中的明膠是交聯(lián)的。
8.根據(jù)權(quán)利要求I至7任一項的材料，其中明膠β-TCP海綿是通過交聯(lián)和凍干包含β -TCP和明膠的組合物來制備的。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含富血小板血漿和明膠β-TCP海綿的誘導硬組織再生的材料，其促進血管生成、骨生成、軟骨生成等。
文檔編號A61L27/00GK102665775SQ20108004715
公開日2012年9月12日 申請日期2010年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月20日
發(fā)明者岡本慎一, 田畑泰彥 申請人:日東電工株式會社