專(zhuān)利名稱(chēng)：抗原多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗原多肽、包含所述多肽的疫苗和所述疫苗在保護(hù)受試者免受微生物感染中的用途。
背景技術(shù)：
疫苗保護(hù)免受許多感染性疾病的侵害。許多疫苗通過(guò)滅活或減毒的病原體產(chǎn)生， 所述病原體可被注射進(jìn)入受試者。經(jīng)免疫的受試者通過(guò)產(chǎn)生體液(例如抗體)和細(xì)胞(例如細(xì)胞毒性T細(xì)胞)反應(yīng)來(lái)作出反應(yīng)。例如，某些流感疫苗通過(guò)利用使用甲醛的化學(xué)處理滅活病毒來(lái)進(jìn)行制備。對(duì)于許多病原體，化學(xué)或熱滅活(雖然其可產(chǎn)生賦予保護(hù)性免疫的疫苗免疫原)也產(chǎn)生副作用例如發(fā)熱和注射部位反應(yīng)。在細(xì)菌的情況下，滅活的生物體傾向于具有如此高的毒性以至于副作用限制了此類(lèi)粗制疫苗免疫原(例如細(xì)胞百日咳菌苗 (pertussis vaccine))的應(yīng)用，從而疫苗的開(kāi)發(fā)已落后于藥物開(kāi)發(fā)。此外，使用完整細(xì)胞滅活的生物體的有效疫苗開(kāi)發(fā)受到表位遮蔽(印itope masking)、免疫顯性、低抗原濃度和抗原冗余(antigen redundancy)的問(wèn)題困擾。這是不幸的，因?yàn)槟壳暗目股刂委煬F(xiàn)因抗藥性細(xì)菌的出現(xiàn)而受到偏見(jiàn)。因此，許多現(xiàn)代疫苗從病原體的保護(hù)性抗原(通過(guò)分子克隆分離的和從產(chǎn)生副作用的材料純化的)制得。這類(lèi)后一種疫苗稱(chēng)為‘亞單位疫苗’。亞單位疫苗的開(kāi)發(fā)在近年來(lái)已成為許多研究的焦點(diǎn)。新型病原體的出現(xiàn)和抗生素抗藥性的增加已產(chǎn)生了對(duì)開(kāi)發(fā)新型疫苗和鑒定在亞單位疫苗的開(kāi)發(fā)中是有用的其他候選分子的需要。同樣地，從基因組和蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)新型疫苗抗原將使得能夠開(kāi)發(fā)新型亞單位疫苗候選者(特別是抗細(xì)菌病原體的)。然而，雖然亞單位疫苗傾向于避免被殺死的或減毒的病原體疫苗的副作用，但它們的“純的”狀態(tài)意味著亞單位疫苗并非總是具有足夠的免疫原性來(lái)賦予保護(hù)作用。已產(chǎn)生對(duì)抗生素的抗性的病原生物的實(shí)例金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。金黃色葡萄球菌是其正常生長(zhǎng)環(huán)境是約20_40%的正常健康人的鼻的上皮內(nèi)層 (epithelial lining)的細(xì)菌，其也通常見(jiàn)于人的皮膚，通常不引起傷害。然而，在某些情況下，特別是當(dāng)皮膚損傷時(shí)，該病原體可引起感染。這在醫(yī)院中是個(gè)具體問(wèn)題，其中患者可能已進(jìn)行外科手術(shù)和/或正在服用免疫抑制藥。這些患者因它們已接受的治療而更容易遭受金黃色葡萄球菌感染。由于抗金黃色葡萄球菌抗生素被廣泛用于控制微生物感染，因此金黃色葡萄球菌的抗抗生素菌株已出現(xiàn)?？辜籽跷髁志攴浅Ｆ毡椴⑶疫@些抗性菌株中有許多也抗幾種其他抗生素。目前還沒(méi)有針對(duì)金黃色葡萄球菌的有效接種方法。因此金黃色葡萄球菌是主要的人病原體，其能夠引起許多疾病，其中一些疾病是威脅生命的疾病，包括敗血病、心內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎和中毒性休克。該能力通過(guò)生物體的多樣性和其參與毒性的組分庫(kù)(arsenal of component)來(lái)確定。在感染開(kāi)始時(shí)，和隨著其進(jìn)展，生物體的需要和環(huán)境改變，這反映在金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的毒力決定簇的相應(yīng)改變。在感染開(kāi)始時(shí)，對(duì)于病原體重要的是附著于宿主組織，這樣才能產(chǎn)生一大套細(xì)胞表面相關(guān)附著蛋白(cell surface associated attachment protein)。病原體還具有通過(guò)產(chǎn)生因子逃避宿主防御的能力，所述因子可減少吞噬作用或干擾細(xì)胞被循環(huán)抗體識(shí)別的能力。通常感染的病灶發(fā)展為膿腫并且生物體的數(shù)量增加。金黃色葡萄球菌具有通過(guò)產(chǎn)生群感效應(yīng)肽 (quorum sensing peptide)監(jiān)控其自己的細(xì)胞密度的能力。該肽的積累(與通過(guò)開(kāi)始饑餓細(xì)胞造成的生理變化相關(guān))在毒力決定簇的產(chǎn)生上引發(fā)從粘附素(adhesin)至參與侵襲和組織穿透的成分的轉(zhuǎn)換。

發(fā)明內(nèi)容
本公開(kāi)內(nèi)容涉及從革蘭陽(yáng)性細(xì)菌金黃色葡萄球菌(S. aureus)分離和表征的抗原多肽DivIB的鑒定。DivIB是膜內(nèi)在蛋白質(zhì)，其包含細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域[氨基酸1-171]和膜間結(jié)構(gòu)域[氨基酸172-192]以及細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域[氨基酸193-439]。這在圖1中進(jìn)行了示意性舉例說(shuō)明。已顯示DivIB和其片段提供了免受金黃色葡萄球菌攻擊的保護(hù)作用并且代表了新型疫苗候選者。革蘭陰性細(xì)菌中的DivIB同源物稱(chēng)為FtsQ。根據(jù)本發(fā)明的方面，提供了選自下列多肽的多肽i)由圖2a、3a或4a中所示的核苷酸序列編碼的多肽或其抗原片段；ii)由核苷酸序列編碼的多肽，其中所述序列由于遺傳密碼而與(i)中定義的核苷酸序列簡(jiǎn)并；iii)包含氨基酸序列的多肽，其中通過(guò)至少一個(gè)氨基酸殘基的添加、缺失或替代來(lái)修飾所述序列，如圖2b、3b或4b中所示，其中所述多肽用作疫苗。經(jīng)修飾的多肽或變異多肽在氨基酸序列方面的不同在于可以通過(guò)可存在于任何組合的一個(gè)或多個(gè)替代、添加、缺失、截短。其中優(yōu)選變體是與參照多肽不同在于保守氨基酸替代的那些變體。此類(lèi)替代是用另一個(gè)具有相似特征的氨基酸替代給定氨基酸的那些替代。氨基酸的下列非限定性列表被認(rèn)為是保守替代(相似)a)丙氨酸、絲氨酸和蘇氨酸； b)谷氨酸和天冬氨酸；c)天冬酰胺和谷氨酰胺；d)精氨酸和賴(lài)氨酸；e)異亮氨酸、亮氨酸、 甲硫氨酸和纈氨酸以及f)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。最優(yōu)選的是保持或增強(qiáng)與其所源自的參照多肽相同的生物功能和活性的變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，變異多肽與本文中舉例說(shuō)明的全長(zhǎng)氨基酸序列具有至少85% 的同一性，更優(yōu)選至少90%的同一性，更優(yōu)選至少95%的同一性，仍然更優(yōu)選至少97%的同一性和最優(yōu)選至少99%的同一性。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多肽由圖2a中所示的核苷酸序列編碼。在本發(fā)明的可選擇的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多肽由圖2b中的氨基酸序列或其抗原性部分表示。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多肽由圖3a中所示的核苷酸序列編碼。在本發(fā)明的可選擇的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多肽由圖3b中的氨基酸序列或其抗原性部分表示。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多肽由圖4a中所示的核苷酸序列編碼。在本發(fā)明的可選擇的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多肽由圖4b中的氨基酸序列或其抗原性部分表示。根據(jù)本發(fā)明的其他方面，提供了編碼用作疫苗的根據(jù)本發(fā)明的多肽的核酸分子。
根據(jù)本發(fā)明的其他方面，提供了用于抗微生物感染而接種的疫苗組合物，其包含選自下列多肽的多肽i)由圖2a、3a或4a中所示的核苷酸序列編碼的多肽或其抗原片段；ii)由核苷酸序列編碼的多肽，其中所述序列由于遺傳密碼而與(i)中定義的核苷酸序列簡(jiǎn)并；iii)包含氨基酸序列的多肽，其中通過(guò)至少一個(gè)氨基酸殘基的添加、缺失或替代來(lái)修飾所述序列，如圖2b、3b或4b中所示；其中所述組合物任選地包含佐劑和/或載體。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述組合物包含佐劑和/或載體。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述佐劑選自選自GMCSF、干擾素、、干擾素α、干擾素β、白細(xì)胞介素12、白細(xì)胞介素23、白細(xì)胞介素17、白細(xì)胞介素2、白細(xì)胞介素1、TGF、 TNFa和TNF β的細(xì)胞因子。在本發(fā)明的其他可選擇的實(shí)施方案中，所述佐劑為T(mén)LR激動(dòng)劑例如CpG寡核苷酸、 鞭毛蛋白、單磷酰脂質(zhì)Α、聚肌胞(poly I :C)及其衍生物。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述佐劑為細(xì)菌細(xì)胞壁衍生物例如胞壁酰二肽 (MDP)和 / 或海藻糖 dicorynomycolate (TDM)。佐劑是通過(guò)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活性增強(qiáng)對(duì)抗原的特異性免疫反應(yīng)的物質(zhì)或方法。佐劑的實(shí)例包括(僅通過(guò)舉例)針對(duì)共刺激分子的激動(dòng)性抗體、弗氏佐劑、胞壁酰二肽、脂質(zhì)體。因此佐劑是免疫調(diào)節(jié)劑。載體是免疫原性分子，當(dāng)其與第二分子結(jié)合時(shí)，增強(qiáng)對(duì)后者的免疫反應(yīng)。以下列方式解釋術(shù)語(yǔ)載體。載體是當(dāng)與第二分子結(jié)合時(shí)增強(qiáng)對(duì)后者的免疫反應(yīng)的免疫原性分子。某些抗原本質(zhì)上不具有免疫原性，然而當(dāng)與外源蛋白質(zhì)分子例如鑰孔血藍(lán)蛋白(keyhole-limpet haemocyanin)或破傷風(fēng)類(lèi)毒素結(jié)合時(shí)可以能夠產(chǎn)生抗體反應(yīng)。此類(lèi)抗原包含B細(xì)胞表位但無(wú)T細(xì)胞表位。這樣的綴合物的蛋白質(zhì)部分(所述“載體”蛋白) 提供了刺激輔助T細(xì)胞的T細(xì)胞表位，這轉(zhuǎn)而刺激抗原特異性B細(xì)胞分化成漿細(xì)胞，并且產(chǎn)生抗所述抗原的抗體。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述微生物感染是由選自下列的細(xì)菌種類(lèi)引起的葡萄球菌(Staphylococcus spp)、糞腸球菌(Enterococcus faecalis)、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、B 方矣鏈球菌(Streptococcus group B)、月市炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、幽門(mén)螺桿菌(Helicobacter pylori)、淋病奈瑟球菌 (Neisseria gonorrhoea)、A方矣鏈球菌(Streptococcus group A)、伯氏疏螺方寵體(Borrelia burgdorferi)、粗球孢子菌(Coccidiodes immitis)、莢膜組織胞菜菌(Histoplasma capsulatum)、愛(ài)氏克雷伯氏菌(Klebsiella edwardii)、B型腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis type B)、奇異變形桿菌(Proteus mirabilis)、弗氏志賀菌(Shigella flexneri)、大腸桿菌(Escherichia coli)、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae) > 沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)、肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae)、鸚鵡熱衣原體(Chlamydia psittaci)、土拉熱弗朗西絲菌(Francisella tularensis)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、鼠疫耶爾森菌(Yersinia pestis)、鼻疽伯克霍爾德氏菌 (Burkholderia mallei)或類(lèi)鼻疽伯克霍爾德氏菌(B. pseudomallei)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述細(xì)菌種類(lèi)選自表皮葡萄球菌(S. epidermidis)、金黃色葡萄球菌、人葡萄球菌(S. hominis)溶血葡萄球菌 (S. haemolyticus)、沃氏葡萄球菌(S. warneri)、頭狀葡萄球菌(S. capitis)、解糖葡萄球菌(S. saccharolyticus)、耳葡萄球菌(S. auricularis)、模仿葡萄球菌(S. simulans)、腐生葡萄球菌(S. saprophyticus)、孔氏葡萄球菌(S. cohnii)、木糖葡萄球菌(S. xylosus)、 豬葡萄球菌(S.hyicus)、山羊葡萄球菌(S. caprae)、雞葡萄球菌(S. gallinarum)、中間葡萄球菌(S. intermedius)。在本發(fā)明的其他優(yōu)選實(shí)施方案中，所述葡萄球菌屬細(xì)胞為金黃色葡萄球菌或表皮葡萄球菌。本發(fā)明的疫苗組合物可通過(guò)任何常規(guī)途徑來(lái)施用，包括注射、鼻內(nèi)噴霧(通過(guò)例如氣溶膠或滴鼻劑的吸入)。施用可以是例如靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、腔內(nèi)、皮下或皮內(nèi)1施用。以有效量施用本發(fā)明的疫苗組合物?！坝行Я俊笔菃为?dú)或與其他劑量一起產(chǎn)生期望反應(yīng)的疫苗組合物的量。在治療特定細(xì)菌性疾病的情況下，期望的反應(yīng)是當(dāng)被傳染源攻擊時(shí)提供保護(hù)作用。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述疫苗組合物適于以鼻腔噴霧的形式施用。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述疫苗組合物提供于吸入器中并且以氣溶膠形式遞送。疫苗的量當(dāng)然將取決于個(gè)體患者參數(shù)，包括年齡、身體健康狀況、身材大小和體重、治療持續(xù)時(shí)間、當(dāng)前治療的性質(zhì)(如果存在的話)、具體的施用途徑以及在保健人員的知識(shí)和專(zhuān)家經(jīng)驗(yàn)內(nèi)的類(lèi)似因素。這些因素對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是公知的并且僅用常規(guī)實(shí)驗(yàn)即可闡明。通常優(yōu)選的是，使用足以激發(fā)免疫的最大劑量的單種組分或其組合；即，根據(jù)可靠的醫(yī)學(xué)判斷的最高安全劑量。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，患者可因醫(yī)學(xué)原因、心理原因或因?qū)嶋H上任何其他原因支持更低劑量或可耐受劑量。可根據(jù)不同參數(shù)，特別是根據(jù)所使用的施用模式和受試者的狀態(tài)來(lái)選擇給受試者施用的疫苗劑量。在受試者的反應(yīng)在所施用的初始劑量上不足的情況下，可使用更高的劑量(或通過(guò)不同的更局部的遞送途徑產(chǎn)生的實(shí)際上更高的劑量)，達(dá)到患者的耐受力所允許的程度。一般而言，按照本領(lǐng)域任何標(biāo)準(zhǔn)方法以有效免疫的劑量配制和施用疫苗的劑量。 用于施用疫苗組合物的其他方案對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的，其中劑量、注射時(shí)間安排、注射部位、施用模式等與上述的不同。在與上述條件大體上相同的條件下給除了人之外的哺乳動(dòng)物施用疫苗組合物(例如為了測(cè)試目的或獸醫(yī)學(xué)治療目的)。本文中所使用的受試者是哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人，并且包括非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物、牛、馬、豬、綿羊或山羊。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，提供了根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物，其包含至少一種額外的抗菌劑。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述試劑是第二種不同的疫苗和/或免疫原性試劑 (例如細(xì)菌多肽和/或多糖抗原)。根據(jù)本發(fā)明的其他方面，提供了本文中描述的用于治療微生物感染或因微生物感染而引起的病況的多肽。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述微生物感染是葡萄球菌性感染。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，因微生物感染引起的所述病況選自結(jié)核病、細(xì)菌相關(guān)食物中毒、血液感染、腹膜炎、心內(nèi)膜炎、骨髓炎、敗血病、皮膚病、髓膜炎(meningitis)、 肺炎、胃潰瘍、淋病、膿毒性咽喉炎、鏈球菌相關(guān)中毒性休克、壞死性筋膜炎、膿皰病、組織胞漿菌病、萊姆病、胃腸炎、痢疾、志賀菌病(Shigellosis)和關(guān)節(jié)炎。根據(jù)本發(fā)明的其它方面，提供了免疫受試者的方法，包括用有效量的根據(jù)本發(fā)明的多肽、核酸分子或疫苗組合物接種所述受試者。在本發(fā)明的優(yōu)選方法中，所述受試者是人。在本發(fā)明的可選擇的優(yōu)選方法中，所述受試者是動(dòng)物，優(yōu)選家畜動(dòng)物，例如牛。在本發(fā)明的優(yōu)選方法中，給所述家畜動(dòng)物接種抗由葡萄球菌屬細(xì)菌細(xì)胞引起的細(xì)菌性乳腺炎的疫苗。在本發(fā)明的優(yōu)選方法中，所述家畜動(dòng)物是羊類(lèi)(caprine)動(dòng)物(例如綿羊、山羊)。在本發(fā)明的優(yōu)選方法中，所述家畜動(dòng)物是牛類(lèi)動(dòng)物(例如，奶牛)。葡萄球菌性乳腺炎是影響家畜的嚴(yán)重病況并且在通過(guò)施用抗生素來(lái)控制疾病方面和在損失奶產(chǎn)量方面可造成相當(dāng)大的開(kāi)支。根據(jù)本發(fā)明的疫苗提供了對(duì)細(xì)菌性(特別是葡萄球菌性)乳腺炎的成本效益高的控制。在本說(shuō)明書(shū)的整個(gè)描述和權(quán)利要求中，詞匯“包括”和“包含”以及所述詞匯的變型例如“含有”和“包括”意指“包括但不限于”，并且無(wú)意(和不)排除其他部分、添加物、
組分、整數(shù)或步驟。在本說(shuō)明書(shū)的整個(gè)描述和權(quán)利要求中，除非上下文另外要求，否則單數(shù)包括復(fù)數(shù)形式。特別地，當(dāng)使用不定冠詞時(shí)，除非上下文另有要求，否則說(shuō)明書(shū)應(yīng)被理解為包括復(fù)數(shù)以及單數(shù)。與本發(fā)明的特定方面、實(shí)施方案或?qū)嵤├Y(jié)合起來(lái)描述的特性、整數(shù)、特征、化合物、化學(xué)部分或基團(tuán)應(yīng)被理解為除非與其不相容，否則適用于本文中描述的任何其他方面、 實(shí)施方案或?qū)嵤├?br>

現(xiàn)僅通過(guò)舉例和參考下列附圖來(lái)描述本發(fā)明的實(shí)施方案圖IDivIB蛋白被預(yù)測(cè)為具有指定的主要模型拓?fù)浞植嫉哪さ鞍?。所述蛋白的N末端(氨基酸1至171)位于細(xì)胞內(nèi)，然而所述蛋白的C末端(氨基酸193至439)暴露于膜的外部；預(yù)測(cè)的金黃色葡萄球菌DivIB的外部分(氨基酸193至439)對(duì)應(yīng)于稱(chēng)為DivIB-I 的片段；圖2a舉例說(shuō)明來(lái)自金黃色葡萄球菌8325的全長(zhǎng)DivIB核苷酸序列；圖2b舉例說(shuō)明來(lái)自金黃色葡萄球菌8325的氨基酸序列，該序列對(duì)應(yīng)于GeneBank ID號(hào)ABD30258. 1 ；圖3a舉例說(shuō)明包括氨基酸193至439的金黃色葡萄球菌DivIB的膜外片段 (DiviB-I)的核苷酸序列，圖3b舉例說(shuō)明其氨基酸序列；圖4a舉例說(shuō)明DivIB-2的核苷酸序列，圖4b舉例說(shuō)明其氨基酸序列；和圖5和圖6舉例說(shuō)明由DivIB-2接種賦予的抗感染保護(hù)作用。
具體實(shí)施例方式方法和材料
用于在大腸桿菌中過(guò)表達(dá)來(lái)自金屬色葡萄球菌的DivIB-I片段的質(zhì)粒的構(gòu)建使用引物5，GLUSh341C和3，GLUSh341C (分別對(duì)應(yīng)于序列引物1和引物2)禾口下列PCR反應(yīng)條件從菌株金黃色葡萄菌SH1000 (Horsburgh MJ, Aish JL, White IJ, Shaw L, Lithgow JK, Foster SJ :sigmaB modulates virulence determinant expression and stress resistance characterization of a functional rsbU strain derived from Staphylococcus aureus 8325-4. J Bacteriol 2002，184 :5457_5467)的染色體 PCR 擴(kuò)增片段DivIB-I 1個(gè)起始變性循環(huán)94°C下進(jìn)行4分鐘；30個(gè)擴(kuò)增循環(huán)在94°C下變性30 秒，在45°C下退火30秒以及在72°C下延伸2. 5秒；最后，使持續(xù)擴(kuò)增輪在72°C下進(jìn)行4 分鐘來(lái)完成。分別在引物5，GLUSh341C和3，GLUSh341C內(nèi)工程化兩個(gè)限制位點(diǎn)NcoI和 XhoI (序列中加下劃線的)。將用NcoI和XhoI消化的片段DivIB-I克隆進(jìn)入來(lái)自Novagen 的pET-21d(+) (Cat. No. 69743-3)的NcoI和XhoI位點(diǎn)，導(dǎo)致稱(chēng)為pGL601的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，從而產(chǎn)生DivIB-I片段的6xHis標(biāo)記的形式。將后者轉(zhuǎn)移進(jìn)入大腸桿菌BL21以過(guò)表達(dá)所述重組蛋白片段。引物 1(5，GLUSh341C)ATAATACCATGGCTCCACTTAGTAAAATTGCGCATG引物 2(3，GLUSh341C)ATAATACTCGAGATTATTCTTACTTGATTGTTTG將上文所示的PCR擴(kuò)增片段在NcoI和XhoI位點(diǎn)克隆進(jìn)入受體pET21d (+)受體質(zhì)粒載體使得在DivIB-I序列的上游添加了兩個(gè)氨基酸(甲硫氨酸和丙氨酸)和在DivIB-I 序列的下游添加了 8個(gè)氨基酸(亮氨酸、谷氨酸和6個(gè)組氨酸)。該整個(gè)區(qū)域包括待從ATG 翻譯起始密碼子至TGA翻譯終止密碼子(在序列內(nèi)以粗體標(biāo)示的)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)片段，其被稱(chēng)為DivIB-2。DivIB-2的DNA(圖4a)和蛋白質(zhì)(圖4b)序列示于下面并且DivIB-I片段的增補(bǔ)核苷酸以下劃線標(biāo)示。實(shí)施例利用DivIB-2的接種保護(hù)Balb/C小鼠免受金黃色葡萄球菌感染在每一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，按照下列方案用DivIB-2接種一組10只6至12周齡的雌性 Balb/C。用100微升由50微克在50微升無(wú)內(nèi)毒素PBS (磷酸鹽緩沖液pH 7. 4)中的重組 DivIB-2 (約98%的純度)和50微升完全弗氏佐劑的混合物組成的溶液使每一只動(dòng)物接觸抗原。兩周后，用100微升由50微克在50微升無(wú)內(nèi)毒素PBS中的重組DivIB-2 (約98%的純度)和50微升不完全弗氏佐劑的混合物組成的溶液對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫加強(qiáng)。1周后，動(dòng)物接受相同的加強(qiáng)。在每一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，除了所述混合物包含商購(gòu)可得的KLH蛋白(鑰孔血藍(lán)蛋白)而非DivIB-2重組蛋白外，按照相同的方案處理對(duì)照組的10只動(dòng)物。在動(dòng)物的頸后部皮內(nèi)進(jìn)行接觸抗原和加強(qiáng)注射。第二次免疫加強(qiáng)后1周，通過(guò)靜脈內(nèi)(尾靜脈)注射100微升無(wú)內(nèi)毒素PBS(其含有1. IX IO7 (士0. 3 X IO7)個(gè)金黃色葡萄球菌菌株Newman的細(xì)胞)來(lái)感染每一只動(dòng)物。從在心腦浸液培養(yǎng)基(BHI)中生長(zhǎng)至早期靜止期的培養(yǎng)物制備后者，隨后用相同體積的PBS 將其洗滌3次。10至14天后，按照方案1頸椎脫位術(shù)處死動(dòng)物。在無(wú)菌條件下從每一只動(dòng)物取出成對(duì)的腎，將其在無(wú)菌PBS中勻漿化。在PBS中進(jìn)行腎勻漿物的系列稀釋?zhuān)瑢⑵渫坎荚贐HI瓊脂平板上。計(jì)數(shù)包含10至150個(gè)葡萄球菌菌落的平板，并且校正稀釋度。從平板上菌落形成單位(CFU)的數(shù)目推知腎中的活細(xì)胞數(shù)目。根據(jù)利用KLH接種的動(dòng)物的腎中金黃色葡萄球菌細(xì)胞的數(shù)目與利用DivIB-2接種的動(dòng)物的腎中金黃色葡萄球菌細(xì)胞的數(shù)目的差異來(lái)測(cè)定通過(guò)用DivIB-2接種所賦予的可能的抗感染保護(hù)作用的評(píng)估。使用Marm-Whitney 檢驗(yàn)計(jì)算差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。從與DivIB-2接種的動(dòng)物相比較KLH接種的動(dòng)物中顯著更多的(ρ < 0. 05)數(shù)量的金黃色葡萄球菌得出保護(hù)作用的結(jié)論。 上述的舉例說(shuō)明通過(guò)DivIB-2接種所賦予的抗感染的保護(hù)作用的的實(shí)驗(yàn)實(shí)例示于圖5和圖6中。顯示了每一組的平均值和對(duì)照與所接種的組之間的統(tǒng)計(jì)上顯著的差異。
權(quán)利要求
1.一種多肽，其選自i)由圖2a、3a或4a所示的核苷酸序列編碼的多肽或其抗原片段； )由核苷酸序列編碼的多肽，其中所述序列由于遺傳密碼而與(i)中定義的核苷酸序列簡(jiǎn)并；iii)包含氨基酸序列的多肽，其中通過(guò)至少一個(gè)氨基酸殘基的添加、缺失或替代來(lái)修飾所述序列，如圖2b、3b或4b中所示，其中所述多肽用作疫苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其中所述多肽由圖2a中所示的核苷酸序列編碼。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其中所述多肽由圖2b中的氨基酸序列或其抗原性部分表不。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其中所述多肽由圖3a中所示的核苷酸序列編碼。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其中所述多肽由圖3b中的氨基酸序列或其抗原性部分表不。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其中所述多肽由圖4a中所示的核苷酸序列編碼。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其中所述多肽由圖4b中的氨基酸序列或其抗原性部分表不。
8.—種核酸分子，其編碼用作疫苗的根據(jù)權(quán)利要求1-7的任一項(xiàng)所述的多肽。
9.一種用于抗微生物感染而接種的疫苗組合物，其包含選自下列多肽的多肽 i)由圖2a、3a或4a中所示的核苷酸序列編碼的多肽或其抗原片段； )由核苷酸序列編碼的多肽，其中所述序列由于遺傳密碼而與(i)中定義的核苷酸序列簡(jiǎn)并；iii)包含氨基酸序列的多肽，其中通過(guò)至少一個(gè)氨基酸殘基的添加、缺失或替代來(lái)修飾所述序列，如圖2b、3b或4b中所示；其中所述組合物任選地包含佐劑和/或載體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的疫苗組合物，其中所述組合物包含佐劑和/或載體。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或11所述的疫苗組合物，其中所述微生物感染由細(xì)菌種類(lèi)引起， 所述細(xì)菌種類(lèi)選自葡萄球菌、糞腸球菌、結(jié)核分枝桿菌、B族鏈球菌、肺炎鏈球菌、幽門(mén)螺桿菌、淋病奈瑟球菌、A族鏈球菌、伯氏疏螺旋體、粗球孢子菌、莢膜組織胞漿菌、愛(ài)氏克雷伯氏菌、B型腦膜炎奈瑟球菌、奇異變形桿菌、弗氏志賀菌、大腸桿菌、流感嗜血桿菌、沙眼衣原體、肺炎衣原體、鸚鵡熱衣原體、土拉熱弗朗西絲菌、銅綠假單胞菌、炭疽芽孢桿菌、肉毒梭菌、鼠疫耶爾森菌、鼻疽伯克霍爾德氏菌或類(lèi)鼻疽伯克霍爾德氏菌。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的疫苗組合物，其中所述細(xì)菌種類(lèi)選自表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、人葡萄球菌、溶血葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、頭狀葡萄球菌、解糖葡萄球菌、耳葡萄球菌、模仿葡萄球菌、腐生葡萄球菌、孔氏葡萄球菌、木糖葡萄球菌、豬葡萄球菌、山羊葡萄球菌、雞葡萄球菌、中間葡萄球菌。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的疫苗組合物，其中所述葡萄球菌屬細(xì)胞是金黃色葡萄球菌或表皮葡萄球菌。
14.根據(jù)權(quán)利要求11-13的任一項(xiàng)所述的疫苗組合物，其中所述疫苗組合物適于以鼻腔噴霧的形式施用。
15.根據(jù)權(quán)利要求11-14的任一項(xiàng)所述的疫苗組合物，其中所述組合物包含至少一種額外的抗菌劑。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的疫苗組合物，其中所述試劑是第二種不同的疫苗和/或免疫原性試劑。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-7的任一項(xiàng)所述的多肽，其用于治療微生物感染或因微生物感染而引起的病況。
18.根據(jù)權(quán)利要求8所述的核酸分子，其用于治療微生物感染或因微生物感染而引起的病況。
19.根據(jù)權(quán)利要求17或18所述的用途，其中所述微生物感染是葡萄球菌感染。
20.根據(jù)權(quán)利要求17或18所述的用途，其中因微生物感染而引起的所述病況選自結(jié)核病、細(xì)菌相關(guān)食物中毒、血液感染、腹膜炎、心內(nèi)膜炎、骨髓炎、敗血病、皮膚病、髓膜炎、肺炎、胃潰瘍、淋病、膿毒性咽喉炎、鏈球菌相關(guān)中毒性休克、壞死性筋膜炎、膿皰病、組織胞漿菌病、萊姆病、胃腸炎、痢疾、志賀菌病和關(guān)節(jié)炎。
21.一種免疫受試者的方法，其包括用有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-16的任一項(xiàng)所述的多肽、核酸或疫苗組合物接種所述受試者。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述受試者為人。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述受試者為家畜動(dòng)物。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中給所述家畜接種抗由葡萄球菌屬細(xì)菌細(xì)胞引起的細(xì)菌性乳腺炎的疫苗。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述家畜為羊類(lèi)動(dòng)物。
26.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述家畜為牛類(lèi)動(dòng)物。
全文摘要
本發(fā)明涉及稱(chēng)為DivIB的抗原多肽及其變體、包含所述多肽的疫苗和所述疫苗在保護(hù)受試者免受微生物感染中的用途。
文檔編號(hào)A61K39/085GK102481353SQ201080039459
公開(kāi)日2012年5月30日 申請(qǐng)日期2010年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月9日
發(fā)明者J·加西亞拉臘, S·福斯特 申請(qǐng)人:阿博森斯生物制劑公司