專利名稱：利用植物細(xì)胞分泌性生產(chǎn)具有人型糖鏈的糖蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用植物細(xì)胞分泌性生產(chǎn)具有人型糖鏈的異源糖蛋白的方法、能夠分泌該糖蛋白的植物細(xì)胞和由該植物細(xì)胞所分泌的具有人型糖鏈的糖蛋白。
背景技術(shù)：
正在進(jìn)行用植物培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生外源蛋白質(zhì)。例如，正嘗試用煙草培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生對人有用的下列蛋白質(zhì)GM-CSF(見E.A.James，C.Wang，Z.Wang，R.Reeves，J.H.Shin，N.S.Magnuson和J.M.Lee，由遺傳修飾植物細(xì)胞所分泌的具有生物活性的人GM-CSF的產(chǎn)生和表征(Production andCharacterization of Biologically Active Human GM-CSFSecreted by Genetically Modified Plant Cells)，Protein Expr.Purif.，19，131-138(2000))、IL-2和IL-4(見N.S.Magnuson，P.M.Linzmaier，R.Reeves，G.An，K.HayGlass和J.M.Lee，從懸浮培養(yǎng)物內(nèi)的遺傳修飾煙草細(xì)胞中分泌具有生物活性的人白細(xì)胞介素-2和白細(xì)胞介素-4(Secretion of Biologically ActiveHuman Interleukin-2 and Interleukin-4 from GeneticallyModified Tobacco Cells in Suspension Culture)，Protein Expr.Purif.，13，45-52(1998))、免疫球蛋白(見N.S.Magnuson，P.M.Linzmaier，J.W.Gao，R.Reeves，G.An和J.M.Lee，從遺傳修飾煙草細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)物中提高回收分泌的哺乳動物蛋白質(zhì)(Enhanced Recovery of a Secreted Mammalian Protein fromSuspension Culture of Genetically Modified Tobacco Cells)，Protein Expr.Purif.，7，220-228(1996))、促紅細(xì)胞生成素(見S.Matsumoto，A.Ishii，K.Ikura，M.Ueda和R.Sasaki，培養(yǎng)煙草細(xì)胞中人促紅細(xì)胞生成素的表達(dá)(Expression of HumanErythropoietin in Cultured Tobacco Cells)，Biosci.Biotechnol.Biochem.，57，1249-1252(1993))和α1-抗胰蛋白酶(見M.Terashima，Y.Murai，M.Kawamura，S.Nakanishi，T.Stoltz，L.Chen，W.Drohan，R.L.Rodriguez和S.Katoh，通過植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生功能性人α1-抗胰蛋白酶(Production ofFunctional Human α1-Antitrypsin by Plant Cell Culture)，Appl.Microbiol.Biotechnol.，52，516-523(1999))。
另一方面，報道了植物培養(yǎng)細(xì)胞可分泌許多蛋白質(zhì)或糖蛋白(見A.Sturm，在兩種分泌型胡蘿卜糖蛋白的特異糖基化位點(diǎn)上復(fù)合N-連接寡糖的異質(zhì)性(Heterogeneity of the Complex N-LinkedOligosaccharides at Specific Glycosylation Sites of TwoSecreted Carrot Glycoproteins)，Eur.J.Biochem.，199，169-179(1991)；Y.Okushima，N.Koizumi，T.Kusano和H.Sano，煙草培養(yǎng)BY2細(xì)胞的分泌蛋白病理相關(guān)蛋白質(zhì)新成員的鑒定(Secreted Proteins of Tobacco Cultured BY2 CellsIdentification of A New Member of Pathogenesis-RelatedProteins)，Plant Mol.Biol.，42，479-488(2000)；和Y.Okushima，N.Koizumi，T.Kusano和H.Sano，糖基化和其適當(dāng)?shù)募庸τ跓煵軧Y2細(xì)胞中的蛋白質(zhì)分泌是關(guān)鍵性的(Glycosylationand Its Adequate Processing is Critical for ProteinSecretion in Tobacco BY2 Cells)，J.Plant Physiolo.，154，623-627(1999))。其中，在煙草BY2培養(yǎng)細(xì)胞的情況下，純化了兩種類型的過氧化物酶，并克隆了它們的基因(見H.Narita，Y.Asaka，K.Ikura，S.Matsumoto和R.Sasaki，釋放入培養(yǎng)煙草細(xì)胞的培養(yǎng)基中的陽離子過氧化物酶同工酶的分離、表征和表達(dá)(Isolation，Characterization and Expression of CationicPeroxidase Isozymes Released into the Medium of CulturedTobacco Cells)，Eur.J.Biochem.，228，855-862(1995))。還報道了通過向培養(yǎng)基中添加聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，可以增加培養(yǎng)基中分泌的蛋白質(zhì)濃度(見N.S.Magnuson，P.M.Linzmaier，J.W.Gao，R.Reeves，G.An和J.M.Lee，從遺傳修飾煙草細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)物中提高回收分泌的哺乳動物蛋白質(zhì)(Enhanced Recoveryof a Secreted Mammalian Protein from Suspension Culture ofGenetically Modified Tobacco Cells)，Protein Expr.Purif.，7，220-228(1996))；以及Y.Okushima等人(見上，(1999))報道了從煙草BY2株系培養(yǎng)細(xì)胞中細(xì)胞外分泌了許許多多的蛋白質(zhì)。其中，由于糖蛋白與識別高甘露糖型糖鏈的凝集素(伴刀豆凝集素A)的反應(yīng)，可以確定許多糖蛋白的細(xì)胞外分泌(見Y.Okushima，見上，(1999))。
對于這些在植物細(xì)胞中產(chǎn)生的糖蛋白(尤其是免疫球蛋白、白細(xì)胞介素和GM-CSF)，每種糖蛋白本身的信號肽在植物細(xì)胞內(nèi)的分泌機(jī)制中也可被識別，并被分泌到培養(yǎng)溶液中(見E.A.James等人，見上；N.S.Magnuson等人，見上，(1998)；N.S.Magnuson等人，見上，(1996))。在任一種這些糖蛋白之中，推測糖鏈參與了血液中半壽期的確定、對于蛋白酶的敏感性和穩(wěn)定性?？墒?，還沒有研究在植物細(xì)胞中實(shí)際產(chǎn)生的并經(jīng)純化的重組蛋白質(zhì)的糖鏈結(jié)構(gòu)，而只是推測這些蛋白質(zhì)具有植物型糖鏈結(jié)構(gòu)。
在糖鏈結(jié)構(gòu)的分析中，揭示出從煙草植物中產(chǎn)生的分泌型抗體分子sIgA具有植物型糖鏈(見M.Cabanes-Macheteau，A.C.Fitchette-Laine，C.Loutelier-Bourhis，C.Lange，N.D.Vine，J.K.Ma，P.Lerouge和L.Faye，在轉(zhuǎn)基因煙草植物中表達(dá)的小鼠IgG的N-糖基化(N-Glycosylation of a Mouse IgG Expressedin Transgenic Tobacco Plants)，Glycobiology，9，365-372(1999))。此外，在從同樣的煙草植物體產(chǎn)生另一種抗體分子的情況下，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的抗體蛋白質(zhì)被蛋白酶分解且不穩(wěn)定(見L.H.Stevens，G.M.Stoopen，I.J.Elbert，J.W.Molthoff，H.A.Bakker，A.Lommen，D.Bosch和W.Jordi，氣候條件和植物發(fā)育階段對于轉(zhuǎn)基因煙草中表達(dá)的抗體穩(wěn)定性的影響(Effect ofClimate Conditions and Plant Developmental Stage on theStability of Antibodies Expressed in Transgenic Tobacco)，Plant Physiol.，124，173-182(2000))。通過使用抗植物型糖鏈抗體的Western方法，可以確定該抗體上添加有植物型糖鏈。雖然報道了人或小鼠所產(chǎn)生的抗體分子糖鏈中存在β1，4連接的半乳糖殘基有利于抗體蛋白質(zhì)的穩(wěn)定，但是植物細(xì)胞所產(chǎn)生的抗體分子不存在這種糖鏈。正是由于這個原因，認(rèn)為煙草植物產(chǎn)生的抗體易于被蛋白酶分解。
在用煙草培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生促紅細(xì)胞生成素的情況下，在體外檢測到了生物活性，但是在體內(nèi)沒有檢測到活性(見S.Matsumoto，K.Ikura，M.Ueda和R.Sasaki，培養(yǎng)煙草細(xì)胞中產(chǎn)生的人糖蛋白(促紅細(xì)胞生成素)的表征(Characterization of a HumanGlycoprotein(Erythropoietin)Produced in Cultured TobaccoCells)，Plant Mol.Biol.，27，1163-1172(1995))。出現(xiàn)這種情況的原因是由于促紅細(xì)胞生成素在其由植物細(xì)胞產(chǎn)生時具有非常不同的糖鏈結(jié)構(gòu)，而促紅細(xì)胞生成素的糖鏈被認(rèn)為很大程度上參與了生物活性。
另一方面，推測植物型糖鏈可能是包括人在內(nèi)的哺乳動物的變態(tài)反應(yīng)原。那即是說，植物所特有的糖鏈結(jié)構(gòu)，如β1，2-木糖和α1，3-巖藻糖，它們未見存在于哺乳動物糖蛋白中，據(jù)報道它們可作為變態(tài)反應(yīng)原(見K.Fotisch，F(xiàn).Altmann，D.Haustein和S.Vieths，涉及碳水化合物表位的芹菜過敏患者的IgE響應(yīng)(Involvement ofCarbohydrate Epitopes in the IgE Response of Celery-Allergic Patients)，Int.Arch.Allergy Immunol.，120，30-42(1999)；I.B.Wilson，J.E.Harthill，N.P.Mullin，D.A.Ashford和F.Altmann，核心α1，3-巖藻糖為被抗植物N-連接寡糖抗體所識別的表位的關(guān)鍵部位并存在于各種各樣的植物提取物中(Core α1，3-Fucose is a Key Part of the Epitope Recognizedby Antibodies Reacting Against Plant N-LinkedOligosaccharides and is Present in a wide Variety of PlantExtracts)，Glycobiology，8，651-661(1998)；和R.van Ree，M.Cabanes-Macheteau，J.Akkerdaas，J.P.Milazzo，C.Loutelier-Bourhis，C.Rayon，M.Villalba，S.Koppelman，R.Aalberse，R.Rodriguez，L.Faye和P.Lerouge，β(1，2)-木糖和α(1，3)-巖藻糖殘基在IgE與植物糖變態(tài)反應(yīng)原的結(jié)合中起著巨大的作用(β(1，2)-Xylose and α(1，3)-Fucose Residues Have aStrong Contribution in IgE Binding to Plant Glycoallergens)，J.Biol.Chem.，275(15)，11451-11458(April 14，2000))。因此，用于醫(yī)學(xué)用途的蛋白質(zhì)必須具有無β1，2-木糖或α1，3-巖藻糖的糖鏈結(jié)構(gòu)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的為解決傳統(tǒng)技術(shù)中存在的上述問題，并提供在植物細(xì)胞中分泌性生產(chǎn)穩(wěn)定的、保持其原始生理活性、且不為變態(tài)反應(yīng)原的糖蛋白的方法、能夠分泌這種糖蛋白的植物細(xì)胞和由該植物細(xì)胞所分泌的具有人型糖鏈的糖蛋白。
作為廣泛研究的結(jié)果，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在煙草培養(yǎng)細(xì)胞BY2株系中表達(dá)人源半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因cDNA時，半乳糖被添加到大多數(shù)分泌至外部培養(yǎng)基的糖蛋白的糖鏈上，并且這些糖蛋白具有無β1，2-木糖或α1，3-巖藻糖的糖鏈結(jié)構(gòu)。本發(fā)明正是基于該發(fā)現(xiàn)而實(shí)現(xiàn)的。因此，當(dāng)用這種遺傳重組體煙草培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生人源的有用蛋白質(zhì)時，能夠?qū)⒕哂蟹亲儜B(tài)反應(yīng)原的糖結(jié)構(gòu)的目標(biāo)蛋白質(zhì)分泌到細(xì)胞外流體中。
本發(fā)明涉及分泌性生產(chǎn)具有人型糖鏈的糖蛋白的方法。該方法包括以下步驟向植物細(xì)胞中引入能夠進(jìn)行將半乳糖殘基轉(zhuǎn)移至非還原性末端乙酰葡糖胺殘基的轉(zhuǎn)移反應(yīng)的酶基因，和引入異源糖蛋白基因，從而獲得轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞；培養(yǎng)獲得的植物細(xì)胞。
在上述方法中，具有人型糖鏈的糖蛋白可以含有核心糖鏈和外部糖鏈，核心糖鏈可以基本上含有較大多數(shù)的甘露糖和乙酰葡糖胺，外部糖鏈可以具有含有非還原性末端半乳糖的末端糖鏈部分。
在上述方法中，外部糖鏈可以具有線性或分枝的結(jié)構(gòu)。
在上述方法中，分枝的糖鏈部分可以為單支化(mono-structure)、二支化(bi-structure)、三支化(tri-structure)或四支化(tetra-structure)結(jié)構(gòu)。
在上述方法中，糖蛋白可以無巖藻糖或木糖。
上述用于分泌性生產(chǎn)的方法可以優(yōu)選地進(jìn)一步包括回收植物細(xì)胞培養(yǎng)基的步驟。
在一個實(shí)施例中，上述用于分泌性生產(chǎn)的方法可以進(jìn)一步包括體外添加糖或糖鏈的步驟。
一方面，本發(fā)明涉及具有糖鏈添加機(jī)制而能夠分泌包含通過由糖鏈添加機(jī)制所添加的糖鏈的蛋白質(zhì)的植物細(xì)胞，該糖鏈添加機(jī)制能夠進(jìn)行將半乳糖殘基轉(zhuǎn)移至非還原性末端乙酰葡糖胺殘基的轉(zhuǎn)移反應(yīng)，其中糖鏈添加機(jī)制添加含有核心糖鏈和外部糖鏈的糖鏈，核心糖鏈基本上含有較大多數(shù)的甘露糖和乙酰葡糖胺，外部糖鏈具有含有非還原性末端半乳糖的末端糖鏈部分。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過上述方法所獲得的具有人型糖鏈的糖蛋白。
本發(fā)明更進(jìn)一步涉及分泌性生產(chǎn)具有人型糖鏈的糖蛋白的方法，其包括以下步驟引入能夠進(jìn)行將半乳糖殘基轉(zhuǎn)移至非還原性末端乙酰葡糖胺殘基的轉(zhuǎn)移反應(yīng)的酶基因，和異源糖蛋白基因，從而獲得轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞；在細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器中表達(dá)該酶。
本發(fā)明更進(jìn)一步涉及用酶基因轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，該酶能夠進(jìn)行將半乳糖殘基轉(zhuǎn)移至非還原性末端乙酰葡糖胺殘基的轉(zhuǎn)移反應(yīng)，其中該酶定位于植物細(xì)胞中，因此植物細(xì)胞能夠合成具有人型糖鏈結(jié)構(gòu)的糖蛋白。
一方面，在上述的植物細(xì)胞中，糖鏈結(jié)構(gòu)包含添加的半乳糖殘基。
一方面，在上述的植物細(xì)胞中，糖鏈結(jié)構(gòu)無β1，2-木糖或α1，3-巖藻糖。
一方面，在上述的植物細(xì)胞中，糖鏈結(jié)構(gòu)包含添加至(N-乙酰葡糖胺)1-2(甘露糖)2-5(N-乙酰葡糖胺)2(選自GlcNAc1Man3GlcNAc2、GlcNAc1Man5GlcNAc2、GlcNAc2Man3GlcNAc2和GlcNAc1Man4GlcNAc2)的N連接型糖鏈上的半乳糖殘基。
一方面，在上述的植物細(xì)胞中，酶定位于植物細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器內(nèi)。
本發(fā)明更進(jìn)一步涉及從上述植物細(xì)胞中再生出的植物。
本發(fā)明更進(jìn)一步涉及從上述植物產(chǎn)生的種子。
附圖簡述

圖1為hGT克隆程序的示意圖。
圖2為用于表達(dá)hGT的載體pGAhGT構(gòu)建程序的示意圖。
圖3為轉(zhuǎn)化體煙草培養(yǎng)細(xì)胞基因組的Southern分析的照片。圖3(A)顯示了當(dāng)用EcoRI與HindIII消化基因組DNA(40μg)并隨后進(jìn)行電泳的結(jié)果。左邊的數(shù)字標(biāo)明了DNA分子量標(biāo)記的位置。圖3(B)顯示了整合入每個轉(zhuǎn)化體中、并含有啟動子、hGT和終止子的2.2kb片段的示意圖。
圖4A為從GT6株系培養(yǎng)基中制備的PA-糖鏈的高效液相層析分析圖。
圖4B為從GT6株系培養(yǎng)基中制備的PA-糖鏈的高效液相層析分析圖。
圖5為GT6株系培養(yǎng)基中分泌的糖蛋白中糖鏈的結(jié)構(gòu)和分析結(jié)果圖。圖中圓括號內(nèi)的數(shù)字表明了具有圖中顯示的各結(jié)構(gòu)的糖鏈的摩爾比例。
圖6為從GT6株系培養(yǎng)基中制備的PA-糖鏈和其外切糖苷酶消化產(chǎn)物的高效液相層析分析圖。
圖7為從GT6株系培養(yǎng)基中制備的PA-糖鏈和其外切糖苷酶消化產(chǎn)物的高效液相層析分析圖。
圖8為從GT6株系培養(yǎng)基中制備的PA-糖鏈和其外切糖苷酶消化產(chǎn)物的高效液相層析分析圖。
圖9為從GT6株系培養(yǎng)基中制備的PA-糖鏈和其外切糖苷酶消化產(chǎn)物的高效液相層析分析圖。
圖10為從GT6株系培養(yǎng)基中制備的PA-糖鏈的IS-MS/MS分析圖。B為A的部分放大圖。
圖11為從GT6株系培養(yǎng)基中制備的PA-糖鏈和其外切糖苷酶消化產(chǎn)物的高效液相層析分析圖。
圖12為從GT6株系培養(yǎng)基中制備的PA-糖鏈和其外切糖苷酶消化產(chǎn)物的高效液相層析分析圖。
圖13為體外唾液酸轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)結(jié)果的照片，該反應(yīng)用源自GT6株系培養(yǎng)基的糖蛋白、源自BY2株系培養(yǎng)基的糖蛋白或脫唾液酸胎球蛋白作為底物。
圖14A為從BY2株系培養(yǎng)基中制備的PA-糖鹽的高效液相層析分析圖。
圖14B為從BY2株系培養(yǎng)基中制備的PA-糖鹽的高效液相層析分析圖。
圖15A為GT6株系培養(yǎng)基中分泌的糖蛋白中糖鏈的結(jié)構(gòu)和分析結(jié)果圖。圖中圓括號內(nèi)的數(shù)字表明了具有圖中顯示的各結(jié)構(gòu)的糖鏈的摩爾比例。
圖15B為GT6株系培養(yǎng)基中分泌的糖蛋白中糖鏈的結(jié)構(gòu)和分析結(jié)果圖。圖中圓括號內(nèi)的數(shù)字表明了具有圖中顯示的各結(jié)構(gòu)的糖鏈的摩爾比例。
圖16為從BY2株系培養(yǎng)基中制備的PA-糖鏈的分析圖。
圖17為從BY2株系培養(yǎng)基中制備的PA-糖鏈和其外切糖苷酶消化產(chǎn)物的高效液相層析分析圖。
圖18A為從BY2株系培養(yǎng)基中制備的PA-糖鏈和其外切糖苷酶消化產(chǎn)物的高效液相層析分析圖。
圖18B為從BY2株系培養(yǎng)基中制備的PA-糖鏈和其外切糖苷酶消化產(chǎn)物的高效液相層析分析圖。
圖19為等電聚焦電泳結(jié)果的照片。通過等電聚焦分析用過的培養(yǎng)煙草細(xì)胞培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)，并對于過氧化物酶活性進(jìn)行染色。野生型表示BY2株系。WT-HRP表示含有HRP的BY2株系轉(zhuǎn)化體。GT-HRP表示含有HRP基因的GT6株系轉(zhuǎn)化體。
圖20為用過的轉(zhuǎn)基因培養(yǎng)煙草細(xì)胞培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)凝集素染色結(jié)果的照片。通過SDS-PAGE將蛋白質(zhì)分級分離，并用考馬斯亮藍(lán)(A)染色，或者將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，再用ConA(B)與RCA120(C)處理。野生型表示BY2株系。WT-HRP-2表示含有HRP基因的BY2株系的一個轉(zhuǎn)化體。GT-HRP-5表示含有HRP基因的GT6株系的一個轉(zhuǎn)化體。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的最好方式下面詳細(xì)描述了本發(fā)明。
在本文中，除非另外說明，可以使用本領(lǐng)域所熟知的蛋白質(zhì)分離與分析方法和免疫學(xué)技術(shù)。這些技術(shù)可以用商購可得的試劑盒、抗體、標(biāo)記物質(zhì)等等來進(jìn)行。
本發(fā)明的方法為生產(chǎn)具有人型糖鏈的糖蛋白的方法。在本發(fā)明中，“人型糖鏈”表示具有與N-乙酰葡糖胺殘基成鍵的半乳糖殘基的糖鏈。人型糖鏈中的半乳糖殘基可以為糖鏈的末端，或者唾液酸殘基可以進(jìn)一步地鍵合到半乳糖殘基的外側(cè)。在本發(fā)明的具有人型糖鏈的糖蛋白中，所述糖鏈含有核心糖鏈部分、分枝糖鏈部分和末端糖鏈部分，木糖和巖藻糖中的至少一種優(yōu)選地不鍵合在一個或更多的這些部分之中，更優(yōu)選地不鍵合在任何的這些部分之中。最優(yōu)選地，人型糖鏈既不含有木糖，也不含有巖藻糖。
植物細(xì)胞可以是任何植物細(xì)胞。植物細(xì)胞可以包括任何形式的培養(yǎng)細(xì)胞、培養(yǎng)組織、培養(yǎng)器官和植物體。其中，優(yōu)選的為培養(yǎng)細(xì)胞、培養(yǎng)組織和培養(yǎng)器官，更優(yōu)選的為培養(yǎng)細(xì)胞?？稍诒景l(fā)明的生產(chǎn)方法中使用的植物種類可以為任何能夠進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)導(dǎo)的植物種類?？稍诒景l(fā)明的生產(chǎn)方法中使用的植物種類的例子包括屬于茄科(Solanaceae)、禾本科(Gramineae)、十字花科(Cruciferae)、薔薇科(Rosaceae)、豆科(Leguminosae)、葫蘆科(Cucurbitaceae)、唇形科(Labiatae)、百合科(Liliaceae)、藜科(Chenopodiaceae)和傘形科(Umbelliferae)的植物。
茄科植物的例子包括屬于煙草屬(Nicotiana)、茄屬(Solanum)、曼陀羅屬(Datura)、番茄屬(Lycopersion)或碧冬茄屬(Petunia)的植物，如煙草、茄子、馬鈴薯、番茄、紅辣椒(red pepper)和矮牽牛。
禾本科植物的例子包括屬于稻屬(Oryza)、大麥屬(Hordenum)、黑麥屬(Secale)、Scccharum、稗屬(Echinochloa)或玉蜀黍?qū)?Zea)的植物，如稻、大麥、黑麥、稗(barnyard millet)、高粱和玉米。
十字花科植物的例子包括屬于蘿卜屬(Raphanus)、蕓苔屬(Brassica)、擬南芥屬(Arabidopsis)、山萮菜屬(Wasabia)或薺屬(Capsella)的植物，如蘿卜、油菜、瘭疽草(whitlowgrass)、辣根和薺菜。
薔薇科植物的例子包括屬于Orunus、蘋果屬(Malus)、梨屬(Pynus)、草莓屬(Fragaria)或薔薇屬(Rosa)的植物，如日本杏、桃、蘋果、梨、草莓和薔薇。
豆科植物的例子包括屬于大豆屬(Glycine)、豇豆屬(Vigna)、菜豆屬(Phaseolus)、豌豆屬(Pisum)、野豌豆屬(Vicia)、落花生屬(Arachis)、車軸草屬(Trifolium)、Alphalfa或苜蓿屬(Medicago)的植物，如大豆、紅豆、菜豆、青豆、蠶豆、落花生、三葉草(clover)和苜蓿(bur clover)。
葫蘆科植物的例子包括屬于絲瓜屬(Luffa)、南瓜屬(Cucurbita)或香瓜屬(Cucumis)的植物，如絲瓜、南瓜、黃瓜和香瓜。
唇形科植物的例子包括屬于薰衣草屬(Lavandula)、薄荷屬(Mentha)或紫蘇屬(Perilla)的植物，如薰衣草、薄荷和紫蘇。
百合科植物的例子包括屬于蔥屬(Allium)、百合屬(Lilium)或郁金香屬(Tulipa)的植物，如蔥、大蒜、百合和郁金香。
藜科植物的例子包括屬于菠菜屬(Spinacia)的植物，如菠菜。
傘形科植物的例子包括屬于當(dāng)歸屬(Angelica)、胡蘿卜屬(Daucus)、鴨兒芹屬(Cryptotaenia)或芹屬(Apitum)的植物，如白根獨(dú)活(Angelica polyclada)、胡蘿卜、百脈根(trefoil)和芹菜。
在這些用于本發(fā)明的產(chǎn)生方法的植物中，優(yōu)選的為煙草、番茄、馬鈴薯、稻、玉米、蘿卜、大豆、青豆、苜蓿和菠菜，更優(yōu)選的為煙草、番茄、馬鈴薯、玉米和大豆。
“能夠進(jìn)行將半乳糖殘基轉(zhuǎn)移至非還原性末端乙酰葡糖胺殘基的轉(zhuǎn)移反應(yīng)的酶”是指一種能夠?qū)肴樘菤埢D(zhuǎn)移到非還原性末端乙酰葡糖胺殘基上的酶，該乙酰葡糖胺殘基是在植物細(xì)胞內(nèi)合成糖蛋白的蛋白質(zhì)部分之后添加糖鏈時產(chǎn)生的。這種酶的例子包括半乳糖基轉(zhuǎn)移酶、乳糖合成酶和β-半乳糖苷酶。這種酶可以源自任何動物物種，但是優(yōu)選地源自哺乳動物，更優(yōu)選地源自人。
這種酶優(yōu)選地定位于細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器中。雖然不想受限于特殊的理論，但是本發(fā)明者認(rèn)為，這種酶存在于細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器(如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體)之中，因此在植物細(xì)胞中表達(dá)和分泌異源糖蛋白的時候，該酶在添加巖藻糖或木糖殘基之前作用于蛋白質(zhì)或糖鏈，或者起某種作用以致抑制了巖藻糖或木糖殘基的添加。
“能夠進(jìn)行將半乳糖殘基轉(zhuǎn)移至非還原性末端乙酰葡糖胺殘基的轉(zhuǎn)移反應(yīng)的酶基因”可以用已知編碼該酶的核苷酸序列從任何動物細(xì)胞中分離得到，或者可以購買商購可得的酶或?qū)⑵湫揎椧赃m合于植物中的表達(dá)之后再使用之。
此處，“基因”表示結(jié)構(gòu)基因部分。為了促進(jìn)植物中的表達(dá)，該基因可以連接調(diào)節(jié)序列，如啟動子、操縱基因和終止子。
“異源糖蛋白”表示原來并不在用于本發(fā)明的植物中表達(dá)的糖蛋白。異源糖蛋白的例子包括酶、激素、細(xì)胞因子、抗體、疫苗、受體和血清蛋白質(zhì)。酶的例子包括辣根過氧化物酶、激酶、葡糖腦苷脂酶、α-半乳糖苷酶、肌醇六磷酸酶、TPA(組織型血纖溶酶原激活物)和HMG-CoA還原酶。激素和細(xì)胞因子的例子包括腦啡肽、干擾素α、GM-CSF、G-CSF、絨毛膜促性腺激素、白細(xì)胞介素-2、干擾素β、干擾素γ、促紅細(xì)胞生成素、血管內(nèi)皮生長因子、人絨毛膜促性腺激素(HCG)、黃體生成素(LH)、促甲狀腺素(TSH)、促乳素和促卵泡激素?？贵w的例子包括IgG、scFv和分泌性IgA。疫苗的例子包括乙型肝炎表面抗原、輪狀病毒抗原、大腸桿菌(Escherichia coli)腸毒素、瘧疾抗原、狂犬病毒的G蛋白和HIV病毒糖蛋白(例如gp120)。受體和基質(zhì)蛋白的例子包括EGF受體、纖連蛋白、α1-抗胰蛋白酶和凝血因子VIII。血清蛋白質(zhì)的例子包括清蛋白、補(bǔ)體系統(tǒng)蛋白質(zhì)、纖溶酶原、皮質(zhì)類固醇結(jié)合球蛋白、甲狀腺素結(jié)合球蛋白和蛋白C。
“異源糖蛋白的基因”可以用已知編碼目標(biāo)異源糖蛋白的核苷酸序列從任何細(xì)胞中分離得到，或者可以購買商購可得的基因或?qū)⑵湫揎椧赃m合于植物中的表達(dá)之后再使用之。
將能夠進(jìn)行將半乳糖殘基轉(zhuǎn)移至非還原性末端乙酰葡糖胺殘基的轉(zhuǎn)移反應(yīng)的酶基因和異源糖蛋白基因用本領(lǐng)域熟知的方法引入植物細(xì)胞中。這些基因可以分別或同時引入。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會意識到方法的選擇可取決于確定用于轉(zhuǎn)化的植物的類型。
轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的合適方法包括微注射(Crossway等人，BioTechniques 4320-334(1986))、電穿孔(Riggs等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 835602-5606(1986))、土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(Hinchee等人，Biotechnology 6915-921(1988)；也可見Ishida等人，Nature Biotechnology 14745-750(June，1996)，對于玉米的轉(zhuǎn)化)、直接的基因轉(zhuǎn)移(Paszkowski等人，EMBO J.32717-2722(1984)；Hayashimoto等人，Plant Physiol.93857-863(1990)(稻))和用可從Agracetus，Inc.，Madison，Wis.和Dupont，Inc.，Wilmington，Del.獲得的裝置的彈道微粒加速法(ballistic particle acceleration)(見例如Sanford等人，U.S.Pat.No.4,945,050；和McCabe等人，Biotechnology 6923-926(1988))。也可參閱Weissinger等人，Annual Rev.Genet.22421-477(1988)；Sanford等人，Particulate Science andTechnology 527-37(1987)(洋蔥)；Svab等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 878526-8530(1990)(煙草葉綠體)；Christou等人，Plant Physiol.87671-674(1988)(大豆)；McCabe等人，Bio/Technology 6923-926(1988)(大豆)；Klein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 854305-4309(1988)(玉米)；Klein等人，Bio/Technology 6559-563(1988)(玉米)；Klein等人，PlantPhysiol.91440-444(1988)(玉米)；Fromm等人，Bio/Technology 8833-839(1990)；和Gordon-Kamm等人，PlantCell 2603-618(1990)(玉米)；Koziel等人，Biotechnology11194-200(1993)(玉米)；Shimamoto等人，Nature 338274-277(1989)(稻)；Christou等人，Biotechnology 9957-962(1991)(稻)；Datta等人，Biol/Technology 3736-740(1990)(稻)；歐洲專利申請EP 0 332 581(鴨茅和其他Pooideae植物)；Vasil等人，Biotechnology 111553-1558(1993)(小麥)；Weeks等人，Plant Physiol.1021077-1084(1993)(小麥)；Wan等人，PlantPhysiol.10437-48(1994)(大麥)；Jahne等人，Theor.Appl.Genet.89525-533(1994)(大麥)；Umbeck等人，Bio/Technology5263-266(1987)(棉花)；Casas等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9011212-11216(December，1993)(高粱)；Somers等人，Bio/Technology 101589-1594(December，1992)(燕麥)；Torbert等人，Plant Cell Reports 14635-640(1995)(燕麥)；Weeks等人，Plant Physiol.1021077-1084(1993)(小麥)；Chang等人，WO 94/13822(小麥)；和Nehra等人，The PlantJournal 5285-297(1994)(小麥)?？梢栽谙铝形墨I(xiàn)中找到通過微粒轟擊將重組體DNA分子引入玉米的一套特別優(yōu)選的實(shí)施例Koziel等人，Biotechnology 11194-200(1993)；Hill等人，Euphytica85119-123(1995)；和Koziel等人，Annals of the New YorkAcademy of Sciences 792164-171(1996)。另一個優(yōu)選的實(shí)施例為在EP 0 292 435中公開的用于玉米的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法。植物的轉(zhuǎn)化可以用單一的DNA種類或多個DNA種類(即共轉(zhuǎn)化)來進(jìn)行，這些技術(shù)都適合于過氧化物酶編碼序列的應(yīng)用。
由其中摻入有上述基因的植物細(xì)胞所表達(dá)和分泌的基因產(chǎn)物可采用本領(lǐng)域熟知的方法來鑒定。鑒定方法的例子包括銀染色、Western印跡法、Northern雜交和酶活性的檢測。
可以表達(dá)能夠進(jìn)行將半乳糖殘基轉(zhuǎn)移至非還原性末端乙酰葡糖胺殘基的轉(zhuǎn)移反應(yīng)的酶并表達(dá)異源糖蛋白的轉(zhuǎn)化細(xì)胞能夠表達(dá)和分泌具有人型糖鏈的異源糖蛋白。換句話說，如此獲得的轉(zhuǎn)化植物具有人型糖鏈添加機(jī)制，從而通過培養(yǎng)這種轉(zhuǎn)化細(xì)胞，可以在培養(yǎng)基中大量地表達(dá)和分泌人型糖蛋白。
這種人型糖蛋白含有核心糖鏈和外部糖鏈，核心糖鏈基本上含有較大多數(shù)的甘露糖和乙酰葡糖胺。所獲得的糖蛋白的外部糖鏈含有非還原性末端糖鏈部分。外部糖鏈可以具有線性或分枝的結(jié)構(gòu)。分枝的糖鏈部分可以為單支化、二支化、三支化和四支化結(jié)構(gòu)中的任何一種。由轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生的糖蛋白優(yōu)選地不含有巖藻糖或木糖。
所得的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞可以維持在培養(yǎng)細(xì)胞狀態(tài)，可以分化成特異的組織或器官，或者可以再生成完整的植物體或從完整的植物體獲得的部分(如種子、果實(shí)、葉、根、莖或花)。
使用本領(lǐng)域熟知的方法和培養(yǎng)基來培養(yǎng)、分化或再生轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。培養(yǎng)基的例子包括Murashige-Skoog(MS)培養(yǎng)基、GamborgB5(B)培養(yǎng)基、White培養(yǎng)基、和Nitsch & Nitsch(Nitsch)培養(yǎng)基，但本發(fā)明不局限于此。這些培養(yǎng)基通常在另外添加了適當(dāng)量的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)(例如植物激素)等等之后才使用。
這些系統(tǒng)對于不同植物株系的應(yīng)用依賴于從原生質(zhì)體再生出那種特殊植物株系的能力。已經(jīng)描述了用于從原生質(zhì)體再生出谷類植物的說明性方法(Fujimura等人，Plant Tissue Culture Letters，274，1985；Toriyama等人，Theot.Appl.Genet.7316，1986；Yamada等人，Plant Cell Rep.，485，1986；Abdullah等人，Biotechnology，41087，1986)。
為了轉(zhuǎn)化不能成功地從原生質(zhì)體再生的植物株系，可以利用將DNA引入完整的細(xì)胞或組織的其他方法。例如，按照描述的方法(Vasil，Biotechnology，6397，1988)可以實(shí)現(xiàn)從未成熟胚胎或外植體中再生谷類植物。
土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移也是用于將基因引入植物細(xì)胞的廣泛適用的系統(tǒng)，因?yàn)橥ㄟ^此方法可以將DNA引入整個植物組織，所以避開了從原生質(zhì)體再生出完整植物的要求。利用土壤桿菌介導(dǎo)的植物整合載體將DNA引入植物細(xì)胞的載體在本領(lǐng)域中是熟知的。見例如上面所描述的方法。
基本上，只要轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞生長以及隨后表達(dá)和分泌所期望的基因產(chǎn)物，即可以使用含有任何合適組成的培養(yǎng)基來分泌性生產(chǎn)具有人型糖鏈的糖蛋白，這種培養(yǎng)基組成含有對于植物細(xì)胞生長所必需的痕量養(yǎng)分，如碳源、氮源、維生素和鹽。也可以添加聚乙烯吡咯烷酮、蛋白酶抑制劑等等，從而穩(wěn)定分泌的異源蛋白質(zhì)和達(dá)到異源蛋白質(zhì)的有效分泌。
由轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞表達(dá)和分泌的具有人型糖鏈的糖蛋白一般可以從植物細(xì)胞的培養(yǎng)基中分離得到。從植物細(xì)胞的培養(yǎng)基中分離糖蛋白可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法來進(jìn)行。例如，糖蛋白可以分別或聯(lián)合采用下列技術(shù)從培養(yǎng)基中純化而分離得到如鹽析(例如硫酸銨沉淀、磷酸鈉沉淀)、溶劑沉淀(例如用丙酮或乙醇的蛋白質(zhì)分級沉淀)、透析、凝膠過濾、離子交換、柱層析(如反相)、超濾和高效液相層析(HPLC)。
作為另一種選擇，本發(fā)明的糖蛋白也可以從植物細(xì)胞中分離或提取。此外，轉(zhuǎn)化細(xì)胞中含有的本發(fā)明的糖蛋白可以用作食物。本發(fā)明的糖蛋白添加了人型糖鏈，所以其無抗原性，從而適合施用于包括人在內(nèi)的動物。
本發(fā)明還進(jìn)一步包括，用能夠進(jìn)行將半乳糖殘基轉(zhuǎn)移至非還原性末端乙酰葡糖胺殘基的轉(zhuǎn)移反應(yīng)的酶基因所轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞或植物體中，β1，2-木糖轉(zhuǎn)移酶或α1，3-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶可能已被失活或抑制活性。
Strasser等人已經(jīng)從擬南芥(Arabidopsis thaliana)中分離到了編碼β1，2-木糖基轉(zhuǎn)移酶的eDNA(Strasser R，Mucha J，MachL，Altmann F，Wilson IB，Glossl J，Steinkellner H，來自擬南芥的β1，2-木糖基轉(zhuǎn)移酶cDNA的分子克隆和功能表達(dá)(Molecularcloning and functional expression of β1，2-xylosyltransferase cDNA from Arabidopsis thaliana)，F(xiàn)EBSLett，(2000)472105-108)。在數(shù)據(jù)庫(如NIH GenBank)中進(jìn)行的同源性搜索可以顯示相應(yīng)于一些植物中的一些EST(表達(dá)序列標(biāo)簽)克隆和基因組序列的核苷酸序列類似于編碼擬南芥β1，2-木糖基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列?；谶@些序列，可以從宿主植物中克隆出編碼β1，2-木糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸，并將其用于通過抑制β1，2-木糖基轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)來形成具有降低了的木糖基轉(zhuǎn)移酶活性的植物細(xì)胞或植物。β1，2-木糖基轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)的抑制可以通過反義方法、共抑制方法、RNAi方法或其他等等方法來進(jìn)行。
作為另一種選擇，可以采用化學(xué)誘變、用寡核苷酸的定點(diǎn)誘變、標(biāo)記方法或其他等等方法形成具有降低了的木糖基轉(zhuǎn)移酶活性的植物細(xì)胞或植物。在該植物中，引入和表達(dá)一個或多個編碼半乳糖轉(zhuǎn)移酶的糖基轉(zhuǎn)移酶基因以及編碼異源多肽的基因可以產(chǎn)生具有人源化多糖結(jié)構(gòu)的異源多肽或分泌具有人源化多糖結(jié)構(gòu)的異源多肽。
類似地，Wilson等人從擬南芥中分離得到了編碼α1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的cDNA(Wilson IB，Rendic D，F(xiàn)reilinger A，Dumic J，Altmann F，Mucha J，Muller S，Hauser MT，來自擬南芥的編碼α1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶同源物的cDNA的克隆和表達(dá)(Cloning andExpression of cDNAs encoding α1，3-fucosyltransferasehomologues from Arabidopsis thaliana)，Biochim Biophys Acta(2001)152788-96)。Leiter等人從綠豆中分離得到了編碼α1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的cDNA(Leiter，H.，Mucha，J.，Staudacher，E.，Grimm，R.，Glossl，J.，Altmann，F(xiàn).，來自綠豆的GDP-L-FucAsn連接的GlcNAc α1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的純化、cDNA克隆和表達(dá)(Purification，cDNA cloning，and expression of GDP-L-FucAsn-linked GlcNAc α1，3-fucosyltransferase from mungbeans)，J.Biol.Chem.(1999)27421830-21839)。在數(shù)據(jù)庫(如NIH GenBank)中進(jìn)行的同源性搜索可以顯示相應(yīng)于一些植物中的一些EST(表達(dá)序列標(biāo)簽)克隆和基因組序列的核苷酸序列類似于編碼擬南芥α1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列?；谶@些序列，可以從宿主植物中克隆出編碼α1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸，并將其用于通過抑制α1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)來形成具有降低了的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的植物細(xì)胞或植物。α1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)的抑制可以通過反義方法、共抑制方法、RNAi方法或其他等等方法來進(jìn)行。
作為另一種選擇，可以采用化學(xué)誘變、用寡核苷酸的定點(diǎn)誘變、標(biāo)記方法或其他等等方法形成具有降低了的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的植物細(xì)胞或植物。在該植物中，引入和表達(dá)一個或多個編碼半乳糖轉(zhuǎn)移酶的糖基轉(zhuǎn)移酶基因以及編碼異源多肽的基因可以產(chǎn)生具有人源化多糖結(jié)構(gòu)的異源多肽或分泌具有人源化多糖結(jié)構(gòu)的異源多肽。
實(shí)施例本發(fā)明通過運(yùn)用實(shí)施例描述于下面。下面的實(shí)施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明。
1.人β1-4半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因的克隆已經(jīng)克隆了β1-4半乳糖轉(zhuǎn)移酶(hGt)(EC2.4.1.38)，并揭示了其一級結(jié)構(gòu)含有400個氨基酸(K.A.Masri等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.，157，657-663(1988))。
(1)引物制備和模板DNA通過參考Masri等人的報道制備出下列引物。
hGT-5Eco5′-AAAGAATTCGCGATGCCAGGCGCGCGTCCCT-3′(SEQ.IDNO1)hGT-2Sal3′-TCGATCGCAAAACCATGTGCAGCTGATG-5′(SEQ.ID.NO2)hGT-7Spe3′-ACGGGACTCCTCAGGGGCGATGATCATAA-5′(SEQ.ID.NO3)hGT6Spe5′-AAGACTAGTGGGCCCCATGCTGATTGA-3′(SEQ.ID.NO4)從Clontech購得的人基因組DNA、人胎盤cDNA和人腎臟cDNA用作模板DNA。
(2)hGT基因cDNA的克隆使用兩種組合(i)模板為人基因組DNA，引物為hGT-5Eco和hGT-7Spe，和(ii)模板為人胎盤cDNA，引物為hGT-2Sal和hGT-6Spe，在下面的條件下進(jìn)行PCR反應(yīng)，從而獲得含有hGT編碼區(qū)域的0.4kb和0.8kb的片段。
(PCR反應(yīng)體系)向1μl模板DNA、5μl 10×PCR緩沖液、4μl dNTPs(200μM)、引物(10pmol)和0.5μl Tag聚合酶(Takara Shuzo生產(chǎn))(在Tub聚合酶的情況下為0.2μl)中加入水至50μl。
(PCR反應(yīng)條件)第一階段循環(huán)數(shù)1；變性(94℃)5分鐘；退火(55℃)1分鐘；延伸(72℃)2分鐘。
第二階段循環(huán)數(shù)30；變性(94℃)1分鐘；退火(55℃)1分鐘；延伸(72℃)2分鐘。
第三階段循環(huán)數(shù)1；變性(94℃)1分鐘；退火(55℃)2分鐘；延伸(72℃)5分鐘。
將獲得的兩個片段合并來構(gòu)建hGT基因cDNA，并將其亞克隆進(jìn)pBluescriptIISK+(SK)中。pBluescriptIISK+(SK)是從Stratagene購買的。圖1顯示了含有hGT基因cDNA的質(zhì)粒的構(gòu)建過程。SEQ.ID.NO5顯示了獲得的hGT基因的堿基序列，SEQ.ID.NO6顯示了推測的氨基酸序列。
獲得的序列與上述Masri等人所公開的hGT序列有所不同，其不同點(diǎn)在于下面幾點(diǎn)a)528位的A、562位的C和1047位的A分別變成了G、T和G，但是編碼的氨基酸沒有改變；b)刪除了622至630位的9個堿基；和c)為了連接上述0.4kb和0.8kb的片段，在制備引物時，將405位的G和408位的T分別轉(zhuǎn)換成了A和A。
順便提一句，在該實(shí)驗(yàn)中將具有兩個起始密碼子(ATG)的hGT基因cDNA設(shè)計(jì)成翻譯從第二個起始密碼子(37位)開始。
2.將hGT基因引入煙草培養(yǎng)細(xì)胞(1)hGT據(jù)報道可以活性類型在大腸桿菌中表達(dá)(見D.Aoki等人，EMBO J.，9，3171(1990)和K.Nakazawa等人，J.Biochem.，113，747(1993))。
為了在煙草培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)hGT，按照圖2中顯示的程序構(gòu)建用于表達(dá)的載體pGAhGT。所用的啟動子為花椰菜花葉病毒35S啟動子(CaMV 35S啟動子)，所用的選擇性標(biāo)記為卡那霉素抗性基因。將pGAhGT通過土壤桿菌引入煙草培養(yǎng)細(xì)胞。
采用Bevan等人的三親株交配方法(見M.Bevan，NucleicAcid Res.，12，8711(1984))來進(jìn)行土壤桿菌的轉(zhuǎn)化。將具有pGA型質(zhì)粒(見G.An，Methods Enzymol.153，292(1987))的大腸桿菌DH 5α菌株(suE44，ΔlacU169(ф80lacZΔM15)，hsdR17)(Bethesda Research Laboratories Inc.，F(xiàn)ocus 8(2)，9(1986))和具有輔助質(zhì)粒pRK2013(見M.Bevan，Nucleic AcidRes.，12，8711(1984))的大腸桿菌HB101菌株各自在含有12.5mg/L四環(huán)素和50mg/L卡那霉素的2×YT培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)過夜，并將根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA101菌株(見E.H.Elizabeth，J.Bacteriol.，168，1291(1986))在含有50mg/L卡那霉素和25mg/L氯霉素的2×YT培養(yǎng)基中于28℃培養(yǎng)過兩夜。從每個培養(yǎng)基中取1.5ml轉(zhuǎn)移入Eppendorf管中，然后收集細(xì)胞并用LB培養(yǎng)基洗滌三次。將獲得的每個種類的細(xì)胞懸浮在100μl的2×YT培養(yǎng)基中，并將這三種細(xì)胞混和，然后將混和物涂在2×YT瓊脂培養(yǎng)基上并于28℃培養(yǎng)以便將pGA型質(zhì)粒從大腸桿菌接合傳遞至土壤桿菌。2天之后，用接種環(huán)刮取遍及2×YT瓊脂培養(yǎng)基表面生長的一部分細(xì)胞，并將其涂在含有50mg/L卡那霉素、12.5mg/L四環(huán)素和25mg/L氯霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上。在28℃培養(yǎng)2天之后，挑選出單克隆。
通過G.An(Plant Mol.Bio.Manual，A3，1)描述的方法來進(jìn)行煙草培養(yǎng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。將土壤桿菌(具有pGA-型質(zhì)粒的EHA101菌株)在含有12.5mg/L四環(huán)素的LB培養(yǎng)基中于28℃培養(yǎng)36小時，將煙草細(xì)胞(煙草(Nicotiana tabacum L.)栽培變種金黃煙2)培養(yǎng)4天(從The Institute of Physical and Chemical Research，Riken Gene Bank，Plant Cell Bank購得，細(xì)胞名為BY-2，商品目錄號為No.RPC1)，然后將土壤桿菌懸浮液和煙草培養(yǎng)細(xì)胞懸浮液分別以100μl和4ml的量放入培養(yǎng)皿中，隨后完全地混和并于25℃靜置在暗處。2天之后，將培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至離心管中，并通過離心分離(1,000rpm，5分鐘)除去上清液。接著加入新鮮培養(yǎng)基，并在離心分離之后將細(xì)胞涂在含有150-200mg/L卡那霉素和250mg/L羧芐青霉素的經(jīng)修改的LS瓊脂培養(yǎng)基平板上，然后將其于25℃靜置在暗處。在經(jīng)過大約2-3星期之后，將愈傷組織細(xì)胞植入新的平板上，并挑選出生長起來的克隆。再經(jīng)過2-3星期之后，將克隆轉(zhuǎn)移到30ml添加了卡那霉素和羧芐青霉素的經(jīng)修改的LS培養(yǎng)基中，并進(jìn)行傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)大約1個月，然后再次進(jìn)行選擇。從獲得的一些抗性株系中隨機(jī)挑選出6個抗性株系(GT1、4、5、6、8和9)。
(2)引入的hGT基因的鑒定用Southern分析來分析獲得的抗性株系，證實(shí)了位于T-DNA中的含有CaMV35S啟動子-hGT基因cDNA-NOS終止子的2.2kb片段整合入了煙草培養(yǎng)細(xì)胞的基因組DNA中。從上面獲得的每個抗性株系中制備得到基因組DNA，然后用EcoRI、HindIII消化和用Southern分析進(jìn)行分析。
根據(jù)Watabe方法(見K.Watabe，克隆至序列(克隆和序列)(Cloning to Sequence(Cloning and Sequence)，ShokubutsuBiotechnology Jikken Manual(Plant BiotechnologyExperimentation Manual)，Noson Bunka Sha))從煙草培養(yǎng)細(xì)胞中制備染色體DNA。用液氮將10ml煙草培養(yǎng)細(xì)胞冷凍，并用研缽和研杵研磨成粉末形式。在液化開始之前，將大約5g如此獲得的粉末加入5ml在離心管(40ml)中預(yù)熱至60℃的2×CTAB(鯨蠟基三甲基溴化銨)溶液中并逐漸地充分混和，當(dāng)于60℃間歇性混和10分鐘或更長時間的時候，保持溫度不變。向其中加入5ml的氯仿∶異戊醇(24∶1)，并完全地混和直至形成乳狀液，然后將乳狀液離心(2,800rpm，15分鐘，室溫)。將上面的液體層轉(zhuǎn)移到新的40ml體積離心管中，并用氯仿∶異戊醇(24∶1)再次進(jìn)行提取操作。向獲得的上面的液體層中加入1/10體積的10％CTAB并完全地混和，然后離心(2,800rpm，15分鐘，室溫)。將上面的液體層轉(zhuǎn)移到新的離心管中，然后向其中加入1體積的冷的異丙醇，充分地進(jìn)行混和并離心(4,500rpm，20分鐘，室溫)。在用抽吸裝置吸去上清液之后，加入含有5ml 1M氯化鈉的TE緩沖溶液，并在55-60℃將其完全溶解。向其中加入5ml冷的異丙醇，當(dāng)觀察到DNA時，用小棒的末端將DNA取出并轉(zhuǎn)移到Eppendorf管(含有80％冷的乙醇)中，然后進(jìn)行漂洗。用70％乙醇進(jìn)一步漂洗DNA，然后將干的沉淀物溶解在合適量的TE緩沖液中。向其中加入5μl的RNA酶A(10mg/ml)，并于37℃反應(yīng)1小時。2×CTAB溶液的組成為2％CTAB、0.1M Tris-HCl(pH8.0)、1.4M氯化鈉和1％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，10％CTAB溶液的組成為10％CTAB和0.7M氯化鈉。
按照下面的描述進(jìn)行Southern分析。
(i)DNA的電泳和堿性修飾在用限制性內(nèi)切酶完全降解40μg獲得的染色體DNA之后，采用標(biāo)準(zhǔn)的方法進(jìn)行1.5％瓊脂糖凝膠電泳(50V)。將凝膠用溴化乙錠染色并照相，然后在400ml 0.25M HCl中搖動20分鐘。在此之后，丟棄溶液，然后將凝膠浸在400ml經(jīng)修改的溶液(1.5M，NaCl，0.5M，NaOH)中并逐漸地?fù)u動45分鐘。隨后丟棄溶液，再加入400ml中和溶液(1.5M NaCl，0.5M Tris-Cl(pH7.4))并逐漸地?fù)u動15分鐘。在丟棄溶液之后，再次加入400ml中和溶液并逐漸地?fù)u動15分鐘。
(ii)轉(zhuǎn)移在電泳之后，用20×SSC將DNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜(Hybond-NAmersham)上。轉(zhuǎn)移過程進(jìn)行12小時或更長時間。將有印跡的膜在室溫干燥1小時，并經(jīng)UV固定5分鐘。20×SSC的組成為3M NaCl和0.3M檸檬酸鈉。
(iii)DNA探針的制備用隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒(Takara Shuzo生產(chǎn))制備DNA探針。在Eppendorf管中制備下面所顯示的反應(yīng)溶液，并于95℃加熱3分鐘之后迅速地在冰中冷卻模板DNA 25ng，隨機(jī)引物2μl，加水至5μl。加入各為1.5μl的10×緩沖液和dNTP以及5μl的[α-32P]dCTP(1.85MBq，50mCi)，隨后用水補(bǔ)足至24μl。向其中加入1μlKlenow片段并置于37℃10分鐘，此后通過NAP10柱(Pharmacia生產(chǎn))進(jìn)行洗脫從而純化出DNA。將該純化的DNA于95℃加熱3分鐘，然后迅速地在冰中冷卻從而得到雜交探針。
(iv)雜交向下面的預(yù)雜交溶液中加入0.05mg/ml的0.5％(w/v)SDS。將上面(ii)中的膜浸入所得的溶液中，然后預(yù)雜交于42℃進(jìn)行2小時或更長時間。在此之后，加入(iii)中制備的DNA探針，然后雜交于42℃進(jìn)行12小時或更長時間。預(yù)雜交溶液的組成為5×SSC、50mM磷酸鈉、50％(w/v)甲酰胺、5×Denhardt’s溶液(通過稀釋100×Denhardt’s溶液獲得)和0.1％(w/v)SDS。100×Denhardt’s溶液的組成為2％(w/v)BSA、2％(w/v)Ficol 400和2％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。
(v)放射自顯影在以下面的順序進(jìn)行清洗之后，采用標(biāo)準(zhǔn)的方法進(jìn)行放射自顯影。用2×SSC和0.1％SDS于65℃清洗15分鐘兩次，然后用0.1×SSC和0.1％SDS于65℃清洗15分鐘一次。
圖3顯示了從上面獲得的每個抗性株系中制備的基因組DNA的Southern分析結(jié)果。正如從圖3中所看到的，可以確定hGT基因整合入了GT1、6、8和9這四個株系中。
3.由半乳糖基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化體分泌的糖蛋白的分析(煙草培養(yǎng)細(xì)胞GT6株系細(xì)胞外分泌性生產(chǎn)的糖蛋白的制備)將煙草培養(yǎng)細(xì)胞GT6株系在用Murashige-Skoog培養(yǎng)基(WakoJunyaku生產(chǎn))的混和鹽制備的經(jīng)修改的Murashige-Skoog培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天，然后將由此所得的培養(yǎng)基在室溫下于2,000rpm離心10分鐘，隨后將所得的上清液作為GT6株系培養(yǎng)基進(jìn)行回收和用于本實(shí)施例中。將獲得的上清液對dH2O(去離子水)進(jìn)行透析(1×105倍稀釋度)，然后冷凍干燥。
(N-連接型糖鏈的制備)將冷凍干燥所獲得的樣品于100℃肼解10小時從而切除糖鏈。向肼解產(chǎn)物中加入過量的丙酮，通過于4℃和10,000rpm離心20分鐘沉淀出糖鏈。糖鏈在飽和碳酸氫鈉水溶液和乙酸酐存在的條件下是N-乙?；?，然后用Dowex 50×2(Muromachi Kagaku kogyo生產(chǎn))進(jìn)行脫鹽，并通過用0.1N氨水平衡的Sephadex G-25超細(xì)凝膠過濾柱(1.8×180cm)，從而回收得到N-連接糖鏈。
(吡啶胺化(pyridylaminated，PA)糖鏈的制備)回收得到的N-連接糖鏈?zhǔn)荘A化的。將PA-樣品通過用3％乙酸水溶液平衡的Sephadex G-25超細(xì)凝膠過濾柱(1.8×180cm)從而純化得到PA-糖鏈。
(用HPLC分級分離和分析PA-糖鏈)用反相(RP)和大小分級分離(SF)HPLC分析PA-糖鏈，用外切糖苷酶消化和IS-MS/MS分析進(jìn)行二維糖鏈制圖。在HPLC(高效液相層析)分析中，使用具有Jasco 821-FP智能型熒光分光光度計(jì)的Jasco 880-PU HPLC，并在310nm的激發(fā)波長和380nm的熒光波長測量熒光強(qiáng)度。
在使用Cosmosil 5C18-P柱(6×250mm，Nakaraitesc生產(chǎn))的RP-HPLC分析中，0.02％TFA水溶液中乙腈的濃度以1.2ml/分鐘的流速經(jīng)過40分鐘從0％增加到6％，從而洗脫下PA-糖鏈。在使用Asahipak NH2P-50柱(4.6×250mm，Showa Denko K.K.生產(chǎn))的SF-HPLC分析中，dH2O-乙腈混和溶液中乙腈的濃度以0.7ml/分鐘的流速經(jīng)過25分鐘從26％增加到50％，從而洗脫下PA-糖鏈。
(通過外切糖苷酶消化分析PA-糖鏈)在用β-半乳糖苷酶(肺炎雙球菌(Diplococcuspneumoniae)，Roche)的酶消化反應(yīng)中，每個PA-糖鏈在含有5mUβ-半乳糖苷酶的0.1M乙酸鈉緩沖液(pH5.5)中于37℃反應(yīng)2天。類似地，在用N-乙酰葡糖胺糖苷酶(N-acetylglucosamidase)(肺炎雙球菌，Roche)的酶消化反應(yīng)中，每個PA-糖鏈在含有5mUN-乙酰葡糖胺糖苷酶的0.1M乙酸鈉緩沖液(pH5.5)中于37℃反應(yīng)2天。此外，在用α-甘露糖苷酶(刀豆，Sigma)的酶消化反應(yīng)中，每個PA-糖鏈在含有10mM乙酸鋅和10μU α-甘露糖苷酶的0.1M乙酸鈉緩沖液(pH3.88)中于37℃反應(yīng)2天。通過將溶液在100℃煮沸3分鐘來終止每個酶消化反應(yīng)。然后將反應(yīng)溶液在12,000rpm離心10分鐘，并將上清液進(jìn)行HPLC。將每個樣品糖鏈的洗脫時間與已知糖鏈的洗脫時間進(jìn)行比較。
(IS-MS/MS分析)用Perkin-Elmer Sciex API-III三聯(lián)四級質(zhì)譜儀進(jìn)行IS-MS/MS分析。掃描間隔為0.5Da。
(體外唾液酸轉(zhuǎn)移酶反應(yīng))將上面在透析和冷凍干燥之后制備得到的源自GT6株系細(xì)胞培養(yǎng)基的糖蛋白用作底物。唾液酸轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)在62.5mM二甲胂酸鈉緩沖溶液(pH6.0)中于37℃進(jìn)行5小時，該緩沖溶液還含有1mg/mlBSA、0.5％Triton CF-54、2μM CMP-唾液酸、6mU α2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(源自大鼠肝)(Wako Junyaku生產(chǎn))和400μg源自GT6株系細(xì)胞培養(yǎng)基的糖蛋白。在對照測試中，400μg源自BY2株系細(xì)胞培養(yǎng)基的糖蛋白和40μg脫唾液酸胎球蛋白(胎牛血清，Sigma)用作底物。
(凝集素染色)將唾液酸轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行使用12.5％聚丙烯酰胺凝膠的SDS-PAGE，其條件為130V進(jìn)行2小時，然后在1mA/cm2的恒定電流下經(jīng)過50分鐘轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。在凝集素印跡過程中，將連有辣根過氧化物酶的SNA凝集素(EY Laboratories，Inc.生產(chǎn))用含有0.05％ Tween-20的PBS溶液作200倍稀釋并投入使用。在印跡過程之后，用POD免疫染色試劑盒(Wako Junyaku生產(chǎn))進(jìn)行染色。
(源自煙草培養(yǎng)細(xì)胞GT6株系培養(yǎng)基的PA-糖鏈的純化)將從GT6株系培養(yǎng)基中制備的PA-糖鏈用RP-HPLC和SF-HPLC(分別顯示在圖4A和圖4B中)進(jìn)行純化。圖4A顯示了RP-HPLC中PA-產(chǎn)物的峰。在將峰(1至6)回收之后各自進(jìn)行SF-HPLC(見圖4B)。
除了通過SF-HPLC獲得的6個峰(圖4B中顯示為A至F)之外，其他峰不是N-連接糖鏈。這是經(jīng)過證實(shí)的，因?yàn)樵贗S-MS/MS分析中，沒有獲得與m/z 299.33(GlcNAc-PA)和m/z 502.52(GlcNAc2-PA)一致的信號。圖5顯示了通過對峰(A-F)分析所得的N-連接糖鏈結(jié)構(gòu)。在圖5中，圓括號內(nèi)的數(shù)字表明了具有圖中顯示的各結(jié)構(gòu)的糖鏈的摩爾比例。
正如圖5中所顯示的，A至F都是具有結(jié)合到N-乙酰葡糖胺殘基上的半乳糖殘基的人型糖鏈，它們不含有巖藻糖殘基，并且除了B和D外不含有木糖殘基。
(源自煙草培養(yǎng)細(xì)胞GT6培養(yǎng)基的PA-糖鏈的結(jié)構(gòu)分析)通過峰A(圖6中的I)的IS-MS分析所獲得的分子量(m/z1354.8)與GalGlcNAcMan3GlcNAc2-PA(1354.27)一致。推測通過IS-MS/MS分析所獲得的信號，即m/z 1192.5、m/z 990.5、m/z827.5、m/z 665.5、m/z 503.0和m/z 300.0分別為GlcNAcMan3GlcNAc2-PA(1192.13)、Man3GlcNAc2-PA(988.94)、Man2GlcNAc2-PA(826.80)、ManGlcNAc2-PA(664.66)、GlcNAc2-PA(502.52)和GlcNAc-PA(299.33)，這暗示峰A含有這些結(jié)構(gòu)(未顯示數(shù)據(jù))。
峰A的β-半乳糖苷酶消化產(chǎn)物為GlcNAcMan3GlcNAc2-PA(圖6中的II)，其N-乙酰葡糖胺糖苷酶消化產(chǎn)物為Man3GlcNAc2-PA(圖6中的III)。
通過峰B(圖7中的I)的IS-MS分析所獲得的分子量(m/z1486.8)與GalGlcNAcMan3XylGlcNAc2-PA(1486.38)一致。推測通過IS-MS/MS分析所獲得的信號，即m/z 1354.5、m/z 1324.0、m/z1324.0、m/z 1122.0、m/z 991.5、m/z 960.0、m/z 666.0、m/z503.0和m/z 300.0分別為GalGlcNAcMan3GlcNAc2-PA(1354.27)、GlcNAcMan3XylGlcNAc2-PA(1324.24)、Man3XylGlcNAc2-PA(1121.05)、Man3GlcNAc2-PA(988.94)、Man2XylGlcNAc2-PA(958.91)、ManGlcNAc2-PA(664.66)、GlcNAc2-PA(502.52)和GlcNAc2-PA(299.33)，這暗示峰B含有這些結(jié)構(gòu)(未顯示數(shù)據(jù))。
峰B的β-半乳糖苷酶消化產(chǎn)物為GlcNAcMan3XylGlcNAc2-PA(圖7中的II)，其N-乙酰葡糖胺糖苷酶消化產(chǎn)物為Man3XylGlcNAc2-PA(圖7中的III)。
通過峰C(圖8中的I)的IS-MS分析所獲得的分子量(m/z1355.0)與GalGlcNAcMan3GlcNAc2-PA(1354.27)一致。推測通過IS-MS/MS分析所獲得的信號，即m/z 1193.5、m/z 989.0、m/z827.0、m/z 665.5、m/z 503.0和m/z 300.0分別為GlcNAcMan3GlcNAc2-PA(m/z 1192.13)、Man3GlcNAc2-PA(m/z988.94)、Man2GlcNAc2-PA(m/z 826.80)、ManGlcNAc2-PA(m/z664.66)、GlcNAc2-PA(m/z 502.52)和GlcNAc-PA(m/z299.33)，這暗示峰C含有這些結(jié)構(gòu)(未顯示數(shù)據(jù))。
峰C的β-半乳糖苷酶消化產(chǎn)物為GlcNAcMan3GlcNAc2-PA(圖8中的II)，其N-乙酰葡糖胺糖苷酶消化產(chǎn)物為Man3GlcNAc2-PA(圖8中的III)。
通過峰D(圖9中的I)的IS-MS分析所獲得的分子量(m/z1487.0，圖10中的A)與GalGlcNAcMan3XylGlcNAc2-PA(m/z1486.38)一致。推測通過IS-MS/MS分析所獲得的信號，即m/z1354.0、m/z 1325.0、m/z 1191.0、m/z 1121.5、m/z 989.5、m/z828.5、m/z 503.0和m/z 300.5分別為GalGlcNAcMan3GlcNAc2-PA(m/z 1354.27)、GlcNAcMan3XylGlcNAc2-PA(m/z 1324.24)、GlcNAcMan3GlcNAc2-PA(m/z 1192.13)、Man3XylGlcNAc2-PA(m/z1121.05)、Man3GlcNAc2-PA(m/z 988.94)、Man2GlcNAc2-PA(m/z826.80)、GlcNAc2-PA(m/z 502.52)和GlcNAc-PA(m/z299.33)，這暗示峰D含有這些結(jié)構(gòu)(圖10中的B)。
峰D的β-半乳糖苷酶消化產(chǎn)物為GlcNAcMan3XylGlcNAc2-PA(圖9中的II)，其N-乙酰葡糖胺糖苷酶消化產(chǎn)物為Man3XylGlcNAc2-PA(圖9中的III)。
通過峰E(圖11中的I)的IS-MS分析所獲得的分子量(m/z1516.6)與GalGlcNAcMan4GlcNAc2-PA(1516.41)一致。推測通過IS-MS/MS分析所獲得的信號，即m/z 1355.0、m/z 1193.0、m/z990.0、m/z 826.5、m/z 665.0、m/z 503.5和m/z 300.0分別為GalGlcNAcMan3GlcNAc2-PA(m/z 1354.27)、GalNAcMan3GlcNAc2-PA(m/z 1192.13)、Man3GlcNAc2-PA(m/z 988.94)、Man2GlcNAc2-PA(m/z 826.80)、ManGlcNAc2-PA(m/z 664.66)、GlcNAc2-PA(m/z502.52)和GlcNAc-PA(m/z 299.33)，這暗示峰E含有這些結(jié)構(gòu)(未顯示數(shù)據(jù))。
峰E的β-半乳糖苷酶消化產(chǎn)物為GlcNAcMan4GlcNAc2-PA(圖11中的II)，其N-乙酰葡糖胺糖苷酶消化產(chǎn)物為Man4GlcNAc2-PA(圖11中的III)。
通過峰F(圖12中的I)的IS-MS分析所獲得的分子量(m/z1679.8)與GalGlcNAcMan5GlcNAc2-PA(1678.55)一致。推測通過IS-MS/MS分析所獲得的信號，即m/z 1517.5、m/z 1313.5、m/z1152.0、m/z 827.5、m/z 665.5、m/z 503.0和m/z 300.0分別為GlcNAcMan5GlcNAc2-PA(m/z 1516.41)、Man5GlcNAc2-PA(m/z1313.22)、Man4GlcNAc2-PA(m/z 1151.08)、Man2GlcNAc2-PA(m/z826.80)、ManGlcNAc2-PA(m/z 664.66)、GlcNAc2-PA(m/z502.52)和GlcNAc-PA(m/z 299.33)，這暗示峰F含有這些結(jié)構(gòu)(未顯示數(shù)據(jù))。
峰F的β-半乳糖苷酶消化產(chǎn)物為GlcNAcMan5GlcNAc2-PA(圖12中的II)，其N-乙酰葡糖胺糖苷酶消化產(chǎn)物為Man5GlcNAc2-PA(圖12中的III)。
綜合這些結(jié)果，認(rèn)為峰A或C為α-D-Man-(1→6)[β-D-Gal-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→2)-α-D-Man-(1→3)]β-D-Man-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→4)-GlcNAc-PA(GalGN1M3-PA)或[β-D-Gal-(1→4)-β-D-GlcNAc(1→2)-α-D-Man-(1→6)]α-D-Man-(1→3)β-D-Man-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→4)-GlcNAc-PA(GalGN1M3-PA)。
認(rèn)為峰B或D為α-D-Man-(1→6)[β-D-Gal-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→2)-α-D-Man-(1→3)][β-D-Xyl-(1→2)]β-D-Man-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→4)-GlcNAc-PA(GalGN1M3X-PA)或[β-D-Gal-(1→4)-β-D-GlcNAc(1→2)-α-D-Man-(1→6)][α-D-Man-(1→3)][β-D-Xyl-(1→2)]β-D-Man-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→4)-GlcNAc-PA(GalGN1M3X-PA)。
認(rèn)為峰E為
α-D-Man-(1→6)-α-D-Man-(1→6)[β-D-Gal-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→2)-α-D-Man-(1→3)]β-D-Man-(1→4)β-D-GlcNAc-(1→4)-GlcNAc-PA(GalGNM4-PA)或α-D-Man-(1→3)-α-D-Man-(1→6)[β-D-Gal-(1→4)-β-D-GlcNAc(1→2)-α-D-Man-(1→3)]β-D-Man-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→4)-GlcNAc-PA(GalGNM4-PA)。
認(rèn)為峰F為α-D-Man-(1→6)[α-D-Man-(1→3)]α-D-Man-(1→6)[β-D-Gal-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→2)-α-D-Man-(1→3)]β-D-Man-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→4)-GlcNAc-PA(GalGNM5-PA)。
(體外唾液酸轉(zhuǎn)移酶反應(yīng))體外唾液酸轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)用源自GT6株系培養(yǎng)基的糖蛋白、源自BY2株系培養(yǎng)基的糖蛋白或脫唾液酸胎球蛋白作為底物來進(jìn)行。將各反應(yīng)物轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，并進(jìn)行凝集素染色。結(jié)果為，凝集素染色在底物是脫唾液酸胎球蛋白(圖13中的泳道1)或源自GT6株系培養(yǎng)基的糖蛋白(圖13中的泳道2)的情況下為陽性；凝集素染色在底物是源自BY2株系培養(yǎng)基的糖蛋白(圖13中的泳道3)的情況下為陰性。從此中揭示出源自煙草培養(yǎng)細(xì)胞GT6株系培養(yǎng)基的糖蛋白在唾液酸轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)中作為底物。
(比較實(shí)施例)(非轉(zhuǎn)化體BY2株系培養(yǎng)細(xì)胞分泌的糖蛋白的分析)(通過細(xì)胞外分泌制備糖蛋白)采用與對于GT6株系同樣的方法獲得經(jīng)冷凍干燥的培養(yǎng)物上清液樣品，只是用BY2株系代替GT6株系。
(N-連接糖鏈的制備)采用與對于GT6株系同樣的方法回收N-連接糖鏈，只是用TSKgel TOYO PERAL HW-40(TOSO生產(chǎn))凝膠過濾柱(2.5×30cm)代替Sephadex G-25超細(xì)凝膠過濾柱(1.8×180cm)。
(吡啶胺化(PA)糖鏈的制備)將回收得到的N-連接糖鏈用2-氨基吡啶進(jìn)行PA化。將PA-樣品通過TSK gel TOYO PERAL HW-40(TOSO生產(chǎn))凝膠過濾柱(2.5×30cm)進(jìn)行過濾從而純化出PA-糖鏈。
(用HPLC分級分離和分析PA-糖鏈)采用與對于GT6株系同樣的方法進(jìn)行PA-糖鏈的分級分離和分析，只是用具有HITACHI FL檢測器L-7480的HITACHI HPLC系統(tǒng)代替具有Jasco 821-FP智能型熒光分光光度計(jì)的Jasco 880-PUHPLC。
(通過外切糖苷酶消化分析PA-糖鏈)在用N-乙酰葡糖胺糖苷酶(肺炎雙球菌，Roche)的酶消化反應(yīng)中，每個PA-糖鏈在含有3mU N-乙酰葡糖胺糖苷酶的0.1M乙酸鈉緩沖液(pH5.45)中于37℃反應(yīng)2天。在用α-甘露糖苷酶(刀豆，Sigma)的酶消化反應(yīng)中，每個PA-糖鏈在含有10mM乙酸鋅和10μUα-甘露糖苷酶的0.1M乙酸鈉緩沖液(pH4.0)中于37℃反應(yīng)2天。通過將溶液在100℃煮沸3分鐘來終止每個酶消化反應(yīng)。然后將反應(yīng)溶液在12,000rpm離心10分鐘，并將上清液進(jìn)行HPLC。將每個樣品糖鏈的洗脫時間與已知糖鏈的洗脫時間進(jìn)行比較。
(IS-MS/MS分析)采用與對于GT6株系同樣的方法進(jìn)行該分析。
(源自BY2株系培養(yǎng)基的PA-糖鏈的制備)將從BY2培養(yǎng)基中制備的PA-糖鏈也用RP-HPLC和SF-HPLC(圖14A和14B)進(jìn)行純化。圖14A顯示了RP-HPLC中PA-產(chǎn)物的峰。在回收之后，將各個級分(I至X)進(jìn)行SF-HPLC(圖14B)。
在圖14A中顯示的級分(I、II和III)中，SF-HPLC分析沒有檢測到N-連接糖鏈。這是經(jīng)過證實(shí)的，因?yàn)樵贗S-MS/MS分析中，沒有獲得與m/z 299.33(GlcNAc-PA)和m/z 502.52(GlcNAc2-PA)一致的信號。用SF-HPLC分析級分IV至X的峰，結(jié)果得到21個峰(見圖14B)。圖15A和15B顯示了經(jīng)分析的N-連接糖鏈結(jié)構(gòu)。
(源自BY2株系培養(yǎng)基的PA-糖鏈的結(jié)構(gòu)分析)對圖14B中顯示的峰V-4、VII-3和VIII-4進(jìn)行IS-MS/MS分析，結(jié)果顯示分子量(m/z)分別為1639.0、1476.5和1314.5，將SF-HPLC中的洗脫位置一起考慮，可得出這些峰中存在的糖鏈結(jié)構(gòu)分別與PA-高甘露糖糖鏈Man7GlcNAc2-PA、Man6GlcNAc2-PA和Man5GlcNAc2-PA一致(未顯示數(shù)據(jù))。
而且，SF-HPLC分析的結(jié)果顯示，各個峰的糖鏈的α-甘露糖苷酶消化產(chǎn)物與ManGlcNAc2-PA(M1)一致(未顯示數(shù)據(jù))。當(dāng)與Man7GlcNAc2-PA的異構(gòu)體M7A、M7B和M7D進(jìn)行比較時，峰V-4的洗脫位置與M7A的洗脫位置一致。在Man6GlcNAc2-PA的異構(gòu)體M6B和M6C中，峰VII-3與M6B一致。而且，Man5GlcNAc2-PA的異構(gòu)體M5A與峰VIII-4是一致的。
綜合這些數(shù)據(jù)，圖14B中顯示的峰V-4、VII-3和VIII-4正如圖15A中所顯示的為α-D-Man-(1→2)-α-D-Man-(1→6)[α-D-Man-(1→3)]α-D-Man-(1→6)[α-D-Man-(1→2)-α-D-Man-(1→3)]β-D-Man-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→4)-GlcNAc-PA(M7A)、α-D-Man-(1→6)[α-D-Man-(1→3)]α-D-Man-(1→6)[α-D-Man(1→2)-α-D-Man-(1→3)]β-D-Man-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→4)-GlcNAc-PA(M6A)和α-D-Man-(1→6)[α-D-Man-(1→3)]α-D-Man-(1→6)[α-D-Man-(1→3)]β-D-Man-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→4)-GlcNAc-PA(M5A)。
在圖中，圓括號內(nèi)的數(shù)字表明了具有圖中顯示的各結(jié)構(gòu)的糖鏈的摩爾比例。
通過圖14B中顯示的峰IV-1和V-1的IS-MS分析所測定的分子量(m/z 1267.5)與Man3XylFucGlcNAc2-PA的計(jì)算值(M3FX1267.19)一致。而且，HPLC中的洗脫位置與二維糖鏈圖譜上的M3FX標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)物完全一致。此外，SF-HPLC分析和IS-MS/MS分析的結(jié)果顯示各個峰的糖鏈的α-甘露糖苷酶消化產(chǎn)物與ManXylFucGlcNAc2-PA(MFX942.91)的計(jì)算值一致(見圖17A和17B)。
綜合這些數(shù)據(jù)，圖14B中顯示的峰IV-1和V-1正如圖15B中所顯示的為α-D-Man-(1→6)[α-D-Man-(1→3)][β-D-Xyl-(1→2)]β-D-Man-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→4)-[α-L-Fuc-(1→3)]GlcNAc-PA(M3FX)。
通過圖14B中顯示的峰VII-2的IS-MS分析所測定的分子量(m/z 1417.0)與GlcNAcMan3XylFucGlcNAc2-PA的計(jì)算值(GNM3FX1470.38)一致。而且，SF-HPLC分析和IS-MS/MS分析的結(jié)果顯示該峰的糖鏈的N-乙酰葡糖胺糖苷酶消化產(chǎn)物與Man3XylFucGlcNAc2-PA(M3FX1267.19)一致。此外，在用α-甘露糖苷酶進(jìn)行消化之后，SF-HPLC分析和IC-MS/MS分析揭示出產(chǎn)物與ManXylFucGlcNAc2-PA(MFX942.91)一致(圖17中的C至E)。在二維糖鏈圖譜上，峰VII-2(圖16中的D-2)在RP-HPLC中的洗脫位置與標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)物GN1M3FX，即β-D-GlcNAc-(1→2)-α-D-Man-(1→6)[α-D-Man-(1→3)][β-D-Xyl-(1→2)]β-D-Man-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→4)-[α-L-Fuc-(1-3)]GlcNAc-PA(圖16中的D-1)完全一致。
綜合這些數(shù)據(jù)，峰VII-2正如圖15B中所顯示的為β-D-GlcNAc-(1→2)-α-D-Man-(1→6)[α-D-Man-(1→3)][β-D-Xyl-(1→2)]β-D-Man-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→4)-[α-L-Fuc-(1→3)]GlcNAc-PA(GN1M3FX)。
圖14B中顯示的峰VII-1和VIII-3的分子量(m/z 1324.0)與GlcNAcMan3XylGlcNAc2-PA的計(jì)算值(GNM3FX1324.24)一致。而且，SF-HPLC分析和IS-MS/MS分析的結(jié)果顯示峰VIII-1的N-乙酰葡糖胺糖苷酶消化產(chǎn)物與Man3XylGlcNAc2-PA(M3X1121.05)一致(圖18A中的B)。此外，在用α-甘露糖苷酶進(jìn)行消化之后，SF-HPLC分析和IC-MS/MS分析揭示出產(chǎn)物與ManXylGlcNAc2-PA(MX796.77)一致(圖18A中的C)。認(rèn)為GNM3X的結(jié)構(gòu)有兩種異構(gòu)體類型，即α-D-Man-(1→6)[β-D-GlcNAc-(1→2)-α-D-Man-(1→3)][β-D-Xyl-(1→2)]β-D-Man-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→4)-GlcNAc-PA(GN1M3X)和β-D-GlcNAc-(1→2)-α-D-Man-(1→6)[α-D-Man-(1→3)][β-D-Xyl-(1→2)]β-D-Man-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→4)-GlcNAc-PA(GN1M3X)。據(jù)報道，在ODS柱上GN1M3X于GN1M3X之前洗脫。當(dāng)考慮峰VII-1和VIII-3的洗脫位置時，正如圖15B中所顯示的，峰VII-1為α-D-Man-(1→6)[β-D-GlcNAc-(1→2)-α-D-Man-(1→3)][β-D-Xyl-(1→2)]β-D-Man-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→4)-GlcNAc-PA(GN1M3X)，峰VIII-3為β-D-GlcNAc-(1→2)-α-D-Man-(1→6)[α-D-Man-(1→3)][β-D-Xyl-(1→2)]β-D-Man-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→4)-GlcNAc-PA(GN1M3X)。
圖14B中顯示的峰X-1在HPLC中的洗脫位置與二維糖鏈圖譜上標(biāo)準(zhǔn)的GN2M3(1395.32)完全一致。而且，SF-HPLC分析和IS-S/MS分析的結(jié)果顯示該峰的糖鏈的N-乙酰葡糖胺糖苷酶消化產(chǎn)物與Man3GlcNAc2-PA(M3988.94)一致。此外，在用α-甘露糖苷酶進(jìn)行消化之后，SF-HPLC分析和IC-MS/MS分析揭示出產(chǎn)物與ManGlcNAc2-PA(M1664.66)一致(未顯示數(shù)據(jù))。綜合這些結(jié)果，峰X-1正如圖15A和15B中所顯示的為β-D-GlcNAc-(1→2)-α-D-Man-(1→6)[β-D-GlcNAc-(1→2)-α-D-Man-(1→3)]β-D-Man-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→4)-GlcNAc-PA(GN2M3)。
圖14B中顯示的峰X-2的分子量(m/z 1529.5)與GlcNAc2Man3XylGlcNAc2-PA的計(jì)算值(GN2M3FX1527.43)一致。而且，HPLC中的洗脫位置與二維糖鏈圖譜上的M3FX標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)物完全一致。此外，該峰的糖鏈的α-甘露糖苷酶消化產(chǎn)物的洗脫位置沒有由于HPLC分析而改變?？墒?，SF-HPLC分析和IC-MS/MS分析的結(jié)果顯示N-乙酰葡糖胺糖苷酶消化產(chǎn)物與Man3XylGlcNAc2-PA(M3X1121.05)一致(圖18B中的B)。在用α-甘露糖苷酶進(jìn)行進(jìn)一步消化之后，SF-HPLC分析和IC-MS/MS分析揭示出產(chǎn)物與ManXylGlcNAc2-PA(MX796.77)一致(圖18A中的C)。綜合這些數(shù)據(jù)，峰X-2正如圖15B中所顯示的為β-D-GlcNAc-(1→2)-α-D-Man-(1→6)[β-D-GlcNAc-(1→2)-α-D-Man-(1→3)][β-D-Xyl-(1→2)]β-D-Man-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→4)-GlcNAc-PA(GN2M3X)。
圖14B中顯示的其他峰IV-2、IV-3、V-2、V-3、V-5、VI-1、VI-2、VI-3、VI-4、VIII-2和IX不是N-連接糖鏈，因?yàn)镮S-MS/MS分析的結(jié)果顯示沒有獲得與m/z 299.33(GlcNAc-PA)和m/z502.52(GlcNAc2-PA)相一致的信號。
4.辣根過氧化物酶(HRP)的分泌將從35S-Cla(Kawaoka等人，J.Ferment.Bioeng.，78，49-53(1994))中獲得的外源基因(辣根過氧化物酶基因)插入載體pBI101 HmB(Akama等人，Plant Cell Rep.，12，7-11(1992))的HindIII和SacI位點(diǎn)，并引入GT6株系。在培養(yǎng)獲得的GT6株系的克隆(GT-HRP-5、GT-HRP-19)之后，收集上清液并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的等電聚焦電泳。正如圖19中所表明的，結(jié)果在克隆GT-HRP-5、GT-HRP-19的上清液中檢測到HRP的pI7.8的電泳條帶，因此可以確定外源蛋白質(zhì)也從被GalT基因轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞分泌出來。此外，圖20表明了由克隆GT-HRP-5分泌并按照上面所描述的方法用標(biāo)準(zhǔn)SDS-PAGE電泳分離的蛋白質(zhì)的凝集素染色結(jié)果。RCA120染色表明GT-HRP-5顯示陽性信號(圖20(c))，因此表明分泌的HRP具有添加了半乳糖的糖鏈結(jié)構(gòu)。
工業(yè)適用性本發(fā)明涉及用植物細(xì)胞分泌性生產(chǎn)具有人型糖鏈的異源糖蛋白的方法、能夠分泌該糖蛋白的植物細(xì)胞和由該植物細(xì)胞所分泌的具有人型糖鏈的糖蛋白。本發(fā)明的糖蛋白具有人型糖鏈，因此其無抗原性從而可用于對包括人在內(nèi)的動物進(jìn)行施用。
序列表<110>Tatsuji，Seki and Kazuhito，F(xiàn)ujiyama<120>分泌性生產(chǎn)具有人型糖鏈的糖蛋白的方法<130>J198020401<160>6<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物hGT-5Eco<400>1aaagaattcg cgatgccagg cgcgcgtccc t 31<210>2<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物hGT-2Sal<400>2tcgatcgcaa aaccatgtgc agctgatg 28<210>3<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物hGT-7Spe
<400>3acgggactcc tcaggggcga tgatcataa29<210>4<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物hGT-6Spe<400>4aagactagtg ggccccatgc tgattga 27<210>5<211>1158<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1155)<400>5atg cca ggc gcg tcc cta cag cgg gcc tgc cgc ctg ctc gtg gcc gtc48Met Pro Gly Ala Ser Leu Gln Arg Ala Cys Arg Leu Leu Val Ala Val1 5 10 15tgc gct ctg cac ctt ggc gtc acc ctc gtt tac tac ctg gct ggc cgc96Cys Ala Leu His Leu Gly Val Thr Leu Val Tyr Tyr Leu Ala Gly Arg20 25 30gac ctg agc cgc ctg ccc caa ctg gtc gga gtc tcc aca ccg ctg cag144Asp Leu Ser Arg Leu Pro Gln Leu Val Gly Val Ser Thr Pro Leu Gln35 40 45ggc ggc tcg aac agt gcc gcc gcc atc ggg cag tcc tcc ggg gag ctc192Gly Gly Ser Asn Ser Ala Ala Ala Ile Gly Gln Ser Ser Gly Glu Leu
50 55 60cgg acc gga ggg gcc cgg ccg ccg cct cct cta ggc gcc tcc tcc cag240Arg Thr Gly Gly Ala Arg Pro Pro Pro Pro Leu Gly Ala Ser Ser Gln65 70 75 80ccg cgc ccg ggt ggc gac tcc agc cca gtc gtg gat tct ggc cct ggc288Pro Arg Pro Gly Gly Asp Ser Ser Pro Val Val Asp Ser Gly Pro Gly85 90 95ccc gct agc aac ttg acc tcg gtc cca gtg ccc cac acc acc gca ctg336Pro Ala Ser Asn Leu Thr Ser Val Pro Val Pro His Thr Thr Ala Leu100 105 110tcg ctg ccc gcc tgc cct gag gag tcc ccg cta cta gtg ggc ccc atg384Ser Leu Pro Ala Cys Pro Glu Glu Ser Pro Leu Leu Val Gly Pro Met115 120 125ctg att gag ttt aac atg cct gtg gac ctg gag ctc gtg gca aag cag432Leu Ile Glu Phe Asn Met Pro Val Asp Leu Glu Leu Val Ala Lys Gln130 135 140aac cca aat gtg aag atg ggc ggc cgc tat gcc ccc agg gac tgc gtc480Asn Pro Asn Val Lys Met Gly Gly Arg Tyr Ala Pro Arg Asp Cys Val145 150 155 160tct cct cac aag gtg gcc atc atc att cca ttc cgc aac cgg cag gag528Ser Pro His Lys Val Ala Ile Ile Ile Pro Phe Arg Asn Arg Gln Glu165 170 175cac ctc aag tac tgg cta tat tat ttg cac cca gtc ctg cag cgc cag576His Leu Lys Tyr Trp Leu Tyr Tyr Leu His Pro Val Leu Gln Arg Gln180 185 190cag ctg gac tat ggc atc tat gtt atc aac cag gcg gga gac act ata624Gln Leu Asp Tyr Gly Ile Tyr Val Ile Asn Gln Ala Gly Asp Thr Ile195 200 205ttc aat cgt gct aag ctc ctc aat gtt ggc ttt caa gaa gcc ttg aag672
Phe Asn Arg Ala Lys Leu Leu Asn Val Gly Phe Gln Glu Ala Leu Lys210 215 220gac tat gac tac acc tgc ttt gtg ttt agt gac gtg gac ctc att cca720Asp Tyr Asp Tyr Thr Cys Phe Val Phe Ser Asp Val Asp Leu Ile Pro225 230 235 240atg aat gac cat aat gcg tac agg tgt ttt tca cag cca cgg cac att768Met Asn Asp His Asn Ala Tyr Arg Cys Phe Ser Gln Pro Arg His Ile245 250 255tcc gtt gca atg gat aag ttt gga ttc agc cta cct tat gtt cag tat816Ser Val Ala Met Asp Lys Phe Gly Phe Ser Leu Pro Tyr Val Gln Tyr260 265 270ttt gga ggt gtc tct gct cta agt aaa caa cag ttt cta acc atc aat864Phe Gly Gly Val Ser Ala Leu Ser Lys Gln Gln Phe Leu Thr Ile Asn275 280 285gga ttt cct aat aat tat tgg ggc tgg gga gga gaa gat gat gac att912Gly Phe Pro Asn Asn Tyr Trp Gly Trp Gly Gly Glu Asp Asp Asp Ile290 295 300ttt aac aga tta gtt ttt aga ggc atg tct ata tct cgc cca aat gct960Phe Asn Arg Leu Val Phe Arg Gly Met Ser Ile Ser Arg Pro Asn Ala305 310 315 320gtg gtc ggg agg tgt cgc atg atc cgc cac tca aga gac aag aaa aat1008Val Val Gly Arg Cys Arg Met Ile Arg His Ser Arg Asp Lys Lys Asn325 330 335gaa ccc aat cct cag agg ttt gac cga att gca cac aca aag gag aca1056Glu Pro Asn Pro Gln Arg Phe Asp Arg Ile Ala His Thr Lys Glu Thr340 345 350atg ctc tct gat ggt ttg aac tca ctc acc tac cag gtg ctg gat gta1104Met Leu Ser Asp Gly Leu Asn Ser Leu Thr Tyr Gln Val Leu Asp Val355 360 365
cag aga tac cca ttg tat acc caa atc aca gtg gac atc ggg aca ccg1l52Gln Arg Tyr Pro Leu Tyr Thr Gln Ile Thr Val Asp Ile Gly Thr Pro370 375 380agc tag1158Ser385<210>6<211>385<212>PRT<213>人<400>6Met Pro Gly Ala Ser Leu Gln Arg Ala Cys Arg Leu Leu Val Ala Val1 5 10 15Cys Ala Leu His Leu Gly Val Thr Leu Val Tyr Tyr Leu Ala Gly Arg20 25 30Asp Leu Ser Arg Leu Pro Gln Leu Val Gly Val Ser Thr Pro Leu Gln35 40 45Gly Gly Ser Ash Ser Ala Ala Ala Ile Gly Gln Ser Ser Gly Glu Leu50 55 60Arg Thr Gly Gly Ala Arg Pro Pro Pro Pro Leu Gly Ala Ser Ser Gln65 70 75 80Pro Arg Pro Gly Gly Asp Ser Ser Pro Val Val Asp Ser Gly Pro Gly85 90 95Pro Ala Ser Asn Leu Thr Ser Val Pro Val Pro His Thr Thr Ala Leu100 105 110Ser Leu Pro Ala Cys Pro Glu Glu Ser Pro Leu Leu Val Gly Pro Met115 120 125Leu Ile Glu Phe Asn Met Pro Val Asp Leu Glu Leu Val Ala Lys Gln130 135 140
Asn Pro Asn Val Lys Met Gly Gly Arg Tyr Ala Pro Arg Asp Cys Val145 150 155 160Ser Pro His Lys Val Ala Ile Ile Ile Pro Phe Arg Asn Arg Gln Glu165 170 175His Leu Lys Tyr Trp Leu Tyr Tyr Leu His Pro Val Leu Gln Arg Gln180 185 190Gln Leu Asp Tyr Gly Ile Tyr Val Ile Asn Gln Ala Gly Asp Thr Ile195 200 205Pbe Asn Arg Ala Lys Leu Leu Asn Val Gly Phe Gln Glu Ala Leu Lys210 215 220Asp Tyr Asp Tyr Thr Cys Phe Val Phe Ser Asp Val Asp Leu Ile Pro225 230 235 240Met Asn Asp His Asn Ala Tyr Arg Cys Phe Ser Gln Pro Arg His Ile245 250 255Ser Val Ala Met Asp Lys Phe Gly Phe Ser Leu Pro Tyr Val Gln Tyr260 265 270Phe Gly Gly Val Ser Ala Leu Ser Lys Gln Gln Phe Leu Thr Ile Asn275 280 285Gly Phe Pro Asn Asn Tyr Trp Gly Trp Gly Gly Glu Asp Asp Asp Ile290 295 300Phe Asn Arg Leu Val Phe Arg Gly Met Ser Ile Ser Arg Pro Asn Ala305 310 315 320Val Val Gly Arg Cys Arg Met Ile Arg His Ser Arg Asp Lys Lys Asn325 330 335Glu Pro Asn Pro Gln Arg Phe Asp Arg Ile Ala His Thr Lys Glu Thr340 345 350Met Leu Ser Asp Gly Leu Asn Ser Leu Thr Tyr Gln Val Leu Asp Val355 360 365Gln Arg Tyr Pro Leu Tyr Thr Gln Ile Thr Val Asp Ile Gly Thr Pro
370 375 380Ser38權(quán)利要求
1.分泌性生產(chǎn)具有人型糖鏈的糖蛋白的方法，其包括以下步驟引入能夠進(jìn)行將半乳糖殘基轉(zhuǎn)移至非還原性末端乙酰葡糖胺殘基的轉(zhuǎn)移反應(yīng)的酶基因和異源糖蛋白基因，從而獲得轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞；和培養(yǎng)該植物細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中該具有人型糖鏈的糖蛋白含有核心糖鏈和外部糖鏈，該核心糖鏈基本上含有較大多數(shù)的甘露糖和乙酰葡糖胺，該外部糖鏈具有含有非還原性末端半乳糖的末端糖鏈部分。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中該外部糖鏈具有線性結(jié)構(gòu)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中該外部糖鏈具有分枝的結(jié)構(gòu)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中該分枝的糖鏈部分可以為單支化、二支化、三支化或四支化結(jié)構(gòu)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任何一項(xiàng)所述的方法，其中該糖蛋白無巖藻糖或木糖。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其進(jìn)一步包括回收該植物細(xì)胞培養(yǎng)溶液的步驟。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任何一項(xiàng)所述的方法，其進(jìn)一步包括體外添加糖或糖鏈的步驟。
9.一種植物細(xì)胞，其中包含能夠進(jìn)行將半乳糖殘基轉(zhuǎn)移至非還原性末端乙酰葡糖胺殘基的轉(zhuǎn)移反應(yīng)的糖鏈添加機(jī)制，并能夠分泌具有由該糖鏈添加機(jī)制所添加的糖鏈的蛋白質(zhì)，其中該糖鏈添加機(jī)制添加含有核心糖鏈和外部糖鏈的糖鏈，該核心糖鏈基本上含有較大多數(shù)的甘露糖和乙酰葡糖胺，該外部糖鏈具有含有非還原性末端半乳糖的末端糖鏈部分。
10.具有人型糖鏈的糖蛋白，該糖蛋白通過根據(jù)權(quán)利要求1-8中任何一項(xiàng)所述的方法獲得。
11.分泌性生產(chǎn)具有人型糖鏈的糖蛋白的方法，其包括以下步驟引入能夠進(jìn)行將半乳糖殘基轉(zhuǎn)移至非還原性末端乙酰葡糖胺殘基的轉(zhuǎn)移反應(yīng)的酶基因和異源糖蛋白基因，從而獲得轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞；和在細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器中表達(dá)該酶。
12.用酶基因轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，該酶能夠進(jìn)行將半乳糖殘基轉(zhuǎn)移至非還原性末端乙酰葡糖胺殘基的轉(zhuǎn)移反應(yīng)，其中該酶定位于植物細(xì)胞中，使得植物細(xì)胞能夠合成具有人型糖鏈結(jié)構(gòu)的糖蛋白。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的植物細(xì)胞，其中該糖鏈結(jié)構(gòu)包含添加的半乳糖殘基。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的植物細(xì)胞，其中該糖鏈結(jié)構(gòu)無β1，2-木糖或α1，3-巖藻糖。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的植物細(xì)胞，其中該糖鏈結(jié)構(gòu)包含有添加至選自下組的(N-乙酰葡糖胺)1-2(甘露糖)2-5(N-乙酰葡糖胺)2的N-連接型糖鏈上的半乳糖殘基GlcNAc1Man3GlcNAc2、GlcNAc1Man5GlcNAc2、GlcNAc2Man3GlcNAc2和GlcNAc1Man4GlcNAc2。
16.根據(jù)權(quán)利要求12所述的植物細(xì)胞，其中該酶定位于植物細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器內(nèi)。
17.從權(quán)利要求12的植物細(xì)胞再生出的植物。
18.從權(quán)利要求16的植物產(chǎn)生的種子。
全文摘要
分泌性生產(chǎn)具有人型糖鏈的糖蛋白的方法，其包括以下步驟引入能夠進(jìn)行將半乳糖殘基轉(zhuǎn)移至非還原性末端乙酰葡糖胺殘基的轉(zhuǎn)移反應(yīng)的酶基因和異源糖蛋白基因，從而獲得轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞；培養(yǎng)植物細(xì)胞；和回收植物細(xì)胞的培養(yǎng)基。
文檔編號C12P21/00GK1549861SQ0280452
公開日2004年11月24日 申請日期2002年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月19日
發(fā)明者藤山和仁, 關(guān)達(dá)治, 吉田敏臣, 臣 申請人:陶氏化學(xué)公司