專利名稱：益生菌的聯(lián)合的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及益生菌的聯(lián)合，該聯(lián)合包括乳桿菌，丙酸菌桿和/或雙歧桿菌的各種聯(lián)合。優(yōu)選益生菌與適宜的益生元聯(lián)合以產(chǎn)生合生素(synbiotic)。本發(fā)明的聯(lián)合可以就這樣食用或可以與適宜的食品，如奶產(chǎn)品或飲料聯(lián)合，并且其有治療用途，例如刺激免疫系統(tǒng)和改善總體健康。
本發(fā)明的背景益生菌是活微生物，當(dāng)給人或動物施用它們時，其通過改善腸內(nèi)微生物平衡促進(jìn)宿主的健康(Fuller，R.人與動物的益生菌，1989，J.Appl.Microbiol.66365-378)。文獻(xiàn)很好地記載的益生菌包括鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)LGG、約氏乳桿菌(L.johnsonii)LAI、干酪乳桿菌(L.casei)Shirota和乳雙歧桿菌(Bifidobacterium lactis)BbI2。此外，在本領(lǐng)域的文獻(xiàn)中還描述了許多其它益生菌(參見，例如M.E.Sanders&J.H.in’tVeld 1999.Antonie van Leeuwenhoek 76293-315，Kluwer AcademicPublishers)。益生菌促進(jìn)健康的作用包括腸內(nèi)菌群的平衡和維持，免疫系統(tǒng)的刺激和抗致癌活性。益生菌在人腸道內(nèi)的有益作用是基于活細(xì)菌細(xì)胞、它們的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和代謝產(chǎn)物引起的幾個因素。通常在營養(yǎng)品中或作為膠囊施用益生菌。
如果一種細(xì)菌基本上滿足下面的要求，那么該細(xì)菌可以稱為益生菌在消化道中普遍的苛刻條件下(胃的低pH，消化系統(tǒng)的酸性等)保持生活力；附著在腸壁上；在腸內(nèi)代謝；技術(shù)上可應(yīng)用(能承受處理)；顯示了臨床檢驗的和報告的健康作用；且食用安全(Lee，Y-K和Salminen，S.1995即將到來的益生菌時代，Trend Food Sci Technol，6241-245)。
益生元是不易消化的食物組分，在結(jié)腸中其通過選擇地刺激一個或一些益生細(xì)菌的生長和活性促進(jìn)人類的健康(Gibson，G.R.和Roberfroid，M.B.1995.飲食調(diào)整人結(jié)腸微生物群-引入益生元概念J.Nutr.1251401-1412)。益生元通常是不易消化的碳水化合物(寡糖或多糖)或在上消化道中不被降解或吸收的糖醇。用在商品中的已知益生元包括菊粉(果寡糖或FOS)和轉(zhuǎn)半乳-寡糖(transgalacto-oligosaccharide)(GOS或TOS)。
合生素定義為益生元和益生菌的聯(lián)合，其中益生元促進(jìn)所添加的微生物的生活力和其對腸的粘附，由此促進(jìn)健康(Gibson和Roberfroid 1995，上文)。當(dāng)已通過小腸的不易消化的碳水化合物在結(jié)腸中發(fā)酵時，形成例如短鏈脂肪酸、其它有機酸、醇、氫和二氧化碳(Gibson和Roberfroid 1995，上文)。發(fā)酵中產(chǎn)生的主要脂肪酸是乙酸、丁酸和丙酸(Cummings，J.H.短鏈脂肪酸，《人結(jié)腸細(xì)菌營養(yǎng)、生理和病理作用》(Human ColonicBacteriaRole in Nutrition，Physiologya nd Pathology)G.R.Gibson和G.T.Macfarlane(編輯)，101-130頁，CRC Press，Boca Raton，1995)。短鏈脂肪酸數(shù)量的增加通常是有益的。盡管不易消化的碳水化合物也可能包括腸道發(fā)酵不利的化合物，但是，它們是結(jié)腸微生物的主要底物(Gibson和Roberfroid 1995，上文)。
人消化道容納了大量與宿主共生生活的細(xì)菌。在消化道的不同部分之間微生物的內(nèi)容有很大差異，所有腸道細(xì)菌中有大約95％出現(xiàn)在結(jié)腸中，結(jié)腸是腸的最重要部分。估計在結(jié)腸中旺盛地生長著400多種細(xì)菌物種。除了這些以外，腸道中還包含稱為暫居微生物的微生物(G.R.Gibson和M.B.Roberfroid(編輯)《結(jié)腸微生群營養(yǎng)和健康》(Colonic Microbiota；Nutrition and Health.)Kluwer Academic Publisher，Dordrecht，1999)。優(yōu)勢物種如下擬桿菌屬(Bacteroides)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、糞球菌屬(Coprococcus)、消化鏈球菌屬(Peptostreptococcus)、真桿菌屬(Eubacterium)和瘤胃球菌屬(Ruminococcus)。乳桿菌屬(Lactobacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、韋榮氏球菌屬(Veillonella)、丙酸桿菌屬(Propionibacterium)和腸桿菌科(Enterobacteriaceae)物種的數(shù)量稍微少些。其中一些物種是有用的微生物，而其它物種甚至可能是有害的。在糞便中平均微生物含量是1012cfu/g(每干物質(zhì))。細(xì)菌在結(jié)腸中降解和發(fā)酵小腸中不吸收的那些食物組分，身體可以利用腸道所吸收的發(fā)酵終產(chǎn)物。除了營養(yǎng)外，結(jié)腸內(nèi)的微生物平衡對人的健康狀況有重要意義(Tannock，G.W.1998.腸道微生物群的研究研發(fā)益生菌的先決條件Int.Dairy J.8527-533)。腸內(nèi)菌群組成的改變或其數(shù)量的突然減少(由于嚴(yán)重腹瀉，抗生素治療等)將增加潛在病原物種的感染性，這可能造成嚴(yán)重的后果(過敏的發(fā)作，腸道疾病，癌癥)。
例如，認(rèn)為腸細(xì)菌產(chǎn)生的β-葡糖醛酸酶有利于致癌化合物的形成。類固醇和其它致癌化合物在肝中代謝，然后與葡糖醛酸綴合。膽汁將綴合的葡糖醛酸內(nèi)脂化合物遞送到小腸，化合物進(jìn)一步經(jīng)過小腸到達(dá)結(jié)腸，在結(jié)腸中葡糖醛酸酶能水解這些化合物，由此釋放毒性化合物進(jìn)入結(jié)腸(Rowland，I.R.1995.結(jié)腸毒理學(xué)腸道微生物群的作用，《人結(jié)腸細(xì)菌營養(yǎng)、生理和病理作用》編者Gibson，G.R.和Macfarlane，G.T.，155-174頁，Boca RatonCRC Press)。真桿菌屬、擬桿菌屬和梭菌屬種被認(rèn)為比雙歧桿菌屬和乳桿菌屬代表物種可以釋放更大量的這些有害酶進(jìn)入腸。因此，這提供了為什么由雙歧桿菌和乳桿菌組成的腸內(nèi)菌群是有益的一個原因。
此外，例如來源于蔬菜和茶的糖苷在小腸中不被吸收，其經(jīng)過小腸到達(dá)結(jié)腸，在結(jié)腸它們可以通過β-葡糖苷酶作用水解，形成有毒或致誘變的苷元化合物(Goldin，B.R.1990.腸道微生物群藥物和致癌劑的代謝Annalsof Medicine 2243-48)。
而且，腸內(nèi)菌群產(chǎn)生降解脲為氨的脲酶。高數(shù)量的氨對腸上皮細(xì)胞有毒(Mobley，H.L.T.和Hausinger，R.P.1989.微生物脲酶意義、調(diào)節(jié)和分子表征Microbiological Review 5385-108)。
人的腸內(nèi)菌群是在生命的早期形成的，此后其組成不會發(fā)生較大的變化。僅可能發(fā)生物種內(nèi)的微小變化(例如，在雙歧桿菌內(nèi))。
隨著對腸內(nèi)菌群重要性的日益增加理解，研究已經(jīng)活躍地集中于發(fā)現(xiàn)可以通過加強有益細(xì)菌物種而減少有害細(xì)菌物種用于影響菌群組成及菌群活動(生活力)的因子。促進(jìn)有益細(xì)菌的益生元被認(rèn)為可以影響微生物的活動。對半乳寡糖(GOS)已經(jīng)進(jìn)行廣泛的研究，其是二、三、四、五和六糖，而且其主要含有半乳糖單元。它們是從乳糖酶促制備的，而且終產(chǎn)物的內(nèi)容取決于所用的酶(Matsumoto，K等，1993.半乳寡糖，《寡糖制備，性質(zhì)和應(yīng)用》(Oligosaccharides.Production，properties andapplication.)編輯Nakakuki，T.，Japanese Technology Reviews.3卷，2號，90-116頁，Gordon and Breach Science Publishers，瑞士，澳大利亞)。較早已經(jīng)證明GOS顯示了例如雙歧因子(bifidogenic)特性，即促進(jìn)雙歧桿菌生長的特性(Ito，M等，1990.施用半乳寡糖對人排泄物中微生物群、糞便重量和腹部感覺的影響Microb.Ecol Health Dis.3285-292)。
背景技術(shù)：
描述在本領(lǐng)域文獻(xiàn)中已經(jīng)大量描述了含有單個益生菌株系的產(chǎn)品和大量不同益生菌的聯(lián)合。在本領(lǐng)域的文獻(xiàn)中也已經(jīng)描述了合生素。
例如EP 904 784公開(N.V.Nutricia)描述了含有雙歧桿菌、屎腸球菌(Enterococcus faecium)和乳桿菌的益生菌產(chǎn)品。此外，該產(chǎn)品可以含有益生元(如多糖和非降解性淀粉)和免疫球蛋白、維生素等。根據(jù)該公開，因為該產(chǎn)品可以例如刺激免疫系統(tǒng)，所以其有促進(jìn)健康的作用。然而，該作用沒有在臨床試驗中被證實，也沒有任何其它生物學(xué)活性的研究。
WO 00/33854，(N.VNutricia)描述了包含益生菌和寡糖的產(chǎn)品。盡管也提到了片球菌屬(Pediococcus)、丙酸桿菌屬、明串珠菌屬(leuconostoc)和酵母屬(Saccharomyecs)，但是此益生菌特別指乳桿菌屬和雙歧桿菌屬。涉及的益生元包括轉(zhuǎn)半乳寡糖(TOS)和果寡糖(FOS)。根據(jù)該公開，特別有益的聯(lián)合包括鼠李糖乳桿菌和轉(zhuǎn)半乳寡糖或馬鈴薯半乳聚糖的水解產(chǎn)物，在實施例中也示例了這種聯(lián)合和其制備。根據(jù)該公開，產(chǎn)品有促進(jìn)健康的作用，而且在腸道失調(diào)治療方面特別有用。然而，沒有以任何方式證明其活性。
WO 97/34615(University of New South Wales)描述了益生菌組合物，其除了含有一種或多種益生菌外還含有耐受性(非降解性)淀粉和寡糖，在這三種成分間獲得了協(xié)同效應(yīng)。所提到的益生菌是酵母屬，雙歧桿菌屬，擬桿菌屬，梭菌屬(Clostridium)，梭桿菌屬，丙酸桿菌屬，乳球菌屬，鏈球菌屬，腸球菌屬，葡萄球菌屬(Staphylococcus)，消化鏈球菌屬和乳桿菌屬；寡糖尤其包括果寡糖和半乳寡糖。實施例表明了雙歧桿菌、玉米淀粉和果寡糖對雙歧桿菌數(shù)量有協(xié)同效應(yīng)。然而，沒有描述任何治療效果。
US 5,895,648(Sitia-Yomo S.p.A.)描述了益生菌組合物，其包含凍干形式的活細(xì)菌，即至少兩種雙歧桿菌和至少兩種乳桿菌或鏈球菌，它們與一個或多個寡糖相聯(lián)合。組合物包含一共4到20重量份的益生菌和5到22重量份的寡糖，其中所提及的寡糖是例如半乳寡糖和果寡糖，特別提到了菊粉。提到的益生菌包括短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)、嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacterium infantis)、長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)、兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)、保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)、干酪乳桿菌、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)和屎鏈球菌(Streptococcus faecium)。根據(jù)該公開，含有益生菌和益生元的混合物可以加到基于奶的甜食、奶或汁中以平衡腸的功能。然而，沒有描述該聯(lián)合的任何生物活性。
出版物Milchwissenschaft(1998)，53卷，11號，603-605頁描述了含有三種細(xì)菌株系費氏丙酸桿菌舍氏亞種(Propionibacterium freudenreichiisubsp.shermanii)MTCC 1371、嗜酸乳桿菌R.和兩歧雙歧桿菌NDRI的PAB奶。該產(chǎn)品中沒有加益生元。根據(jù)該公開，PAB奶適于嬰兒和兒童，也適合患有乳糖不耐受癥的人。
WO 99/10476描述了特定細(xì)菌株系，即鼠李糖乳桿菌HN001(NM97/09514)和HN067(NM97/01915)及嗜酸乳桿菌HN017(NM97/09515)和乳雙歧桿菌HN019(NM97/09513)對免疫系統(tǒng)的刺激作用，該刺激作用經(jīng)測定為增強的吞噬作用。這些株系可以單獨使用，或加入到奶產(chǎn)品或藥物制劑中。
US 5,902,578(Abbott Laboratories)涉及用羅伊氏乳桿菌(lactobacillus reuterii)、嗜酸乳桿菌和嬰兒雙歧桿菌混合物預(yù)防和治療腹瀉的方法，該混合物制備為粉末、液體或丸劑。
在背景技術(shù)中也已經(jīng)描述了上述類型的益生菌和合生素的生物學(xué)與治療作用。作為例子可以提到Gallagher，D.等，Journal of Nutrition(1996)，126卷，5號，1362-1371頁，其中描述了在大鼠中雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌對結(jié)腸癌的作用，并指出通過聯(lián)合使用細(xì)菌和果寡糖獲得了最好結(jié)果；而且，Kirjavainen，P.等，Clinical and Diagnostic LaboratoryImmunology(N0v 1999)，6卷，6號，799-802頁描述了兩個單獨研究的乳酸株系，鼠李糖乳桿菌GG和費氏丙酸桿菌舍氏亞種JS對小鼠淋巴細(xì)胞水平和由此的免疫應(yīng)答的積極效果。但沒有描述或研究這兩個細(xì)菌的聯(lián)合。
在本領(lǐng)域的文獻(xiàn)中也已經(jīng)描述了益生菌和有治療效果的其它物質(zhì)的聯(lián)合。例如，WO 97/29762和WO 97/29763(Procter&Gamble Company)描述了與半乳寡糖或果寡糖聯(lián)合的乳桿菌和雙歧桿菌和石南科(Ericaceae)植物或其提取物一起在尿道感染和腸失調(diào)治療中的用途，而且，WO 00/29007(Reddy)描述了益生菌，如乳球菌屬、乳桿菌屬、片球菌屬、鏈球菌屬、丙酸桿菌屬、短桿菌屬(Brevibacterium)、青霉屬(Penicillium)和酵母屬與基于草本植物的天然產(chǎn)品和藥樣物質(zhì)的聯(lián)合。
盡管已經(jīng)廣泛研究了益生菌和合生素，但是在相當(dāng)大程度上尚未得到好的和多種多樣的商品。因此，存在給消費者提供新產(chǎn)品的繼續(xù)而明顯的需要，所述新產(chǎn)品有清楚證實的益生菌效果，并且可以制備成使其能作為例如每日飲食的方便部分或增補物使用的形式。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明的目的是提供新的含益生菌的產(chǎn)品，其益生菌作用已經(jīng)清楚證明，其使用起來舒適而且對消費者是健康的。
用包含多種益生菌的本發(fā)明新聯(lián)合達(dá)到了這些目的。因此本發(fā)明是基于新的聯(lián)合，其包含兩種乳桿菌株系、一種丙酸桿菌和/或一種雙歧桿菌。此外，優(yōu)選此聯(lián)合還包含支持上述微生物生長的益生元。
根據(jù)本發(fā)明，主要利用兩個乳桿菌株系，即鼠李糖乳桿菌LGG(ATCC53103)和鼠李糖乳桿菌LC705(DSM 7061)。丙酸桿菌通常是費氏丙酸桿菌舍氏亞種PJS(DMS 7067)。雙歧桿菌可以是有益生菌作用的任何雙歧桿菌，通常使用屬于短雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、長雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌和青春雙歧桿菌(Bifidobacterium adolescentis)的株系。
通常至少包含這些細(xì)菌中的三種，并且優(yōu)選所述聯(lián)合包含鼠李糖乳桿菌LGG和/或費氏丙酸桿菌舍氏亞種PJS。
最優(yōu)選的聯(lián)合是四種株系，即鼠李糖乳桿菌LGG(ATCC 53103)、鼠李糖乳桿菌LC705(DSM 7061)、費氏丙酸桿菌舍氏亞種PJS(DMS 7067)和嬰兒雙歧桿菌Bbi99(DSM 13692)的聯(lián)合。然而，如果期望，聯(lián)合中可以包含任何雙歧桿菌(如BbI2)。所用益生元優(yōu)選半乳寡糖(GOS)。
另一個優(yōu)選的組合物是雙歧桿菌和丙酸桿菌的聯(lián)合，其中可以與費氏丙酸桿菌舍氏亞種PJS(DMS 7067)一起使用任何雙歧桿菌。
可以就此使用此新的聯(lián)合，或?qū)⑵溆米髁硪粋€產(chǎn)品(如藥品或食品)的一部分。本發(fā)明的聯(lián)合對人腸內(nèi)平衡有有益的效果，因為它增加了腸內(nèi)酯(entero-lactone)的產(chǎn)生并降低了不利的高pH值。該聯(lián)合通過增加淋巴細(xì)胞和γ-干擾素(IFN)的量及通過降低致癌物質(zhì)的形成也影響了免疫應(yīng)答。因此，本發(fā)明的聯(lián)合對于腸失調(diào)、過敏和癌癥的預(yù)防和治療及促進(jìn)總體健康是有用的。
因此根據(jù)本發(fā)明，此聯(lián)合也適用作治療物質(zhì)和用于治療物質(zhì)的制備中。
本發(fā)明的詳述在現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)描述了本發(fā)明所用的株系，鼠李糖乳桿菌GG(LGG)、干酪乳桿菌鼠李糖亞種(Lactobacillus casei ssp.rhamnosus)LC705和費氏丙酸桿菌舍氏亞種JS(PJS)?？梢园谠撀?lián)合中的嬰兒雙歧桿菌Bbi99是一種新的株系，在下面將對其作更詳細(xì)描述。
例如，在美國專利5,032,399，(Gorbach&Goldin)中描述了鼠李糖乳桿菌GG(LGG)。該株系是從人糞便中分離的，它在pH3中能很好生長，并且在甚至更低pH及高膽汁酸含量中也能存活。該株系對粘膜和上皮細(xì)胞都顯示了優(yōu)良的粘附作用。其從葡萄糖可以得到很好的乳酸產(chǎn)量當(dāng)在MRS肉湯中生長時，該株系產(chǎn)生了1.5-2％的乳酸。該株系不發(fā)酵乳糖，因此不從乳糖產(chǎn)生乳酸。該株系利用下面的碳水化合物D-阿拉伯糖，核糖，半乳糖，D-葡萄糖，D-果糖，D-甘露糖，鼠李糖，半乳糖醇，肌醇，甘露醇，山梨糖醇，N-乙酰氨基葡萄糖，苦杏仁苷，對苯二酚葡萄糖苷，七葉苷，水楊苷，纖維二糖，麥芽糖，蔗糖，海藻糖，松三糖，龍膽二糖，D-塔格糖，L-巖藻糖和葡糖酸。該株系在+15℃-45℃生長良好，最適溫度是30-37℃。鼠李糖乳桿菌GG保藏在保藏單位美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，保藏號ATCC 53103。
在F1專利92498(Valio Oy)中較詳細(xì)地描述了干酪乳桿菌鼠李糖亞種LC705。LC705是以鏈的形式存在的革蘭氏陽性短桿菌；它是同型發(fā)酵細(xì)菌；弱蛋白水解；在+15℃-45℃生長良好；不從精氨酸產(chǎn)生氨；過氧化氫酶陰性；當(dāng)在MRS肉湯(LAB M)中生長時，該株系產(chǎn)生1.6％有L(+)構(gòu)型旋光活性的乳酸；該株系分解檸檬酸(0.169％)，因此產(chǎn)生雙乙酰和3-羥基丁酮；該株系可以發(fā)酵至少下列碳水化合物(糖，糖醇)核糖，半乳糖，D-葡萄糖，D-果糖，D-甘露糖，L-山梨糖，鼠李糖，甘露醇，山梨糖醇，甲基-D-糖苷，N-乙酰氨基葡萄糖，苦杏仁苷，對苯二酚葡萄糖苷，七葉苷，水楊苷，纖維二糖，麥芽糖，乳糖，蔗糖，海藻糖，松三糖，龍膽二糖，D-松二糖和D-塔格糖。LC705弱粘附于粘膜細(xì)胞，但是適度地粘附于上皮細(xì)胞。在低pH值和高膽汁酸含量中，該株系的生活力良好。在5％鹽濃度中該株系很好地存活，在10％鹽濃度中該株系相當(dāng)好地存活。干酪乳桿菌鼠李糖亞種LC705保藏在德意志微生物保藏中心GmbH(DSM)，保藏號DSM 7061。
在F1專利92498(Valio Oy)中也較詳細(xì)地描述了費氏丙酸桿菌舍氏亞種JS(PJS)。PJS為革蘭氏陽性短桿菌；它可以發(fā)酵葡萄糖，果糖，半乳糖和乳糖；它能很好地發(fā)酵乳酸；它的最適生長溫度是32℃。在低pH值和高膽汁酸含量中，該株系的生活力是優(yōu)良的。費氏丙酸桿菌舍氏亞種JS保藏在德意志微生物保藏中心GmbH(DSM)，保藏號DSM 7067。
從健康新生兒的糞便中分離了嬰兒雙歧桿菌Bbi99。嬰兒雙歧桿菌Bbi99是革蘭氏陽性多形桿菌。該株系是過氧化氫酶陰性，果糖-6-磷酸-磷酸轉(zhuǎn)酮酶陽性(F6PPK)及α-和β-半乳糖苷酶與α-和β-葡糖苷酶陽性。嬰兒雙歧桿菌Bbi發(fā)酵下列碳水化合物核糖，半乳糖，D-葡萄糖，D-果糖，D-甘露糖，甲基-D-甘露糖，N-乙酰氨基葡萄糖，七葉苷，水楊苷，纖維二糖，麥芽糖，乳糖，蜜二糖和龍膽二糖。最適的生長溫度是30-40℃而最適pH6.5-7.0。當(dāng)在含有己糖的肉湯中生長時，該株系產(chǎn)生L-乳酸和乙酸(以2∶3的比率)。DNA的G+C含量是55-67mol％。根據(jù)布達(dá)佩斯條約，嬰兒雙歧桿菌Bbi99在2000年8月28日保藏在德意志微生物保藏中心GmbH(DSM)，保藏號DSM 13692。
本發(fā)明的聯(lián)合也可以包含其它微生物，如奶品工業(yè)所用引子中含有的微生物和益生菌。存在很多文獻(xiàn)很好記載的引子株系，從生產(chǎn)商如HansenA/S，(丹麥)和Danisco/Wiesby GmbH(德國)可以商購得到該引子株系。
為了制備本發(fā)明的聯(lián)合，用本領(lǐng)域常規(guī)的方法培養(yǎng)微生物。它們可以作為純培養(yǎng)物或作為不同混合的培養(yǎng)物培養(yǎng)。培養(yǎng)物可以就此使用，或可以如期望地例如通過純化、濃縮、凍干或精加工進(jìn)行處理以生產(chǎn)各種制品。
在聯(lián)合中使用足夠量的益生菌以產(chǎn)生期望的益生菌效果。因此，每種益生菌的量根據(jù)例如所用的株系和它們的數(shù)量、益生菌細(xì)胞總數(shù)、總的日劑量及產(chǎn)品的其它特性和組分可以在寬的范圍內(nèi)變化。此聯(lián)合的日劑量通常包含約106-1010cfu的益生菌。
優(yōu)選向聯(lián)合中加入一個或多個益生元以形成合生素。根據(jù)涉及的聯(lián)合中含有的微生物選擇益生元，以便其能支持微生物的生長。適宜的益生元可以包括例如寡糖，特別是半乳寡糖(GOS)，低聚異麥芽酮糖(palatinoseoligosaccharide)，大豆寡糖，龍膽寡糖，低聚木糖，非降解性淀粉，乳蔗糖，乳果糖，乳糖醇，麥芽糖醇，聚右旋糖或類似物。向合生素加入足夠量的益生元以產(chǎn)生益生元效果。可以根據(jù)例如涉及的株系、包含的益生元的量及產(chǎn)品的其它內(nèi)容物和應(yīng)用，確定什么是足夠量。因此，該量也在寬的范圍內(nèi)變化；例如在日劑量中它可以是0.5到5g。
益生元不一定需要包含在聯(lián)合中。根據(jù)終產(chǎn)品和應(yīng)用的目的，盡管益生元可以幾乎與益生菌聯(lián)合同時使用，但是單獨地食用益生元可能更好。在一些情況下，可能僅消耗益生菌聯(lián)合就足夠了，因此根本不需要益生元。當(dāng)宿主腸內(nèi)條件不需要添加益生元就適合益生菌生長時以及當(dāng)正常飲食中含有益生元時(例如，如果它在麥片粥或黑麥面包中提供時)即是這種情況的例子。
本發(fā)明已證明所用微生物滿足設(shè)定的益生菌標(biāo)準(zhǔn)它們在消化道的苛刻條件下很好地生存，很好地粘附于腸道細(xì)胞并在腸內(nèi)很好地繁殖。也已證明它們顯示了優(yōu)良的生物學(xué)作用；例如，它們可以增加從健康觀點考慮的期望微生物的數(shù)量而降低腸內(nèi)有害微生物的數(shù)量，它們可以降低有害酶的活性并由此降低有害或甚至致癌物質(zhì)的形成，而且它們可以對免疫應(yīng)答產(chǎn)生刺激作用。
本發(fā)明的聯(lián)合可以就此或以例如在制備藥品的常規(guī)方法中制造的膠囊，丸劑或片劑形式使用。也可以向各種可食用產(chǎn)品，如食品、飲料或糖果工業(yè)產(chǎn)品、促進(jìn)健康的產(chǎn)品、天然產(chǎn)品等中加入本發(fā)明的聯(lián)合。在本發(fā)明上下文中，優(yōu)選含有本發(fā)明聯(lián)合的產(chǎn)品，如奶產(chǎn)品，特別是酸奶和其它發(fā)酵的奶產(chǎn)品；奶酪和糊；兒童食品；汁和湯；和膠囊。膠囊形式的產(chǎn)品通常僅含有益生菌聯(lián)合，而益生元單獨服用。
可以以常規(guī)方法制備終產(chǎn)品，本發(fā)明聯(lián)合可以在制備時加入，或者此后在終產(chǎn)品精加工期間加入。
參考下面的實施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明，實施例僅意指示例本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
實施例1本發(fā)明聯(lián)合的制備從細(xì)菌混合物中制備本發(fā)明聯(lián)合，當(dāng)期望時，添加半乳寡糖(GOS)作為益生元。從四個株系，即鼠李糖乳桿菌LGG(ATCC 53103)、鼠李糖乳桿菌LC705(DSM 7061)、費氏丙酸桿菌舍氏亞種PJS(DSM 7067)和嬰兒雙歧桿菌Bbi99(DSM 13692)的細(xì)菌培養(yǎng)物(濃縮物或冷凍干燥的粉末)形成所述細(xì)菌混合物。
單獨地培養(yǎng)LGG和雙歧桿菌在包含5.0％低蛋白乳清粉(Valio Oy)，0.5％酪蛋白水解產(chǎn)物(ValioOy)，0.5％工業(yè)酵母和0.0015％MnSO4×H2O的培養(yǎng)基中培養(yǎng)LGG。在水中溶解培養(yǎng)基成分，滅菌培養(yǎng)基(在120℃，20分鐘)。在37℃的溫度和pH5.8(用NH4OH調(diào)節(jié))下及在100rpm的混合速率下培養(yǎng)約18小時。培養(yǎng)后，用10％(v/v)保護劑補料(如46％的蔗糖肉湯或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的類似替代物)濃縮、洗滌和冷凍干燥細(xì)菌細(xì)胞。培養(yǎng)物中最終細(xì)菌含量＞1×109cfu/ml，濃縮物中＞1×109cfu/g，凍干粉末中＞1×1011cfu/g。
雙歧桿菌的生長培養(yǎng)基的組成如下低蛋白乳清粉(Valio Ltd.)4％，酪蛋白水解產(chǎn)物(Valio Ltd.)1.0％，工業(yè)酵母(LAB M)1.0％，半胱氨酸-HCl(Merck，Darmstadt，德國)0.03％。將培養(yǎng)基的其它組分最先溶解在水中，然后加入半胱氨酸-HCl，滅菌培養(yǎng)基(在120℃，20分鐘)。在37℃的溫度和pH6.7(用NH4OH調(diào)節(jié))下及在100rpm的混合速率下培養(yǎng)約18-20小時。培養(yǎng)物中的細(xì)菌含量＞1×109cfu/ml。培養(yǎng)后，用10％(v/v)保護劑補料(如46％的蔗糖肉湯或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的類似替代物)濃縮、洗滌和冷凍干燥細(xì)菌細(xì)胞。濃縮物中細(xì)菌含量＞1×1010cfu/g，凍干粉末中＞1×1011cfu/g。
通過以1∶2的比率接種細(xì)菌細(xì)胞到基于乳清的生長肉湯中，一起培養(yǎng)LC705和PJS?；谌榍宓纳L培養(yǎng)基含有3.5-5％低蛋白乳清粉(ValioOy)，1.0％酪蛋白水解產(chǎn)物，1.0％酵母提取物(Valio Oy)。在30℃培養(yǎng)所述株系3天，其中通過自動pH調(diào)整方法維持pH在4.5。培養(yǎng)后，每個細(xì)菌株系的含量＞1×109cfu/ml。培養(yǎng)后，用10％(v/v)保護劑補料，如46％的蔗糖肉湯或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的類似替代物濃縮，洗滌和冷凍干燥細(xì)菌細(xì)胞。濃縮物中每種細(xì)菌的含量＞1×1010cfu/g，凍干粉末中＞1×10cfu/g。
也可以單獨培養(yǎng)所述的株系。在此情況下，LC705按上述與共同培養(yǎng)有關(guān)的方法進(jìn)行培養(yǎng)，但在30℃培養(yǎng)時間僅是1天。PJS在包含2％低蛋白乳清粉、1.0％酪蛋白水解產(chǎn)物和1％酵母提取物的基于乳清的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在pH6.3中，在30℃培養(yǎng)該株系3天，之后，執(zhí)行上述過程。
以1∶1∶1的比率混合濃縮物或粉末。當(dāng)LC 705和PJS單獨培養(yǎng)時，混合的比率是1∶1∶1∶1。將獲得的濃縮物或凍干粉末混合物用作本聯(lián)合的不同產(chǎn)品施用物中的益生菌部分。向產(chǎn)品施用物中加入混合物以在產(chǎn)品中獲得下列最終細(xì)菌含量
LGG＞106cfu/g產(chǎn)品LC 705 ＞106cfu/g產(chǎn)品PJS＞106cfu/g產(chǎn)品雙歧桿菌 ＞106cfu/g產(chǎn)品當(dāng)期望時，GOS(Valio Oy)作為單獨產(chǎn)物加入到產(chǎn)品施用物中以在產(chǎn)品中獲得約0.5-5g/劑的GOS濃度。
實施例2株系的粘附特性和它們在腸內(nèi)條件下的耐受性根據(jù)Ouweland等(Ouwehand，A.C.，Kirjavainen，P.V.，Grnlund，M.-M.，Isolauri，E.，和Salminen，S.J.1999.益生微生物對腸粘膜的粘附Dairy J.9623-630)，檢測這些益生菌株系對粘膜的粘附性。LGG和益生菌PJS極好地粘附于腸粘膜上，Bbi99中度粘附，LC705弱粘附。粘附是微生物在腸內(nèi)產(chǎn)生有益效果的先決條件。另一方面，已知LC705可以很好地粘附上皮細(xì)胞，這與LGG類似(Lehto，E.和Salminen S.1997.兩種乳桿菌、一種乳球菌和一種丙酸桿菌對培養(yǎng)的人腸CaCO-2細(xì)胞系的粘附，Bioscience Microflora 1613-17)。當(dāng)腸內(nèi)失去平衡和保護性粘膜弱化時，該特性是有益的。
表1益生菌株系的粘附特性

體外試驗表明所述株系耐受生理膽汁鹽含量和胃的低pH。
在MRS肉湯中，在不同pH值下檢測所述株系，其中pH用乳酸調(diào)到數(shù)值pH4，pH3和pH2。在pH肉湯中接種1％的待研究的株系(新鮮的培養(yǎng)物)，在37℃生長3小時，之后，用適宜所述株系的瓊脂測定活細(xì)胞的含量(見表5)。在pH3中，在3小時過程中，所述株系很好地保持了它們的生活力。丙酸桿菌即使在pH2中也保持了生活力。在試驗中，細(xì)菌不受食物帶有的成分(如脂肪)的保護，因此，我們認(rèn)為，當(dāng)它們與食物一起體內(nèi)消耗時可以保存得甚至更好。
表2在調(diào)整pH的MRS肉湯中培養(yǎng)的株系的細(xì)胞含量

關(guān)于膽汁鹽的耐受性，通過接種1％新鮮培養(yǎng)物到待研究的膽汁鹽MRS肉湯中，在含有0.3％和0.5％Oxgal(Sigma)膽汁鹽的MRS肉湯中檢驗所述株系。
在37℃，在肉湯中培養(yǎng)所述株系3小時，之后，用適宜該株系的瓊脂測定活細(xì)胞的含量(見表5)。所有株系均經(jīng)受住了處理而極好地存活下來。
表3在0.3％和0.5％膽汁鹽含量中培養(yǎng)的株系的細(xì)胞含量

實施例3篩選適宜本聯(lián)合的益生元通過在添加有1％待研究益生元的無糖MRS肉湯中培養(yǎng)每個株系，研究對于每個株系可選擇使用的益生元。將每個株系在其最適溫度下培養(yǎng)1-2天。在試驗期間，通過用分光光度法測定培養(yǎng)物的濁度觀察細(xì)菌生長。如表4所示，對于所有四株株系的生長而言最好的促進(jìn)劑是1％半乳-寡糖(GOS)增補物。
表4 益生元對細(xì)菌生長的作用

實施例4終產(chǎn)物的制備用功能飲料(Finnish‘tehojuoma’中；Valio Oy)作為制備汁(劑量65ml/天)的基礎(chǔ)，其中所述每劑量(＝65ml)汁中添加0.1g凍干的細(xì)菌混合物和70％GOS糖漿3.8g。用沒有添加GOS糖漿或細(xì)菌混合物的相應(yīng)汁作為對照。
成品汁的細(xì)菌含量如下LGG＞107cfu/mlLC705 ＞107cfu/mlPJS＞108cfu/mlBbi99 ＞107cfu/ml產(chǎn)品用于下面的臨床試驗中，其中pro＝汁+益生菌增補物和syn＝汁+益生菌+益生元增補物。
實施例5本發(fā)明聯(lián)合的臨床效果對20位男性臨床試驗實施例4所述的飲料，該飲料包含上述益生菌聯(lián)合(Pro)或益生菌聯(lián)合和益生元(Syn)。根據(jù)研究計劃，受試者每日飲用飲料，而且在研究期間，不允許他們消費任何其它含有益生菌的產(chǎn)品。研究方案是，試驗開始于安慰劑導(dǎo)入期(run-in period)，接著進(jìn)入兩周的益生菌期和隨后的合生素期，然后結(jié)束于所謂的安慰劑洗脫期(wash-outperiod)。
研究方案和進(jìn)度表

每一期的最后，受試者提供了糞便樣品和血液樣品(＝N)。
從糞便樣品分析微生物和酶，從血液分析腸內(nèi)酯含量和免疫應(yīng)答。
5.1微生物微生物的數(shù)量用本領(lǐng)域已知的方法和表5中的參數(shù)確定總?cè)樗峋暮?LGG、LC705)，總丙酸桿菌含量(PJS)和總雙歧桿菌的含量。
表5測定微生物的方法

對體內(nèi)腸細(xì)菌細(xì)胞含量的影響在受試者使用含有益生菌產(chǎn)品的期間，在受試者的樣品中LGG，LC705和PJS的含量顯著增加(表6)。因為從最開始試驗時雙歧桿菌含量就高，所以推測改變僅發(fā)生在種內(nèi)。
表6細(xì)菌含量(log，cfu/g糞便；±標(biāo)準(zhǔn)差)

向攝取試驗中消費的產(chǎn)品中添加合生素改善了所加入的益生菌在腸內(nèi)的生活力。例如，這已通過合生素期間LGG含量的增加得到了證明。
對pH的影響在服用益生菌混合物和合生素的組中，有最初高于7的pH水平的人的pH水平降低了，而在最初pH值低于7的人中沒有觀察到降低(表7)。
表7益生菌和合生素補充后DH的變化

5.2酶如Ling等(Ling，W-H.，Korpela，R.，Mykknen，H.，Salminen，S.，和Hnninen，O.1994補充乳桿菌GG減少健康成年女性的結(jié)腸水解和還原活性Journal of Nutrition 124，18-24)所述處理糞便樣品。
如Freeman(Freeman，II.，J.1986.在1，2-二甲基肼誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸癌發(fā)生中不同純化的纖維素果膠和半纖維素纖維對糞便中酶的影響Cancer Research 465529-5532)所述測定β-葡糖醛酸酶和β-葡糖苷酶，根據(jù)制造商(Boehringer Mannheim cat no.542946)的說明書測定脲酶。
在試驗過程中，在益生菌攝取和合生素攝取期間，β-葡糖醛酸酶、脲酶和β-葡糖苷酶的含量減少了(表8)。攝取后，酶的水平恢復(fù)到正常。合生素比益生菌混合物對酶的水平有更強的降低作用。
表8酶含量的變化(nmol/分鐘/g糞便)

葡糖苷酶和葡糖醛酸酶的代謝產(chǎn)生了致癌化合物。通過本發(fā)明的益生菌和合生素聯(lián)合產(chǎn)生的酶活性的顯著降低清楚地證明了與致癌物質(zhì)形成降低有關(guān)的積極效果。
5.3腸內(nèi)酯的含量用Adlercreutz等的方法(Adlercreutz，H.，F(xiàn)ostis T.，Lampe，J.，Whl，K.，Mkel，T.，Brunow，G.和Hase，T.1993.通過同位素稀釋氣相色譜質(zhì)譜定量測定雜食和素食女性血漿中的木脂體和異黃酮類化合物Scan J.Clin Lab Invest 535-18)測定腸內(nèi)酯的含量。
作為合生素攝取的結(jié)果，最初腸內(nèi)酯水平＜10nmol/l的受試者的腸內(nèi)酯水平顯著增加了(達(dá)到11.2的水平)。
在試驗期間，沒有觀察到在試驗開始時血清腸內(nèi)酯水平已經(jīng)正常(10＜x＞30)的人的腸內(nèi)酯水平有變化。結(jié)果如表9所示。
表9試驗期間腸內(nèi)酯含量(根據(jù)最初的水平分組)

已經(jīng)證明腸內(nèi)酯含量與患癌癥的風(fēng)險明顯相關(guān)含量越高，風(fēng)險越低。因此，該結(jié)果也表明本發(fā)明的益生菌和合生素聯(lián)合對降低癌癥風(fēng)險具有有益的效果。
5.4免疫學(xué)研究對淋巴細(xì)胞功能的影響開始合生素產(chǎn)品攝取前和已經(jīng)開始攝取后4周后研究淋巴細(xì)胞功能。
按如下研究淋巴細(xì)胞的功能用Ficoll梯度從外周血分離淋巴細(xì)胞。在RPMI培養(yǎng)肉湯(NationalPublic Health Institute；department of nutrient broth)中用PHA促細(xì)胞分裂劑(Sigma)刺激淋巴細(xì)胞，該培養(yǎng)肉湯含有5％滅活的AB+血清(FinnishRed Cross)和L-谷氨酰胺。48小時后，從4個相鄰的培養(yǎng)孔中收集細(xì)胞培養(yǎng)基用于細(xì)胞因子測定，在所述培養(yǎng)孔的為每個孔中細(xì)胞濃度為每200μl培養(yǎng)肉湯有200 000個細(xì)胞并且孔中有或無促細(xì)胞分裂劑。加入胸腺嘧啶核苷16小時后收集細(xì)胞，測定摻入DNA的放射性胸腺嘧啶核苷(cpm)。通過用ELISA方法，從細(xì)胞培養(yǎng)肉湯測定細(xì)胞因子IL-4，IL-5，TGF-β1和IFN-γ的含量。
在跟蹤調(diào)查期間，沒有檢測到淋巴細(xì)胞分泌的IL-4，IL-5和TGF-β1含量的變化。在跟蹤調(diào)查期間，由PHA刺激的淋巴細(xì)胞分泌的IFN-γ含量顯著增加(p＝0.009，Wilcoxon檢驗，參見

圖1)。在跟蹤調(diào)查期間，淋巴細(xì)胞的自發(fā)和PHA刺激的增殖均增加(兩種情況p＝0.0002，wilcoxon檢驗，圖1和2)。
根據(jù)研究的結(jié)果，因此，合生素產(chǎn)品的應(yīng)用促進(jìn)了受試者淋巴細(xì)胞的增殖和IFN-γ細(xì)胞因子的分泌。IFN-γ屬于所謂的Th1細(xì)胞因子，其增強細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞的功能，是IL-4和TGF-β1細(xì)胞因子的拮抗劑。據(jù)報告，易于過敏的人的IFN-γ分泌低下。此外，據(jù)推測有特應(yīng)性和過敏反應(yīng)易感性的兒童在IFN-γ分泌上成熟緩慢。因此，本發(fā)明聯(lián)合對IFN-γ分泌的顯著刺激作用證明了它們在過敏癥的預(yù)防和治療中的效力。
權(quán)利要求
1.一種聯(lián)合，其特征在于它包含微生物鼠李糖乳桿菌LGG(ATCC53103)、鼠李糖乳桿菌LC705(DSM 7061)、費氏丙酸桿菌舍氏亞種PJS(DMS 7067)和雙歧桿菌中的至少3種，或包含費氏丙酸桿菌舍氏亞種PJS(DMS 7067)和雙歧桿菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聯(lián)合，其特征在于它包含鼠李糖乳桿菌LGG(ATCC 53103)、鼠李糖乳桿菌LC705(DSM 7061)、費氏丙酸桿菌舍氏亞種PJS(DMS 7067)和雙歧桿菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聯(lián)合，其特征在于它包含費氏丙酸桿菌舍氏亞種PJS(DMS 7067)和雙歧桿菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求1到3任一項所述的聯(lián)合，其特征在于雙歧桿菌是嬰兒雙歧桿菌Bbi99(DSM 13692)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1到4任一項所述的聯(lián)合，其特征在于它進(jìn)一步包含常規(guī)的引子微生物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1到5任一項所述的聯(lián)合，其特征在于它還包含益生元或與益生元一起使用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的聯(lián)合，其特征在于益生元是寡糖，低聚木糖或聚右旋糖。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的聯(lián)合，其特征在于益生元是半乳寡糖(GOS)。
9.權(quán)利要求1到8任一項所述的聯(lián)合，其用做治療物質(zhì)。
10.包含至少下面兩種微生物的聯(lián)合鼠李糖乳桿菌LGG(ATCC53103)、鼠李糖乳桿菌LC705(DSM 7061)、費氏丙酸桿菌舍氏亞種PJS(DMS 7067)和雙歧桿菌，但所述聯(lián)合不是鼠李糖乳桿菌LGG(ATCC53103)和雙歧桿菌的聯(lián)合，其用做治療物質(zhì)。
11.權(quán)利要求1到8任一項所述的聯(lián)合在食品工業(yè)、制藥工業(yè)、或健康促進(jìn)產(chǎn)品或天然產(chǎn)品的生產(chǎn)中的用途。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的用途，其特征在于將所述聯(lián)合添加到奶產(chǎn)品、飲料、汁、湯或兒童食品中。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的用途，其特征在于以單劑量的形式制備所述聯(lián)合。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的用途，其特征在于所述劑量形式是膠囊。
全文摘要
本發(fā)明涉及益生菌的聯(lián)合，其包含乳桿菌、丙酸桿菌和/或雙歧桿菌的不同聯(lián)合。優(yōu)選益生菌與適合的益生元聯(lián)合以形成合生素。本發(fā)明的聯(lián)合可以就此使用，或與適合的食品或藥品聯(lián)合，并且其有治療用途，例如用于刺激免疫系統(tǒng)和改善總體的健康。
文檔編號A23L1/03GK1487798SQ02804117
公開日2004年4月7日 申請日期2002年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月25日
發(fā)明者A·梅于雷-梅基寧, T·索瑪拉尼恩, O·瓦拉拉, A 梅于雷-梅基寧, 昀 岫 申請人:瓦利奧有限公司