專利名稱：制備3-(2-羥基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(hmbpa)的方法和微生物的制作方法
相關(guān)申請(qǐng)本發(fā)明要求2001年1月19日提交的在先申請(qǐng)臨時(shí)專利申請(qǐng)系列號(hào)60/263,053(未決)的利益。本發(fā)明也與2000年9月21日申請(qǐng)的美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)09/667,569(未決)相關(guān)，它是1999年9月21日申請(qǐng)的美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)09/400,494(放棄)的部分繼續(xù)申請(qǐng)。美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)09/667,569還要求在先提交的(2000年6月7日申請(qǐng)的)臨時(shí)專利申請(qǐng)系列號(hào)60/210,072，(2000年7月28日申請(qǐng)的)臨時(shí)專利申請(qǐng)系列號(hào)60/221,836，和(2000年8月24日申請(qǐng)的)臨時(shí)專利申請(qǐng)系列號(hào)60/227,860的利益。上面提及的每個(gè)申請(qǐng)的完整內(nèi)容均引入這里作為參考。
背景技術(shù)：
合成化學(xué)化合物的傳統(tǒng)方法是從大量化學(xué)制品合成，該方法被多種因素所限制，如底物的可獲得性和/或費(fèi)用，拆解復(fù)雜的產(chǎn)物混合物的困難，合成大量純化形式的化合物的復(fù)雜性和制備手性化合物的困難。因此，研究者近來(lái)在尋找能表達(dá)在各種生物合成過(guò)程中(例如，在藥物化合物，研究試劑，營(yíng)養(yǎng)藥，維生素，營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑，抗生素化合物等等的合成中)有用的酶的細(xì)菌或微生物系統(tǒng)。尤其是，生物轉(zhuǎn)化方法已經(jīng)被評(píng)定為利于優(yōu)選化合物制備的方法，而且近來(lái)直接微生物合成的方法已經(jīng)成為制藥和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中投入大量研究的焦點(diǎn)。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及直接微生物合成[R]-3-(2-羥基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸或3-(2-羥基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(“HMBPA”)的方法，該化合物在本文中可交換稱作“β-丙氨酸2-(R)-羥基異戊酸”，“β-丙氨酸2-羥基異戊酸”，“β-丙氨酰-α-羥基異戊酸”，N-(2-羥基-3-甲基-1-氧代丁基)-β-丙氨酸(“HMOBA”)和/或“fantothenate”。尤其是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在被改造過(guò)表達(dá)與泛酸和/或異亮氨酸-纈氨酸(ilv)生物合成常規(guī)相關(guān)的某些酶的微生物中，存在競(jìng)爭(zhēng)泛酸生物合成的關(guān)鍵前體，即α-酮異戊酸(α-KIV)和β-丙氨酸的生物合成替代途徑。α-KIV轉(zhuǎn)變?yōu)棣?羥基異戊酸(α-HIV)可以由多種還原酶催化，而α-HIV隨后與β-丙氨酸縮合產(chǎn)生HMBPA。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明公開了3-(2-羥基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(HMBPA)的制備方法，包括在過(guò)量α-酮異戊酸和過(guò)量β-丙氨酸存在下培養(yǎng)具有增加的酮還原酶活性或增加的泛酸合成酶活性的微生物使HMBPA產(chǎn)生。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明公開了3-(2-羥基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(HMBPA)的制備方法，包括在過(guò)量α-酮異戊酸和過(guò)量β-丙氨酸存在下培養(yǎng)具有增加的酮還原酶活性和增加的泛酸合成酶活性的微生物使HMBPA產(chǎn)生。在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物具有修飾的panE基因，例如，修飾的panE1基因和/或修飾的panE2基因(如，panE基因被過(guò)表達(dá)，去調(diào)節(jié)或以多拷貝存在)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，微生物具有修飾的panC基因(如，panC基因被過(guò)表達(dá)，去調(diào)節(jié)或以多拷貝存在)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，微生物進(jìn)一步具有增加的乙酰羥酸異構(gòu)還原酶活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在過(guò)量α-酮異戊酸和過(guò)量β-丙氨酸存在下，在使乙酰羥酸異構(gòu)還原酶活性增加的條件下培養(yǎng)微生物使HMBPA產(chǎn)生。在又一個(gè)實(shí)施方案中，微生物包含修飾的ilvC基因(如ilvC基因被過(guò)表達(dá)，去調(diào)節(jié)或以多拷貝存在)。在又一個(gè)實(shí)施方案中，微生物進(jìn)一步具有降低的酮泛解酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶活性(如，具有修飾的panB基因，例如，panB基因被刪除)。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明公開了3-(2-羥基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(HMBPA)的制備方法，包括在過(guò)量α-酮異戊酸和過(guò)量β-丙氨酸存在下培養(yǎng)具有降低的酮泛解酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶活性的微生物使HMBPA產(chǎn)生。在另一個(gè)方面，本發(fā)明公開了使3-(2-羥基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(HMBPA)相對(duì)于泛酸而言產(chǎn)生提高的方法，包括在使HMBPA產(chǎn)生相對(duì)于泛酸產(chǎn)生得以增強(qiáng)的條件下培養(yǎng)重組微生物。在另一個(gè)方面，本發(fā)明公開了2-羥基異戊酸(α-HIV)的制備方法，包括在使α-HIV產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)過(guò)表達(dá)PanE1或PanE2并進(jìn)一步具有降低的PanC或PanD活性的微生物。在另一個(gè)方面，本發(fā)明公開了3-(2-羥基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(HMBPA)的制備方法，包括在使HMBPA產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)serA或glyA的表達(dá)或活性降低的重組微生物。在另一個(gè)方面，本發(fā)明公開了3-(2-羥基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(HMBPA)的制備方法，包括在使HMBPA產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)serA和glyA的表達(dá)或活性降低的重組微生物。培養(yǎng)上述微生物的條件包括，例如，在增加穩(wěn)態(tài)葡萄糖的條件下，在降低穩(wěn)態(tài)溶解氧的條件下，和/或在降低絲氨酸的條件下培養(yǎng)。本發(fā)明也公開了根據(jù)上述過(guò)程和/或方法制備的產(chǎn)物。也公開了用于上述方法中的重組微生物。
根據(jù)本發(fā)明的方法制備的化合物具有多種用途。例如，HMBPA可用于合成HMG CoA還原酶(II)的抑制劑(Gordon等.Bio.Med.Chem.Lett.1(3)161(1991))。已經(jīng)研究了HMG CoA還原酶(II)的抑制劑在治療高膽固醇血癥和冠狀動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展中的應(yīng)用。HMG CoA還原酶的抑制劑也已經(jīng)用于降低危險(xiǎn)患者發(fā)生心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)。而且，已經(jīng)證明HMBPA前體2-羥基異戊酸(α-HIV)具有營(yíng)養(yǎng)藥性質(zhì)，例如，可以預(yù)防皮膚衰老。具體地，α-羥酸，如α-HIV(或2-羥纈氨酸)，可用于合成α-羥基酯，其已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)增加糖胺聚糖、蛋白聚糖、膠原蛋白、彈性蛋白和其它皮膚成分的生物合成誘導(dǎo)皮膚厚度增加。這些化合物可用于治療皮膚紊亂，如老年斑，皮膚紋，皺紋，光老化和老化。
由下列詳細(xì)描述和權(quán)利要求將使本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)更明顯。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是泛酸和異亮氨酸/纈氨酸(ilv)生物合成途徑的示意圖。泛酸生物合成酶以粗體描述，其相應(yīng)基因以斜體字表示。異亮氨酸/纈氨酸(ilv)生物合成酶以粗斜體描述，其相應(yīng)基因以斜體字表示。
圖2是在枯草芽孢桿菌中產(chǎn)生[R]-3-(2-羥基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(“HMBPA”)的生物合成途徑的圖解表示。
圖3是[R]-3-(2-羥基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(“HMBPA”)的結(jié)構(gòu)的圖解描述。
圖4是來(lái)自14L PA824發(fā)酵培養(yǎng)物的培養(yǎng)基樣品的HPLC色譜。
圖5是質(zhì)譜圖，顯示了[R]-3-(2-羥基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸的相對(duì)單一同位素質(zhì)量(relative monoisotopic mass)。
圖6描述了已知或推測(cè)的PanB蛋白的C末端氨基酸比對(duì)。
圖7是構(gòu)建質(zhì)粒pAN624的圖解表示。
圖8是構(gòu)建質(zhì)粒pAN620的圖解表示。
圖9是構(gòu)建質(zhì)粒pAN636的圖解表示。
圖10是構(gòu)建允許使用氯霉素選擇單或多拷貝的質(zhì)粒pAN637的圖解表示。
圖11是質(zhì)粒pAN238的結(jié)構(gòu)示意圖，該質(zhì)粒通過(guò)P26啟動(dòng)子過(guò)表達(dá)枯草芽孢桿菌panE2。
發(fā)明詳述本發(fā)明至少部分基于細(xì)菌中新生物合成途徑，即[R]-3-(2-羥基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(“HMBPA”)生物合成途徑的發(fā)現(xiàn)。具體地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)細(xì)菌能夠從異亮氨酸-纈氨酸(ilv)生物合成途徑的關(guān)鍵產(chǎn)物和泛酸生物合成途徑的前體-α-酮異戊酸(α-KIV)產(chǎn)生HMBPA。細(xì)菌中制備HMBPA至少涉及泛酸生物合成酶，即酮泛解酸還原酶(panE1基因產(chǎn)物)和/或乙酰羥酸異構(gòu)還原酶(ilvC基因產(chǎn)物)，而且HMPBA由α-KIV還原形成的2-羥基異戊酸(α-HIV)與β-丙氨酸縮合得到，在后反應(yīng)由泛酸生物合成酶泛酸合成酶(panC基因產(chǎn)物)催化。增加微生物中酮泛解酸還原酶(如PanE1)和/或panE2和/或乙酰羥酸異構(gòu)還原酶(如Ilvc)的活性(例如，通過(guò)過(guò)表達(dá)或去調(diào)節(jié)編碼所述酶的基因)，可實(shí)現(xiàn)HMBPA的產(chǎn)生。降低或消除微生物的酮泛解酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶活性(panB基因產(chǎn)物)(例如，修飾或缺失編碼酮泛解酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的panB基因(如，PanB))以及任選地增加所述微生物的酮泛解酸還原酶和/或PanE2和/或乙酰羥酸異構(gòu)還原酶的活性，可達(dá)到最佳的HMBPA制備。底物α-KIV和β-丙氨酸是HMBPA制備所必需的，后者可以通過(guò)例如β-丙氨酸補(bǔ)給和/或增加門冬氨酸-α-脫羧酶活性(panD基因產(chǎn)物)提供。增加底物(即α-KIV和/或β-丙氨酸)濃度可以進(jìn)一步提高HMBPA的產(chǎn)量。過(guò)表達(dá)ilvBNCD基因和/或alsS可增加α-KIV產(chǎn)生。在適當(dāng)改造的微生物中限制絲氨酸的可用量或合成可進(jìn)一步增加HMBPA的產(chǎn)量。
為了使本發(fā)明更容易理解，這里首先定義某些術(shù)語(yǔ)。
術(shù)語(yǔ)“泛酸生物合成途徑”包括涉及泛酸形成或合成中利用的泛酸生物合成酶(如編碼生物合成酶的基因所編碼的多肽)、化合物(如，前體、底物、中間體或產(chǎn)物)、輔因子等等的生物合成途徑。術(shù)語(yǔ)“泛酸生物合成途徑”包括在微生物中(如，在體內(nèi))引起泛酸合成的生物合成途徑和在體外引起泛酸合成的生物合成途徑。
術(shù)語(yǔ)“泛酸生物合成酶”包括在泛酸生物合成途徑的化合物(如，中間體或產(chǎn)物)的形成中利用的任何酶。例如，泛解酸從α-酮異戊酸(α-KIV)通過(guò)中間體酮泛解酸合成。酮泛解酸的形成由泛酸生物合成酶酮泛解酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(panB基因產(chǎn)物)催化。泛解酸的形成由泛酸生物合成酶酮泛解酸還原酶(panE基因產(chǎn)物)催化。從門冬氨酸合成β-丙氨酸由泛酸生物合成酶門冬氨酸-α-脫羧酶(panD基因產(chǎn)物)催化。從泛解酸和β-丙氨酸(如，縮合)形成泛酸由泛酸生物合成酶泛酸合成酶(panC基因產(chǎn)物)催化?；诖诵掳l(fā)現(xiàn)的HMBPA生物合成途徑，泛酸生物合成酶也可以執(zhí)行備選功能作為這里所述的HMBPA生物合成途徑中的酶。
術(shù)語(yǔ)“泛酸(panthothenate)”包括游離酸形式的泛酸，也稱作“泛酸(pantothenic acid)”，以及其任何鹽(如，通過(guò)用陽(yáng)離子，例如鈣、鈉、鉀、銨替代泛酸的酸性氫得到的鹽)，也稱作“泛酸鹽(panthothenate salt)”。術(shù)語(yǔ)“泛酸”也包括泛酸的醇衍生物。優(yōu)選的泛酸鹽是泛酸鈣或泛酸鈉。優(yōu)選的醇衍生物是羥泛酸。本發(fā)明的泛酸鹽和/或醇包括可以從這里描述的游離酸通過(guò)常規(guī)方法制備的鹽和/或醇。在另一個(gè)實(shí)施方案中，泛酸鈣由本發(fā)明的微生物直接合成。本發(fā)明的泛酸鹽也可以用常規(guī)方法轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x酸形式的泛酸。
術(shù)語(yǔ)“異亮氨酸-纈氨酸生物合成途徑”包括涉及在丙酮酸轉(zhuǎn)變?yōu)槔i氨酸或異亮氨酸的形成或合成過(guò)程中利用的異亮氨酸-纈氨酸生物合成酶(如編碼生物合成酶的基因所編碼的多肽)、化合物(如，前體、底物、中間體或產(chǎn)物)、輔因子等等的生物合成途徑。術(shù)語(yǔ)“異亮氨酸-纈氨酸生物合成途徑”包括在微生物中(如，在體內(nèi))引起纈氨酸或異亮氨酸合成的生物合成途徑和在體外引起纈氨酸或異亮氨酸合成的生物合成途徑。圖1包括異亮氨酸-纈氨酸生物合成途徑的圖解表示。異亮氨酸-纈氨酸生物合成酶以粗斜體描述，其相應(yīng)基因用斜體字表示。
術(shù)語(yǔ)“異亮氨酸-纈氨酸生物合成酶”包括在異亮氨酸-纈氨酸生物合成途徑的化合物(如，中間體或產(chǎn)物)的形成中利用的任何酶。根據(jù)圖1，從丙酮酸通過(guò)中間體(乙酰乳酸、α，β-二羥基異戊酸(α，β-DHIV))和α-酮異戊酸(α-KIV))前行合成纈氨酸。從丙酮酸形成乙酰乳酸由異亮氨酸-纈氨酸生物合成酶乙酰羥酸合成酶(ilvBN基因產(chǎn)物，或alsS基因產(chǎn)物)催化。從乙酰乳酸形成α，β-DHIV由異亮氨酸-纈氨酸生物合成酶乙酰羥酸異構(gòu)還原酶(ilvC基因產(chǎn)物)催化。從α，β-DHIV合成α-KIV由異亮氨酸-纈氨酸生物合成酶二羥酸脫水酶(ilvD基因產(chǎn)物)催化。而且，通過(guò)支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶，纈氨酸和異亮氨酸可與它們各自的α-酮化合物進(jìn)行相互轉(zhuǎn)化?；诖诵掳l(fā)現(xiàn)的HMBPA生物合成途徑，異亮氨酸-纈氨酸生物合成酶也可以執(zhí)行備選功能作為這里所述的HMBPA生物合成途徑中的酶。
術(shù)語(yǔ)“3-(2-羥基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(“HMBPA”)生物合成途徑”包括涉及HMBPA形成或合成中利用的與泛酸生物合成途徑常規(guī)相關(guān)的生物合成酶和化合物(如底物等)的生物合成替代途徑。術(shù)語(yǔ)“HMBPA生物合成途徑”包括在微生物中(如，在體內(nèi))引起HMBPA合成的生物合成途徑和在體外引起HMBPA合成的生物合成途徑。
術(shù)語(yǔ)“HMBPA生物合成酶”包括在HMBPA生物合成途徑的化合物(如，中間體或產(chǎn)物)的形成中利用的任何酶。例如，從α-酮異戊酸(α-KIV)合成2-羥基異戊酸(α-HIV)由panE1或panE2基因產(chǎn)物(PanE1(這里可替換稱作酮泛解酸還原酶)或PanE2(對(duì)泛酸生物合成沒(méi)有明顯貢獻(xiàn)的α-酮酸還原酶))和/或由ilvC基因產(chǎn)物(這里可替換稱作乙酰羥酸異構(gòu)還原酶)催化。從β-丙氨酸和α-HIV形成HMBPA由panC基因產(chǎn)物(這里可替換稱作泛酸合成酶)催化。
術(shù)語(yǔ)“3-(2-羥基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(propionic acid)(“HMBPA”)”包括游離酸形式的HMBPA，也稱作“3-(2-羥基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(propionate)”，及其任何鹽(如，通過(guò)用陽(yáng)離子，例如，鈣、鈉、鉀、銨替代[R]-3-(2-羥基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸的酸性氫得到的鹽)，也稱作“3-(2-羥基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸鹽(propionic acid salt))”或“HMBPA鹽”。優(yōu)選的HMBPA鹽是HMBPA鈣或HMBPA鈉。本發(fā)明的HMBPA鹽包括可以通過(guò)常規(guī)方法從這里所述的游離酸制備的鹽。本發(fā)明的HMBPA鹽也可以通過(guò)常規(guī)方法轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x酸形式的[R]-3-(2-羥基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸。
在下列分部中進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明的各個(gè)方面。
I.靶向編碼各種泛酸和/或異亮氨酸-纈氨酸(ilv)和/或HMBPA生物合成酶的基因在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及對(duì)泛酸和/或異亮氨酸-纈氨酸(ilv)和/或HMBPA生物合成途徑中的各種生物合成酶進(jìn)行打靶或修飾。具體地，本發(fā)明涉及通過(guò)修飾或改變編碼所述生物合成酶的基因而改變與所述途徑相關(guān)的各種酶活性。
這里使用的術(shù)語(yǔ)“基因”包括在生物體中可以通過(guò)基因間DNA(即在生物的染色體DNA中天然位于基因側(cè)翼和/或分開基因的間插或間隔DNA)與另一個(gè)基因或其它基因分開的核酸分子(如，DNA分子或其片段)?；蛘?，一個(gè)基因可以些微重疊另一個(gè)基因(如，第一個(gè)基因的3’端與第二個(gè)基因的5’端重疊)，所述重疊基因通過(guò)基因間DNA與其它基因分開?；蚩梢灾笇?dǎo)酶或其它蛋白分子的合成(如，可以包括編碼序列，例如，編碼蛋白的連續(xù)開放閱讀框架(ORF))或本身可以在生物體中起作用。生物體中的基因可以簇集在操縱子中(見(jiàn)本文中的定義)，所述操縱子通過(guò)基因間DNA與其它基因和/或操縱子分開。這里使用的“分離的基因”包括基本不含有在該基因所來(lái)源的生物的染色體DNA中天然位于該基因側(cè)翼的序列(即，不含編碼第二個(gè)或不同蛋白的相鄰編碼序列或相鄰結(jié)構(gòu)序列等)的基因，但該基因可以任選包括5’和3’調(diào)節(jié)序列，例如啟動(dòng)子序列和/或終止序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，分離的基因主要包括蛋白質(zhì)的編碼序列(如，編碼芽孢桿菌蛋白的序列)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，分離的基因包括編碼蛋白的序列(如，編碼芽孢桿菌蛋白的序列)和來(lái)自該基因的來(lái)源生物的染色體DNA的相鄰5’和/或3’調(diào)節(jié)序列(如，相鄰5’和/或3’芽孢桿菌調(diào)節(jié)序列)。優(yōu)選，分離的基因含有少于大約10kb，5kb，2kb，1kb，0.5kb，0.2kb，0.1kb，50bp，25bp或10bp的在該基因的來(lái)源生物的染色體DNA中天然位于該基因側(cè)翼的核苷酸序列。
術(shù)語(yǔ)“操縱子”包括至少兩個(gè)相鄰基因或ORF，它們?nèi)芜x在至少一個(gè)基因或ORF的5’或3’端串聯(lián)重疊。術(shù)語(yǔ)“操縱子”包括含有與一個(gè)或多個(gè)相鄰基因或ORF(如，編碼酶，例如，生物合成酶的結(jié)構(gòu)基因)關(guān)聯(lián)的啟動(dòng)子和可能的調(diào)節(jié)元件的基因表達(dá)協(xié)調(diào)單位。例如，可以通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白與調(diào)節(jié)元件結(jié)合或通過(guò)抗轉(zhuǎn)錄終止協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)基因(如結(jié)構(gòu)基因)的表達(dá)。操縱子的基因(如結(jié)構(gòu)基因)可轉(zhuǎn)錄為編碼所有蛋白的單一mRNA。
這里使用的“具有突變的基因”或“突變基因”包括具有包含至少一個(gè)改變(如置換、插入、缺失)的核苷酸序列的基因，其中所述改變致使由所述突變體編碼的多肽或蛋白顯示出與野生型核酸分子或基因編碼的多肽或蛋白不同的活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，例如當(dāng)在相似條件下測(cè)定(如，在相同溫度下培養(yǎng)的微生物中測(cè)定)時(shí)，具有突變的基因或突變基因編碼與野生型基因編碼的多肽或蛋白相比活性增加的多肽或蛋白。這里使用的“活性增加”或“酶活性增加”是指比野生型核酸分子或基因編碼的多肽或蛋白的活性至少高5％的活性，優(yōu)選至少高5-10％，更優(yōu)選至少高10-25％，甚至更優(yōu)選比野生型核酸分子或基因編碼的多肽或蛋白的活性至少高25-50％，50-75％或75-100％的活性。上面引用值的中間范圍，如75-85％，85-90％，90-95％，也旨在包括在本發(fā)明中。這里使用的“活性增加”或“酶活性增加”也可以包括比野生型基因編碼的多肽或蛋白的活性至少高1.25倍的活性，優(yōu)選至少高1.5倍，更優(yōu)選至少高2倍，甚至更優(yōu)選比野生型基因編碼的多肽或蛋白的活性至少高3倍，4倍，5倍，10倍，20倍，50倍，100倍或更高的活性。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，例如，當(dāng)在相似條件下測(cè)定時(shí)(如，在相同溫度下培養(yǎng)的微生物中測(cè)定時(shí))，具有突變的基因或突變基因編碼與野生型基因編碼的多肽或蛋白相比活性降低的多肽或蛋白。突變基因也可不編碼多肽或編碼產(chǎn)量水平降低的野生型多肽。這里使用的“活性降低”或“酶活性降低”是指比野生型核酸分子或基因編碼的多肽或蛋白的活性至少低5％的活性，優(yōu)選至少低5-10％，更優(yōu)選至少低10-25％，甚至更優(yōu)選比野生型核酸分子或基因編碼的多肽或蛋白的活性至少低25-50％，50-75％或75-100％的活性。上面引用值的中間范圍，如75-85％，85-90％，90-95％，也旨在包括在本發(fā)明中。這里使用的“活性降低”或“酶活性降低”也可以包括活性被消除或“剔除”(如，比野生型核酸分子或基因編碼的多肽或蛋白的活性低大約100％的活性)。
可以根據(jù)任何被很好接受用于測(cè)定感興趣的特定蛋白的活性的試驗(yàn)來(lái)確定活性?？梢灾苯訙y(cè)定或檢測(cè)活性，例如，測(cè)定從細(xì)胞或微生物分離或純化的蛋白的活性?？晒┻x擇地，可在細(xì)胞或微生物內(nèi)或細(xì)胞外介質(zhì)內(nèi)測(cè)定或檢測(cè)活性。例如，可以通過(guò)使突變基因在微生物例如，具有溫度敏感性酶的突變微生物中表達(dá)，然后檢測(cè)突變基因彌補(bǔ)溫度敏感性(Ts)突變體的酶活性的能力，對(duì)突變基因(即，所述編碼降低的酶活性的突變體)進(jìn)行檢測(cè)。編碼“增加的酶活性”的突變基因可以是能比例如相應(yīng)野生型基因更有效地彌補(bǔ)Ts突變體的基因。編碼“酶活性降低”的突變基因是在彌補(bǔ)Ts突變體方面不如例如相應(yīng)野生型基因有效的基因。
本領(lǐng)域技術(shù)人員明了，與相應(yīng)野生型多肽或蛋白相比，核酸或基因序列中甚至單一置換(如，在相應(yīng)氨基酸序列中編碼一個(gè)氨基酸改變的一個(gè)堿基置換)也可戲劇性地影響所編碼多肽或蛋白的活性。這里定義的突變基因(如，編碼突變多肽或蛋白)可容易地與編碼蛋白同系物(homologue)的核酸或基因區(qū)別，因?yàn)橥蛔兓蚓幋a活性改變的蛋白或多肽，并且任選地在表達(dá)所述突變基因或產(chǎn)生所述突變蛋白或多肽的微生物(如，突變微生物)中可觀察到與表達(dá)野生型基因的相應(yīng)微生物不同或明顯不同的表型。相反地，蛋白同系物可具有等同或基本相似的活性，任選地當(dāng)在微生物中產(chǎn)生時(shí)與表達(dá)野生型基因的相應(yīng)微生物相比無(wú)可區(qū)別的表型。因此，不是由例如核酸分子、基因、蛋白或多肽間的序列等同程度來(lái)區(qū)分同系物和突變體，而是由所編碼的蛋白或多肽的活性來(lái)區(qū)分同系物和突變體同系物可以具有例如低序列等同性(如，30-50％序列等同性)然而具有基本等同的功能活性，而突變體可以例如享有99％序列等同性然而具有大大不同或改變的功能活性。
本領(lǐng)域技術(shù)人員也將領(lǐng)會(huì)到用于本發(fā)明的核酸分子，基因，蛋白或多肽可來(lái)自具有HMBPA生物合成途徑，ilv生物合成途徑或泛酸生物合成途徑的任何微生物。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用已知技術(shù)如同源性篩選，序列比較等等鑒定這種核酸分子，基因，蛋白或多肽，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)這些核酸分子，基因，蛋白或多肽進(jìn)行修飾以使其能在重組微生物中表達(dá)或產(chǎn)生(如，通過(guò)使用適當(dāng)啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、表達(dá)或整合載體，修飾基因序列使轉(zhuǎn)錄增加(考慮優(yōu)選密碼子使用)等，根據(jù)這里所述的技術(shù)和本領(lǐng)域已知的那些技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn))。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的基因來(lái)自革蘭氏陽(yáng)性微生物生物體(如，由于生物體外圍繞存在革蘭氏陽(yáng)性壁而保持堿性染色，例如，結(jié)晶紫的微生物)。術(shù)語(yǔ)“來(lái)自”(如“來(lái)自”革蘭氏陽(yáng)性微生物)是指在此微生物中天然存在的基因(如革蘭氏陽(yáng)性微生物的天然基因)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的基因來(lái)自屬于選自芽孢桿菌屬(Bacillus)、棒桿菌屬(Cornyebacterium)(如谷氨酸棒桿菌(Cornyebacterium glutamicum))、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(lactococci)和鏈霉菌(Streptomyces)屬的屬的微生物。在更優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的基因來(lái)自芽孢桿菌屬的微生物。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明基因來(lái)自選自枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、緩病芽孢桿菌(Bacillus lentimorbus))、遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus))、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillus firmus)、泛酸芽孢桿菌(Bacilluspantothenticus)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)、蘇云金芽孢桿菌(Baciilus thuringiensis)、耐芽孢桿菌(Bacillus halodurans)和其它1組芽孢桿菌種(例如，以16S rRNA型表征的種)的微生物。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，基因來(lái)自短芽孢桿菌(Bacillus brevis)或嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的基因來(lái)自選自地衣芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌，枯草芽孢桿菌和短小芽孢桿菌的微生物。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，基因來(lái)自枯草芽孢桿菌(如，是枯草芽孢桿菌來(lái)源的)。術(shù)語(yǔ)“來(lái)自枯草芽孢桿菌”或“枯草芽孢桿菌來(lái)源的”包括在枯草芽孢桿菌微生物中天然發(fā)現(xiàn)的基因。在本發(fā)明范圍內(nèi)包括芽孢桿菌來(lái)源的基因(如，枯草芽孢桿菌來(lái)源的基因)，例如，芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌coaX基因，serA基因，glyA基因，coaA基因，pan基因和/或ilv基因。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的基因來(lái)自革蘭氏陰性(不接受堿性染色)微生物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的基因來(lái)自屬于選自沙門氏菌屬(Salmonella)(如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium))，埃希氏菌屬(Escherichia)，克雷伯氏菌屬(Klebsiella)，沙雷氏菌屬(Serratia)和變形桿菌屬(Proteus)的屬的微生物。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的基因來(lái)自埃希氏菌屬的微生物。在甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的基因來(lái)自大腸桿菌(Escherichia coli)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的基因來(lái)自酵母屬(Saccharomyces)(如，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))。
II.重組核酸分子和載體本發(fā)明還公開了包括這里所述的基因(如分離的基因)的重組核酸分子(如重組DNA分子)，所述基因優(yōu)選芽孢桿菌基因，更優(yōu)選枯草芽孢桿菌基因，甚至更優(yōu)選枯草芽孢桿菌泛酸生物合成基因和/或異亮氨酸-纈氨酸(ilv)生物合成基因和/或HMBPA生物合成基因。術(shù)語(yǔ)“重組核酸分子”包括經(jīng)改變，修飾或改造(如一個(gè)或多個(gè)核苷酸插入、缺失或置換)在核苷酸序列方面不同于其所來(lái)源的天然或自然核酸分子的核酸分子(如，DNA分子)。優(yōu)選，重組核酸分子(如，重組DNA分子)包括可操作連接調(diào)節(jié)序列的本發(fā)明的分離基因。短語(yǔ)“可操作連接調(diào)節(jié)序列”意思是感興趣的基因的核苷酸序列與調(diào)節(jié)序列以允許基因進(jìn)行表達(dá)(如，增強(qiáng)的，增加的，組成的，基礎(chǔ)的，衰減的，減少的或阻礙的表達(dá))，優(yōu)選以允許該基因編碼的基因產(chǎn)物表達(dá)(如，當(dāng)將如這里定義的重組核酸分子包括在重組載體中并導(dǎo)入微生物中時(shí))的方式連接。
術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)序列”包括影響(如，調(diào)制或調(diào)節(jié))其它核酸序列(即基因)表達(dá)的核酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)序列被包括在重組核酸分子中，其相對(duì)于感興趣的特定基因的位置和方向與兩者在天然情況下顯示的位置和/或方向相似或等同，如為天然位置和/或方向。例如，感興趣基因可包括在重組核酸分子中與如下調(diào)節(jié)序列可操作連接，所述調(diào)節(jié)序列在天然生物中伴隨或鄰近此感興趣基因(如，可操作連接“天然”調(diào)節(jié)序列(如，連接“天然”啟動(dòng)子))?？晒┻x擇地，感興趣基因可包括在重組核酸分子中與如下調(diào)節(jié)序列可操作連接，該調(diào)節(jié)序列在天然生物中伴隨或鄰近另一個(gè)(如，不同的)基因?？晒┻x擇地，感興趣基因可包括在重組核酸分子中與來(lái)自另一個(gè)生物的調(diào)節(jié)序列可操作連接。例如，可以使來(lái)自其它微生物的調(diào)節(jié)序列(如，其它細(xì)菌調(diào)節(jié)序列，噬菌體調(diào)節(jié)序列等等)與特定感興趣基因可操作連接。
在一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)序列是非自然或非天然存在的序列(如，已經(jīng)被修飾，突變，置換，衍化，缺失的序列，包括化學(xué)合成的序列)。優(yōu)選的調(diào)節(jié)序列包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止信號(hào)、抗終止信號(hào)和其它表達(dá)控制元件(如，阻遏物或誘導(dǎo)物結(jié)合的序列和/或轉(zhuǎn)錄和/或翻譯調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，例如，在轉(zhuǎn)錄的mRNA中)。例如Sambrook，J.，F(xiàn)ritsh，E.F.和Maniatis，T.Molecular CloningALaboratory Manual。第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約，1989中描述了這種調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)序列包括指導(dǎo)核苷酸序列在微生物中組成型表達(dá)的那些序列(如，組成型啟動(dòng)子和強(qiáng)組成型啟動(dòng)子)，指導(dǎo)核苷酸序列在微生物中可誘導(dǎo)表達(dá)的那些序列(如，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，例如，木糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)和衰減或抑制核苷酸序列在微生物中的表達(dá)的那些序列(如，衰減信號(hào)或阻遏序列)。通過(guò)去除或缺失調(diào)節(jié)序列來(lái)調(diào)節(jié)感興趣基因的表達(dá)也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，可去除參與轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)節(jié)的序列以使感興趣基因表達(dá)增強(qiáng)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組核酸分子包括可操作地連接啟動(dòng)子或啟動(dòng)子序列的編碼至少一個(gè)細(xì)菌基因產(chǎn)物(如，泛酸生物合成酶，異亮氨酸-纈氨酸生物合成酶和/或HMBPA生物合成酶)的核酸序列或基因。本發(fā)明優(yōu)選的啟動(dòng)子包括芽孢桿菌啟動(dòng)子和/或噬菌體啟動(dòng)子(如，感染芽孢桿菌的噬菌體)。在一個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是芽孢桿菌啟動(dòng)子，優(yōu)選強(qiáng)芽孢桿菌啟動(dòng)子(如，芽孢桿菌中與生物化學(xué)管家基因關(guān)聯(lián)的啟動(dòng)子或芽孢桿菌中與糖酵解途徑基因關(guān)聯(lián)的啟動(dòng)子)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是噬菌體啟動(dòng)子。在優(yōu)選實(shí)施方案中，啟動(dòng)子來(lái)自噬菌體SP01。在尤其優(yōu)選實(shí)施方案中，啟動(dòng)子選自P15，P26或Pveg，具有例如下列各序列GCTATTGACGACAGCTATGGTTCACTGTCCACCAACCAAAACTGTGCTCAGTACCGCCAATATTTCTCCCTTGAGGGGTACAAAGAGGTGTCCCTAGAAGAGATCCACGCTGTGTAAAAATTTTACAAAAAGGTATTGACTTTCCCTACAGGGTGTGTAATAATTTAATTACAGGCGGGGGCAACCCCGCCTGT(SEQ ID NO1)，GCCTACCTAGCTTCCAAGAAAGATATCCTAACAGCACAAGAGCGGAAAGATGTTTTGTTCTACATCCAGAACAACCTCTGCTAAAATTCCTGAAAAATTTTGCAAAAAGTTGTTGACTTTATCTACAAGGTGTGGTATAATAATCTTAACAACAGCAGGACGC(SEQ ID NO2)，和GAGGAATCATAGAATTTTGTCAAAATAATTTTATTGACAACGTCTTATTAACGTTGATATAATTTAAATTTTATTTGACAAAAATGGGCTCGTGTTGTACAATAAATGTAGTGAGGTGGATGCAATG(SEQ IDNO3)。其它優(yōu)選的啟動(dòng)子包括tef(翻譯延伸因子(TEF)啟動(dòng)子)和pyc(丙酮酸羧化酶(PYC)啟動(dòng)子)，它們可以啟動(dòng)在芽孢桿菌(如枯草芽孢桿菌)中高水平表達(dá)。其它優(yōu)選的啟動(dòng)子，例如，當(dāng)用于革蘭氏陽(yáng)性微生物時(shí)，包括但不限于amy和SPO2啟動(dòng)子。其它優(yōu)選的啟動(dòng)子，例如，當(dāng)用于革蘭氏陰性微生物時(shí)，包括但不限于cos，tac，trp，tet，trp-tet，lpp，lac，lpp-lac，lacIQ，T7，T5，T3，gal，trc，ara，SP6，λ-PR或λ-PL。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組核酸分子包括一個(gè)或多個(gè)終止序列(如，轉(zhuǎn)錄終止序列)。術(shù)語(yǔ)“終止序列”包括起終止mRNA轉(zhuǎn)錄作用的調(diào)節(jié)序列。終止序列(或串聯(lián)轉(zhuǎn)錄終止子)可進(jìn)一步起穩(wěn)定mRNA(如，通過(guò)給mRNA添加結(jié)構(gòu))的作用，以例如抗核酸酶。
在再一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組核酸分子包括這樣的序列，該序列使得含有它的載體能得以檢測(cè)，即，可檢測(cè)和/或可選擇標(biāo)記，例如，編碼抗生素抗性的基因或能克服營(yíng)養(yǎng)缺陷突變的序列，例如，trpC，熒光標(biāo)記，藥物標(biāo)記，和/或比色標(biāo)記(如，lacZ/β-半乳糖苷酶)。在再一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組核酸分子包括人工核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)或可轉(zhuǎn)錄為人工RBS的序列。術(shù)語(yǔ)“人工核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)”包括mRNA分子內(nèi)(如，DNA內(nèi)編碼的)與核糖體結(jié)合(如，以啟動(dòng)翻譯)的位點(diǎn)，該位點(diǎn)與天然RBS(如，天然基因中發(fā)現(xiàn)的RBS)至少有一個(gè)核苷酸不同。優(yōu)選的人工RBS包括大約5-6，7-8，9-10，11-12，13-14，15-16，17-18，19-20，21-22，23-24，25-26，27-28，29-30或更多個(gè)核苷酸，其中大約1-2，3-4，5-6，7-8，9-10，11-12，13-15或更多個(gè)核苷酸與天然RBS(如，感興趣基因的天然RBS，例如，天然panB RBS TAAACATGAGGAGGAGAAAACATG(SEQ ID NO4)或天然panDRBS ATTCGAGAAATGGAGAGAATATAATATG(SEQ ID NO5))不同。
優(yōu)選，對(duì)差異核苷酸進(jìn)行置換使它們等同于最佳比對(duì)進(jìn)行比較時(shí)理想RBS中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸。理想RBS包括，但不限于，AGAAAGGAGGTGA(SEQ ID NO6)，TTAAGAAAGGAGGTGANNNNATG(S EQ ID NO7)，TTAGAAAGGAGGTGANNNNNATG(SEQ ID NO8)，AGAAAGGAGG TGANNNNNNNATG(SEQ ID NO9)，和AGAAAGGAGGTGANNNN NNATG(SEQ ID NO10)。人工RBS可用于替代與特定基因關(guān)聯(lián)的天然存在的或天然RBS。優(yōu)選人工RBS增強(qiáng)特定基因的翻譯。優(yōu)選的人工RBS(如，增加panB，例如，芽孢桿菌panB翻譯的RBS)包括CCCTCTAGAAGGAGGAGAAAACATG(SEQ IDNO11)和CCCTCTAGAGGAGGAGAAAACATG(SEQ ID NO12)。優(yōu)選的人工RBS(如，增加panD，例如，芽孢桿菌panD翻譯的RBS)包括TTAGAAAGGAGGATTTAAATATG(SEQ ID NO13)，TTAGAAAGGAGGTTTAATTAATG(SEQ ID NO14)，TTAGAAAGGAGGTGATTTAAATG(SEQ ID NO15)，TTAGAAAGGAGGTGTTTAAAATG(SEQ ID NO16)，ATTCGAGAAAGGAGGTGAATATAATATG(SEQ ID NO17)，ATTCGAGAAAGGAGGTGAATAATAATG(SEQ ID NO18)和ATTCGTAGAAAGGAGGTGAATTAATATG(SEQ ID NO19)。
本發(fā)明進(jìn)一步公開了包括這里所述的核酸分子(如，基因或包含所述基因的重組核酸分子)的載體(如重組載體)。術(shù)語(yǔ)“重組載體”包括已經(jīng)被改變，修飾或改造從而含有與此重組載體所來(lái)源的天然或自然核酸分子中所包含的序列相比較多，較少或不同的核酸序列的載體(如，質(zhì)粒、噬菌體、噬粒、病毒、粘?；蚱渌兓暮怂彷d體)。優(yōu)選，重組載體包括可操作地連接如這里定義的調(diào)節(jié)序列(例如，啟動(dòng)子序列，終止序列和/或人工核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS))的編碼生物合成酶的基因或包含所述基因的重組核酸分子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組載體包括可以增強(qiáng)在細(xì)菌中的復(fù)制的序列(如，增強(qiáng)復(fù)制序列)。在一個(gè)實(shí)施方案中，增強(qiáng)復(fù)制序列來(lái)源于大腸桿菌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，增強(qiáng)復(fù)制序列來(lái)自pBR322。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組載體包括抗生素抗性序列。術(shù)語(yǔ)“抗生素抗性序列”包括促進(jìn)或使宿主生物(如，芽孢桿菌)抵抗抗生素的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗生素抗性序列選自cat(氯霉素抗性)序列，tet(四環(huán)素抗性)序列，erm(紅霉素抗性)序列，neo(新霉素抗性)序列，kan(卡那霉素抗性)和spec(壯觀霉素抗性)序列。本發(fā)明的重組載體可進(jìn)一步包括同源重組序列(如，設(shè)計(jì)以允許感興趣基因重組到宿主生物的染色體中的序列)。例如，bpr，vpr，和/或amyE序列可用作同源靶標(biāo)以實(shí)現(xiàn)向宿主染色體中的重組。本領(lǐng)域技術(shù)人員也將領(lǐng)會(huì)到載體的設(shè)計(jì)可根據(jù)如選擇的待被遺傳改造的微生物，期望的基因產(chǎn)物表達(dá)水平等等因素來(lái)裁定。
IV.重組微生物本發(fā)明進(jìn)一步公開了包括如這里所述的載體或基因(如，野生型和/或突變基因)的微生物，即重組微生物。這里使用的術(shù)語(yǔ)“重組微生物”包括已經(jīng)被遺傳改變、修飾或改造(如遺傳工程化)以致與它所來(lái)源的天然微生物相比顯示出改變、修飾或不同的基因型和/或表型(如，當(dāng)遺傳學(xué)修飾影響該微生物的編碼核酸序列時(shí))的微生物(如，細(xì)菌、酵母細(xì)胞、真菌細(xì)胞等)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組微生物是革蘭氏陽(yáng)性生物(如，由于存在革蘭氏陽(yáng)性壁圍繞生物體而保持堿性染色，例如，結(jié)晶紫的微生物)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，重組微生物是屬于選自芽孢桿菌屬、棒桿菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬和鏈霉菌屬的屬的微生物。在更優(yōu)選實(shí)施方案中，重組微生物是芽孢桿菌屬的微生物。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，重組微生物選自枯草芽孢桿菌，緩病芽孢桿菌，遲緩芽孢桿菌，堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌，泛酸芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌，蠟狀芽孢桿菌，環(huán)狀芽孢桿菌，凝結(jié)芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，巨大芽孢桿菌，短小芽孢桿菌，蘇云金芽孢桿菌，耐芽孢桿菌和其它1組芽孢桿菌種(例如，以16S rRNA型表征的種)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，重組微生物來(lái)自短芽孢桿菌或嗜熱脂肪芽孢桿菌。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，重組微生物選自地衣芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌，枯草芽孢桿菌和短小芽孢桿菌。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，重組微生物是革蘭氏陰性(不接受堿性染色)生物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，重組微生物是選自沙門氏菌屬，埃希氏菌屬，克雷伯氏菌屬，沙雷氏菌屬和變形桿菌屬的屬的微生物。在更優(yōu)選實(shí)施方案中，重組微生物是埃希氏菌屬的微生物。在甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中，重組微生物是大腸桿菌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，重組微生物是酵母屬微生物(如，釀酒酵母(S.cerevisiae))。
本發(fā)明優(yōu)選的“重組”微生物是具有去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成途徑或酶，去調(diào)節(jié)的異亮氨酸-纈氨酸(ilv)生物合成途徑或酶和/或去調(diào)節(jié)的HMBPA生物合成途徑或酶的微生物。術(shù)語(yǔ)“去調(diào)節(jié)的”或“去調(diào)節(jié)”包括改變或修飾微生物的至少一個(gè)編碼生物合成途徑中的酶的基因，使微生物中的該生物合成酶的水平或活性改變或變動(dòng)。優(yōu)選，改變或修飾至少一個(gè)編碼生物合成途徑中的酶的基因使基因產(chǎn)物增多或增加。短語(yǔ)“去調(diào)節(jié)的途徑”也可以包括這樣的生物合成途徑，其中一個(gè)以上編碼生物合成途徑中的酶的基因被改變或修飾，以致一個(gè)以上的生物合成酶的水平或活性發(fā)生改變或變動(dòng)。使微生物的生物學(xué)途徑“去調(diào)節(jié)”的能力(如同時(shí)去調(diào)節(jié)給定生物合成途徑中的一個(gè)以上基因)在有些情況下源自微生物的一種特殊現(xiàn)象，即微生物中一個(gè)以上的酶(如，兩個(gè)或三個(gè)生物合成酶)可以由術(shù)語(yǔ)稱作“操縱子”(見(jiàn)這里的定義)的連續(xù)基因物質(zhì)上彼此鄰近存在的基因編碼。由于包括在操縱子中的基因的協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)，單一啟動(dòng)子和/或調(diào)節(jié)元件的改變或修飾即可導(dǎo)致該操縱子編碼的每個(gè)基因產(chǎn)物的表達(dá)都發(fā)生改變或變動(dòng)。調(diào)節(jié)元件的改變或修飾可包括，但不限于，去除內(nèi)源性啟動(dòng)子和/或調(diào)節(jié)元件，添加強(qiáng)啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或多個(gè)啟動(dòng)子或去除調(diào)節(jié)序列使基因產(chǎn)物表達(dá)被改變，改變操縱子在染色體中的位置，改變與操縱子相鄰的或位于操縱子內(nèi)的核酸序列如核糖體結(jié)合位點(diǎn)，增加操縱子的拷貝數(shù)量，修飾參與操縱子轉(zhuǎn)錄和/或操縱子的基因產(chǎn)物翻譯的蛋白(如，調(diào)節(jié)蛋白、抑制因子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄激活物等等)，或本領(lǐng)域中使基因表達(dá)去調(diào)節(jié)的任何其它常規(guī)方法(包括但不限于反義核酸分子的使用，例如，以阻斷阻抑蛋白的表達(dá))。去調(diào)節(jié)也可涉及改變一個(gè)或多個(gè)基因的編碼區(qū)，以得到例如可抵抗反饋?zhàn)饔没蚓哂懈呋蚋偷谋然钚缘拿浮?br> 在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，設(shè)計(jì)或改造重組微生物使至少一個(gè)泛酸生物合成酶、至少一個(gè)異亮氨酸-纈氨酸生物合成酶和/或至少一個(gè)HMBPA生物合成酶過(guò)表達(dá)。術(shù)語(yǔ)“過(guò)表達(dá)的”或“過(guò)表達(dá)”包括基因產(chǎn)物(如生物合成酶)的表達(dá)水平比該微生物操作前的表達(dá)水平高或比未接受操作的可比較微生物中的表達(dá)水平高。在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物可被遺傳設(shè)計(jì)或改造以過(guò)表達(dá)基因產(chǎn)物，從而使基因產(chǎn)物水平比沒(méi)有被改造的可比較微生物中的表達(dá)水平高。
遺傳學(xué)改造可包括，但不限于，改變或修飾與特定基因表達(dá)關(guān)聯(lián)的調(diào)節(jié)序列或位點(diǎn)(如，添加強(qiáng)啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或多個(gè)啟動(dòng)子或去除調(diào)節(jié)序列使表達(dá)成為組成型的)，改變特定基因的染色體位置，改變與特定基因鄰近的核酸序列如核糖體結(jié)合位點(diǎn)，增加特定基因的拷貝數(shù)量，修飾參與特定基因轉(zhuǎn)錄和/或特定基因產(chǎn)物翻譯的蛋白(如，調(diào)節(jié)蛋白、抑制因子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄激活物等等)，或本領(lǐng)域中使特定基因表達(dá)去調(diào)節(jié)的其它任何常規(guī)方法(包括但不限于反義核酸分子的使用，例如，以阻斷阻抑蛋白的表達(dá))。遺傳學(xué)改造也可包括缺失基因，例如，以阻斷生物學(xué)途徑或去除阻遏蛋白。在涉及具有基因缺失的微生物的實(shí)施方案中，本領(lǐng)域技術(shù)人員將領(lǐng)會(huì)，為了微生物的存活力不受危害，培養(yǎng)基中可能需要存在或添加至少低水平的某些化合物。通常，這種低水平是常規(guī)配制的復(fù)雜培養(yǎng)基中存在的水平。此外，當(dāng)涉及在可以引起商業(yè)或工業(yè)上有吸引力的產(chǎn)物量產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)具有基因缺失的微生物的方法時(shí)，可能需要向培養(yǎng)基中補(bǔ)充稍微增加水平的某些化合物。例如，在涉及培養(yǎng)panB基因缺失的微生物的方法中，培養(yǎng)基中必須存在至少低水平(如常規(guī)配制的復(fù)雜培養(yǎng)基中的泛酸水平)的泛酸，而為了例如產(chǎn)生商業(yè)或工業(yè)上有吸引力的量的HMBPA，可以向培養(yǎng)基中添加稍微增加水平的泛酸。例如，為了產(chǎn)生商業(yè)或工業(yè)上有吸引力的HMBPA量，培養(yǎng)基中可添加10-30mg/L泛酸。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可從物理上或環(huán)境上操作微生物以過(guò)表達(dá)基因產(chǎn)物，使基因產(chǎn)物水平高于微生物操作前的表達(dá)水平或高于沒(méi)有被操作的可比較微生物中的表達(dá)水平。例如，可以在存在已知或猜測(cè)可以增加特定基因轉(zhuǎn)錄和/或特定基因產(chǎn)物翻譯的試劑時(shí)培養(yǎng)微生物或用這些試劑處理微生物，使轉(zhuǎn)錄和/或翻譯增強(qiáng)或增加?？晒┻x擇地，可以在能增加特定基因轉(zhuǎn)錄和/或特定基因產(chǎn)物翻譯的選擇溫度下培養(yǎng)微生物，使轉(zhuǎn)錄和/或翻譯增強(qiáng)或增加。
V.重組微生物的培養(yǎng)和發(fā)酵術(shù)語(yǔ)“培養(yǎng)”包括使本發(fā)明的活微生物維持和/或生長(zhǎng)(如，使培養(yǎng)物或菌株維持和/或生長(zhǎng))。在一個(gè)實(shí)施方案中，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的微生物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在固體或半固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的微生物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，在包含對(duì)微生物的維持和/或生長(zhǎng)而言必需或有益的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(如，碳源或碳底物，例如碳水化合物，碳?xì)浠衔?，油，脂，脂肪酸，有機(jī)酸和醇；氮源，例如，胨，酵母提取物，肉膏，麥芽汁，尿素，硫酸銨，氯化銨，硝酸銨和磷酸銨；磷源，例如，磷酸，其鈉和鉀鹽；微量元素，例如，鎂，鐵，錳，鈣，銅，鋅，硼，鉬，和/或鈷鹽；以及生長(zhǎng)因子如氨基酸，維生素，生長(zhǎng)促進(jìn)劑等等)的培養(yǎng)基(如，無(wú)菌的液體培養(yǎng)基)中培養(yǎng)本發(fā)明的微生物。
優(yōu)選，在受控pH下培養(yǎng)本發(fā)明的微生物。術(shù)語(yǔ)“受控pH”包括可以引起期望產(chǎn)物(如，HMPBA)產(chǎn)生的任何pH。在一個(gè)實(shí)施方案中，在大約pH7培養(yǎng)微生物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在6.0和8.5之間的pH培養(yǎng)微生物。期望的pH可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的任何方法維持。
也優(yōu)選，在受控通氣下培養(yǎng)本發(fā)明的微生物。術(shù)語(yǔ)“受控通風(fēng)會(huì)”包括足以導(dǎo)致期望產(chǎn)物(如，HMPBA)產(chǎn)生的通氣(如，氧氣)。在一個(gè)實(shí)施方案中，通氣由調(diào)節(jié)培養(yǎng)物中的氧水平來(lái)控制，例如，由調(diào)節(jié)溶解在培養(yǎng)基中的氧量來(lái)控制。優(yōu)選，通過(guò)攪拌培養(yǎng)物來(lái)控制培養(yǎng)物的通氣。攪拌可以用螺旋槳或類似機(jī)械攪拌裝置，用旋轉(zhuǎn)或搖動(dòng)培養(yǎng)容器(如，管或燒瓶)或用各種泵裝置來(lái)提供?？梢允篃o(wú)菌空氣或氧氣通過(guò)培養(yǎng)基(如，通過(guò)發(fā)酵混合物)進(jìn)一步控制通氣。也優(yōu)選，在沒(méi)有過(guò)量泡沫(如，通過(guò)添加消泡劑)的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的微生物。
此外，可在受控溫度下培養(yǎng)本發(fā)明的微生物。術(shù)語(yǔ)“受控溫度”包括可以引起期望產(chǎn)物(如，HMPBA)產(chǎn)生的任何溫度。在一個(gè)實(shí)施方案中，受控溫度包括15℃和95℃之間的溫度。在另一個(gè)實(shí)施方案中，受控溫度包括15℃和70℃之間的溫度。優(yōu)選溫度是20℃至55℃，更優(yōu)選30℃至50℃。
可以在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)(如維持和/或生長(zhǎng))微生物，優(yōu)選利用常規(guī)培養(yǎng)方法如固定培養(yǎng)、試管培養(yǎng)、搖動(dòng)培養(yǎng)(如，旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)培養(yǎng)，搖瓶培養(yǎng)等)、通風(fēng)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)或發(fā)酵，連續(xù)或間斷地培養(yǎng)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，在搖瓶中培養(yǎng)微生物。在更優(yōu)選實(shí)施方案中，在發(fā)酵罐中(如，發(fā)酵方法)培養(yǎng)微生物。本發(fā)明的發(fā)酵方法包括但不限于分批發(fā)酵、補(bǔ)料分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵過(guò)程或方法。短語(yǔ)“分批方法”或“分批發(fā)酵”是指培養(yǎng)基、養(yǎng)料、補(bǔ)充添加劑等等的組成在發(fā)酵開始時(shí)設(shè)定并且在發(fā)酵過(guò)程中不進(jìn)行改變的閉合系統(tǒng)，然而，可以嘗試控制如pH和氧氣濃度等因素以防止過(guò)度培養(yǎng)基酸化和/或微生物死亡。短語(yǔ)“補(bǔ)料分批方法”或“補(bǔ)料分批”發(fā)酵是指隨著發(fā)酵的進(jìn)行添加(如，遞增或連續(xù)添加)一種或多種底物或補(bǔ)充物的分批發(fā)酵。短語(yǔ)“連續(xù)方法”或“連續(xù)發(fā)酵”是指這樣的系統(tǒng)，其中將規(guī)定的發(fā)酵培養(yǎng)基連續(xù)添加到發(fā)酵罐中同時(shí)移去等量使用過(guò)的培養(yǎng)基或“條件”培養(yǎng)基，優(yōu)選用于回收期望產(chǎn)物(如HMPBA)。已經(jīng)開發(fā)出多種此類方法，且它們是本領(lǐng)域熟知的。
短語(yǔ)“在使期望化合物產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)”包括在適宜或足以產(chǎn)生期望化合物或使所生產(chǎn)的特定化合物達(dá)到期望量的條件下(如，溫度，壓力，pH，持續(xù)時(shí)間等)對(duì)微生物進(jìn)行維持和/或生長(zhǎng)。例如，可以使培養(yǎng)持續(xù)足以產(chǎn)生期望量化合物(如，HMPBA)的時(shí)間。優(yōu)選，培養(yǎng)持續(xù)足以基本達(dá)到適當(dāng)化合物產(chǎn)量的時(shí)間(如，足以達(dá)到適當(dāng)?shù)腍MPBA濃度或適當(dāng)?shù)腍MPBA泛酸比率的時(shí)間)。在一個(gè)實(shí)施方案中，持續(xù)培養(yǎng)大約12至24小時(shí)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，持續(xù)培養(yǎng)24至36小時(shí)，36至48小時(shí)，48至72小時(shí)，72至96小時(shí)，96至120小時(shí)，120至144小時(shí)，或超過(guò)144小時(shí)。在再一個(gè)實(shí)施方案中，在可導(dǎo)致大約36小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生至少大約5至10g/L化合物，大約48小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生至少大約10至20g/L化合物，或大約72小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生至少大約20至30g/L化合物的條件下培養(yǎng)微生物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在使HMBPA∶HMBPA+泛酸的比率至少達(dá)到1∶10(即，10％HMBPA∶90％泛酸，例如，按使用HPLC分析產(chǎn)物樣品時(shí)比較峰面積所確定的)的條件下培養(yǎng)微生物，優(yōu)選該比率至少達(dá)到2∶10(20％HMBPA∶90％泛酸)，更優(yōu)選至少達(dá)到2.5∶10(25％HMBPA∶75％泛酸)，更優(yōu)選至少達(dá)到3∶10(30％HMBPA∶70％泛酸)，4∶10(40％HMBPA∶60％泛酸)，5∶10(50％HMBPA∶50％泛酸)，6∶10(60％HMBPA∶40％泛酸)，7∶10(70％HMBPA∶30％泛酸)，8∶10(80％HMBPA∶20％泛酸)，9∶10(90％HMBPA∶10％泛酸)或更高。
本發(fā)明的方法還可以包括回收期望化合物(如，HMBPA)的步驟。術(shù)語(yǔ)“回收”期望化合物包括從培養(yǎng)基中提取，收獲，分離或純化化合物?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域已知的任何常規(guī)分離或純化方法回收化合物，這些方法包括但不限于用傳統(tǒng)樹脂處理(如，陰離子或陽(yáng)離子交換樹脂，非離子吸收樹脂等)，用傳統(tǒng)吸附劑處理(如，活性炭，硅酸，硅膠，纖維素，礬土等)，改變pH，溶劑提取(如，用常規(guī)溶劑如醇、乙酸乙酯、己烷等等)，透析，過(guò)濾，濃縮，結(jié)晶，重結(jié)晶，pH調(diào)節(jié)，冷凍干燥等等。例如，從培養(yǎng)基中回收化合物可以通過(guò)首先從培養(yǎng)物中移出微生物來(lái)進(jìn)行。然后可以使培養(yǎng)基通過(guò)或加載于陽(yáng)離子交換樹脂上以去除陽(yáng)離子，然后通過(guò)或加至陰離子交換樹脂上以去除無(wú)機(jī)陰離子和比感興趣化合物具有更強(qiáng)酸性的有機(jī)酸。所得化合物可隨后轉(zhuǎn)變成如這里所述的鹽(如，鈣鹽)。
優(yōu)選，“提取”、“分離”或“純化”本發(fā)明的期望化合物使所得制品基本上不含其它培養(yǎng)基成分(如，不含培養(yǎng)基成分和/或發(fā)酵副產(chǎn)物)。短語(yǔ)“基本上不含其它培養(yǎng)基成分”包括其中期望化合物與產(chǎn)生它的培養(yǎng)物中的培養(yǎng)基成分或發(fā)酵副產(chǎn)物已相分離的期望化合物制品。在一個(gè)實(shí)施方案中，該制品中有多于大約80％的期望化合物(干重)(如，少于大約20％的其它培養(yǎng)基成分或發(fā)酵副產(chǎn)物)，更優(yōu)選多于大約90％的期望化合物(如，少于大約10％的其它培養(yǎng)基成分或發(fā)酵副產(chǎn)物)，再更優(yōu)選多于大約95％的期望化合物(如，少于大約5％的其它培養(yǎng)基成分或發(fā)酵副產(chǎn)物)，和最優(yōu)選多于大約98-99％的期望化合物(如，少于大約1-2％的其它培養(yǎng)基成分或發(fā)酵副產(chǎn)物)。當(dāng)期望化合物已經(jīng)衍生為鹽時(shí)，優(yōu)選該化合物進(jìn)一步不含與形成該鹽相關(guān)的化學(xué)污染物。當(dāng)期望化合物已經(jīng)衍生為醇時(shí)，優(yōu)選該化合物進(jìn)一步不含與醇形成相關(guān)的化學(xué)污染物。
在可供選擇的實(shí)施方案中，并不從微生物中純化期望化合物，例如，當(dāng)微生物在生物學(xué)上無(wú)危險(xiǎn)性(如，安全)時(shí)。例如，可將全部培養(yǎng)基(或培養(yǎng)上清)用作產(chǎn)物(如，粗產(chǎn)物)來(lái)源。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用未經(jīng)修飾的培養(yǎng)物(或培養(yǎng)上清)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，濃縮培養(yǎng)物(或培養(yǎng)上清)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，干燥或冷凍干燥培養(yǎng)物(或培養(yǎng)上清)。
優(yōu)選，本發(fā)明的制備方法導(dǎo)致期望化合物以顯著高的產(chǎn)量產(chǎn)生。短語(yǔ)“顯著高的產(chǎn)量”包括產(chǎn)量或產(chǎn)出水平足夠增高或超過(guò)可比較制備方法通常的產(chǎn)量，例如，增高到足以商業(yè)化制備期望產(chǎn)物(如，以商業(yè)上可行性費(fèi)用制備產(chǎn)物)的水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明公開了制備方法，包括在使期望產(chǎn)物(如HMPBA)以高于2g/L的水平產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)重組微生物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明公開了制備方法，包括在使期望產(chǎn)物(如HMPBA)以高于10g/L的水平產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)重組微生物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明公開了制備方法，包括在使期望產(chǎn)物(如HMPBA)以高于20g/L的水平產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)重組微生物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明公開了制備方法，包括在使期望產(chǎn)物(如HMPBA)以高于30g/L的水平產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)重組微生物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明公開了制備方法，包括在使期望產(chǎn)物(如HMPBA)以高于40g/L的水平產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)重組微生物。本發(fā)明進(jìn)一步公開了制備期望化合物的方法，包括在可導(dǎo)致于商業(yè)期望時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生足夠增高水平的化合物的條件下培養(yǎng)重組微生物。
根據(jù)所操作的生物合成酶或生物合成酶的組合，為了產(chǎn)生期望化合物，可能期望或需要給本發(fā)明微生物提供(如，飼喂)至少一個(gè)生物合成前體。術(shù)語(yǔ)“生物合成前體”或“前體”包括這樣的試劑或化合物，當(dāng)提供、接觸微生物，或包括在微生物的培養(yǎng)基中時(shí)其起增強(qiáng)或增加期望產(chǎn)物的生物合成的作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，生物合成前體或前體是門冬氨酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，生物合成前體或前體是β-丙氨酸。優(yōu)選添加的門冬氨酸或β-丙氨酸量是可以導(dǎo)致培養(yǎng)基中的濃度足夠增加微生物的生產(chǎn)力(如，導(dǎo)致的濃度足以增加HMPBA產(chǎn)量)的量。術(shù)語(yǔ)“β-丙氨酸過(guò)量”包括使β-丙氨酸水平增加或高于常規(guī)用于培養(yǎng)所論微生物的水平。例如，本實(shí)施例中所述的芽孢桿菌微生物的培養(yǎng)常規(guī)在大約0-5g/L β-丙氨酸存在下進(jìn)行。因此，過(guò)量β-丙氨酸水平可包括大約5-10或更多，優(yōu)選大約5-20g/L的β-丙氨酸。本發(fā)明的生物合成前體可以以濃縮溶液或懸浮液形式(如，在適宜溶劑，如水或緩沖液中)或固體形式(如，粉末形式)添加。此外，本發(fā)明的生物合成前體可以以單份額添加，連續(xù)或間斷給予給定的一段時(shí)間。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，生物合成前體是纈氨酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，生物合成前體是α-酮異戊酸。優(yōu)選，纈氨酸或α-酮異戊酸以導(dǎo)致培養(yǎng)基中的濃度足以引起期望化合物(如HMPBA)產(chǎn)生的量添加。術(shù)語(yǔ)“α-KIV過(guò)量”包括使α-KIV水平增加或高于常規(guī)用于培養(yǎng)所述微生物的水平。例如，本實(shí)施例中所述的芽孢桿菌微生物的培養(yǎng)可以在大約0-5g/Lα-KIV存在下進(jìn)行。因此，過(guò)量α-KIV水平可包括大約5-10g/L，更優(yōu)選大約5-20g/Lα-KIV。術(shù)語(yǔ)“纈氨酸過(guò)量”包括使纈氨酸水平增加或高于常規(guī)用于培養(yǎng)所述微生物的水平。例如，本實(shí)施例中所述的芽孢桿菌微生物的培養(yǎng)常規(guī)在大約0-0.5g/L纈氨酸存在下進(jìn)行。因此，過(guò)量纈氨酸水平可包括大約0.5-5g/L，優(yōu)選大約5-20g/L纈氨酸。生物合成前體這里也稱作“補(bǔ)充的生物合成底物”。
而且，本發(fā)明的某些方面包括在增加穩(wěn)態(tài)葡萄糖，降低穩(wěn)態(tài)溶解氧和/或降低絲氨酸的條件下培養(yǎng)微生物(例如，重組微生物)。術(shù)語(yǔ)“增加穩(wěn)態(tài)葡萄糖”包括使穩(wěn)態(tài)葡萄糖水平增加或高于常規(guī)用于培養(yǎng)所述微生物的水平。例如，在本實(shí)施例中描述的芽孢桿菌微生物的培養(yǎng)常規(guī)在大約0.2-1.0g/L穩(wěn)態(tài)葡萄糖存在下進(jìn)行。因此，增加的穩(wěn)態(tài)葡萄糖水平可以包括大約1-2g/L，大約2-5g/l，優(yōu)選地大約5-20g/l的穩(wěn)態(tài)葡萄糖水平。術(shù)語(yǔ)“降低穩(wěn)態(tài)溶解氧”包括使穩(wěn)態(tài)溶解氧水平少于或低于常規(guī)用于培養(yǎng)所述微生物的水平，并且例如，與增加的穩(wěn)態(tài)葡萄糖水平逆相關(guān)。例如，在本實(shí)施例中描述的芽孢桿菌微生物的培養(yǎng)常規(guī)在大約10-30％溶解氧存在下進(jìn)行。因此，降低的穩(wěn)態(tài)溶解氧可包括約0-10％，優(yōu)選約0-5％的穩(wěn)態(tài)溶解氧水平。術(shù)語(yǔ)“降低絲氨酸”包括使絲氨酸水平在常規(guī)培養(yǎng)所述微生物所用的的較低水平范圍內(nèi)。例如，在本實(shí)施例中描述的芽孢桿菌微生物的培養(yǎng)常規(guī)在大約0-0.5g/L絲氨酸存在下進(jìn)行。因此，降低的絲氨酸水平可包括例如0-0.1g/l的絲氨酸水平。
本發(fā)明的另一個(gè)方面包括以這里所述的重組微生物為特征的生物轉(zhuǎn)化方法。術(shù)語(yǔ)“生物轉(zhuǎn)化方法”，這里也稱作“生物轉(zhuǎn)變方法”，包括導(dǎo)致適當(dāng)?shù)孜锖?或中間化合物生成(如，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)變成)期望產(chǎn)物(如，HMPBA)的生物學(xué)方法。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明公開了制備HMBPA的生物轉(zhuǎn)化方法，包括在使HMBPA產(chǎn)生的條件下讓過(guò)表達(dá)還原酶(如，過(guò)表達(dá)PanE1，PanE2和/或IlvC)的微生物接觸適當(dāng)?shù)孜锘蚯绑w，和回收所述HMBPA。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明公開了制備HMBPA的生物轉(zhuǎn)化方法，包括在使HMBPA產(chǎn)生的條件下讓PanB活性降低或缺失的微生物接觸適當(dāng)?shù)孜锘蚯绑w，和回收所述HMBPA。在再一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明公開了制備HMBPA的生物轉(zhuǎn)化方法，包括在使HMBPA產(chǎn)生的條件下讓過(guò)表達(dá)至少一個(gè)還原酶并且有降低或刪除的PanB活性的微生物接觸適當(dāng)?shù)孜锘蚯绑w，和回收所述HMBPA。實(shí)施上述生物轉(zhuǎn)化的優(yōu)選重組微生物包括這里所述的重組微生物。在再一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明公開了生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，包括在使HMBPA產(chǎn)生的條件下讓?duì)?HIV和β-丙氨酸接觸分離或純化的PanC。任選地，可以使α-KIV接觸純化或分離的還原酶(如，PanE1，PanE2和/或IlvC)和還原當(dāng)量來(lái)源(例如NADH)而得到α-HIV。使α-HIV或HMBPA產(chǎn)生的條件可包括分別導(dǎo)致期望的α-HIV或HMBPA產(chǎn)生的任何條件。在再一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括α-HIV的制備方法，包括在使α-HIV產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)過(guò)表達(dá)PanE1和/或PanE2和/或IlvC并且具有降低或刪除的PanC或PanD(以分別降低HMBPA或β-丙氨酸合成)的微生物。
生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)中使用的微生物和/或酶以允許它們執(zhí)行預(yù)期功能(如，產(chǎn)生期望化合物)的形式存在。微生物可以是整個(gè)細(xì)胞，或可以僅僅是獲得期望的最終結(jié)果所需的那些細(xì)胞部分?？梢詫⑽⑸飸腋?如，在適當(dāng)溶液如緩沖溶液或培養(yǎng)基中)，洗滌(如，洗滌使微生物不含培養(yǎng)基)，丙酮干燥，固定(如，用聚丙烯酰胺凝膠或κ-角叉菜膠或在合成載體，例如，珠，基質(zhì)等等上)，固著，交聯(lián)或透化處理(如，透化處理膜和/或壁以便化合物，例如，底物、中間體或產(chǎn)物可更容易通過(guò)所述膜或壁)。
用下列實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，這些實(shí)施例不應(yīng)該解釋為限制本發(fā)明。貫穿本申請(qǐng)引用的所有參考文獻(xiàn)，專利和出版的專利申請(qǐng)的內(nèi)容引入這里作為參考。
實(shí)施例實(shí)施例I[R]-3-(2-羥基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(HMBPA)生物合成途徑的發(fā)現(xiàn)和表征在開發(fā)芽孢桿菌菌株用于制備泛酸的過(guò)程中，對(duì)參與泛酸生物合成途徑和異亮氨酸-纈氨酸(ilv)途徑(圖1)的酶進(jìn)行了各種遺傳學(xué)操作，如美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)09/400,494和美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)09/667,569所述。例如，具有去調(diào)節(jié)的panBCD操縱子和/或具有去調(diào)節(jié)的panE1的菌株顯示出泛酸產(chǎn)量增加(當(dāng)在β-丙氨酸和α-KIV存在下培養(yǎng)時(shí))。進(jìn)一步具有去調(diào)節(jié)的ilvBN和ilvD的菌株在僅有β-丙氨酸存在時(shí)即顯示出增加的泛酸產(chǎn)生。而且，可以通過(guò)進(jìn)一步使panD去調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)β-丙氨酸不依賴性。
示例性菌株是PA824，色氨酸原養(yǎng)型微生物，Spec和Tet抗性，在panBCD座位有去調(diào)節(jié)的panBCD，在panE1座位有去調(diào)節(jié)的panE1(枯草芽孢桿菌基因組中的兩個(gè)基因與大腸桿菌panE同源，panE1和panE2，前者編碼參與泛酸產(chǎn)生的主要酮泛解酸還原酶，而panE2對(duì)泛酸合成沒(méi)有貢獻(xiàn)(美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)09/400,494))，在ilvD座位有去調(diào)節(jié)的ilvD，在amyE座位ilvBNC盒過(guò)表達(dá)，而在bpr座位panD過(guò)表達(dá)。
我們?cè)?4L發(fā)酵容器中研究了PA824的泛酸產(chǎn)生。分批和補(bǔ)料培養(yǎng)基的組成如下。
分批
滅菌并冷卻后添加
分批培養(yǎng)基的終體積是6L。微量元素溶液SM-1000X具有下列組成0.15g Na2MoO4·2H2O，2.5g H3BO3，0.7g CoCl2·6H2O，0.25g CuSO4·5H2O，1.6g MnCl2·4H2O，0.3g ZnSO4·7H2O，溶于水中(終體積1L)。
將60ml搖瓶PA824培養(yǎng)物(OD＝10在SVY培養(yǎng)基中740ml H2O水中含Dilfco小牛肉浸汁25g，Difco酵母提取物5g，谷氨酸鈉5g，(NH4)2SO42.7g，高壓滅菌；添加200ml無(wú)菌1M K2HPO4(pH7)和60ml無(wú)菌50％葡萄糖溶液(終體積1L))接種于分批培養(yǎng)基中。作為葡萄糖限制的補(bǔ)料分批培養(yǎng)，發(fā)酵在43℃運(yùn)行，空氣流速12L/分鐘。指數(shù)生長(zhǎng)期消耗第一批葡萄糖(2.5g/L)。隨后通過(guò)連續(xù)補(bǔ)給如下補(bǔ)料溶液，使葡萄糖濃度維持在0.2-1g/L之間。
補(bǔ)料
可變補(bǔ)料速度泵由計(jì)算機(jī)控制且通過(guò)算法與罐中的葡萄糖濃度相關(guān)聯(lián)。在這個(gè)實(shí)施例中，總補(bǔ)料是6L。
發(fā)酵過(guò)程中，pH設(shè)置在7.2。通過(guò)與計(jì)算機(jī)控制相接的pH測(cè)定來(lái)達(dá)到控制。通過(guò)補(bǔ)給25％NH3溶液或20％H3PO4溶液維持pH值。NH3同時(shí)作為發(fā)酵的N源。通過(guò)調(diào)節(jié)攪拌和通氣速度，將溶解氧濃度[pO2]設(shè)置在30％。添加硅氧烷油控制泡沫。補(bǔ)料溶液添加停止后，在這個(gè)實(shí)施例中48小時(shí)后，繼續(xù)發(fā)酵直到[pO2]值達(dá)到95％。接著，通過(guò)滅菌30分鐘殺死微生物以終止發(fā)酵。將發(fā)酵肉湯培養(yǎng)物的樣品鋪在瓊脂平板上證實(shí)已成功的滅菌。滅菌和離心去除細(xì)胞后，發(fā)酵肉湯培養(yǎng)物中泛酸滴度是21.7g/L(HPLC分析測(cè)定)。
對(duì)于HPLC分析，用無(wú)菌水稀釋發(fā)酵肉湯培養(yǎng)物樣品(1∶40)。將5μl這種稀釋液注射到HPLC柱中(Aqua C18，5μm，150×2.0mm，PhenomenexTM)。柱的溫度保持在40℃。流動(dòng)相A是14.8mM H3PO3，流動(dòng)相B是100％乙腈。流速恒定為0.5mL/分鐘。梯度應(yīng)用開始 2％流動(dòng)相B0-3分鐘 線性增加到3％流動(dòng)相B3-3.5分鐘 線性增加到20％流動(dòng)相BUV檢測(cè)器(210nm)進(jìn)行檢測(cè)。運(yùn)行時(shí)間是7分鐘，另外3分鐘分析后時(shí)間(posttime)。泛酸的截留時(shí)間是3.9分鐘。圖4給出了上面提及樣品的HPLC色譜。
與截留時(shí)間4.7分鐘的峰相關(guān)的化合物的鑒定在所述發(fā)酵條件下，PA824常規(guī)產(chǎn)生大約20-30g/L泛酸。除了產(chǎn)生顯著量的泛酸，在這個(gè)系統(tǒng)中還發(fā)現(xiàn)具有大約4.7分鐘的截留時(shí)間的第二種洗脫化合物。發(fā)酵中形成的此第二種突出產(chǎn)物被證實(shí)是[R]-3-(2-羥基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(HMBPA)(這里也稱作“β-丙氨酸2-(R)-羥基異戊酸”，“β-丙氨酸2-羥基異戊酸”和/或“β-丙氨?；?α-羥基異戊酸”)。反相急驟層析(流動(dòng)相10mM KH2PO4，具有含量遞增的乙腈(1-50％))純化后，通過(guò)質(zhì)譜(圖5；相對(duì)單一同位素質(zhì)量189)和1H-和13C-NMR(數(shù)據(jù)未顯示)對(duì)其進(jìn)行了鑒定。
為了證實(shí)該化合物的身份，按如下特意合成外消旋β-丙氨酸2-羥基異戊酸。將β-丙氨酸(2.73g/30mmol)和甲醇鈉(5.67g，甲醇中30％溶液/31.5mmol)溶于甲醇(40mL)中。加入2-羥基異戊酸甲基酯(2-羥基-3-甲基丁酸甲基酯)(3.96g/30mmol)并回流18小時(shí)。然后，通過(guò)rotavap去除甲醇并用叔丁醇(50mL)替代。添加叔丁醇鉀(50mg)并回流26小時(shí)。在真空中去除溶劑，將殘余物溶解于水中(50mL)并使之通過(guò)強(qiáng)酸性離子交換樹脂(H+-形式LewatiteTMS 100 G1；100mL)。再加入些水用以洗滌離子交換樹脂。合并含水洗脫物，在真空中去除水。殘余物接受急驟層析(硅膠；在醋酸乙酯中的2％醋酸作為洗脫劑)并蒸發(fā)產(chǎn)物餾分得到固體殘余物。殘余物從醋酸乙酯/甲苯(分別是10mL/20mL)中再結(jié)晶，得到分析純HMBPA(β-丙氨酸2-羥基異戊酸)，它在質(zhì)譜儀中顯示190(189+H-)的相對(duì)單一同位素質(zhì)量并顯示出與發(fā)酵得到的產(chǎn)物相同的1H-NMR共振。
圖2顯示了導(dǎo)致HMBPA產(chǎn)生的生物合成途徑。圖3描述了[R]-3-(2-羥基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(HMBPA)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。如圖2所示，HMBPA是α-羥基異戊酸(α-HIV)和β-丙氨酸的縮合產(chǎn)物，由PanC酶催化產(chǎn)生。α-HIV是α-KIV還原產(chǎn)生的，該反應(yīng)是由還原酶PanE(如，PanE1和/或PanE2)和/或IlvC催化的反應(yīng)。
基于化學(xué)結(jié)構(gòu)和引起HMBPA產(chǎn)生的生物合成途徑，本發(fā)明人制定了下列模型以描述以前已知的泛酸和異亮氨酸-纈氨酸(ilv)途徑和新表征的HMBPA生物合成途徑之間的相互作用。該模型在至少一個(gè)方面顯示了在微生物中存在至少兩個(gè)途徑競(jìng)爭(zhēng)α-KIV(生物合成酶PanB的底物)，這兩個(gè)途徑即泛酸生物合成途徑和HMBPA生物合成途徑。(競(jìng)爭(zhēng)α-KIV的第三個(gè)和第四個(gè)途徑是導(dǎo)致從α-KIV產(chǎn)生纈氨酸或亮氨酸的途徑，見(jiàn)如圖1)。泛酸生物合成途徑和HMBPA生物合成途徑至少還產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)酶PanC的底物，即α-HIV和泛解酸。該模型預(yù)示，降低PanB活性將增加α-HIV合成中α-KIV的可用量(并最終，增加HMBPA合成)而降低微生物合成的泛解酸和/或泛酸的量。相反，增加PanB活性將增加泛解自泛酸合成中泛解酸和酮泛解酸的可用量。下列實(shí)施例為模型提供了實(shí)驗(yàn)支持并進(jìn)一步示例了基于該模型增加HMBPA產(chǎn)量的方法。
實(shí)施例II-VI對(duì)于實(shí)施例II-VI，泛酸和/或HMBPA的定量按如下進(jìn)行。在注射到Phenomenex AquaTM5μC18 HPLC柱(250×4.60mm，125A)上前于水中或5％乙腈中將發(fā)酵培養(yǎng)物等分試樣1∶100稀釋而將試管培養(yǎng)物等分試樣1∶10稀釋。流動(dòng)相是A＝5％乙腈，用磷酸調(diào)節(jié)到pH2.5的50mM磷酸一鈉緩沖液；和B＝95％乙腈，5％H2O。
線性梯度如下。
另外的參數(shù)和裝置如下流速＝1.0ml/分鐘；注射體積＝20μl；檢測(cè)器＝Hewlett Packard 1090系列DAD UV檢測(cè)器-3014，信號(hào)A＝197nm，ref.＝450nm，固件版E；柱加熱器＝烤箱溫度40C；硬件＝Hewlett PackardKayakTMXA；和軟件＝Hewlett Packard Chemstation PlusTM家庭版A.06.03[509]。
在這些發(fā)酵條件下，PA824常規(guī)產(chǎn)生大約30-40g/L泛酸。在這個(gè)系統(tǒng)中，HMBPA在大約13分鐘洗脫。
實(shí)施例II酮泛解酸還原酶有助于HMBPA產(chǎn)生而增加芽孢桿菌中酮泛解酸還原酶活性導(dǎo)致HMBPA產(chǎn)量提高如實(shí)施例I所述，在過(guò)表達(dá)panE1的微生物中觀察到相應(yīng)于HMBPA的新HPLC峰，表明酮泛解酸還原酶增加有助于HMBPA產(chǎn)生(以及泛酸產(chǎn)生)。如前提及，枯草芽孢桿菌基因組中的兩個(gè)基因與編碼酮泛解酸還原酶的大腸桿菌panE基因同源，這兩個(gè)基因被命名為panE1和panE2。在芽孢桿菌中，panE1基因編碼參與泛酸產(chǎn)生的主要酮泛解酸還原酶，而panE2對(duì)泛酸合成沒(méi)有貢獻(xiàn)。事實(shí)上，從P26啟動(dòng)子過(guò)表達(dá)panE2(SEQ IDNO25)可以引起泛酸滴度下降(如見(jiàn)，美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)09/400,494)。
因此，我們對(duì)如下進(jìn)行了檢驗(yàn)即，除了由panE1基因產(chǎn)物產(chǎn)生外，制備HMBPA所需的α-HIV的相當(dāng)大部分是否可能由panE2基因產(chǎn)物產(chǎn)生。推測(cè)，panE2基因產(chǎn)物是可將α-KIV還原為α-HIV的酶，但是其不能明顯地將酮泛解酸還原為泛解酸。
為了檢驗(yàn)該假說(shuō)，用來(lái)自菌株P(guān)A248(ΔpanE2∷cat)(如SEQ ID NO24所示，構(gòu)建參見(jiàn)美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)09/400,494)的染色體DNA的ΔpanE2∷cat盒轉(zhuǎn)化泛酸生產(chǎn)株P(guān)A824(如實(shí)施例I所述)，從中缺失panE2得到菌株P(guān)A919。就生長(zhǎng)于SVY加β-丙氨酸中的測(cè)試管培養(yǎng)物中泛酸和HMBPA的產(chǎn)量，對(duì)三個(gè)PA919分離株和PA824進(jìn)行比較。
表1.在SVY葡萄糖+β-丙氨酸5的48小時(shí)測(cè)試管培養(yǎng)物中43℃生長(zhǎng)的PA824和PA880衍生物產(chǎn)生的泛酸和HMBPA.
如表1數(shù)據(jù)所示，PA919的所有三個(gè)分離株比PA824產(chǎn)生低大約4倍的HMBPA，證明panE2基因產(chǎn)物是HMBPA合成的有力貢獻(xiàn)者。而且，僅過(guò)表達(dá)panE2即可顯著增加HMBPA產(chǎn)量。用于panE2過(guò)表達(dá)的示例質(zhì)粒命名為pAN238，見(jiàn)SEQ ID NO25所示(圖10)。
實(shí)施例III.降低微生物中的PanB活性可以增加HMBPA產(chǎn)量。
從PA365(PA377的RL-1譜系等同物，美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)09/667,569中描述)構(gòu)建如下菌株，該菌株缺失P26panBCD盒并含有在vpr座位擴(kuò)增的P26panC*D盒，和在bpr座位擴(kuò)增的野生型P26panB盒(PA666)或P26ΔpanB盒(PA664)，其構(gòu)建方式如下。圖6顯示了已知或推測(cè)的PanB蛋白的C末端氨基酸比對(duì)。鑒定到具有保守或半保守氨基酸殘基的稱作1，2和3的三個(gè)區(qū)域，這些區(qū)域在圖頂部以箭頭指出?？莶菅挎邨U菌PanB蛋白(RBS02239)以下劃線顯示。兩個(gè)PanB蛋白(RCY14036和CAB56202.1)缺失區(qū)域3，后一個(gè)PanB蛋白還缺失區(qū)域2且無(wú)保守氨基酸殘基占據(jù)區(qū)域1。
創(chuàng)建缺失區(qū)域1，2和3的枯草芽孢桿菌PanB變異體。設(shè)計(jì)3’PCR引物擴(kuò)增枯草芽孢桿菌PanB基因使區(qū)域3，區(qū)域2和3，或所有三個(gè)區(qū)域從最終產(chǎn)物中缺失，從而創(chuàng)建期望變異體。產(chǎn)生PCR產(chǎn)物并克隆入大腸桿菌表達(dá)載體pASK-1BA3中，分別產(chǎn)生質(zhì)粒pAN446，pAN447和pAN448。接著用這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)化含有panB6突變的大腸桿菌株SJ2以檢測(cè)互補(bǔ)作用。僅缺失區(qū)域3的pAN446能夠互補(bǔ)。這表明區(qū)域3對(duì)于枯草芽孢桿菌PanB活性不是必需的，但區(qū)域2是活性或穩(wěn)定性所必需的。
這個(gè)分析中的下一步是從pAN446將panB基因轉(zhuǎn)移到枯草芽孢桿菌表達(dá)載體中，然后將其導(dǎo)入適合測(cè)試編碼的PanB蛋白在枯草芽孢桿菌中的活性的菌株中。為此，首先創(chuàng)建缺失了P26panBCD操縱子的菌株。這是通過(guò)首先在恰位于panB RBS上游的BseRI位點(diǎn)和位于panD中的BglII位點(diǎn)之間插入cat基因，創(chuàng)建質(zhì)粒pAN624(圖7)而完成的。pAN624的序列顯示在SEQ ID NO20中。去除了所有panB和panC的所得缺失-置換突變(ΔpanBCD∷cat624)通過(guò)轉(zhuǎn)化交換進(jìn)入PA354，在補(bǔ)充1mM泛酸的平板上選擇氯霉素抗性。保留一個(gè)轉(zhuǎn)化體并命名為PA644。PCR分析從PA644分離的染色體DNA，證明含有此缺失-置換突變。如所期望的，PA644生長(zhǎng)需要泛酸，但其保留了PA354中最初存在的改造的ilv基因(P26ilvBNC P26ilvD)以及P26pan E1基因。因此，除PanB外該菌株過(guò)量產(chǎn)生參與泛解酸合成的所有酶。將含有最短panB缺失的基因插入到枯草芽孢桿菌表達(dá)載體pOTP61 (美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)09/667,569描述)中，創(chuàng)建質(zhì)粒pAN627。同時(shí)，將野生型panB對(duì)照基因插入到pOTP61中，創(chuàng)建質(zhì)粒pAN630。連接每個(gè)質(zhì)粒的NotI片段(缺少大腸桿菌載體序列)并轉(zhuǎn)化PA644選擇四環(huán)素抗性。
每次轉(zhuǎn)化保留一個(gè)轉(zhuǎn)化體并進(jìn)一步用來(lái)自PA628的染色體DNA轉(zhuǎn)化，選擇Pan+。PA628含有整合在vpr座位的多拷貝P26panC*D表達(dá)質(zhì)粒(pAN620)。為了確定panB基因突變對(duì)泛酸生產(chǎn)的直接影響，圖8示意顯示的質(zhì)粒pAN620(SEQ ID NO21所示)提供了泛酸合成所需的剩余兩個(gè)酶(PanC和PanD)。每次轉(zhuǎn)化后分離四個(gè)轉(zhuǎn)化體，在含10g/L門冬氨酸的SVY培養(yǎng)基中生長(zhǎng)48小時(shí)，然后檢測(cè)泛酸產(chǎn)量。具有3’缺失的panB基因的轉(zhuǎn)化體命名為PA664，那些含有野生型基因的命名為PA666。數(shù)據(jù)表明PA664中3’缺失的panB基因編碼活性大大降低的panB蛋白。為了檢測(cè)HMBPA產(chǎn)量，PA365、PA666和PA664的測(cè)試管培養(yǎng)物在SVY+門冬氨酸培養(yǎng)基中生長(zhǎng)48小時(shí)，培養(yǎng)基中有或沒(méi)有添加α-KIV或泛解酸，然后如前所述檢測(cè)HMBPA和泛酸。
表2.PanB活性和添加前體對(duì)HMBPA和泛酸產(chǎn)量的影響，48小時(shí)測(cè)試管培養(yǎng)物數(shù)據(jù)，SVY+門冬氨酸鹽(10g/L)培養(yǎng)基。
*HMBPA峰＝峰面積×10-3
表2提供的數(shù)據(jù)證明缺乏補(bǔ)充物時(shí)，PA666產(chǎn)生HMBPA最少，而PA664產(chǎn)生最多，表明PanB活性和HMBPA產(chǎn)生之間反向相關(guān)。這與預(yù)言這兩個(gè)途徑競(jìng)爭(zhēng)α-KIV(PanB底物)并產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)PanC的底物的模型相一致；降低PanB活性預(yù)期可以增加α-KIV可用于α-HIV合成的量并增加HMBPA產(chǎn)量，而相應(yīng)地降低泛解酸的合成量。當(dāng)將α-KIV添加到培養(yǎng)基中，所有三個(gè)菌株產(chǎn)生明顯更多的HMBPA。這個(gè)結(jié)果證明α-KIV是HMBPA的前體(如圖2所示)而且過(guò)量α-KIV利于HMBPA產(chǎn)生。這個(gè)結(jié)果也提示HMBPA的合成至少部分起因于過(guò)量α-KIV產(chǎn)生的溢出作用。當(dāng)將泛解酸添加到培養(yǎng)基中，所有三個(gè)菌株的HMBPA粗略降低百分之50。相反，所有菌株產(chǎn)生明顯增多的泛酸。這個(gè)結(jié)果也與此兩個(gè)途徑產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)PanC的底物(α-HIV和泛解酸)的模型相一致?？傊鲜鼋Y(jié)果進(jìn)一步表明泛解酸合成降低應(yīng)該對(duì)促進(jìn)HMBPA產(chǎn)生以及降低泛酸水平有益。
實(shí)施例IV調(diào)節(jié)HMBPA泛酸水平的方法如實(shí)施例I和II證明，PanE1和/或PanE2有助于提高HMBPA產(chǎn)量，降低PanB活性亦如此。這個(gè)實(shí)施例證明過(guò)表達(dá)PanE1可以使HMBPA產(chǎn)生相對(duì)于泛酸產(chǎn)生增加，而過(guò)表達(dá)PanB將使HMBPA產(chǎn)生相對(duì)于泛酸產(chǎn)生降低。而且，在過(guò)表達(dá)IlvC的菌株中，HMBPA產(chǎn)量提高。
PA668是PA824的衍生物，含有在vpr或panB座位擴(kuò)增的P26panB額外拷貝。PA668使用panB表達(dá)載體(pAN636)構(gòu)建，此載體允許用氯霉素選擇多拷貝。pAN636的序列顯示在SEQ ID NO22中，載體的示意性描述見(jiàn)圖9。連接無(wú)大腸桿菌載體序列的pAN636 NotI限制性片段，接著用于轉(zhuǎn)化PA824，在含5μg/ml氯霉素的平板上選擇。分離抵抗30μg/ml氯霉素的轉(zhuǎn)化體并在48小時(shí)測(cè)試管培養(yǎng)物中篩選泛酸產(chǎn)生。經(jīng)證實(shí)的分離株產(chǎn)生少于PA824的HMBPA(相反，產(chǎn)生比PA824多大約百分之10的泛酸)。構(gòu)建第二株，稱作PA669，它是含有在vpr或panE1座位擴(kuò)增的額外拷貝P26panE1的PA824。用自連接的質(zhì)粒pAN637 NotI片段轉(zhuǎn)化PA824構(gòu)建菌株P(guān)A669，選擇氯霉素抗性。pAN637的序列顯示在SEQ IDNO23中，載體的示意性描述見(jiàn)圖10。選擇兩株P(guān)A669分離株進(jìn)行進(jìn)一步研究；SDS-PAGE分析由兩株制備的全部細(xì)胞提取物，判定PA669-5比PA669-7產(chǎn)生較少的PanE1。
菌株P(guān)A824、PA668-2、PA668-24和兩個(gè)PA669分離株(PA669-5和PA669-7)的測(cè)試管培養(yǎng)物在三種不同的培養(yǎng)基(SVY，SVY+門冬氨酸，和SVY+門冬氨酸+泛解酸)中生長(zhǎng)48小時(shí)，然后檢測(cè)泛酸、HMBPA和β-丙氨酸(表3)。
表3.額外拷貝panB和panE1對(duì)PA824產(chǎn)生泛酸和HMBPA產(chǎn)量的影響，48小時(shí)測(cè)試培養(yǎng)物數(shù)據(jù)，SVY培養(yǎng)基
*HMBPA＝峰面積×10-3
在SVY培養(yǎng)基中，沒(méi)有菌株產(chǎn)生可檢測(cè)量的HMBPA。所有菌株產(chǎn)生粗略等同量的泛酸和少量β-丙氨酸，表明在這些培養(yǎng)物中β-丙氨酸對(duì)于泛酸和HMBPA的合成有限制作用，而且β-丙氨酸是兩種化合物的前體。當(dāng)在SVY+門冬氨酸培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，兩個(gè)PA669分離株產(chǎn)生的HMBPA比PA824產(chǎn)生的多，而兩個(gè)PA668分離株產(chǎn)生的HMBPA比PA824產(chǎn)生的少。值得注目的是產(chǎn)生PanE1最多的菌株(PA669-7)產(chǎn)生HMBPA最多(而泛酸最少)。這提示高水平PanE1利于HMBPA產(chǎn)生，但代價(jià)是較低的泛酸合成。此外，有趣的是，PA668-24產(chǎn)生的HMBPA比PA668-2多，但兩個(gè)菌株提取物的SDS-PAGE分析表明它們產(chǎn)生粗略等同水平的PanB。SDS-PAGE分析也表明PA668-24比PA668-2產(chǎn)生多得多的IlvC?；谶@些數(shù)據(jù)，我們提出IlvC通過(guò)增加穩(wěn)態(tài)水平的α-KIV和/或通過(guò)催化α-KIV形成α-HIV來(lái)影響HMBPA合成，由此解釋了所觀察到的向HMBPA產(chǎn)生的偏移。
表3的最后一組數(shù)據(jù)表明，向生長(zhǎng)培養(yǎng)基中添加泛解酸使以前產(chǎn)生可檢測(cè)水平的HMBPA的所有菌株現(xiàn)產(chǎn)生減少的HMBPA(通過(guò)例如使合成移向泛酸方向)。這進(jìn)一步支持α-HIV和泛解酸是PanC的競(jìng)爭(zhēng)性底物的模型。
實(shí)施例V限制絲氨酸可用量來(lái)增加HMBPA產(chǎn)量推測(cè)，調(diào)節(jié)微生物培養(yǎng)物中絲氨酸或亞甲基四氫葉酸的可用量也可以控制產(chǎn)生的泛酸與HMBPA的比率。具體地，提出降低絲氨酸可用量可使HMBPA生產(chǎn)相對(duì)于泛酸生產(chǎn)增加，而增加絲氨酸可用量將使HMBPA生產(chǎn)相對(duì)于泛酸生產(chǎn)降低。這個(gè)方法是基于PanB底物(亞甲基四氫葉酸)來(lái)自絲氨酸這一理解。因此，調(diào)節(jié)絲氨酸水平應(yīng)該能有效調(diào)節(jié)PanB底物水平。為了檢驗(yàn)這個(gè)假說(shuō)，PA824在SVY葡萄糖加5g/Lβ-丙氨酸和±5g/L絲氨酸的測(cè)試管培養(yǎng)基中43℃生長(zhǎng)48小時(shí)。
表4.添加和不添加絲氨酸時(shí)PA824產(chǎn)生的HMBPA和泛酸
如表4證明，添加絲氨酸可以降低產(chǎn)量水平，而相反增加泛酸的產(chǎn)量。為了調(diào)節(jié)HMBPA產(chǎn)生水平而降低亞甲基四氫葉酸水平的至少一個(gè)方法是降低絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(glyA基因產(chǎn)物)的活性，由此降低適當(dāng)改造的微生物中亞甲基四氫葉酸的生物合成。為了調(diào)節(jié)HMBPA產(chǎn)量而降低絲氨酸水平的至少一個(gè)方法是降低3-磷酸甘油酸脫氫酶(serA基因產(chǎn)物)的活性。
實(shí)施例VI通過(guò)改變重組微生物的培養(yǎng)條件來(lái)增加HMBPA產(chǎn)量在至少一個(gè)發(fā)酵物(發(fā)酵P162)中，HMBPA產(chǎn)量水平達(dá)到35g/L。簡(jiǎn)言之，如實(shí)施例I所述實(shí)施菌株P(guān)A824的發(fā)酵，但利用如下配制的PFM-155培養(yǎng)基。
分批
滅菌并冷卻后添加
補(bǔ)料
滅菌并冷卻后添加
然而，由于發(fā)酵過(guò)程中缺乏過(guò)程控制，結(jié)果，溶解氧在16和17小時(shí)之間變成限制性的和葡萄糖在16小時(shí)后開始累積。
發(fā)酵條件中的這些改變?cè)?6小時(shí)當(dāng)時(shí)或之后產(chǎn)生下列重要結(jié)果。即，HMBPA合成開始增加而泛酸合成相應(yīng)降低。在16小時(shí)前的四個(gè)小時(shí)期間，培養(yǎng)物產(chǎn)生7g/l HMBPA，而之后四個(gè)小時(shí)，產(chǎn)生9.0g/l。泛酸則相反，在12-16小時(shí)和16-20小時(shí)之間分別產(chǎn)生10g/l和6.0g/l。20和36小時(shí)之間，HMBPA合成的平均速度是1.0g/l小時(shí)。總體上，發(fā)酵物P162在36小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生35g/l HMBPA。
因此，看來(lái)過(guò)量補(bǔ)給葡萄糖和/或限制溶解氧(如，在大約16小時(shí)開始)可以引起HMBPA產(chǎn)量增加。因此，增加HMBPA生產(chǎn)(相對(duì)于泛酸生產(chǎn))的兩個(gè)方法是增加穩(wěn)態(tài)葡萄糖水平和/或降低穩(wěn)態(tài)溶解氧水平。
等同物本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，或只需使用常規(guī)試驗(yàn)即能夠確定本文所述的本發(fā)明具體實(shí)施方案的很多等同物。這些等同物旨在包括在下列權(quán)利要求中。
序列表<110>巴斯福股份公司<120>制備3-(2-羥基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(HMBPA)的方法和微生物<130>BGI-146PC<140>
<141>
<160>25<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>194<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述啟動(dòng)子序列<220>
<221>-35_signal<222>(136)..(141)<220>
<221>-10_signal<222>(159)..(164)<400>1gctattgacg acagctatgg ttcactgtcc accaaccaaa actgtgctca gtaccgccaa 60tatttctccc ttgaggggta caaagaggtg tccctagaag agatccacgc tgtgtaaaaa 120ttttacaaaa aggtattgac tttccctaca gggtgtgtaa taatttaatt acaggcgggg 180gcaaccccgc ctgt194<210>2<211>163<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述啟動(dòng)子序列<220>
<221>-35_signal<222>(113)..(118)<220>
<221>-10_signal<222>(136)..(141)<400>2gcctacctag cttccaagaa agatatccta acagcacaag agcggaaaga tgttttgttc 60tacatccaga acaacctctg ctaaaattcc tgaaaaattt tgcaaaaagt tgttgacttt 120
atctacaagg tgtggtataa taatcttaac aacagcagga cgc163<210>3<211>127<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述啟動(dòng)子序列<220>
<221>-35_signal<222>(34)..(39)<220>
<221>-10_signal<222>(58)..(63)<220>
<221>-35_signal<222>(75)..(80)<220>
<221>-10_signal<222>(98)..(103)<400>3gaggaatcat agaattttgt caaaataatt ttattgacaa cgtcttatta acgttgatat 60aatttaaatt ttatttgaca aaaatgggct cgtgttgtac aataaatgta gtgaggtgga 120tgcaatg127<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述核糖體結(jié)合位點(diǎn)<400>4taaacatgag gaggagaaaa catg 24<210>5<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述核糖體結(jié)合位點(diǎn)<400>5attcgagaaa tggagagaat ataatatg 28<210>6<211>13<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述核糖體結(jié)合位點(diǎn)<400>6agaaaggagg tga 13<210>7<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述核糖體結(jié)合位點(diǎn)<220>
<223>所有的n均為任何核苷酸<400>7ttaagaaagg aggtgannnn atg 23<210>8<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述核糖體結(jié)合位點(diǎn)<220>
<223>所有的n均為任何核苷酸<400>8ttagaaagga ggtgannnnn atg 23<210>9<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述核糖體結(jié)合位點(diǎn)<220>
<223>所有的n均為任何核苷酸<400>9agaaaggagg tgannnnnnn atg 23<210>10<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述核糖體結(jié)合位點(diǎn)
<220>
<223>所有的n均為任何核苷酸<400>10agaaaggagg tgannnnnna tg 22<210>11<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述核糖體結(jié)合位點(diǎn)<400>11ccctctagaa ggaggagaaa acatg25<210>12<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述核糖體結(jié)合位點(diǎn)<400>12ccctctagag gaggagaaaa catg 24<210>13<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述核糖體結(jié)合位點(diǎn)<400>13ttagaaagga ggatttaaat atg 23<210>14<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述核糖體結(jié)合位點(diǎn)<400>14ttagaaagga ggtttaatta atg 23<210>15<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述核糖體結(jié)合位點(diǎn)<400>15ttagaaagga ggtgatttaa atg 23
<210>16<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述核糖體結(jié)合位點(diǎn)<400>16ttagaaagga ggtgtttaaa atg 23<210>17<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述核糖體結(jié)合位點(diǎn)<400>17attcgagaaa ggaggtgaat ataatatg 28<210>18<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述核糖體結(jié)合位點(diǎn)<400>18attcgagaaa ggaggtgaat aataatg 27<210>19<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述核糖體結(jié)合位點(diǎn)<400>19attcgtagaa aggaggtgaa ttaatatg 28<210>20<211>6886<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述載體<220>
<223>pAN624<400>20aagaaaccaa ttgtccatat tgcatcagac attgccgtca ctgcgtcttt tactggctct 60tctcgctaac caaaccggta accccgctta ttaaaagcat tctgtaacaa agcgggacca 120aagccatgac aaaaacgcgt aacaaaagtg tctataatca cggcagaaaa gtccacattg 180
attatttgca cggcgtcaca ctttgctatg ccatagcatt tttatccata agattagcgg 240atcctacctg acgcttttta tcgcaactct ctactgtttc tccatacccg tttttttggg 300ctaacaggag gaattaacca tggatccgag ctcgacagta tcaagcactt cacaatctgg 360gagctgaaag cccgccttat gtagctcata cttgacaaat ccaaggtcaa aatggatatt 420gtgggcgaca aaataagcgc cgtcaagcaa ttggaatact tcttcagcaa ctgcttcaaa 480tggctgttca ttctcgacca tttgattaga gattccagta agctgctcaa taaaagcagg 540gattgattta tttggattaa tgtattttga aaaccgctca gtaatttgtc cattttcgat 600tacaaccgct gcgatttgta tgattttatc gcctttcttc ggcgaattcc ctgttgtctc 660tacatctata acaacgaacc gttgcttatt cattaaaatg gacacctcaa ttcttgcata 720cgacaaaagt gtaacacgtt ttgtacggaa atggagcggc aaaaccgttt tactctcaaa 780atcttaaaag aaaacccccg ataaaggggg cttttcttct acaaaattgt acgggctggt 840tcgttcccca gcatttgttc aattttgttt tgatcattca gaacagccac tttcggctca 900tggcttgccg cttcttgatc agacatcatt ttgtaggaaa taataatgac cttatctcct 960tcctgcacaa ggcgtgcggc tgcaccgttt aagcatatga cgccgcttcc ccgtttacca 1020ggaataatat acgtttcaag acgtgctcca ttattattat tcacaatttg tactttttca 1080ttaggaagca ttcccacagc atcaatgaga tcctctagag tcgacctgca ggcatgcaag 1140cttccgtcga cgctctccct tatgcgactc ctgcattagg aagcagccca gtagtaggtt 1200gaggccgttg agcaccgccg ccgcaaggaa tggtgcatgc aaggagatgg cgcccaacag 1260tcccccggcc acggggcctg ccaccatacc cacgccgaaa caagcgctca tgagcccgaa 1320gtggcgagcc cgatcttccc catcggtgat gtcggcgata taggcgccag caaccgcacc 1380tgtggcgccg gtgatgccgg ccacgatgcg tccggcgtag aggatcaatc ttcatccatt 1440ccaaggtaaa tcccccttcg ccgtttctgt taccattata caccttttga accttaacgt 1500aaacgttaag ttttaaaaaa caataaaaaa gacgagcagc atacagcacc cgtctttcac 1560tttcctgttt aagctaaact tcccgccact gacagagact ctttttgaag gctttcagaa 1620agcactcgat acgcgatctg gagctgtaat ataaaaacct tcttcaacta acggggcagg 1680ttagtgacat tagaaaaccg actgtaaaaa gtacagtcgg cattatctca tattataaaa 1740gccagtcatt aggcctatct gacaattcct gaatagagtt cataaacaat cctgcatgat 1800aaccatcaca aacagaatga tgtacctgta aagatagcgg taaatatatt gaattacctt 1860tattaatgaa ttttcctgct gtaataatgg gtagaaggta attactatta ttattgatat 1920ttaagttaaa cccagtaaat gaagtccatg gaataataga aagagaaaaa gcattttcag 1980gtataggtgt tttgggaaac aatttccccg aaccattata tttctctaca tcagaaaggt 2040ataaatcata aaactctttg aagtcattct ttacaggagt ccaaatacca gagaatgttt 2100tagatacacc atcaaaaatt gtataaagtg gctctaactt atcccaataa cctaactctc 2160cgtcgctatt gtaaccagtt ctaaaagctg tatttgagtt tatcaccctt gtcactaaga 2220aaataaatgc agggtaaaat ttatatcctt cttgttttat gtttcggtat aaaacactaa 2280tatcaatttc tgtggttata ctaaaagtcg tttgttggtt caaataatga ttaaatatct 2340cttttctctt ccaattgtct aaatcaattt tattaaagtt catttgatat gcctcctaaa 2400tttttatcta aagtgaattt aggaggctta cttgtctgct ttcttcatta gaatcaatcc 2460ttttttaaaa gtcaatatta ctgtaacata aatatatatt ttaaaaatat cccactttat 2520ccaattttcg tttgttgaac taatgggtgc tttagttgaa gaataaagac cacattaaaa 2580aatgtggtct tttgtgtttt tttaaaggat ttgagcgtag cgaaaaatcc ttttctttct 2640tatcttgata ataagggtaa ctattgcatg ataagctgtc aaacatgaga attcccgttt 2700tcttctgcaa gccaaaaaac cttccgttac aacgagaagg attcttcact ttctaaagtt 2760cggcgagttt catccctctg tcccagtcct tttttggatc aaggcagact gctgcaatgt 2820ctatctattt taataatagg tgcagttcgc aggcgatact gcccaatgga agtataccaa 2880aatcaacggg cttgtaccaa cacattagcc caattcgata tcggcagaat agattttttt 2940aatgccttcg ttcgtttcta aaagcagaac gccttcatca tctataccta acgccttacc 3000gtaaaaggtt ccgtttaacg ttctggctct catattagtg ccaataccga gcgcatagct 3060ttcccataaa agcttaatcg gcgtaaatcc gtgcgtcata taatcccggt accgtttctc 3120aaagcatagt aaaatatgct ggatgacgcc ggcccgatca attttttccc cagcagcttg 3180gctgaggctt gtcgcgatgt ccttcaattc atctggaaaa tcattaggct gctggttaaa 3240cggtctccag cttggctgtt ttggcggatg agagaagatt ttcagcctga tacagattaa 3300atcagaacgc agaagcggtc tgataaaaca gaatttgcct ggcggcagta gcgcggtggt 3360cccacctgac cccatgccga actcagaagt gaaacgccgt agcgccgatg gtagtgtggg 3420gtctccccat gcgagagtag ggaactgcca ggcatcaaat aaaacgaaag gctcagtcga 3480aagactgggc ctttcgtttt atctgttgtt tgtcggtgaa cgctctcctg agtaggacaa 3540atccgccggg agcggatttg aacgttgcga agcaacggcc cggagggtgg cgggcaggac 3600gcccgccata aactgccagg catcaaatta agcagaaggc catcctgacg gatggccttt 3660ttgcgtttct acaaactctt tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct 3720catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat 3780tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc 3840tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg 3900
ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg 3960ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtgttga 4020cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta 4080ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc 4140tgccataacc atgagtgata acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc 4200gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg 4260ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc 4320aatggcaaca acgttgcgca aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca 4380acaattaata gactggatgg aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct 4440tccggctggc tggtttattg ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat 4500cattgcagca ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg 4560gagtcaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat 4620taagcattgg taactgtcag accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact 4680tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat 4740cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc 4800ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct 4860accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg 4920cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt taggccacca 4980cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc 5040tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga 5100taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac 5160gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga 5220agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag 5280ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg 5340acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag 5400caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc 5460tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc 5520tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg aagagcgcct 5580gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg cggtatttca caccgcatat ggtgcactct 5640cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagtat acactccgct atcgctacgt 5700gactgggtca tggctgcgcc ccgacacccg ccaacacccg ctgacgcgcc ctgacgggct 5760tgtctgctcc cggcatccgc ttacagacaa gctgtgaccg tctccgggag ctgcatgtgt 5820cagaggtttt caccgtcatc accgaaacgc gcgaggcagc agatcaattc gcgcgcgaag 5880gcgaagcggc atgcataatg tgcctgtcaa atggacgaag cagggattct gcaaacccta 5940tgctactccg tcaagccgtc aattgtctga ttcgttacca attatgacaa cttgacggct 6000acatcattca ctttttcttc acaaccggca cggaactcgc tcgggctggc cccggtgcat 6060tttttaaata cccgcgagaa atagagttga tcgtcaaaac caacattgcg accgacggtg 6120gcgataggca tccgggtggt gctcaaaagc agcttcgcct ggctgatacg ttggtcctcg 6180cgccagctta agacgctaat ccctaactgc tggcggaaaa gatgtgacag acgcgacggc 6240gacaagcaaa catgctgtgc gacgctggcg atatcaaaat tgctgtctgc caggtgatcg 6300ctgatgtact gacaagcctc gcgtacccga ttatccatcg gtggatggag cgactcgtta 6360atcgcttcca tgcgccgcag taacaattgc tcaagcagat ttatcgccag cagctccgaa 6420tagcgccctt ccccttgccc ggcgttaatg atttgcccaa acaggtcgct gaaatgcggc 6480tggtgcgctt catccgggcg aaagaacccc gtattggcaa atattgacgg ccagttaagc 6540cattcatgcc agtaggcgcg cggacgaaag taaacccact ggtgatacca ttcgcgagcc 6600tccggatgac gaccgtagtg atgaatctct cctggcggga acagcaaaat atcacccggt 6660cggcaaacaa attctcgtcc ctgatttttc accaccccct gaccgcgaat ggtgagattg 6720agaatataac ctttcattcc cagcggtcgg tcgataaaaa aatcgagata accgttggcc 6780tcaatcggcg ttaaacccgc caccagatgg gcattaaacg agtatcccgg cagcagggga 6840tcattttgcg cttcagccat acttttcata ctcccgccat tcagag 6886<210>21<211>7140<212>DNAc213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述載體<220>
<223>DAN620
<400>21tcggcggccg cttcgtcgac cgaaacagca gttataaggc atgaagctgt ccggtttttg 60caaaagtggc tgtgactgta aaaagaaatc gaaaaagacc gttttgtgtg aaaacggtct 120ttttgtttcc ttttaaccaa ctgccataac tcgaggccta cctagcttcc aagaaagata 180tcctaacagc acaagagcgg aaagatgttt tgttctacat ccagaacaac ctctgctaaa 240attcctgaaa aattttgcaa aaagttgttg actttatcta caaggtgtgg tataataatc 300ttaacaacag caggacgctc tagattagaa aggaggattt aaatatgaga cagattactg 360atatttcaca gctgaaagaa gccataaaac aataccattc agagggcaag tcaatcggat 420ttgttccgac gatggggttt ctgcatgagg ggcatttaac cttagcagac aaagcaagac 480aagaaaacga cgccgttatt atgagtattt ttgtgaatcc tgcacaattc ggccctaatg 540aagattttga agcatatccg cgcgatattg agcgggatgc agctcttgca gaaaacgccg 600gagtcgatat tctttttacg ccagatgctc atgatatgta tcccggtgaa aagaatgtca 660cgattcatgt agaaagacgc acagacgtgt tatgcgggcg ctcaagagaa ggacattttg 720acggggtcgc gatcgtactg acgaagcttt tcaatctagt caagccgact cgtgcctatt 780tcggtttaaa agatgcgcag caggtagctg ttgttgatgg gttaatcagc gacttcttca 840tggatattga attggttcct gtcgatacgg tcagagagga agacggctta gccaaaagct 900ctcgcaatgt atacttaaca gctgaggaaa gaaaagaagc gcctaagctg tatcgggccc 960ttcaaacaag tgcggaactt gtccaagccg gtgaaagaga tcctgaagcg gtgataaaag 1020ctgcaaaaga tatcattgaa acgactagcg gaaccataga ctatgtagag ctttattcct 1080atccggaact cgagcctgtg aatgaaattg ctggaaagat gattctcgct gttgcagttg 1140ctttttcaaa agcgcgttta atagataata tcattattga tattcgtaga aaggaggtga 1200attaatatgt atcgtacgat gatgagcggc aaacttcaca gggcaactgt tacggaagca 1260aacctgaact atgtgggaag cattacaatt gatgaagatc tcattgatgc tgtgggaatg 1320cttcctaatg aaaaagtaca aattgtgaat aataataatg gagcacgtct tgaaacgtat 1380attattcctg gtaaacgggg aagcggcgtc atatgcttaa acggtgcagc cgcacgcctt 1440gtgcaggaag gagataaggt cattattatt tcctacaaaa tgatgtctga tcaagaagcg 1500gcaagccatg agccgaaagt ggctgttctg aatgatcaaa acaaaattga acaaatgctg 1560gggaacgaac cagcccgtac aattttgtaa aggatcctgt tttggcggat gagagaagat 1620tttcagcctg atacagatta aatcagaacg cagaagcggt ctgataaaac agaatttgcc 1680tggcggcagt agcgcggtgg tcccacctga ccccatgccg aactcagaag tgaaacgccg 1740tagcgccgat ggtagtgtgg ggtctcccca tgcgagagta gggaactgcc aggcatcaaa 1800taaaacgaaa ggctcagtcg aaagactggg cctttcgttt tatctgttgt ttgtcggtga 1860acgctctcct gagtaggaca aatccgccgg gagcggattt gaacgttgcg aagcaacggc 1920ccggagggtg gcgggcagga cgcccgccat aaactgccag gcatcaaatt aagcagaagg 1980ccatcctgac ggatggcctt tttgcgtttc tacaaactct tggtaccgag acgatcgtcc 2040tctttgttgt agcccatcac ttttgctgaa gagtaggagc cgaaagtgac ggcgtattca 2100ttgagcggca gctgagtcgc accgacagaa atcgcttctc ttgatgtgcc cggcgatccg 2160actgtccagc cgttcggtcc gctgttgccg tttgaggtaa cagcgacaac gccttctgac 2220atggcccagt caagcgctgt gcttgtcgcc cagtccgggt tgtttaaaga gtttccgaga 2280gacaggttca tcacatctgc cccgtcctgc actgcacgtt ccacgcccgc gatgacgttt 2340tccgttgtgc cgcttccgcc aggccctaac acacgataag caagaagtgt ggcatcaggc 2400gctacgcctt taatcgttcc gtttgcagcc acagttccgg ctacgtgtgt gccatggtca 2460gttgcctcgc ccctcggatc gccggttggt gtttcttttg gatcgtaatc attgtccaca 2520aaatcgtatc ctttatattg tccaaagttt ttcttcagat ctgggtgatt gtattcaacc 2580ccagtgtcaa taatcgccac cttgatgcct tttcctgtgt agcctaaatc ccatgcatcg 2640tttgctccga tataaggcgc actgtcatcc atttgcggag atacggcgtc ttcggagatt 2700gtggggaatt ctcatgtttg acagcttatc atgcaatagt tacccttatt atcaagataa 2760gaaagaaaag gatttttcgc tacgctcaaa tcctttaaaa aaacacaaaa gaccacattt 2820tttaatgtgg tctttattct tcaactaaag cacccattag ttcaacaaac gaaaattgga 2880taaagtggga tatttttaaa atatatattt atgttacagt aatattgact tttaaaaaag 2940gattgattct aatgaagaaa gcagacaagt aagcctccta aattcacttt agataaaaat 3000ttaggaggca tatcaaatga actttaataa aattgattta gacaattgga agagaaaaga 3060gatatttaat cattatttga accaacaaac gacttttagt ataaccacag aaattgatat 3120tagtgtttta taccgaaaca taaaacaaga aggatataaa ttttaccctg catttatttt 3180cttagtgaca agggtgataa actcaaatac agcttttaga actggttaca atagcgacgg 3240agagttaggt tattgggata agttagagcc actttataca atttttgatg gtgtatctaa 3300aacattctct ggtatttgga ctcctgtaaa gaatgacttc aaagagtttt atgatttata 3360cctttctgat gtagagaaat ataatggttc ggggaaattg tttcccaaaa cacctatacc 3420tgaaaatgct ttttctcttt ctattattcc atggacttca tttactgggt ttaacttaaa 3480tatcaataat aatagtaatt accttctacc cattattaca gcaggaaaat tcattaataa 3540aggtaattca atatatttac cgctatcttt acaggtacat cattctgttt gtgatggtta 3600tcatgcagga ttgtttatga actctattca ggaattgtca gataggccta atgactggct 3660
tttataatat gagataatgc cgactgtact ttttacagtc ggttttctaa tgtcactaac 3720ctgccccgtt agttgaagaa cgaagcggcc gcaattcttg aagacgaaag ggcctcgtga 3780tacgcctatt tttataggtt aatgtcatga taataatggt ttcttagacg tcaggtggca 3840cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata cattcaaata 3900tgtatccgct catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga 3960gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc 4020ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg 4080cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc 4140ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat 4200cccgtattga cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat acactattct cagaatgact 4260tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat 4320tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata acactgcggc caacttactt ctgacaacga 4380tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc 4440ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga 4500tgcctgcagc aatggcaaca acgttgcgca aactattaac tggcgaacta cttactctag 4560cttcccggca acaattaata gactggatgg aggcggataa agttgcagga ccacttctgc 4620gctcggccct tccggctggc tggtttattg ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt 4680ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct 4740acacgacggg gagtcaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct gagataggtg 4800cctcactgat taagcattgg taactgtcag accaagttta ctcatatata ctttagattg 4860atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt gataatctca 4920tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga 4980tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa 5040aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga 5100aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt 5160taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt 5220taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat 5280agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct 5340tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca 5400cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag 5460agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc 5520gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga 5580aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca 5640tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag 5700ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg 5760aagagcgcct gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg cggtatttca caccgcatat 5820ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagtat acactccgct 5880atcgctacgt gactgggtca tggctgcgcc ccgacacccg ccaacacccg ctgacgcgcc 5940ctgacgggct tgtctgctcc cggcatccgc ttacagacaa gctgtgaccg tctccgggag 6000ctgcatgtgt cagaggtttt caccgtcatc accgaaacgc gcgaggcagc tgcggtaaag 6060ctcatcagcg tggtcgtgaa gcgattcaca gatgtctgcc tgttcatccg cgtccagctc 6120gttgagtttc tccagaagcg ttaatgtctg gcttctgata aagcgggcca tgttaagggc 6180ggttttttcc tgtttggtca cttgatgcct ccgtgtaagg gggaatttct gttcatgggg 6240gtaatgatac cgatgaaacg agagaggatg ctcacgatac gggttactga tgatgaacat 6300gcccggttac tggaacgttg tgagggtaaa caactggcgg tatggatgcg gcgggaccag 6360agaaaaatca ctcagggtca atgccagcgc ttcgttaata cagatgtagg tgttccacag 6420ggtagccagc agcatcctgc gatgcagatc cggaacataa tggtgcaggg cgctgacttc 6480cgcgtttcca gactttacga aacacggaaa ccgaagacca ttcatgttgt tgctcaggtc 6540gcagacgttt tgcagcagca gtcgcttcac gttcgctcgc gtatcggtga ttcattctgc 6600taaccagtaa ggcaaccccg ccagcctagc cgggtcctca acgacaggag cacgatcatg 6660cgcacccgtg gccaggaccc aacgctgccc gagatgcgcc gcgtgcggct gctggagatg 6720gcggacgcga tggatatgtt ctgccaaggg ttggtttgcg cattcacagt tctccgcaag 6780aattgattgg ctccaattct tggagtggtg aatccgttag cgaggtgccg ccggcttcca 6840ttcaggtcga ggtggcccgg ctccatgcac cgcgacgcaa cgcggggagg cagacaaggt 6900atagggcggc gcctacaatc catgccaacc cgttccatgt gctcgccgag gcggcataaa 6960tcgccgtgac gatcagcggt ccagtgatcg aagttaggct ggtaagagcc gcgagcgatc 7020cttgaagctg tccctgatgg tcgtcatcta cctgcctgga cagcatggcc tgcaacgcgg 7080gcatcccgat gccgccggaa gcgagaagaa tcataatggg gaaggccatc cagcctcgcg 7140<210>22<211>6725<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述載體<220>
<223>pAN636<400>22tcggcggccg cttcgtcgac cgaaacagca gttataaggc atgaagctgt ccggtttttg 60caaaagtggc tgtgactgta aaaagaaatc gaaaaagacc gttttgtgtg aaaacggtct 120ttttgtttcc ttttaaccaa ctgccataac tcgaggccta cctagcttcc aagaaagata 180tcctaacagc acaagagcgg aaagatgttt tgttctacat ccagaacaac ctctgctaaa 240attcctgaaa aattttgcaa aaagttgttg actttatcta caaggtgtgg tataataatc 300ttaacaacag caggacgctc tagaaggagg agaaaacatg aaaacaaaac tggattttct 360aaaaatgaag gagtctgaag aaccgattgt catgctgacc gcttatgatt atccggcagc 420taaacttgct gaacaagcgg gagttgacat gattttagtc ggtgattcac ttggaatggt 480cgtcctcggc cttgattcaa ctgtcggtgt gacagttgcg gacatgatcc atcatacaaa 540agccgttaaa aggggtgcgc cgaatacctt tattgtgaca gatatgccgt ttatgtctta 600tcacctgtct aaggaagata cgctgaaaaa tgcagcggct atcgttcagg aaagcggagc 660tgacgcactg aagcttgagg gcggagaagg cgtgtttgaa tccattcgcg cattgacgct 720tggaggcatt ccagtagtca gtcacttagg tttgacaccg cagtcagtcg gcgtactggg 780cggctataaa gtacagggca aagacgaaca aagcgccaaa aaattaatag aagacagtat 840aaaatgcgaa gaagcaggag ctatgatgct tgtgctggaa tgtgtgccgg cagaactcac 900agccaaaatt gccgagacgc taagcatacc ggtcattgga atcggggctg gtgtgaaagc 960ggacggacaa gttctcgttt atcatgatat tatcggccac ggtgttgaga gaacacctaa 1020atttgtaaag caatatacgc gcattgatga aaccatcgaa acagcaatca gcggatatgt 1080tcaggatgta agacatcgtg ctttccctga acaaaagcat tcctttcaaa tgaaccagac 1140agtgcttgac ggcttgtacg ggggaaaata agggggggat cctgttttgg cggatgagag 1200aagattttca gcctgataca gattaaatca gaacgcagaa gcggtctgat aaaacagaat 1260ttgcctggcg gcagtagcgc ggtggtccca cctgacccca tgccgaactc agaagtgaaa 1320cgccgtagcg ccgatggtag tgtggggtct ccccatgcga gagtagggaa ctgccaggca 1380tcaaataaaa cgaaaggctc agtcgaaaga ctgggccttt cgttttatct gttgtttgtc 1440ggtgaacgct ctcctgagta ggacaaatcc gccgggagcg gatttgaacg ttgcgaagca 1500acggcccgga gggtggcggg caggacgccc gccataaact gccaggcatc aaattaagca 1560gaaggccatc ctgacggatg gcctttttgc gtttctacaa actcttggta ccgagacgat 1620cgtcctcttt gttgtagccc atcacttttg ctgaagagta ggagccgaaa gtgacggcgt 1680attcattgag cggcagctga gtcgcaccga cagaaatcgc ttctcttgat gtgcccggcg 1740atccgactgt ccagccgttc ggtccgctgt tgccgtttga ggtaacagcg acaacgcctt 1800ctgacatggc ccagtcaagc gctgtgcttg tcgcccagtc cgggttgttt aaagagtttc 1860cgagagacag gttcatcaca tctgccccgt cctgcactgc acgttccacg cccgcgatga 1920cgttttccgt tgtgccgctt ccgccaggcc ctaacacacg ataagcaaga agtgtggcat 1980caggcgctac gcctttaatc gttccgtttg cagccacagt tccggctacg tgtgtgccat 2040ggtcagttgc ctcgcccctc ggatcgccgg ttggtgtttc ttttggatcg taatcattgt 2100ccacaaaatc gtatccttta tattgtccaa agtttttctt cagatctggg tgattgtatt 2160caaccccagt gtcaataatc gccaccttga tgccttttcc tgtgtagcct aaatcccatg 2220catcgtttgc tccgatataa ggcgcactgt catccatttg cggagatacg gcgtcttcgg 2280agattgtggg gaattctcat gtttgacagc ttatcatgca atagttaccc ttattatcaa 2340gataagaaag aaaaggattt ttcgctacgc tcaaatcctt taaaaaaaca caaaagacca 2400cattttttaa tgtggtcttt attcttcaac taaagcaccc attagttcaa caaacgaaaa 2460ttggataaag tgggatattt ttaaaatata tatttatgtt acagtaatat tgacttttaa 2520aaaaggattg attctaatga agaaagcaga caagtaagcc tcctaaattc actttagata 2580aaaatttagg aggcatatca aatgaacttt aataaaattg atttagacaa ttggaagaga 2640aaagagatat ttaatcatta tttgaaccaa caaacgactt ttagtataac cacagaaatt 2700gatattagtg ttttataccg aaacataaaa caagaaggat ataaatttta ccctgcattt 2760attttcttag tgacaagggt gataaactca aatacagctt ttagaactgg ttacaatagc 2820gacggagagt taggttattg ggataagtta gagccacttt atacaatttt tgatggtgta 2880tctaaaacat tctctggtat ttggactcct gtaaagaatg acttcaaaga gttttatgat 2940ttataccttt ctgatgtaga gaaatataat ggttcgggga aattgtttcc caaaacacct 3000atacctgaaa atgctttttc tctttctatt attccatgga cttcatttac tgggtttaac 3060ttaaatatca ataataatag taattacctt ctacccatta ttacagcagg aaaattcatt 3120aataaaggta attcaatata tttaccgcta tctttacagg tacatcattc tgtttgtgat 3180
ggttatcatg caggattgtt tatgaactct attcaggaat tgtcagatag gcctaatgac 3240tggcttttat aatatgagat aatgccgact gtacttttta cagtcggttt tctaatgtca 3300ctaacctgcc ccgttagttg aagaacgaag cggccgcaat tcttgaagac gaaagggcct 3360cgtgatacgc ctatttttat aggttaatgt catgataata atggtttctt agacgtcagg 3420tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct aaatacattc 3480aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg cttcaataat attgaaaaag 3540gaagagtatg agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg cggcattttg 3600ccttcctgtt tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt 3660gggtgcacga gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt 3720tcgccccgaa gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt 3780attatcccgt attgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact attctcagaa 3840tgacttggtt gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag 3900agaattatgc agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact tacttctgac 3960aacgatcgga ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac 4020tcgccttgat cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac 4080cacgatgcct gcagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac 4140tctagcttcc cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg caggaccact 4200tctgcgctcg gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg 4260tgggtctcgc ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt 4320tatctacacg acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat 4380aggtgcctca ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa gtttactcat atatacttta 4440gattgattta aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa 4500tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga 4560aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac 4620aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt 4680tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgtccttc tagtgtagcc 4740gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat 4800cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag 4860acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc 4920cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag 4980cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac 5040aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg 5100gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct 5160atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc 5220tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga 5280gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga 5340agcggaagag cgcctgatgc ggtattttct ccttacgcat ctgtgcggta tttcacaccg 5400catatggtgc actctcagta caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact 5460ccgctatcgc tacgtgactg ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac 5520gcgccctgac gggcttgtct gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc 5580gggagctgca tgtgtcagag gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg 5640taaagctcat cagcgtggtc gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc 5700agctcgttga gtttctccag aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta 5760agggcggttt tttcctgttt ggtcacttga tgcctccgtg taagggggaa tttctgttca 5820tgggggtaat gataccgatg aaacgagaga ggatgctcac gatacgggtt actgatgatg 5880aacatgcccg gttactggaa cgttgtgagg gtaaacaact ggcggtatgg atgcggcggg 5940accagagaaa aatcactcag ggtcaatgcc agcgcttcgt taatacagat gtaggtgttc 6000cacagggtag ccagcagcat cctgcgatgc agatccggaa cataatggtg cagggcgctg 6060acttccgcgt ttccagactt tacgaaacac ggaaaccgaa gaccattcat gttgttgctc 6120aggtcgcaga cgttttgcag cagcagtcgc ttcacgttcg ctcgcgtatc ggtgattcat 6180tctgctaacc agtaaggcaa ccccgccagc ctagccgggt cctcaacgac aggagcacga 6240tcatgcgcac ccgtggccag gacccaacgc tgcccgagat gcgccgcgtg cggctgctgg 6300agatggcgga cgcgatggat atgttctgcc aagggttggt ttgcgcattc acagttctcc 6360gcaagaattg attggctcca attcttggag tggtgaatcc gttagcgagg tgccgccggc 6420ttccattcag gtcgaggtgg cccggctcca tgcaccgcga cgcaacgcgg ggaggcagac 6480aaggtatagg gcggcgccta caatccatgc caacccgttc catgtgctcg ccgaggcggc 6540ataaatcgcc gtgacgatca gcggtccagt gatcgaagtt aggctggtaa gagccgcgag 6600cgatccttga agctgtccct gatggtcgtc atctacctgc ctggacagca tggcctgcaa 6660cgcgggcatc ccgatgccgc cggaagcgag aagaatcata atggggaagg ccatccagcc 6720tcgcg 6725<210>23
<211>6806<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述載體<220>
<223>pAN637<400>23tcggcggccg cttcgtcgac cgaaacagca gttataaggc atgaagctgt ccggtttttg 60caaaagtggc tgtgactgta aaaagaaatc gaaaaagacc gttttgtgtg aaaacggtct 120ttttgtttcc ttttaaccaa ctgccataac tcgaggccta cctagcttcc aagaaagata 180tcctaacagc acaagagcgg aaagatgttt tgttctacat ccagaacaac ctctgctaaa 240attcctgaaa aattttgcaa aaagttgttg actttatcta caaggtgtgg tataataatc 300ttaacaacag caggacgctc tagacaattg agatcttaag aaaggaggtg ttaattaatg 360aagattggaa tcattggcgg aggctccgtt ggtcttttat gcgcctatta tttgtcactt 420tatcacgacg tgactgttgt gacgaggcgg caagaacagg ctgcggccat tcagtctgaa 480ggaatccggc tttataaagg cggggaggaa ttcagggctg attgcagtgc ggacacgagt 540atcaattcgg actttgacct gcttgtcgtg acagtgaagc agcatcagct tcaatctgtt 600ttttcgtcgc ttgaacgaat cgggaagacg aatatattat ttttgcaaaa cggcatgggg 660catatccacg acctaaaaga ctggcacgtt ggccattcca tttatgttgg aatcgttgag 720cacggagctg taagaaaatc ggatacagct gttgatcata caggcctagg tgcgataaaa 780tggagcgcgt tcgacgatgc tgaaccagac cggctgaaca tcttgtttca gcataaccat 840tcggattttc cgatttatta tgagacggat tggtaccgtc tgctgacggg caagctgatt 900gtaaatgcgt gtattaatcc tttaactgcg ttattgcaag tgaaaaatgg agaactgctg 960acaacgccag cttatctggc ttttatgaag ctggtatttc aggaggcatg ccgcatttta 1020aaacttgaaa atgaagaaaa ggcttgggag cgggttcagg ccgtttgtgg gcaaacgaaa 1080gagaatcgtt catcaatgct ggttgacgtc attggaggcc ggcagacgga agctgacgcc 1140attatcggat acttattgaa ggaagcaagt cttcaaggtc ttgatgccgt ccacctagag 1200tttttatatg gcagcatcaa agcattggag cgaaatacca acaaagtggt ttactaagga 1260tcctgttttg gcggatgaga gaagattttc agcctgatac agattaaatc agaacgcaga 1320agcggtctga taaaacagaa tttgcctggc ggcagtagcg cggtggtccc acctgacccc 1380atgccgaact cagaagtgaa acgccgtagc gccgatggta gtgtggggtc tccccatgcg 1440agagtaggga actgccaggc atcaaataaa acgaaaggct cagtcgaaag actgggcctt 1500tcgttttatc tgttgtttgt cggtgaacgc tctcctgagt aggacaaatc cgccgggagc 1560ggatttgaac gttgcgaagc aacggcccgg agggtggcgg gcaggacgcc cgccataaac 1620tgccaggcat caaattaagc agaaggccat cctgacggat ggcctttttg cgtttctaca 1680aactcttggt accgagacga tcgtcctctt tgttgtagcc catcactttt gctgaagagt 1740aggagccgaa agtgacggcg tattcattga gcggcagctg agtcgcaccg acagaaatcg 1800cttctcttga tgtgcccggc gatccgactg tccagccgtt cggtccgctg ttgccgtttg 1860aggtaacagc gacaacgcct tctgacatgg cccagtcaag cgctgtgctt gtcgcccagt 1920ccgggttgtt taaagagttt ccgagagaca ggttcatcac atctgccccg tcctgcactg 1980cacgttccac gcccgcgatg acgttttccg ttgtgccgct tccgccaggc cctaacacac 2040gataagcaag aagtgtggca tcaggcgcta cgcctttaat cgttccgttt gcagccacag 2100ttccggctac gtgtgtgcca tggtcagttg cctcgcccct cggatcgccg gttggtgttt 2160cttttggatc gtaatcattg tccacaaaat cgtatccttt atattgtcca aagtttttct 2220tcagatctgg gtgattgtat tcaaccccag tgtcaataat cgccaccttg atgccttttc 2280ctgtgtagcc taaatcccat gcatcgtttg ctccgatata aggcgcactg tcatccattt 2340gcggagatac ggcgtcttcg gagattgtgg ggaattctca tgtttgacag cttatcatgc 2400aatagttacc cttattatca agataagaaa gaaaaggatt tttcgctacg ctcaaatcct 2460ttaaaaaaac acaaaagacc acatttttta atgtggtctt tattcttcaa ctaaagcacc 2520cattagttca acaaacgaaa attggataaa gtgggatatt tttaaaatat atatttatgt 2580tacagtaata ttgactttta aaaaaggatt gattctaatg aagaaagcag acaagtaagc 2640ctcctaaatt cactttagat aaaaatttag gaggcatatc aaatgaactt taataaaatt 2700gatttagaca attggaagag aaaagagata tttaatcatt atttgaacca acaaacgact 2760tttagtataa ccacagaaat tgatattagt gttttatacc gaaacataaa acaagaagga 2820tataaatttt accctgcatt tattttctta gtgacaaggg tgataaactc aaatacagct 2880tttagaactg gttacaatag cgacggagag ttaggttatt gggataagtt agagccactt 2940tatacaattt ttgatggtgt atctaaaaca ttctctggta tttggactcc tgtaaagaat 3000gacttcaaag agttttatga tttatacctt tctgatgtag agaaatataa tggttcgggg 3060
aaattgtttc ccaaaacacc tatacctgaa aatgcttttt ctctttctat tattccatgg 3120acttcattta ctgggtttaa cttaaatatc aataataata gtaattacct tctacccatt 3180attacagcag gaaaattcat taataaaggt aattcaatat atttaccgct atctttacag 3240gtacatcatt ctgtttgtga tggttatcat gcaggattgt ttatgaactc tattcaggaa 3300ttgtcagata ggcctaatga ctggctttta taatatgaga taatgccgac tgtacttttt 3360acagtcggtt ttctaatgtc actaacctgc cccgttagtt gaagaacgaa gcggccgcaa 3420ttcttgaaga cgaaagggcc tcgtgatacg cctattttta taggttaatg tcatgataat 3480aatggtttct tagacgtcag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg 3540tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat 3600gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat 3660tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt 3720aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag 3780cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa 3840agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg 3900ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct 3960tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac 4020tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca 4080caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat 4140accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgcagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact 4200attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc 4260ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga 4320taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg 4380taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg 4440aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca 4500agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta 4560ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca 4620ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg 4680cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga 4740tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa 4800tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc 4860tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg 4920tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac 4980ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct 5040acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc 5100ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg 5160gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg 5220ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct 5280ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga 5340taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg 5400cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca 5460tctgtgcggt atttcacacc gcatatggtg cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc 5520atagttaagc cagtatacac tccgctatcg ctacgtgact gggtcatggc tgcgccccga 5580cacccgccaa cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc atccgcttac 5640agacaagctg tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc gtcatcaccg 5700aaacgcgcga ggcagctgcg gtaaagctca tcagcgtggt cgtgaagcga ttcacagatg 5760tctgcctgtt catccgcgtc cagctcgttg agtttctcca gaagcgttaa tgtctggctt 5820ctgataaagc gggccatgtt aagggcggtt ttttcctgtt tggtcacttg atgcctccgt 5880gtaaggggga atttctgttc atgggggtaa tgataccgat gaaacgagag aggatgctca 5940cgatacgggt tactgatgat gaacatgccc ggttactgga acgttgtgag ggtaaacaac 6000tggcggtatg gatgcggcgg gaccagagaa aaatcactca gggtcaatgc cagcgcttcg 6060ttaatacaga tgtaggtgtt ccacagggta gccagcagca tcctgcgatg cagatccgga 6120acataatggt gcagggcgct gacttccgcg tttccagact ttacgaaaca cggaaaccga 6180agaccattca tgttgttgct caggtcgcag acgttttgca gcagcagtcg cttcacgttc 6240gctcgcgtat cggtgattca ttctgctaac cagtaaggca accccgccag cctagccggg 6300tcctcaacga caggagcacg atcatgcgca cccgtggcca ggacccaacg ctgcccgaga 6360tgcgccgcgt gcggctgctg gagatggcgg acgcgatgga tatgttctgc caagggttgg 6420tttgcgcatt cacagttctc cgcaagaatt gattggctcc aattcttgga gtggtgaatc 6480cgttagcgag gtgccgccgg cttccattca ggtcgaggtg gcccggctcc atgcaccgcg 6540acgcaacgcg gggaggcaga caaggtatag ggcggcgcct acaatccatg ccaacccgtt 6600ccatgtgctc gccgaggcgg cataaatcgc cgtgacgatc agcggtccag tgatcgaagt 6660taggctggta agagccgcga gcgatccttg aagctgtccc tgatggtcgt catctacctg 6720cctggacagc atggcctgca acgcgggcat cccgatgccg ccggaagcga gaagaatcat 6780
aatggggaag gccatccagc ctcgcg 6806<210>24<211>3867<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述載體<400>24aagctttctc aagaagcgaa caagaaaaaa gaagagcaga ttaaacagct tcaagagttt 60gtcgctagat tcagcgccaa tgcgtctaaa tctaagcagg ctacatcaag aaagaaactt 120ctcgaaaaaa tcacgctgga tgatattaaa ccgtcttccc gccgctatcc ttatgttaac 180ttcacgccgg aacgggaaat cggaaatgat gttcttcgcg tggaaggctt aacaaaaaca 240atcgatggcg taaaggtgct tgacaatgtc agctttatta tgaatcgaga agataaaatt 300gctttcactg gccgaaatga acttgctgtt actacgctgt ttaaaatcat ttccggggaa 360atggaagctg acagcggaac gtttaaatgg ggtgttacca catctcaagc gtattttcca 420aaagacaaca gcgaatattt cgaaggcagt gatctgaacc ttgtagactg gcttcgccaa 480tattctccgc acgaccaaag tgagagcttt ttacgcggtt tcttaggacg catgctgttc 540tctggagaag aagtccacaa aaaagcaaat gtactttccg ggggagaaaa ggtccgctgt 600atgctgtcga aagcgatgct ttctggcgcc aatattttaa ttttggatga gccgaccaac 660catttagacc tagagtccat tacagcgctc aataacggct taatcagctt taaaggcgct 720atgctgttta cttcccatga ccatcagttt gtgcagacca ttgccaacag aattatagaa 780attacaccta acggcatcgt cgataagcaa atgagctatg acgagttcct tgaaaatgct 840gatgtgcaga aaaaattgac tgaactatac gccgaataaa aaagcagaga tttctctgct 900ttttttgata cctaaatgtg aaaggagatc acaacatgaa atttttggtt gtcggagcag 960gtggagtagg cgggtatatt ggcggacggc tttcggagaa aggaaatgat gtgacatttc 1020tcgtgcgcca aaaacgagct gagcagctta aaaaaaccgg gcttgtcatc catagtgaaa 1080aagggaatgt atcatttcag cccgaactaa tcagtgccgg agaaacaggg caatttgatg 1140tcgttatcat tgcttctaaa gcatactcgc ttggtcaagt gatagaggat gtcaaaccat 1200ttatccatca agaatctgtc attatccctt ttttaaatgg gtaccgccac tatgagcagc 1260tatttgcggc attttcaaaa gaacaggtgc tgggcggcct gtgttttata gaaagtgctt 1320tagacaacaa aggagaaatt catcatacga gcgcatcgca tcgttttgta tttggagaat 1380ggaacggcga gcgtacggag cggataagag cgcttgaaga ggcattttca ggtgtgaagg 1440ctgaagtcat cattagcggg catatcgaga agatcccctg cagcaatagt tacccttatt 1500atcaagataa gaaagaaaag gatttttcgc tacgctcaaa tcctttaaaa aaacacaaaa 1560gaccacattt tttaatgtgg tctttattct tcaactaaag cacccattag ttcaacaaac 1620gaaaattgga taaagtggga tatttttaaa atatatattt atgttacagt aatattgact 1680tttaaaaaag gattgattct aatgaagaaa gcagacaagt aagcctccta aattcacttt 1740agataaaaat ttaggaggca tatcaaatga actttaataa aattgattta gacaattgga 1800agagaaaaga gatatttaat cattatttga accaacaaac gacttttagt ataaccacag 1860aaattgatat tagtgtttta taccgaaaca taaaacaaga aggatataaa ttttaccctg 1920catttatttt cttagtgaca agggtgataa actcaaatac agcttttaga actggttaca 1980atagcgacgg agagttaggt tattgggata agttagagcc actttataca atttttgatg 2040gtgtatctaa aacattctct ggtatttgga ctcctgtaaa gaatgacttc aaagagtttt 2100atgatttata cctttctgat gtagagaaat ataatggttc ggggaaattg tttcccaaaa 2160cacctatacc tgaaaatgct ttttctcttt ctattattcc atggacttca tttactgggt 2220ttaacttaaa tatcaataat aatagtaatt accttctacc cattattaca gcaggaaaat 2280tcattaataa aggtaattca atatatttac cgctatcttt acaggtacat cattctgttt 2340gtgatggtta tcatgcagga ttgtttatga actctattca ggaattgtca gataggccta 2400atgactggct tttataatat gagataatgc cgactgtact ttttacagtc ggttttctaa 2460tgtcactaac ctgccccgtt agttgaagaa ggtttttata ttacagctcc cgggagatct 2520gggatcacta gtccaaacga cagaaggcga ccacctgcat ggatttttga ttgaaaaagc 2580aaaacgttta tctctcgctg caccagtatt agaaaccgtt tatgcgaatc tgcaaatgta 2640tgaagcagaa aaataaaaaa aggaggcgga aaagcctcct tttatttact taaaaagccc 2700aatttccgtt tctgaagata ggctctcttt tcccgtctgc cgtaattccg tcaatattca 2760tatccttaga accgatcata aagtccacgt gtgtaatgct ttcatttagg ccttctttga 2820caagctcttc acgagacatc tgctttccgc cttcaatatt aaaggcatag gcgcttccga 2880tcgccaaatg atttgacgcg ttttcatcaa acagcgtgtt atagaaaaga atgtttgatt 2940gtgatatagg cgaatcgtaa ggaacaagtg ccacttcacc taaatagtga gaaccttcat 3000ctgtttccac cagttctttt aaaatatcct cacctttttc agctttaatg tcgactatac 3060
ggccattttc aaacgtcagg gtgaaatttt caataatatt tccgccgtag cttaatggtt 3120ttgtgcttga taccactccg tcaaccccgt ctttttgcgg cagcgtgaac acttcttctg 3180tcggcatatt ggccataaac tcatggccac tttcattcac gcttcccgca cctgcccaaa 3240catgcttcct aggcagctta attgttagat cagttccttc tgcttgataa tgtaaggcag 3300cgtaatgtct ctcgttcaaa tggtcaactt tttcatgaag attttggtca tgattgatcc 3360acgcctgaac cgggttgtct tcatttacgc gcgtcgcttt aaaaatttct tcccacagaa 3420ggtggatcgc ttcctcctct gatttgccag gaaacacctt gtgagcccag cctgctgatg 3480ccgcacctac gacagtccag ctgactttgt ctgattgaat atattgtctg tatgtatgta 3540atgctttgcc tgctgctttt tggaatgccg caatccgttt ggaatctata ccttttagca 3600agtctgggtt cgacgacaca acagaaatga aagcagctcc atttttggca agctcttctc 3660tgccttttgc ttcccattca ggatattctt caaatgcttc aaacggcgca agttcgtatt 3720ttaatttggc gacttcgtca tcctgccaat tcacggtgac gttttttgcg cccttttcat 3780atgcgtgttt tacaattaaa cggacaaaat cccgaacgtc tgttgaagca tttacgacta 3840catactggcc tttttggaca ttaacgc 3867<210>25<211>8704<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述載體<220>
<223>pAN238<400>25gcggccgctt cgtcgaccga aacagcagtt ataaggcatg aagctgtccg gtttttgcaa 60aagtggctgt gactgtaaaa agaaatcgaa aaagaccgtt ttgtgtgaaa acggtctttt 120tgtttccttt taaccaactg ccataactcg aggcctacct agcttccaag aaagatatcc 180taacagcaca agagcggaaa gatgttttgt tctacatcca gaacaacctc tgctaaaatt 240cctgaaaaat tttgcaaaaa gttgttgact ttatctacaa ggtgtggtat aataatctta 300acaacagcag gacgctctag aggaggagac taacatgaaa tttttggttg tcggagcagg 360tggagtaggc gggtatattg gcggacggct ttcggagaaa ggaaatgatg tgacatttct 420cgtgcgccaa aaacgagctg agcagcttaa aaaaaccggg cttgtcatcc atagtgaaaa 480agggaatgta tcatttcagc ccgaactaat cagtgccgga gaaacagggc aatttgatgt 540cgttatcatt gcttctaaag catactcgct tggtcaagtg atagaggatg tcaaaccatt 600tatccatcaa gaatctgtca ttatcccttt tttaaatggg taccgccact atgagcagct 660atttgcggca ttttcaaaag aacaggtgct gggcggcctg tgttttatag aaagtgcttt 720agacaacaaa ggagaaattc atcatacgag cgcatcgcat cgttttgtat ttggagaatg 780gaacggcgag cgtacggagc ggataagagc gcttgaagag gcattttcag gtgtgaaggc 840tgaagtcatc attagcgggc atatcgagaa ggacatttgg aaaaagtatc tctttattgc 900agcgcaagcg gggatcacaa cgttatttca acgaccgctt ggcccaatcc tcgccacaga 960agccggacgt cacacggccc aaactcttat tggggaaatt tgcactgttt tacgaaaaga 1020aggtgttccg gctgatccgg ctcttgagga agagagcttt cgtacgatga ccagcatgtc 1080ttaccatatg aagtcctcca tgcttcggga tatggaaaac ggccaaacga cagaaggcga 1140ccacctgcat ggatttttga ttgaaaaagc aaaacgttta tctctcgctg caccagtatt 1200agaaaccgtt tatgcgaatc tgcaaatgta tgaagcagaa aaataaaaaa aggaggcgga 1260aaagcctcct tttatttact taaaaagccc aatttccgtt tctgaagata ggctctcttt 1320tcccgtctgc cgggatcctg ttttggcgga tgagagaaga ttttcagcct gatacagatt 1380aaatcagaac gcagaagcgg tctgataaaa cagaatttgc ctggcggcag tagcgcggtg 1440gtcccacctg accccatgcc gaactcagaa gtgaaacgcc gtagcgccga tggtagtgtg 1500gggtctcccc atgcgagagt agggaactgc caggcatcaa ataaaacgaa aggctcagtc 1560gaaagactgg gcctttcgtt ttatctgttg tttgtcggtg aacgctctcc tgagtaggac 1620aaatccgccg ggagcggatt tgaacgttgc gaagcaacgg cccggagggt ggcgggcagg 1680acgcccgcca taaactgcca ggcatcaaat taagcagaag gccatcctga cggatggcct 1740ttttgcgttt ctacaaactc ttggtaccca gaaaaagcgg caaaagcggc tgttaaaaaa 1800gcgaaatcga agaagctgtc tgccgctaag acggaatatc aaaagcgttc tgctgttgtg 1860tcatctttaa aagtcacagc cgatgaatcc cagcaagatg tcctaaaata cttgaacacc 1920cagaaagata aaggaaatgc agaccaaatt cattcttatt atgtggtgaa cgggattgct 1980gttcatgcct caaaagaggt tatggaaaaa gtggtgcagt ttcccgaagt ggaaaaggtg 2040cttcctaatg agaaacggca gctttttaag tcatcctccc catttaatat gaaaaaagca 2100
cagaaagcta ttaaagcaac tgacggtgtg gaatggaatg tagaccaaat cgatgcccca 2160aaagcttggg cacttggata tgatggaact ggcacggttg ttgcgtccat tgataccggg 2220gtggaatgga atcatccggc attaaaagag aaatatcgcg gatataatcc ggaaaatcct 2280aatgagcctg aaaatgaaat gaactggtat gatgccgtag caggcgaggc aagcccttat 2340gatgatttgg ctcatggaac ccacgtgaca ggcacgatgg tgggctctga acctgatgga 2400acaaatcaaa tcggtgtagc acctggcgca aaatggattg ctgttaaagc gttctctgaa 2460gatggcggca ctgatgctga cattttggaa gctggtgaat gggttttagc accaaaggac 2520gcggaaggaa atccccaccc ggaaatggct cctgatgttg tcaataactc atggggaggg 2580ggctctggac ttgatgaatg gtacagagac atggtcaatg cctggcgttc ggccgatatt 2640ttccctgagt tttcagcggg gaatacggat ctctttattc ccggcgggcc tggttctatc 2700gcaaatccgg caaactatcc agaatcgttt gcaactggag cgactgagaa ttccaattcc 2760ccatggagag aaaagaaaat cgctaatgtt gattactttg aacttctgca tattcttgaa 2820tttaaaaagg ctgaaagagt aaaagattgt gctgaaatat tagagtataa acaaaatcgt 2880gaaacaggcg aaagaaagtt gtatcgagtg tggttttgta aatccaggct ttgtccaatg 2940tgcaactgga ggagagcaat gaaacatggc attcagtcac aaaaggttgt tgctgaagtt 3000attaaacaaa agccaacagt tcgttggttg tttctcacat taacagttaa aaatgtttat 3060gatggcgaag aattaaataa gagtttgtca gatatggctc aaggatttcg ccgaatgatg 3120caatataaaa aaattaataa aaatcttgtt ggttttatgc gtgcaacgga agtgacaata 3180aataataaag ataattctta taatcagcac atgcatgtat tggtatgtgt ggaaccaact 3240tattttaaga atacagaaaa ctacgtgaat caaaaacaat ggattcaatt ttggaaaaag 3300gcaatgaaat tagactatga tccaaatgta aaagttcaaa tgattcgacc gaaaaataaa 3360tataaatcgg atatacaatc ggcaattgac gaaactgcaa aatatcctgt aaaggatacg 3420gattttatga ccgatgatga agaaaagaat ttgaaacgtt tgtctgattt ggaggaaggt 3480ttacaccgta aaaggttaat ctcctatggt ggtttgttaa aagaaataca taaaaaatta 3540aaccttgatg acacagaaga aggcgatttg attcatacag atgatgacga aaaagccgat 3600gaagatggat tttctattat tgcaatgtgg aattgggaac ggaaaaatta ttttattaaa 3660gagtagttca acaaacgggc catattgttg tataagtgat gaaatactga atttaaaact 3720tagtttatat gtggtaaaat gttttaatca agtttaggag gaattaatta tgaagtgtaa 3780tgaatgtaac agggttcaat taaaagaggg aagcgtatca ttaaccctat aaactacgtc 3840tgccctcatt attggagggt gaaatgtgaa tacatcctat tcacaatcga atttacgaca 3900caaccaaatt ttaatttggc tttgcatttt atcttttttt agcgtattaa atgaaatggt 3960tttgaacgtc tcattacctg atattgcaaa tgattttaat aaaccacctg cgagtacaaa 4020ctgggtgaac acagccttta tgttaacctt ttccattgga acagctgtat atggaaagct 4080atctgatcaa ttaggcatca aaaggttact cctatttgga attataataa attgtttcgg 4140gtcggtaatt gggtttgttg gccattcttt cttttcctta cttattatgg ctcgttttat 4200tcaaggggct ggtgcagctg catttccagc actcgtaatg gttgtagttg cgcgctatat 4260tccaaaggaa aataggggta aagcatttgg tcttattgga tcgatagtag ccatgggaga 4320aggagtcggt ccagcgattg gtggaatgat agcccattat attcattggt cctatcttct 4380actcattcct atgataacaa ttatcactgt tccgtttctt atgaaattat taaagaaaga 4440agtaaggata aaaggtcatt ttgatatcaa aggaattata ctaatgtctg taggcattgt 4500attttttatg ttgtttacaa catcatatag catttctttt cttatcgtta gcgtgctgtc 4560attcctgata tttgtaaaac atatcaggaa agtaacagat ccttttgttg atcccggatt 4620agggaaaaat atacctttta tgattggagt tctttgtggg ggaattatat ttggaacagt 4680agcagggttt gtctctatgg ttccttatat gatgaaagat gttcaccagc taagtactgc 4740cgaaatcgga agtgtaatta ttttccctgg aacaatgagt gtcattattt tcggctacat 4800tggtgggata cttgttgata gaagaggtcc tttatacgtg ttaaacatcg gagttacatt 4860tctttctgtt agctttttaa ctgcttcctt tcttttagaa acaacatcat ggttcatgac 4920aattataatc gtatttgttt taggtgggct ttcgttcacc aaaacagtta tatcaacaat 4980tgtttcaagt agcttgaaac agcaggaagc tggtgctgga atgagtttgc ttaactttac 5040cagcttttta tcagagggaa caggtattgc aattgtaggt ggtttattat ccataccctt 5100acttgatcaa aggttgttac ctatggaagt tgatcagtca acttatctgt atagtaattt 5160gttattactt ttttcaggaa tcattgtcat tagttggctg gttaccttga atgtatataa 5220acattctcaa agggatttct aaatcgttaa gggatcaact ttgggagaga gttcaaaatt 5280gatccttttt ttataacagt tcgaagcggc cgcaattctt gaagacgaaa gggcctcgtg 5340atacgcctat ttttataggt taatgtcatg ataataatgg tttcttagac gtcaggtggc 5400acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat 5460atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag 5520agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc attttgcctt 5580cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt 5640gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta agatccttga gagttttcgc 5700cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta 5760tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac 5820
ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg atggcatgac agtaagagaa 5880ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg 5940atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc 6000cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg 6060atgcctgcag caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact acttactcta 6120gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata aagttgcagg accacttctg 6180cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg 6240tctcgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc 6300tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt 6360gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt 6420gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc 6480atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag 6540atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa 6600aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg 6660aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag 6720ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg 6780ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga 6840tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc 6900ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc 6960acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga 7020gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt 7080cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg 7140aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac 7200atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga 7260gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg 7320gaagagcgcc tgatgcggta ttttctcctt acgcatctgt gcggtatttc acaccgcata 7380tggtgcactc tcagtacaat ctgctctgat gccgcatagt taagccagta tacactccgc 7440tatcgctacg tgactgggtc atggctgcgc cccgacaccc gccaacaccc gctgacgcgc 7500cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg cttacagaca agctgtgacc gtctccggga 7560gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat caccgaaacg cgcgaggcag ctgcggtaaa 7620gctcatcagc gtggtcgtga agcgattcac agatgtctgc ctgttcatcc gcgtccagct 7680cgttgagttt ctccagaagc gttaatgtct ggcttctgat aaagcgggcc atgttaaggg 7740cggttttttc ctgtttggtc acttgatgcc tccgtgtaag ggggaatttc tgttcatggg 7800ggtaatgata ccgatgaaac gagagaggat gctcacgata cgggttactg atgatgaaca 7860tgcccggtta ctggaacgtt gtgagggtaa acaactggcg gtatggatgc ggcgggacca 7920gagaaaaatc actcagggtc aatgccagcg cttcgttaat acagatgtag gtgttccaca 7980gggtagccag cagcatcctg cgatgcagat ccggaacata atggtgcagg gcgctgactt 8040ccgcgtttcc agactttacg aaacacggaa accgaagacc attcatgttg ttgctcaggt 8100cgcagacgtt ttgcagcagc agtcgcttca cgttcgctcg cgtatcggtg attcattctg 8160ctaaccagta aggcaacccc gccagcctag ccgggtcctc aacgacagga gcacgatcat 8220gcgcacccgt ggccaggacc caacgctgcc cgagatgcgc cgcgtgcggc tgctggagat 8280ggcggacgcg atggatatgt tctgccaagg gttggtttgc gcattcacag ttctccgcaa 8340gaattgattg gctccaattc ttggagtggt gaatccgtta gcgaggtgcc gccggcttcc 8400attcaggtcg aggtggcccg gctccatgca ccgcgacgca acgcggggag gcagacaagg 8460tatagggcgg cgcctacaat ccatgccaac ccgttccatg tgctcgccga ggcggcataa 8520atcgccgtga cgatcagcgg tccagtgatc gaagttaggc tggtaagagc cgcgagcgat 8580ccttgaagct gtccctgatg gtcgtcatct acctgcctgg acagcatggc ctgcaacgcg 8640ggcatcccga tgccgccgga agcgagaaga atcataatgg ggaaggccat ccagcctcgc 8700gtcg 870權(quán)利要求
1. 3-(2-羥基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(HMBPA)的制備方法，包括在使HMBPA產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)微生物和檢測(cè)由所述微生物制備的HMBPA。
2. 3-(2-羥基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(HMBPA)的制備方法，包括在使HMBPA產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)微生物和分離由所述微生物制備的HMBPA。
3. 3-(2-羥基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(HMBPA)的制備方法，包括在過(guò)量α-酮異戊酸和過(guò)量β-丙氨酸存在下培養(yǎng)具有增加的酮還原酶活性或增加的泛酸合成酶活性的微生物使HMBPA產(chǎn)生。
4. 3-(2-羥基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(HMBPA)的制備方法，包括在過(guò)量α-酮異戊酸和過(guò)量β-丙氨酸存在下培養(yǎng)具有增加的酮還原酶活性和增加的泛酸合成酶活性的微生物使HMBPA產(chǎn)生。
5.權(quán)利要求3或4的方法，其中所述微生物包含修飾的panE基因。
6.權(quán)利要求5的方法，其中panE基因被過(guò)表達(dá)、去調(diào)節(jié)或以多拷貝存在。
7.權(quán)利要求3或4的方法，其中所述微生物包含修飾的panE1基因。
8.權(quán)利要求3或4的方法，其中所述微生物包含修飾的panE2基因。
9.權(quán)利要求3或4的方法，其中所述微生物包含修飾的panE1基因和修飾的panE2基因。
10.權(quán)利要求3或4的方法，其中所述微生物包含修飾的panC基因。
11.權(quán)利要求3或4的方法，其中panC基因被過(guò)表達(dá)、去調(diào)節(jié)或以多拷貝存在。
12.權(quán)利要求3或4的方法，其中所述微生物還具有增加的乙酰羥酸異構(gòu)還原酶活性。
13.3-(2-羥基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(HMBPA)的制備方法，包括在過(guò)量α-酮異戊酸和過(guò)量β-丙氨酸存在下培養(yǎng)具有增加的乙酰羥酸異構(gòu)還原酶活性的微生物使HMBPA產(chǎn)生。
14.權(quán)利要求12或13的方法，其中所述微生物包含修飾的ilvC基因。
15.權(quán)利要求14的方法，其中ilvC基因被過(guò)表達(dá)、去調(diào)節(jié)或以多拷貝存在。
16.權(quán)利要求3，4或11任一項(xiàng)的方法，其中所述微生物還具有降低的酮泛解酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶活性。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述微生物包含修飾的panB基因。
18.權(quán)利要求16的方法，其中所述微生物的panB基因缺失。
19. 3-(2-羥基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(HMBPA)的制備方法，包括在過(guò)量α-酮異戊酸和過(guò)量β-丙氨酸存在下培養(yǎng)具有降低的酮泛解酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶活性的微生物使HMBPA產(chǎn)生。
20.使3-(2-羥基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(HMBPA)相對(duì)于泛酸而言產(chǎn)生提高的方法，包括在使HMBPA產(chǎn)生相對(duì)于泛酸產(chǎn)生得以增強(qiáng)的條件下培養(yǎng)重組微生物。
21. 2-羥基異戊酸(α-HIV)的制備方法，包括在使α-HIV產(chǎn)生的條件下，培養(yǎng)過(guò)表達(dá)PanE1或PanE2并進(jìn)一步具有降低的PanC或PanD活性的微生物。
22. 3-(2-羥基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(HMBPA)的制備方法，包括在使HMBPA產(chǎn)生的條件下，培養(yǎng)具有降低的serA或glyA表達(dá)或活性的重組微生物。
23. 3-(2-羥基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(HMBPA)的制備方法，包括在使HMBPA產(chǎn)生的條件下，培養(yǎng)具有降低的serA和glyA表達(dá)或活性的重組微生物。
24.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中微生物在增加穩(wěn)態(tài)葡萄糖的條件下培養(yǎng)。
25.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中微生物在降低穩(wěn)態(tài)溶解氧的條件下培養(yǎng)。
26.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中微生物在降低絲氨酸的條件下培養(yǎng)。
27.根據(jù)上述任一項(xiàng)權(quán)利要求制備的產(chǎn)物。
28.產(chǎn)生3-(2-羥基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(HMBPA)的重組微生物，該微生物在編碼酮泛解酸還原酶的至少一個(gè)基因中具有導(dǎo)致還原酶活性增加的修飾，并且在panB基因中具有導(dǎo)致酮泛解酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶活性降低的突變或缺失。
29.權(quán)利要求28的重組微生物，其中編碼酮泛解酸還原酶的基因是panE基因。
30.權(quán)利要求29的重組微生物，其中panE基因是panE1。
31.權(quán)利要求29的重組微生物，其中panE基因是panE2。
32.權(quán)利要求28的重組微生物，其中微生物在panE1和panE2中具有修飾。
33.權(quán)利要求28的重組微生物，其在ilvC中還具有導(dǎo)致乙酰羥酸異構(gòu)還原酶活性增加的修飾。
34.產(chǎn)生3-(2-羥基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(HMBPA)的重組微生物，該微生物在ilvC中具有導(dǎo)致乙酰羥酸異構(gòu)還原酶活性增加的修飾，并在panB基因中具有導(dǎo)致酮泛解酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶活性降低的突變或缺失。
35.權(quán)利要求28-34任一項(xiàng)的重組微生物，其中所述微生物屬于芽孢桿菌屬。
36.權(quán)利要求35的重組微生物，其是枯草芽孢桿菌。
全文摘要
本發(fā)明公開了利用具有改變的泛酸生物合成酶活性的微生物制備3－(2－羥基－3－甲基－丁酰氨基)－丙酸(“HMBPA”)和α－羥基異戊酸(“α－HIV”)的方法。也公開了重組微生物和其培養(yǎng)條件。也公開了包括HMBPA的組合物和包括α－HIV的組合物。
文檔編號(hào)C12P7/42GK1496400SQ02803856
公開日2004年5月12日 申請(qǐng)日期2002年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月19日
發(fā)明者T·赫爾曼, T·A·帕特森, J·G·佩羅, R·R·約卡姆, K-U·鮑爾代紐斯, C·貝克, T 赫爾曼,λ, 佩羅, 帕特森, 約卡姆 申請(qǐng)人:巴斯福股份公司