專利名稱：蛋白質(zhì)糖基化的制作方法
蛋白質(zhì)糖基化本發(fā)明涉及寡糖基(oligosaccharyl)轉(zhuǎn)移酶多肽及其在通過微生物宿主細(xì)胞生產(chǎn)糖基化的重組蛋白中的用途，并且包括含有糖基化的重組抗原的疫苗。介紹重組蛋白質(zhì)如酶、多肽激素、重組單克隆抗體和重組抗原的大規(guī)模生產(chǎn)要求高標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)量控制，由于這些蛋白質(zhì)中許多是給予到人的。此外，疫苗尤其是亞單位疫苗的開發(fā)要求生產(chǎn)大量的、不含可以激發(fā)過敏反應(yīng)的污染性抗原的純蛋白質(zhì)。在細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)基于原核細(xì)胞表達(dá)或真核細(xì)胞表達(dá)進(jìn)行。當(dāng)要求對蛋白進(jìn)行翻譯后修飾如糖基化時，后者是優(yōu)選的。背景
糖基化是將糖的懸掛基團(tuán)(pendent group)加到蛋白質(zhì)、多肽或肽上,其改變所述蛋白質(zhì)、多肽或肽的活性和/或生物利用度。該過程是共翻譯或者翻譯后的，并且是酶介導(dǎo)的。存在兩種類型的糖基化對天冬酰胺側(cè)鏈的N-聯(lián)糖基化，以及對絲氨酸或蘇氨酸氨基酸側(cè)鏈的0-聯(lián)糖基化。N-聯(lián)糖基化是最普通的翻譯后修飾并且在真核細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上進(jìn)行。N-聯(lián)糖基化可以分為兩大類；為兩個N-乙酰葡糖胺的高甘露糖寡糖和包括其他類型的糖基的復(fù)合寡糖。糖基化多肽包含的肽基序?yàn)锳sn-X-Ser或Asn-X-Thr，其中X是除脯氨酸之外的任意氨基酸。其被酶寡糖基轉(zhuǎn)移酶
催化；參見Yan & Lennarz J. Biol.Chem. ,Vol. 280(5),3121-3124(2005)OT catalyzes the transfer of an oligosaccharylmoiety(Glc3Man9GlcNAc2)from the dolichol-linked pyrophosphate donor to the sidechain of an Asn0對于所有的N-聯(lián)寡糖而言，五糖核心是共有的并作為許多N-聯(lián)寡糖的基礎(chǔ)。0-聯(lián)糖基化較不常見。絲氨酸或者蘇氨酸殘基通過其側(cè)鏈氧通過糖苷鍵與糖連接。通常地，N-乙酰葡糖胺是以此方式與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相連的。最近才認(rèn)識到原核細(xì)胞具有將蛋白質(zhì)糖基化的能力。尤其地，認(rèn)識到了在一些e蛋白菌中存在N-聯(lián)糖基化。例如空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni) [C. jejuni]的基因組編碼脂寡糖和N-聯(lián)糖蛋白的合成中牽涉的基因。蛋白質(zhì)糖基化位置[pgl位置]牽涉到30個以上的糖蛋白的糖基化中。還證明了所述的pgl基因可以在大腸桿菌[E.coli]中發(fā)揮功能從而修飾共表達(dá)的空腸彎曲桿菌蛋白質(zhì)，這說明大腸桿菌可以被改造從而產(chǎn)生異源重組糖蛋白。由空腸彎曲桿菌基因座編碼的PglB可以將包括細(xì)菌0-抗原的替代多糖轉(zhuǎn)移到成熟的N-聯(lián)七糖GalNac5GlcBac，這暗示寬松的特異性。然而，有與此酶相關(guān)的問題；所述的酶并不能夠轉(zhuǎn)移所有的多糖。這可以是由在多糖的還原性末端的糖的C2位上需要乙酰氨基基團(tuán)所導(dǎo)致的。因此希望能鑒定替代的無此障礙的寡糖基轉(zhuǎn)移酶。在藥物的歷史上最重要的發(fā)現(xiàn)之一是接種策略的開發(fā)，所述的接種策略用于針對大量的感染性和非感染性的疾病，為人和動物提供保護(hù)。多種疫苗是由注射到個體中的滅活或減毒的病原體制備的。這些有時候可以引起不良的副作用。多種現(xiàn)代疫苗是由病原體的保護(hù)性抗原制備的，其通過純化或分子克隆從引起副作用的物質(zhì)中分離。這些后者的疫苗稱作“亞單位疫苗”。由莢膜細(xì)菌引起的細(xì)菌性感染是全世界主要的健康問題。由于主要表面抗原莢膜多糖的T細(xì)胞非依賴性的本質(zhì),難以針對肺炎鏈球菌(Streptoccocuspneumoniae),流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)和腦膜炎雙球菌(Neisseriameningitidis)菌種進(jìn)行接種。關(guān)于有效疫苗的開發(fā)，T細(xì)胞非依賴性抗原如莢膜多糖表現(xiàn)出特別的問題。抗體的產(chǎn)量低，并且一般地在再次免疫中不被加強(qiáng)?？贵w同種型被限制為IgM,而其他同種型對特異性抗原一般具有低的親和性。主要問題在于幼童對T細(xì)胞非依賴性疫苗的應(yīng)答。這些個體對于細(xì)菌感染是最脆弱的。T細(xì)胞依賴性抗原在引發(fā)高滴度、高親和性的抗體應(yīng)答中更為有效，并且通常是蛋白質(zhì)。這是由于對B-淋巴細(xì)胞有幫助的T-淋巴細(xì)胞在對這些抗原的免疫應(yīng)答中被引發(fā)。B-淋巴細(xì)胞通過其特異性抗原受體結(jié)合于抗原，這導(dǎo)致了部分激活。如果所述的抗原是蛋白質(zhì)的話，所述的B淋巴細(xì)胞攝取并加工該抗原成為肽，所述的肽是與HLA II類分子在細(xì)胞表面上表達(dá)的。T細(xì)胞非依賴性抗原在組成上不總是蛋白質(zhì)，并且因此不能由B-淋巴細(xì)胞通過HLA分子進(jìn)行加工和呈遞。該抗原呈遞的失敗使得該抗原的T-細(xì)胞識別低，并且因此導(dǎo)致其無T細(xì)胞輔助。用于肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌和腦膜炎雙球菌的糖綴合疫苗當(dāng)前批準(zhǔn)為人使用，并且通過將這些細(xì)菌的莢膜(或者其他的細(xì)菌性基于多糖的結(jié)構(gòu)，如脂寡多糖，L0S)與 蛋白質(zhì)類毒素連接。當(dāng)這些疫苗提供良好的免疫水平時，其昂貴并難于生產(chǎn)，要求對來自致病性有機(jī)體的多糖進(jìn)行純化，以及要求與載體蛋白的化學(xué)連接。還有證據(jù)顯示，出現(xiàn)了由未被所述的疫苗覆蓋的血清型引起的疾病。有機(jī)體系的應(yīng)用代表了更快以及更經(jīng)濟(jì)的糖綴合生產(chǎn)的方法。本公開涉及與空腸彎曲桿菌PglB同源的寡糖基轉(zhuǎn)移酶的識別和表征，并且所述的寡糖基轉(zhuǎn)移酶能夠在不需要醋酸亞氨基的情況下將蛋白質(zhì)糖基化，從而提供了在疫苗中有用的蛋白質(zhì)糖蛋白綴合物，其會受益于T細(xì)胞的輔助從而提供對例如細(xì)菌感染有效的疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了包含核苷酸序列的載體轉(zhuǎn)化的微生物細(xì)胞，所述的核苷酸序列選自i)由圖Ia表示的核酸序列組成的核酸分子；ii)由在嚴(yán)格的雜交條件下與(i)中的核酸分子雜交的核酸序列所組成的核酸分子并且該核酸序列編碼多肽；其中所述的細(xì)胞表達(dá)重組多肽，該多肽是所述的寡糖基轉(zhuǎn)移酶的底物。當(dāng)兩個互補(bǔ)的核酸分子彼此之間發(fā)生一定數(shù)量的氫鍵鍵合時，核酸分子的雜交發(fā)生。嚴(yán)格性或者雜交可以根據(jù)核酸周圍的環(huán)境條件、雜交方法的本質(zhì)以及所使用的核酸分子的組成和長度發(fā)生變化。在Sambrook等人，Molecular Cloning ALaboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,NY,2001)；以及 Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Acid Probes Part I, Chapter 2 (Elsevier, NewYork, 1993)中討論了為了達(dá)到特定的嚴(yán)格性程度所需要的關(guān)于雜交條件的計(jì)算。Tm是50%的給定的核酸分子鏈與其互補(bǔ)鏈雜交時的溫度。隨后是雜交條件的示例性設(shè)定，其不是限制性的
非常高的嚴(yán)格性(使具有至少90%同源性的序列雜交)雜交 5x SSC在65°C下16小時洗滌兩次2x SSC在室溫(RT)下每次15分鐘洗滌兩次0. 5x SSC在65°C下每次20分鐘高嚴(yán)格性(使具有至少80%同源性的序列雜交)雜交5x_6x SSC 在 65°C _70°C下 16-20 小時洗滌兩次2x SSC在室溫(RT)下每次5-20分鐘洗滌兩次lx SSC在55°C _70°C下每次30分鐘
低嚴(yán)格性(使具有至少50%同源性的序列雜交)雜交6x SSC 在 RT 到 55°C 下 16-20 小時洗滌至少兩次2x_3x SSC在RT到55°C下每次20-30分鐘。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的微生物細(xì)胞使用核酸分子進(jìn)行轉(zhuǎn)化，所述的核酸分子包含核苷酸序列，所述的核苷酸序列編碼如圖Ib所示的寡糖基轉(zhuǎn)移酶多肽，或者編碼變體多肽，所述的變體多肽包含經(jīng)修飾的圖Ib所示的氨基酸序列，所述修飾是通過至少一個氨基酸殘基的缺失、添加或取代進(jìn)行并保持或者增強(qiáng)了寡糖基轉(zhuǎn)移酶活性。通過可以存在于任何組合中的一次或多次的取代、添加、缺失、截短，變體多肽可以在氨基酸序列上有差別。優(yōu)選的變體是從參照多肽上進(jìn)行保守的氨基酸取代的那些。該取代是將給定的氨基酸用具有類似特征的另一氨基酸取代的那些。隨后的非限制性的氨基酸列表認(rèn)為是保守置換(類似的)a)丙氨酸、絲氨酸和蘇氨酸；b)谷氨酸和天冬氨酸；c)天冬酰胺和谷氨酰胺；d)精氨酸和賴氨酸；e)異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和纈氨酸以及f)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。最優(yōu)選的是與其變化自的參照多肽保持或者增強(qiáng)了相同的生物功能和活性的變體。此外，本發(fā)明描述了與所公開的多肽序列具有至少40-75%的同源性的多肽序列，或者其片段和功能上等價(jià)的多肽；優(yōu)選地其與整個氨基酸序列相比具有至少43%同源性。在一個實(shí)施方案中，與在本文中參考圖Ib所圖示的整個氨基酸序列相比，所述的多肽與所述的氨基酸序列具有至少85%的同源性，更優(yōu)選地具有至少90%的同源性，甚至更優(yōu)選地具有至少95%的同源性，還更優(yōu)選地具有至少97%的同源性，以及最優(yōu)選地具有至少99%的同源性。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的載體是表達(dá)載體，所述的表達(dá)載體適合于表達(dá)編碼寡糖基轉(zhuǎn)移酶多肽的核酸分子的表達(dá)。針對一般性的表達(dá)載體的構(gòu)建和重組DNA技術(shù)有大量的已公開文獻(xiàn)。請參見，Sambrook 等人(1989)Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring HarbourLaboratory, Cold Spring Harbour, NY 及其中的參考文獻(xiàn)；Marston, F (1987) DNA CloningTechniques A Practical Approach Vol III IRL Press，Oxford UK ；DNA Cloning F MAusubel 等人，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons，Inc.(1994) o在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的重組多肽包括至少一個肽基序，所述的肽基序由以下氨基酸序列構(gòu)成Asp/Glu-Xaa1-Asn-Xaa2-SerZThr
其中Xaa1和Xaa2是除脯氨酸之外的任意氨基酸。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的重組多肽是從傳染性病原體中分離的抗原。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的傳染性病原體是細(xì)菌性病原體。優(yōu)選地，可以從以下的病原體將多糖轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)、豬鏈球菌(Streptococcus suis)、海豚鏈球菌(streptococcus inae)、無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)、停乳鏈球菌(Streptococcus dysgalactiae)、馬鏈球菌(Streptococcus equi)、乳房鏈球菌(Streptococcus uberist)、米勒鏈球菌組(Streptococcus milleri group)(SMG)、血鏈球菌(Streptococcus sanguis)，牛鏈球菌(Streptococcus bovis)，鏈球菌 A 組(Streptococcus group A)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)，產(chǎn)酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)，植生克雷伯菌(Klebsiella planticola)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aerunginosa)、鮑氏不動桿菌(Acinetobcater baumanii)、醋酸I丐不動桿菌(Acinetobacter calcoaceticus)，傷寒沙門菌(Salmonella enterica serovar Typhi)，空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)， 結(jié)腸彎曲菌(Campylobacter coli)，紅嘴區(qū)鳥彎曲桿菌(Campylobacter lari)，流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)、幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)、腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoea)、乳酸胺奈瑟菌(Neisseria lactamica)、志賀菌屬(Shigella spp.)、葡萄球菌屬(Staphylococcus spp)、艱難梭狀芽胞桿菌(Clostridium difficile)、肉毒桿菌(Clostridium botulinum)，炭疽桿菌(Bacillus anthracis)，類鼻疽伯克霍爾德氏菌(Burkholderia pseudomallei)、鼻疽伯克霍爾德氏菌(Burkholderia mallei)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus spp.)，破傷風(fēng)桿菌(Clostridium tetani)，白喉棒狀桿菌(Corynebacterium diptheriae)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、大腸桿菌(Escherichia coli)、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)，病毒衍生的抗原，例如人乳頭瘤病毒(HPV)、甲型肝炎、乙型肝炎、輪狀病毒以及流感病毒、得自寄生蟲如惡性癥原蟲(Plasmodium faciparum)的抗原。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的細(xì)菌性病原體選自表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、金黃色葡萄球菌(S. aureus)、人葡萄球菌(S.hominis)、溶血性葡萄球菌(S. haemolyticus)、沃氏葡萄球菌(S. warneri)、頭狀葡萄球菌(S. capitis)、解糖葡萄球菌(S. saccharoIyticus)、耳葡萄球菌(S. auricularis)、模仿葡萄球菌(S. simulans)、腐生性葡萄球菌(S. saprophyticus)、科氏葡萄球菌(S. cohnii)、木糖葡萄球菌(S. xylosus)、科氏葡萄球菌(S. cohnii)、沃氏葡萄球菌(S. warneri)、豬葡萄球菌(S. hyicus)、山羊葡萄球菌(S. caprae)、雞葡萄球菌(S. gallinarum)、中間葡萄球菌(S. intermedius)、人葡萄球菌(S.hominis)。根據(jù)本發(fā)明的寡糖基轉(zhuǎn)移酶多肽用于結(jié)合來自以下的多糖A)來自以下的莢膜(K)抗原肺炎鏈球菌、豬鏈球菌、海豚鏈球菌、無乳鏈球菌、米勒鏈球菌組(SMG)、牛鏈球菌、肺炎克雷伯菌、產(chǎn)酸克雷伯菌、植生克雷伯菌(Klebsiellaplanticola)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aerunginosa)、鮑氏不動桿菌(Acinetobcaterbaumanii)、醋酸鈣不動桿菌、傷寒沙門菌、類鼻疽伯克霍爾德氏菌、鼻疽伯克霍爾德氏菌、新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)、空腸彎曲桿菌、胸膜肺炎放線桿菌、絲狀支原體絲狀亞種 SC 型(Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC)、格氏乳球菌(Lactococcusgarvieae)；B)來自以下的0-抗原肺炎克雷伯菌、產(chǎn)酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)、植生克雷伯菌、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aerungmosa)、鮑氏不動桿菌(Acinitobcaterbaumanii)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella enterica serovar Typhimurium)、傷寒沙門菌(Salmonella enterica serovar Typhi)、假結(jié)核耶爾森菌(Yersiniapseudotuberculosis)、布魯氏菌屬(Brucella spp.)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、胸膜肺炎放線桿菌、粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)；
C)來自銅綠假單胞菌、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)的胞外多
糖/表面多糖。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的重組抗原性多肽包含氨基酸序列或其抗原性部分或者變體氨基酸序列，或者由該氨基酸序列或其抗原性部分或者變體氨基酸序列組成，所述的氨基酸序列選自圖4a_4e中表示的序列，其中所述的變體是圖4a_4e中表示的至少一個氨基酸殘基的缺失、取代或添加。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述重組抗原性多肽包含氨基酸序列或其抗原性部分或者變體氨基酸序列，或者由該氨基酸序列或其抗原性部分或者變體氨基酸序列組成，所述的氨基酸序列選自圖5a中表示的序列，其中所述的變體是圖5中表示的至少一個氨基酸殘基的缺失、取代或添加。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述重組抗原性多肽包含氨基酸序列或其抗原性部分或者變體氨基酸序列，或者由該氨基酸序列或其抗原性部分或者變體氨基酸序列組成，所述的氨基酸序列選自圖6a_6g中表示的序列，其中所述的變體是圖6a_6g中表示的至少一個氨基酸殘基的缺失、取代或添加。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述重組抗原性多肽包含氨基酸序列或其抗原性部分或者變體氨基酸序列，或者由該氨基酸序列或其抗原性部分或者變體氨基酸序列組成，所述的氨基酸序列選自圖7a-7m中表示的序列，其中所述的變體是圖7a_7m中表示的至少一個氨基酸殘基的缺失、取代或添加。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述重組抗原性多肽包含氨基酸序列或其抗原性部分或者變體氨基酸序列，或者由該氨基酸序列或其抗原性部分或者變體氨基酸序列組成，所述的氨基酸序列選自圖8a_8i中表示的序列，其中所述的變體是圖8a_8i中表示的至少一個氨基酸殘基的缺失、取代或添加。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述重組抗原性多肽包含氨基酸序列或其抗原性部分或者變體氨基酸序列，或者由該氨基酸序列或其抗原性部分或者變體氨基酸序列組成，所述的氨基酸序列選自圖9a或9b中表示的序列，其中所述的變體是圖9a或9b中表示的至少一個氨基酸殘基的缺失、取代或添加。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述重組抗原性多肽包含氨基酸序列或其抗原性部分或者變體氨基酸序列，或者由該氨基酸序列或其抗原性部分或者變體氨基酸序列組成，所述的氨基酸序列選自圖IOa或IOb中表示的序列，其中所述的變體是圖IOa或IOb中表示的至少一個氨基酸殘基的缺失、取代或添加。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述重組抗原性多肽包含氨基酸序列或其抗原性部分或者變體氨基酸序列，或者由該氨基酸序列或其抗原性部分或者變體氨基酸序列組成，所述的氨基酸序列選自圖Ila-Ilk中表示的序列，其中所述的變體是圖Ila-Ilk中表示的至少一個氨基酸殘基的缺失、取代或添加。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述重組抗原性多肽包含氨基酸序列或其抗原性部分或者變體氨基酸序列，或者由該氨基酸序列或其抗原性部分或者變體氨基酸序列組成，所述的氨基酸序列選自

圖12中表示的序列，其中所述的變體是圖12中表示的至少一個氨基酸殘基的缺失、取代或添加。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述重組抗原性多肽包含氨基酸序列或其抗原性部分或者變體氨基酸序列，或者由該氨基酸序列或其抗原性部分或者變體氨基酸序列組成，所述的氨基酸序列選自圖13a_13i中表示的序列，其中所述的變體是圖13a_13i中表示的至少一個氨基酸殘基的缺失、取代或添加。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述重組抗原性多肽包含圖14中表示的氨基酸序 列或其抗原性部分或者變體氨基酸序列，或者由該氨基酸序列或其抗原性部分或者變體氨基酸序列組成，，在變體氨基酸序列中所述的變體是圖14中表示的至少一個氨基酸殘基的缺失、取代或添加。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述重組抗原性多肽包含氨基酸序列或其抗原性部分或者變體氨基酸序列，或者由該氨基酸序列或其抗原性部分或者變體氨基酸序列組成，所述的氨基酸序列選自圖15a_15f中表示的序列，其中所述的變體是圖15a_15f中表示的至少一個氨基酸殘基的缺失、取代或添加。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述重組抗原性多肽包含氨基酸序列或其抗原性部分或者變體氨基酸序列，或者由該氨基酸序列或其抗原性部分或者變體氨基酸序列組成，所述的氨基酸序列選自圖16a_16f中表示的序列，其中所述的變體是圖16a_16f中表示的至少一個氨基酸殘基的缺失、取代或添加。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述重組抗原性多肽包含氨基酸序列或其抗原性部分或者變體氨基酸序列，或者由該氨基酸序列或其抗原性部分或者變體氨基酸序列組成，所述的氨基酸序列選自圖17中表示的序列，其中所述的變體是圖17中表示的至少一個氨基酸殘基的缺失、取代或添加。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述重組抗原性多肽包含圖18中表示的氨基酸序列或其抗原性部分或者變體氨基酸序列，或者由該氨基酸序列或其抗原性部分或者變體氨基酸序列組成，在變體氨基酸序列中所述的變體是圖18中表示的至少一個氨基酸殘基的缺失、取代或添加。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述重組抗原性多肽包含圖19中表示的氨基酸序列或其抗原性部分或者變體氨基酸序列，或者由該氨基酸序列或其抗原性部分或者變體氨基酸序列組成，在變體氨基酸序列中所述的變體是圖19中表示的至少一個氨基酸殘基的缺失、取代或添加。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述重組抗原性多肽包含氨基酸序列或其抗原性部分或者變體氨基酸序列，或者由該氨基酸序列或其抗原性部分或者變體氨基酸序列組成，所述的氨基酸序列選自圖20a-20c中表示的序列，其中所述的變體是圖20a-20c中表示的至少一個氨基酸殘基的缺失、取代或添加。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述重組抗原性多肽包含氨基酸序列或其抗原性部分或者變體氨基酸序列，或者由該氨基酸序列或其抗原性部分或者變體氨基酸序列組成，所述的氨基酸序列選自圖21a或21b中表示的序列，其中所述的變體是圖21a或21b中表示的至少一個氨基酸殘基的缺失、取代或添加。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述重組抗原性多肽包含氨基酸序列或其抗原性部分或者變體氨基酸序列，或者由該氨基酸序列或其抗原性部分或者變體氨基酸序列組成，所述的氨基酸序列選自圖22a-22f中表示的序列，其中所述的變體是圖22a-22f中表示的至少一個氨基酸殘基的缺失、取代或添加。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述重組抗原性多肽包含氨基酸序列或其抗原性部分或者變體氨基酸序列，或者由該氨基酸序列或其抗原性部分或者變體氨基酸序列組成，所述的氨基酸序列選自圖23a-23f中表示的序列，其中所述的變體是圖23a-23f中表示的 至少一個氨基酸殘基的缺失、取代或添加。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述重組抗原性多肽包含氨基酸序列或其抗原性部分或者變體氨基酸序列，或者由該氨基酸序列或其抗原性部分或者變體氨基酸序列組成，所述的氨基酸序列選自圖24a-24d中表示的序列，其中所述的變體是圖24a-24d中表示的至少一個氨基酸殘基的缺失、取代或添加。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述重組抗原性多肽包含圖25中表示的氨基酸序列或其抗原性部分或者變體氨基酸序列，或者由該氨基酸序列或其抗原性部分或者變體氨基酸序列組成，在變體氨基酸序列中所述的變體是圖25中表示的至少一個氨基酸殘基的缺失、取代或添加。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述的微生物細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的糖綴合疫苗可以通過兩種方法制備i.在表達(dá)所要綴合的多糖的宿主有機(jī)體中表達(dá)該寡糖基轉(zhuǎn)移酶多肽及經(jīng)修飾的糖蛋白受體。這可能需要使用經(jīng)遺傳修飾的宿主，例如0-抗原連接酶突變體。ii在大腸桿菌宿主中表達(dá)所述的寡糖基轉(zhuǎn)移酶多肽，所述的經(jīng)修飾的糖蛋白以及經(jīng)克隆的多糖生物合成基因座。所述的微生物細(xì)胞優(yōu)選地為埃希氏菌屬(Escherichi),例如大腸桿菌；可選地所述的細(xì)菌細(xì)胞是沙門氏桿菌屬(Salmonella spp.)。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了疫苗組合物，所述的組合物包含根據(jù)本發(fā)明的細(xì)菌糖綴合抗原多肽或者其部分。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的組合物包含載體和/或任選地包含佐劑。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的佐劑選自細(xì)胞因子，所述的細(xì)胞因子選自GMCSF、干擾素Y、干擾素a、干擾素P、白細(xì)胞介素12、白細(xì)胞介素18、白細(xì)胞介素23、白細(xì)胞介素17、白細(xì)胞介素2、白細(xì)胞介素l、TGF、TNFa和TNF 3。 在本發(fā)明的進(jìn)一步的替代實(shí)施方案中，所述的佐劑是TLR激動劑如CpG寡核苷酸、鞭毛蛋白、單磷酰基脂質(zhì)A、聚I :C及其衍生物。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的佐劑是細(xì)菌細(xì)胞壁衍生物，如胞壁酰二肽(MDP)和 / 或海藻糖棒狀二霉菌酸酯(trehelose dycorynemycolate) (TDM)。
佐劑是通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活性提高對抗原做出特異性免疫應(yīng)答的物質(zhì)或者步驟。佐劑的實(shí)例包括，僅是示例性的，共刺激分子的激動劑抗體、Freunds佐劑、胞壁酰二肽和脂質(zhì)體。因此佐劑是免疫調(diào)節(jié)劑。載體是免疫原性的分子，其當(dāng)連接于第二個分子時提高對后者的免疫應(yīng)答。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述的組合物包含如以下所描述的兩種或三種不同的糖綴合抗原性多肽的混合物。根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步的方面，提供了含有根據(jù)本發(fā)明的微生物細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物。根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步的方面，提供了含有根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)物的發(fā)酵罐。根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步的方面，提供了根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞在生產(chǎn)糖綴合多肽中的用途。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了生產(chǎn)重組糖綴合多肽的方法，所述的方法包括i)提供根據(jù)本發(fā)明的微生物培養(yǎng)物；ii)培養(yǎng)所述的微生物培養(yǎng)物；并且iii)將所述的糖綴合多肽從所述的微生物細(xì)胞或者所述的細(xì)胞培養(yǎng)基中分離。用于本發(fā)明的方法中的微生物細(xì)胞以有經(jīng)驗(yàn)的工作人員熟悉的方式進(jìn)行生長或者培養(yǎng)，所述的方式取決于宿主有機(jī)體。作為規(guī)則，將微生物細(xì)胞在含有碳源、氮源、微量元素以及如果適當(dāng)?shù)脑捑S生素的液體培養(yǎng)基中，在0°c至100°C的溫度優(yōu)選地在10°C至60°C的溫度下，充氧氣下進(jìn)行生長，所述的碳源一般地為糖的形式，所述的氮源一般地為有機(jī)氮源如酵母提取物或者鹽如硫酸銨的形式，所述的微量元素如鐵、錳和鎂的鹽。液體培養(yǎng)基的pH可以保持恒定或者不保持恒定，所謂的保持恒定即在培養(yǎng)期間進(jìn)行調(diào)節(jié)。培養(yǎng)物可以分批、半分批或者連續(xù)地進(jìn)行生長?？梢詫I養(yǎng)物在發(fā)酵的開始提供，或者半連續(xù)地或者連續(xù)地進(jìn)行提供。所生成的產(chǎn)物可以按照以上所描述的本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的方法進(jìn)行分離。為此，有機(jī)體有利地可以預(yù)先破裂。在此過程中，PH值有利地保持于PH4和12之間，優(yōu)選地在pH6和9之間，尤其優(yōu)選地在pH7和8之間。要使用的培養(yǎng)基必須適當(dāng)?shù)貪M足所考慮的菌株的要求。對于不同的微生物的培養(yǎng)基的描述可以在教科書"Manual of Methods for General Bacteriology" of theAmerican Society for Bacteriology (Washington D. C. , USA, 1981)中得到。如前文所描述的，可以按照本發(fā)明采用的這些培養(yǎng)基一般地含有一種或更多種的碳源、氮源、無機(jī)鹽、維生素和/或微量元素。優(yōu)選的碳源是糖，例如單糖、二糖或者多糖。碳源的實(shí)例為葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或者纖維素。還可以將糖以絡(luò)合物(complex compounds)的形式添加到培養(yǎng)基中,所述的絡(luò)合物如糖蜜或者其他制糖中的副產(chǎn)物。多種碳源的混合物的添加也可以是有利的。其他可能的碳源是油和脂肪，例如大豆油、葵花籽油、花生油和/或椰子油，脂肪酸例如棕櫚酸、硬脂酸和/或亞油酸，醇和/或多元醇例如甘油、甲醇和/或乙醇，以及有機(jī)酸例如乙酸和/或乳酸。氮源一般地是有機(jī)的或者無機(jī)的氮化合物或者含有這些化合物的材料。氮源的實(shí)例包括液態(tài)或者氣態(tài)的氨或者銨鹽如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨或者硝酸銨、硝酸鹽、尿素、氨基酸或者復(fù)合氨源如玉米漿、大豆柏、大豆蛋白、酵母提取物、肉提取物以及其他。所述的氮源可以單獨(dú)地或者以混合物使用?？梢源嬖谟谂囵B(yǎng)基中的無機(jī)鹽化合物包含鈣、鎂、鈉、鈷、鑰、鉀、錳、鋅、銅和鐵的氯鹽、磷酸鹽和硫酸鹽。無機(jī)的含硫化合物可以用作硫源來生產(chǎn)含硫的精細(xì)化學(xué)品尤其是甲硫氨酸，所述的含硫化合物例如硫酸鹽、亞硫酸鹽、連二亞硫酸鹽、連四硫酸鹽、硫代硫酸鹽、硫化物或者其他的有機(jī)硫化合物如硫醇(mercaptan)和硫醇(thiol)。磷酸、磷酸二氫鉀或者磷酸氫二鉀或者對應(yīng)的含鈉的鹽可以用作磷的來源。為了保持溶液中的金屬例子，可以向培養(yǎng)基中添加螯合劑。特別適合的螯合劑包括苯二酚例如鄰苯二酚或原兒酚和有機(jī)酸例如檸檬酸。根據(jù)本發(fā)明的用于培養(yǎng)微生物細(xì)胞的發(fā)酵培養(yǎng)基通常還包含其他的生長因子如維生素或者生長促進(jìn)劑，所述維生素或生長促進(jìn)劑包括例如生物素、核黃素、硫胺素、葉酸、 煙酸、泛酸鹽和吡哆醇。生長因子和鹽通常得自復(fù)合培養(yǎng)基的組分如酵母提取物、糖蜜、玉米漿等等。此外更可能地，向該培養(yǎng)基中加入適合的前體。培養(yǎng)基化合物的精確組分很大程度上取決于具體實(shí)驗(yàn)，并且是但由每個具體案例單獨(dú)地所決定的。優(yōu)化培養(yǎng)基的信息可見于教科書"Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach" (EditorsP. M. Rhodes, P. F. Stanbury, IRL Press (1997) pp. 53-73, ISBN 0 199635773)。生長培養(yǎng)基還可以得自商業(yè)上的供貨商，例如Standard I (Merck)或者BHI (腦心臟浸液,DIFC0)等等。培養(yǎng)物的溫度正常地在15°C至45°C，優(yōu)選地在在25°C至40°C，并且可以在實(shí)驗(yàn)期間保持恒定或者加以改變。培養(yǎng)基的PH應(yīng)在5到8. 5的范圍內(nèi)，優(yōu)選地在7. 0附近。培養(yǎng)的pH可以在培養(yǎng)過程中通過加入堿性化合物或者酸性化合物來控制，所述的堿性化合物如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨和氨水，所述的酸性化合物如磷酸或者硫酸?？梢酝ㄟ^采用消泡劑來控制起泡，所述的消泡劑如脂肪酸聚乙二醇酯。為了保持質(zhì)體的穩(wěn)定性，可以向培養(yǎng)基中添加適用的具有選擇性效果的物質(zhì)，例如抗生素。通過向培養(yǎng)物中導(dǎo)入氧氣或者含有氧氣的氣體混合物來保持需氧條件，所述的氣體混合物如環(huán)境空氣。繼續(xù)培養(yǎng)，直到希望的產(chǎn)物的形成達(dá)到最大。該目標(biāo)正常地在10到160個小時內(nèi)達(dá)到。根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步的方面，提供了針對細(xì)菌感染接種受試者的方法，所述的方法包括使用根據(jù)本發(fā)明的有效量的疫苗免疫所述的受試者。在本說明書(specification)的說明書(description)以及權(quán)利要求書中，詞語“包含(comprise)”和“含有”以及該詞語的變化例如“包含(comprising) ”和“包含(comprises)”意為“包括但不限于”，并且不希望(并且也不)排除其他的部分、添加物、組件、整體或者步驟。在本說明書(specification)的說明書(description)和權(quán)利要求書中，除非上下文另外要求，單數(shù)包括了復(fù)數(shù)。具體地，在使用不定冠詞處，除非上下文另外要求，說明書理解為預(yù)期的復(fù)數(shù)以及單數(shù)。除非與其不相容，結(jié)合本發(fā)明的具體的方面、實(shí)施方案或者實(shí)例描述的特征、整體、特性、化合物、化學(xué)部分或者基團(tuán)理解為可以應(yīng)用到在此描述的任意其他方面、實(shí)施方案或者實(shí)例。本發(fā)明的實(shí)施方案在此僅通過實(shí)例并參考以下的附圖進(jìn)行描述圖Ia是Nitratiruptor tergasus PglB的直系同源基因的核苷酸序列；圖Ib是Nitratiruptor tergasus pglB的直系同源基因的氨基酸序列；圖2A) CJOlH-His 的檢測。與 i)pMAF10[空腸彎曲桿菌 PglB (Cj PglB)]和 ii)pMLNT2 [N. tergacus PglB(Nt PglB)]在鼠傷寒沙門氏菌(S. Typhimurium)中共表達(dá)的重組CJ0114-His，其使用抗-His抗體進(jìn)行檢測。框指示了像0-抗原的梯形帶。B)鼠傷寒沙門氏菌0-抗原的結(jié)構(gòu)。還原末端的半乳糖不允許被Cj PglB轉(zhuǎn)移到蛋白；和圖3經(jīng)純化的CJ0114_His的蛋白酶K處理。來自鼠傷寒沙門氏菌的經(jīng)純化的CJ0114-His(i)，共表達(dá)Nt PglB的鼠傷寒沙門氏菌(ii)以及共表達(dá)Cj PglB的鼠傷寒沙門氏菌(iii), A) 2. 5 u g CJ0114_His，B) 2. 5 y gCJ0114_His，在 37°C 下溫育 16 小時后。C) 2. 5 u g CJ0114-His，在使用蛋白酶K在37°C下孵育16小時后。使用抗-His抗體檢測CJ0114-His。在蛋白酶K處理之后，針對His抗體的反應(yīng)性的缺失表明所識別的梯樣帶具有蛋白質(zhì)來源；圖4a是肺炎鏈球菌(Steptococcus pneumoniae)溶血素的氨基酸序列；圖4b是 無毒變體肺炎球菌溶血素(pnuemolysin)的氨基酸序列；圖4c是肺炎鏈球菌PspA的氨基酸序列；圖4d是肺炎鏈球菌未知抗原的氨基酸序列；并且圖4e是肺炎鏈球菌ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，底物結(jié)合蛋白的氨基酸序列；圖5是白喉棒狀桿菌毒素CRM197的氨基酸序列；圖6a是豬鏈球菌抗原的氨基酸序列；圖6b是豬鏈球菌表面抗原SPl抗原的氨基酸序列；圖6c是豬鏈球菌Rfe A抗原的氨基酸序列；圖6d是豬鏈球菌未知抗原的氨基酸序列；圖66是豬鏈球菌脫氫酶抗原的氨基酸序列；圖6€是豬鏈球菌溶血素的氨基酸序列；并且圖6g是豬鏈球菌磷酸甘油酸變位酶(phosphoglycerate mutase)的氨基酸序列；圖7a是無乳鏈球菌(Steptococcus agalactiae) C5a肽酶的氨基酸序列；圖7b是無乳鏈球菌免疫球蛋白A結(jié)合P抗原的氨基酸序列；圖7c是無乳鏈球菌金屬結(jié)合蛋白AcdA的氨基酸序列；圖7d是無乳鏈球菌LysM抗原的氨基酸序列；圖7e是無乳鏈球菌LPXTG抗原的氨基酸序列；圖7f是無乳鏈球菌細(xì)胞壁表面錨定家族蛋白的氨基酸序列；圖7g是無乳鏈球菌細(xì)胞壁表面錨定家族蛋白的氨基酸序列；圖7h是無乳鏈球菌細(xì)胞壁表面錨定家族蛋白的氨基酸序列；圖71是無乳鏈球菌細(xì)胞Bib A抗原的氨基酸序列；圖7」是無乳鏈球菌C蛋白免疫球蛋白A結(jié)合的P抗原的氨基酸序列；圖7k是無乳鏈球菌表面蛋白Rib抗原的氨基酸序列；圖71是無乳鏈球菌a樣蛋白3的氨基酸序列；并且圖7m是無乳鏈球菌a樣蛋白2的氨基酸序列；圖8a是肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae) Fim A抗原的氨基酸序列；|l|8b是肺炎克雷伯菌推定的菌毛主要亞基的氨基酸序列；圖8c是肺炎克雷伯菌MrkA抗原的氨基酸序列；圖8d是肺炎克雷伯菌OmpA的氨基酸序列；圖8e是肺炎克雷伯菌MrkD的氨基酸序列；圖8f是肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae) FepA的氨基酸序列；圖8g是肺炎克雷伯菌0mpK36的氨基酸序列；圖8h是肺炎克雷伯菌0mpK17的氨基酸序列；并且圖8i是肺炎克雷伯菌OmpW的氨基酸序列；圖9a是海豚鏈球菌(Steptococcus iniae) Sim A抗原的氨基酸序列；圖9b是海豚鏈球菌ScpI抗原的氨基酸序列；圖IOa是HPV外殼蛋白LI的氨基酸序列；圖IOb是HPV主要衣殼蛋白LI的氨基酸序列；
圖I Ia是銅綠假單胞菌(Pseudomoas aeruinosa) OmpA的氨基酸序列；圖I Ib是銅綠假單胞菌OprF的氨基酸序列；圖Ilc是銅綠假單胞菌Opr I的氨基酸序列；圖Ild是銅綠假單胞菌Fli C的氨基酸序列；圖lie是銅綠假單胞菌KatE的氨基酸序列；圖Ilf是銅綠假單胞菌Kat A的氨基酸序列；圖Ilg是銅綠假單胞菌酰胺酶的氨基酸序列；圖Ilh是銅綠假單胞菌0pr86的氨基酸序列；圖Ili是銅綠假單胞菌LcrV的氨基酸序列；圖Ilj是銅綠假單胞菌ToxA的氨基酸序列；以及圖Ilk是銅綠假單胞菌外毒素的氨基酸序列；圖12a是鮑氏不動桿菌(Actinebacter baumanni) FhuE的氨基酸序列；圖13a是腸道沙門氏菌(Salmonella enterica)OmpD的氨基酸序列；圖13b是腸道沙門氏菌SopB的氨基酸序列；圖13c是腸道沙門氏菌GroEL的氨基酸序列；圖13d是腸道沙門氏菌PagC的氨基酸序列；圖13e是腸道沙門氏菌菌毛亞基的氨基酸序列；圖13f是腸道沙門氏菌DnaJ的氨基酸序列；圖13g是腸道沙門氏菌OmpC的氨基酸序列；圖13h是腸 道沙門氏菌OmpF的氨基酸序列；圖131是腸道沙門氏菌外膜蛋白的氨基酸序列；圖14是炭疽桿菌(Bacillus anthracis)保護(hù)性抗原(PagA)的氨基酸序列；圖15a是空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni) Ped I的氨基酸序列；圖15b是空腸彎曲桿菌Ped 2的氨基酸序列；圖15c是空腸彎曲桿菌Peb 3的氨基酸序列；圖15d是空腸彎曲桿菌Cj0114的氨基酸序列；圖15e是空腸彎曲桿菌Cja A的氨基酸序列；以及圖15f是空腸彎曲桿菌FlaA的氨基酸序列；圖16a是流感嗜血桿菌蛋白質(zhì)D的氨基酸序列；圖16b是流感嗜血桿菌Hap的氨基酸序列；圖16c是流感嗜血桿菌PilA的氨基酸序列；圖16d是流感嗜血桿菌Omp P5的氨基酸序列；圖16e是流感嗜血桿菌Hia的氨基酸序列；并且圖16f是流感嗜血桿菌HMWl的氨基酸序列；圖17是百日咳博德特氏菌百日咳桿菌粘附素的氨基酸序列；圖18是大腸桿菌抗原43的氨基酸序列；圖19是幽門螺桿菌UreB的氨基酸序列；圖20a是腦膜炎雙球菌NadA的氨基酸序列；圖20b是腦膜炎雙球菌GNA1870的氨基酸序列；圖20c是腦膜炎雙球菌Fet A的氨基酸序列；圖21a是惡性痕原蟲(Plasmodium falciparum)裂殖子表面蛋白4MSP4的氨基酸序列；圖20b是惡性瘧原蟲裂殖子表面蛋白5，MSP5的氨基酸序列；圖22a是金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) ClfA的氨基酸序列；圖22b是金黃色葡萄球菌烯醇酶的氨基酸序列；圖22c是金黃色葡萄球菌3-氧代?；€原酶的氨基酸序列；圖22d是金黃色葡萄球菌假定的蛋白SAS2241的氨基酸序列；圖22e是金黃色葡萄球菌IsdB的氨基酸序列；圖22f是金黃色葡萄球菌外毒素的氨基酸序列；圖23a是艱難梭狀芽胞桿菌(Clostridium difficile) SLP的氨基酸序列；圖23b是艱難梭狀芽胞桿菌FliC的氨基酸序列；圖23c是艱難梭狀芽胞桿菌FliD的氨基酸序列；圖23d是艱難梭狀芽胞桿菌Cwp84的氨基酸序列；圖23e是艱難梭狀芽胞桿菌Cwp66的氨基酸序列；圖23f是艱難梭狀芽胞桿菌毒素A的氨基酸序列；圖24a是結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis) Cfp-IO的氨基酸序列；圖24b是結(jié)核分枝桿菌Ag85A的氨基酸序列；圖24c是結(jié)核分枝桿菌Ag85B的氨基酸序列；圖24d是結(jié)核分枝桿菌ESAT-6的氨基酸序列；
圖25是重組肉毒桿菌(Recombinant botulinum)毒素F的He功能域[合成的構(gòu)建物]的氨基酸序列；圖26圖示經(jīng)純化的CJ0114_His的蛋白酶K處理。i) 2. 5 ii g蛋白質(zhì)ii) 2. 5 ii g蛋白質(zhì)，在37°C下溫育16h C后，iii)2. 5iig蛋白質(zhì)，在與蛋白酶K在37°C下溫育16h后；圖27催化基序的識別。使用五-His和抗04-抗體在Western印跡分析中檢測純化自鼠傷寒沙門氏菌313749的(^0114-把81^)財(cái)PglB的突變發(fā)生i)單獨(dú)的CJ0114_His，ii)與 Cj PglB 表達(dá)的 CJ0114-His，ii i)與 Nt PglB 表達(dá)的 CJ0114_His，iv)與 Nt PglB職YG表達(dá)的 CJ0114-His ；B)CJ0114_His 的突變發(fā)生。v) CJ0114_HisN國，vi) CJ0114-HisN155Q，vii)CJO114-HisN173Q, viii)CJ0114-HisN179Q ;以及圖28A) Western免疫印跡分析,用于檢測09 0_抗原到具有抗-His抗體和抗_09的CJ0114-His的轉(zhuǎn)移。CJ0114-His是在大腸桿菌E69中表達(dá)的(第i道和第iii道)以及在與Cj PglB(第ii道)或者Nt PglB(第iv道)相同的菌株中表達(dá)?；蛘咴诠烟腔D(zhuǎn)移酶的存在下，通過蛋白質(zhì)特異性抗體(抗-His)和09特異性抗體兩者來檢測09。B)大腸桿菌09的結(jié)構(gòu)。材料和方法細(xì)菌菌株，質(zhì)粒和基因組DNA大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella enterica sv. Typhimurium)菌株在LB中，于37°C下生長。在適當(dāng)時將50iig/ml甲氧芐氨嘧啶和/或100 y g/ml氨芐青霉素加入培養(yǎng)基。將大腸桿菌DH5 a (Invitrogen) and XL-1 (Stratagene)用作克隆實(shí)驗(yàn)的宿主。鼠傷寒沙門氏菌(S. Typhimurium)菌株 SL3749 得自 Salmonella Genetic StockCentre (SGSC)。Nitratiruptor tergacus SB 155-2 的基因組 DNA 由 Japan Agency forMarine-Earth Science and Technology (JAMSTEC)的 Satoshi Nakagawa 提供。將質(zhì)粒pMLBAD (I)和 pETBlue-1 (Novagen)用作克隆載體。質(zhì)粒的構(gòu)建N. tergacus pglB 直系同源基因使用引物 Nit pglB-F (5-AGGAATTCAGATGTATGTGCAAAAAAAG-3, EcoRI 位點(diǎn)加下劃線顯示)和 NitpglB-HA-R(ACAAACTAGT TTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTA
TTTGATTCTATAAATTTTCA-3，SpeI位點(diǎn)加下劃線顯示，HA-編碼的序列加粗顯示)使用Pfx聚合酶(Invitrogen)，由基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增。將所得到的擴(kuò)增子使用EcoRI和SpeI進(jìn)行切害I]，并且連接到EcoRI/Xbal-切割的pMLBAD，產(chǎn)生pMLNT2。空腸彎曲桿菌CjOl 14是從空腸彎曲桿菌(C. jejuni) 11168H基因組DNA中使用Pfx聚合酶擴(kuò)增出來的，其使用引物CjOll4-F(5-ATGAAAAAAATATTCACAGTAGCTC-3)和 Cj0114-R(5_TTA GTGATGGTGATGGTGATGTTTTCTATTAGGTGAAGCTTTTG-3, 6xH-編碼的序列加粗顯示)，并隨后在EcoRV-切割的PETBlue-I中進(jìn)行平末端克隆。所有的載體通過限制性分析和測序進(jìn)行確認(rèn)。蛋白質(zhì)表達(dá)為了檢查PglBNT-HA的表達(dá)，將使用pMLNT2轉(zhuǎn)化的大腸桿菌生長到對數(shù)中期，并且使用0.1%的阿拉伯糖誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)4小時。將完整的細(xì)胞懸浮到Ix SDS-PAGE上樣緩沖液中并加熱到60°C持續(xù)20分鐘。將細(xì)胞裂解液在10% Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝膠(Invitrogen)上進(jìn)行分離,轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素上,并且使用抗-HA-HRP抗體(Roche)進(jìn)行檢測。對于Cj0114-His蛋白質(zhì)的表達(dá)而言，在大腸桿菌中轉(zhuǎn)化pET[CJ0114]，其生長到對數(shù)中期，并且使用ImM IPTG誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)4小時。使用五組氨酸Ab (QIAgen)在全細(xì)胞裂解液中檢測CJOl 14。在鼠傷寒沙門氏菌(S. Typhimurium)中表達(dá)和純化蛋白質(zhì)將鼠傷寒沙門氏菌SL3749使用pMLNT2和pET[CJ0114]進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并且將200ml生長到對數(shù)中期(A6tltl 0. 5)。在200ml的培養(yǎng)物中在37°C下使用0. I %阿拉伯糖和ImM IPTG誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的表達(dá)16小時。離心后，將細(xì)菌團(tuán)(bacterial pellet)使用IxBugBuster (Novagen)在裂解緩沖液(50mMNaH2P04，300mM NaCl，IOmM 咪唑)中進(jìn)行裂解，所述的裂解緩沖液補(bǔ)加lmg/ml溶菌酶(Sigma)、1 U 1/ml Benzonase核酶(Novagen)和0. I %Tween-20。隨后將清亮的裂解液與Iml Ni-NTA瓊脂糖漿液(QIAgen)在攪拌下于4°C溫育，并且隨后加載到空的5ml聚丙烯柱上(Pierce)。將其用I柱體積的洗滌緩沖液(50mMNaH2PO4, 300mM NaCl，20mM咪唑，補(bǔ)加0. 1% Tween 20)洗滌5次，并且隨后用500 U I的洗脫緩沖液(50mM NaH2PO4, 300mM NaCl，20mM咪唑，補(bǔ)加0. 1% Tween 20)洗脫4次。在通過 Western印跡分析純化確認(rèn)后，收集洗脫液并且將蛋白質(zhì)使用Amicon Ultra_4CentrifugalFilter Unit使用Ultracel-10膜(Millipore)濃縮 10倍。將蛋白質(zhì)通過BCA檢測(Pierce)進(jìn)行定量。蛋白酶K處理將2.5iig CJ0114-His 與 200ii g 蛋白酶 K 及 5mM CaCl 在 37°C下溫育 16 小時。對照反應(yīng)中使用水來替代蛋白酶K進(jìn)行溫育。CJOl 14-His 的 Western 免疫印跡檢測將CJ0114-His樣品溶解于12% Tris-甘氨酸凝膠(Invitrogen)中并且轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。將膜在His封閉試劑(QIAgen)中于室溫下封閉I小時并且隨后使用抗-His-HRPd 5000在封閉試劑中，QIAgen)于室溫下檢測I小時。將所述的膜隨后使用PBS-T/T (磷酸鹽緩沖鹽水，補(bǔ)加了 0. 05% Tween和0. 5% Triton)洗滌兩次并且使用PBS洗漆一次，隨后使用Amersham ECL Plus (GE Healthcare)檢測His標(biāo)簽的蛋白質(zhì)。(I)Lefebro 和 Valvano(2002)Construction and Evaluation of PlasmidVectors Optimized for Constitutive and Regulated Gene Expression inBurkholderia cepacia Complex Isolates, APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY68(12),5956-5964。列出的全部多糖均可以潛在地綴合到CRM197上(用于當(dāng)前批準(zhǔn)的肺炎鏈球菌(S. pnemoniae)綴合物疫苗以及其他的糖綴合物的載體蛋白)。這是Diptheria毒素的無毒形式，并且具有天然存在的糖基化基序(442-DVNKS-446 ;參見圖5，突出顯示的基序)。為各個多糖提供了細(xì)菌特異性抗原的細(xì)節(jié)。這些可以潛在地為給定的有機(jī)體提供增強(qiáng)的免疫力(換言之，兩全其美的是蛋白質(zhì)和多糖為長期完全覆蓋誘導(dǎo)免疫力)。還可以將來自一種有機(jī)體的多糖與來自不同的有機(jī)體的免疫原性蛋白組合，從而產(chǎn)生二聯(lián)疫苗(或者如果將此在經(jīng)合理減毒的疫苗遞送菌株如沙門氏菌上進(jìn)行的話，產(chǎn)生三聯(lián)疫苗)。(三聯(lián)疫苗的實(shí)例為旅行者腹瀉的疫苗，其由在沙門氏菌或者EPEC減毒的載體菌株中偶聯(lián)到霍亂毒素的宋內(nèi)志賀菌(Shigella sonnei) 0抗原構(gòu)成)。
在大腸桿菌中表達(dá)異源多糖的策略I.如果多糖生物合成的基因座的序列數(shù)據(jù)是可得的，使用長鏈高保真度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)來從基因組DNA中擴(kuò)增該片段。將得到的擴(kuò)增子使用常規(guī)克隆技術(shù)克隆到低拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體中，所述的質(zhì)粒載體如PACYC184或者pBR322。在大腸桿菌(或替代細(xì)菌宿主)中表達(dá)多糖的成功通過使用對感興趣的多糖特異性的抗體(如果可用的話)Western印跡分析來證實(shí)。2.對于其基因座未經(jīng)確證的多糖的表達(dá)，或者對于PCR擴(kuò)增不合適的情況，從基因組DNA中產(chǎn)生黏粒文庫，并且篩選以鑒定包含多糖生物合成所需的遺傳學(xué)信息的克隆?？寺《嗵鞘荏w蛋白多肽受體底物可以通過PCR，使用高保真聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增并且在表達(dá)載體即PETBlue中克隆。在ORF的3’末端摻入6X組氨酸的標(biāo)簽，從而便于蛋白質(zhì)純化?？梢酝ㄟ^定點(diǎn)突變將D/E-X-N-S/T的基序加工到所克隆的ORF中。 生產(chǎn)重組的糖綴合物多肽的一般方法用于生產(chǎn)重組糖綴合物多肽的優(yōu)先選擇的宿主是大腸桿菌。其使用三種質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化i編碼所述的多糖生物合成基因座的低拷貝數(shù)的質(zhì)?；蛘唣ち?；ii編碼糖受體蛋白的表達(dá)質(zhì)粒，所述的糖受體蛋白包含至少一個D/E-X-N-S/T基序;iii pMLNT2 (編碼 N. tergacus PglB).最初將重組的大腸桿菌在200ml_lL體積的LB肉湯中進(jìn)行培養(yǎng)，所述的LB肉湯在合適的情況下添加選擇性的抗生素。蛋白質(zhì)表達(dá)在生長的對數(shù)中期進(jìn)行誘導(dǎo)，并且細(xì)胞在16-37°C下表達(dá)4h-24h之后進(jìn)行收獲(各個糖綴合物優(yōu)化的具體條件)。重組糖綴合物按照來自鼠傷寒沙門氏菌的CJ0114-His的純化提到的方法進(jìn)行純化。糖基化按照Western印跡分析使用抗-His和特異性的抗-多糖的抗體進(jìn)行證實(shí)。如果將替代細(xì)菌宿主用于糖綴合物的表達(dá)，遵守同樣的方案，但是培養(yǎng)條件可以根據(jù)給定宿主的優(yōu)化條件進(jìn)行改變。實(shí)施例I詵擇的抗原肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)來自在還原性末端具有葡萄糖或者半乳糖的血清型(即 1、2、3、6A、6B、7F、7A、7B、8、9A、9L、9N、9V、10F、10A、11F、11A、11B、11C、13、14、15F、15A、15B、15C、17F、17A、18F、18A、18B、18C、19F、19A、19B、19C、22F、23F、27F、29、31、32 、324、33 、338、34、35八、358、37)、這些血清型可以偶聯(lián)于其上的莢膜肺炎鏈球菌(S. pneumoniae)蛋白質(zhì)抗原包括肺炎鏈球菌溶血素(Pnemolysin)的無毒變體,其中在433位上的色氨酸突變成了苯丙氨酸。這之前顯示出在小鼠中誘導(dǎo)免疫力，并且計(jì)劃作為人接種的候選物[I]。該蛋白的序列包括五個N-X-S/T位點(diǎn),所述的位點(diǎn)潛在地可以修飾成受體基序D/E-X-N-Y-S/T (參見附件3，突出顯示的基序)。其他的肺炎鏈球菌免疫原包括PspA、PspC和PsaA [2，3](參見附件3，潛在的部分基序是突出顯示的)。豬鏈球菌(Streptococcus suis)莢膜.盡管其結(jié)構(gòu)尚未確定，該莢膜區(qū)已經(jīng)在基因組中得到鑒定。豬鏈球菌免疫原包括烯醇酶(Enolase)、Sao、HP0197、RfeA、ESA、IBP、SLY和 38-kDa 的蛋白質(zhì)[4，5，6，7，8]。B組鏈球菌(無乳鏈球菌)所有的九種人血清型(Ia，Ib, II，III，IV，V，VI，VII，VIII)在還原性末端具有葡萄糖。GBS蛋白抗原包括ScpB、C蛋白質(zhì)的0-組分、1^11* 、51 、LrrG、SAG1408, SAG0645, SAG0649, BibA 和 Alp 蛋白質(zhì)家族(a、Rib、R28 和 Alp2) [9，10，11](參見附件5)。針對GBS的建議的疫苗策略是對未懷孕的青少年進(jìn)行免疫，并且可以因此將其潛在地連接到HPV的衣殼蛋白從而得到二聯(lián)疫苗(參見附件6，來自當(dāng)前在英國用作GSK疫苗的HSV類型的衣殼蛋白的氨基酸序列)。還有可能針對定居在反芻動物乳腺并影響乳的質(zhì)量和數(shù)量的菌株開發(fā)疫苗(可以連接到來自其他的細(xì)菌的抗原，所述的細(xì)菌還在乳品場引起乳腺炎，例如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌(Staph aureus)、乳房鏈球菌(Strep.Uberis)和停乳鏈球菌(Strep. Dysgalactiae)。海豚鏈球菌(streptococcus iniae)(魚的病原體)-在獸醫(yī)學(xué)上有著全球性的重要性并且有對疫苗的需求。沒有關(guān)于莢膜的結(jié)構(gòu)性信息，但是基因顯示與無乳鏈球菌 (S. agalatiae)有一些同源性。潛在的蛋白質(zhì)抗原包括M-樣蛋白質(zhì)SimA和SpcI [12,13]。克雷伯菌屬(Klebsiella spp.)克雷伯菌的77個莢膜血清型和70抗原多種血清型K?？死撞牡鞍酌庖咴↖型和3型菌毛的主要結(jié)構(gòu)蛋白。外膜蛋白0mpA、0mpW、0mpK17、0mpK36 和 F印A。銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa):產(chǎn)生A-和B-級的0_抗原。A級在還原性末端具有鼠李糖，B級有10個血清型，多數(shù)是FucNAc，三個Rha，I個Rib。還產(chǎn)生在還原性末端具有Man的胞外多糖，并且銅綠假單胞菌蛋白抗原包括毒素和外膜蛋白。實(shí)施例2使用04-特異性的抗血清(小鼠的單克隆[1E6]，ab8274，abeam UK)確認(rèn)鼠傷寒沙門氏菌的特異性轉(zhuǎn)移CJOlH-His和Nt PglB在鼠傷寒沙門氏菌SL3749 (waaL_)中進(jìn)行表達(dá)。CJ0114-His在變性條件(SM尿素)下通過Ni-NTA親和進(jìn)行純化，并且將該純化的樣品通過SDS-PAGE進(jìn)行分離，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上并且使用抗-His和抗-04抗體進(jìn)行檢測。鼠傷寒沙門氏菌04檢測為具有聚合物梯狀結(jié)構(gòu)，分子量大于未經(jīng)修飾的CJ0114-His蛋白，圖26B。為了證實(shí)將0-抗原結(jié)合到蛋白質(zhì)，將樣品使用蛋白酶K進(jìn)行處理。在所處理的樣品中未識別有04-反應(yīng)性的物種，這表明0-抗原連接到蛋白質(zhì)。實(shí)施例3活性位點(diǎn)的識別以及N-聯(lián)轉(zhuǎn)移的確認(rèn)a.關(guān)鍵的寡糖基轉(zhuǎn)移酶基序(WffDYG)在Nt PglB中通過定點(diǎn)突變，突變成WAAYG。將野生型或者經(jīng)突變的Nt PglB酶與CJO114-His在鼠傷寒沙門氏菌SL3749中進(jìn)行表達(dá)，并且隨后將CJOl 14-His在變性條件下進(jìn)行純化，并且通過Western印跡使用抗-His和抗-04進(jìn)行檢測。鼠傷寒沙門氏菌04僅當(dāng)CJ0114-His和野生型Nt PglB共表達(dá)時被檢測到，圖27。468WAAYG472的突變體不能將0-抗原轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)，這表明Nt PglB作為N-聯(lián)寡糖基轉(zhuǎn)移酶發(fā)揮特異性功能。b.為了進(jìn)一步地檢查Nt PglB的特異性，將CJ0114_His受體蛋白質(zhì)的四個D/E-X-N-X-S/T受體序列肽段(位于氨基酸位置101、155、173和179)中的每個突變成D/E-X-Q-X-S/T。將經(jīng)突變的CJ0114-His蛋白質(zhì)與Nt PglB在鼠傷寒沙門氏菌SL3749中表達(dá)，并且通過Western印跡使用抗-His和抗-04抗體來檢測04 0-抗原的轉(zhuǎn)移。0抗原到蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移在三個經(jīng)突變的受體蛋白質(zhì)中檢測(N101Q，N155Q和N179Q)但是當(dāng)使用CJ0114-HisN179Q作為受體蛋白時沒有，這表明僅有mDSNST175序列子是由Nt PglB所使用的。這還確認(rèn)了糖是通過天冬氨酸殘基連接到蛋白質(zhì)的(即特異性地N-聯(lián)轉(zhuǎn)移)。實(shí)施例4除了鼠傷寒沙門氏菌04，Nt PglB能夠轉(zhuǎn)移大腸桿菌09(參見圖28A)。將NtPglB或者Cj PglB與CJOl 14-His在大腸桿菌E69(09K30)中進(jìn)行表達(dá)，并且隨后純化CJ0114-His。09轉(zhuǎn)移到CJ0114-His通過Western免疫印跡，使用抗-His抗體和抗-09進(jìn)行確認(rèn)。在此菌株中09 0-抗原的還原性末端糖是N-乙?；咸烟前?，其之前顯示為CjPglB的底物。該結(jié)果表明這兩種寡糖基轉(zhuǎn)移酶在特異性上具有類似之處，也有差別。參考文獻(xiàn)[I]Alexander et al. 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權(quán)利要求
1.ー種使用載體轉(zhuǎn)化的微生物細(xì)胞，所述的載體含有選自以下的核苷酸序列 i)由如圖Ia表示的核酸序列組成的核酸分子； ii)由在嚴(yán)格的雜交條件下與(i)中的核酸分子雜交的核酸序列所組成的核酸分子并且該核酸序列編碼多肽；其中所述的細(xì)胞表達(dá)重組多肽，該重組多肽是所述的寡糖基轉(zhuǎn)移酶的底物。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的微生物細(xì)胞，其中所述的細(xì)胞使用核酸分子進(jìn)行轉(zhuǎn)化，所述的核酸分子包含核苷酸序列，所述的核苷酸序列編碼如圖Ib中的氨基酸序列表示的寡糖基轉(zhuǎn)移酶多肽；或者編碼變體多肽，且所述的變體多肽包含經(jīng)修飾的圖Ib所表示的氨基酸序列，所述修飾是通過至少ー個氨基酸殘基的缺失、添加或取代進(jìn)行并且所述的經(jīng)修飾的氨基酸序列保持或者增強(qiáng)了寡糖基轉(zhuǎn)移酶活性。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的微生物細(xì)胞，其中所述的載體是表達(dá)載體，該表達(dá)載體適合表達(dá)編碼寡糖基轉(zhuǎn)移酶多肽的核酸分子。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的微生物細(xì)胞，其中所述的重組多肽包含至少ー個由以下氨基酸序列構(gòu)成的肽基序Asp/Glu-Xaa1-Asn-Xaa2-SerAhr 其中Xaa1和Xaa2是除脯氨酸之外的任意氨基酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的微生物細(xì)胞，其中所述的重組多肽是從傳染性病原體中分離的抗原。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的微生物細(xì)胞，其中所述的傳染性病原體是細(xì)菌性病原體。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或者6所述的微生物細(xì)胞，其中所述的病原體選自肺炎鏈球菌、豬鏈球菌、海豚鏈球菌(streptococcus inae)、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、馬鏈球菌、乳房鏈球菌、米勒鏈球菌組(SMG)、血鏈球菌、牛鏈球菌、鏈球菌A組、肺炎克雷伯菌、產(chǎn)酸克雷伯菌、植生克雷伯菌(Klebsiella planticola)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aerunginosa)、鮑氏不動桿菌(Acinetobcater baumanii)、醋酸I丐不動桿菌、傷寒沙門菌(Salmonellaenterica serovar Typhi)、空腸彎曲桿菌、結(jié)腸彎曲桿菌、紅嘴E|彎曲桿菌、流感嗜血桿菌、幽門螺旋桿菌、腦膜炎雙球菌、淋病奈瑟菌、乳酰胺奈瑟菌、志賀菌屬、葡萄球菌屬、艱難梭狀芽胞桿菌、肉毒桿菌、炭疽桿菌、類鼻疽伯克霍爾德氏菌、鼻疽伯克霍爾德氏菌、乳酸桿菌屬、破傷風(fēng)桿菌、白喉棒狀桿菌、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、大腸桿菌、結(jié)核分枝桿菌、百日咳博德特氏菌、胸膜肺炎放線桿菌，病毒衍生的抗原，例如人乳頭瘤病毒(HPV)、甲型肝炎、こ型肝炎、輪狀病毒以及流感病毒、得自寄生蟲如惡性痕原蟲(Plasmodium faciparum)的抗原。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的微生物細(xì)胞，其中所述的病原體選自表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、人葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、頭狀葡萄球菌、解糖葡萄球菌、耳葡萄球菌、模仿葡萄球菌、腐生性葡萄球菌、科氏葡萄球菌、木糖葡萄球菌、科氏葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、豬葡萄球菌、山羊葡萄球菌、雞葡萄球菌、中間葡萄球菌、人葡萄球菌。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的微生物細(xì)胞，其中所述的寡糖基轉(zhuǎn)移酶多肽使用莢膜(K)抗原修飾所述重組多肽。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的微生物細(xì)胞，其中所述的寡糖基轉(zhuǎn)移酶多肽使用莢膜O抗原修飾所述重組多肽。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的微生物細(xì)胞，其中所述的寡糖基轉(zhuǎn)移酶多肽使用胞外多糖/表面多糖修飾所述重組多肽。
12.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的微生物細(xì)胞，其中所述的重組抗原多肽包含氨基酸序列或者其抗原部分或者變體氨基酸序列，或者由氨基酸序列或者其抗原部分或者變體氨基酸序列組成，所述的氨基酸序列選自圖4a_4e中表示的序列，其中所述的變體是圖4a_4e中表示序列的至少ー個氨基酸殘基的缺失、取代或添加。
13.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的微生物細(xì)胞，其中所述的重組抗原多肽包含氨基酸序列或者其抗原部分或者變體氨基酸序列，或者由氨基酸序列或者其抗原部分或者變體氨基酸序列組成，所述的氨基酸序列選自圖5中表示的序列，其中所述的變體是圖5中表示序列的至少ー個氨基酸殘基的缺失、取代或添加。
14.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的微生物細(xì)胞，其中所述的重組抗原多肽包含氨基酸序列或者其抗原部分或者變體氨基酸序列，或者由氨基酸序列或者其抗原部分或者變體氨基酸序列組成，所述的氨基酸序列選自圖6a_6g中表示的序列，其中所述的變體是圖6a_6g中表示序列的至少ー個氨基酸殘基的缺失、取代或添加。
15.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的微生物細(xì)胞，其中所述的重組抗原多肽包含氨基酸序列或者其抗原部分或者變體氨基酸序列，或者由氨基酸序列或者其抗原部分或者變體氨基酸序列組成，所述的氨基酸序列選自圖7a-7m中表示的序列，其中所述的變體是圖7a_7m中表示序列的至少ー個氨基酸殘基的缺失、取代或添加。
16.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的微生物細(xì)胞，其中所述的重組抗原多肽包含氨基酸序列或者其抗原部分或者變體氨基酸序列，或者由氨基酸序列或者其抗原部分或者變體氨基酸序列組成，所述的氨基酸序列選自圖8a_8i中表示的序列，其中所述的變體是圖8a_8i中表示序列的至少ー個氨基酸殘基的缺失、取代或添加。
17.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的微生物細(xì)胞，其中所述的重組抗原多肽包含氨基酸序列或者其抗原部分或者變體氨基酸序列，或者由氨基酸序列或者其抗原部分或者變體氨基酸序列組成，所述的氨基酸序列選自圖9a或9b中表示的序列，其中所述的變體是圖9a或9b中表示序列的至少ー個氨基酸殘基的缺失、取代或添加。
18.根據(jù)權(quán)利要求5所述的微生物細(xì)胞，其中所述的重組抗原多肽包含氨基酸序列或者其抗原部分或者變體氨基酸序列，或者由氨基酸序列或者其抗原部分或者變體氨基酸序列組成，所述的氨基酸序列選自圖IOa或IOb中表示的序列，其中所述的變體是圖IOa或IOb中表示序列的至少ー個氨基酸殘基的缺失、取代或添加。
19.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的微生物細(xì)胞，其中所述的重組抗原多肽包含氨基酸序列或者其抗原部分或者變體氨基酸序列，或者由氨基酸序列或者其抗原部分或者變體氨基酸序列組成，所述的氨基酸序列選自圖Ila-Ilk中表示的序列，其中所述的變體是圖Ila-Ilk中表示序列的至少ー個氨基酸殘基的缺失、取代或添加。
20.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的微生物細(xì)胞，其中所述的重組抗原多肽包含圖12中表示的氨基酸序列或者其抗原部分或者變體氨基酸序列，或者由圖12中表示的氨基酸序列或者其抗原部分或者變體氨基酸序列組成，其中所述的變體是圖12中表示序列的至少ー個氨基酸殘基的缺失、取代或添加。
21.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的微生物細(xì)胞，其中所述的重組抗原多肽包含氨基酸序列或者其抗原部分或者變體氨基酸序列，或者由氨基酸序列或者其抗原部分或者變體氨基酸序列組成，所述的氨基酸序列選自圖13a-131中表示的序列，其中所述的變體是圖13a-131中表示序列的至少ー個氨基酸殘基的缺失、取代或添加。
22.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的微生物細(xì)胞，其中所述的重組抗原多肽包含圖14中表示的氨基酸序列或者其抗原部分或者變體氨基酸序列，或者由圖14中表示的氨基酸序列或者其抗原部分或者變體氨基酸序列組成，其中所述的變體是圖14中表示序列的至少ー個氨基酸殘基的缺失、取代或添加。
23.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的微生物細(xì)胞，其中所述的重組抗原多肽包含氨基酸序列或者其抗原部分或者變體氨基酸序列，或者由氨基酸序列或者其抗原部分或者變體氨基酸序列組成，所述的氨基酸序列選自圖15a-15f中表示的序列，其中所述的變體是圖15a-15f中表示序列的至少ー個氨基酸殘基的缺失、取代或添加。
24.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的微生物細(xì)胞，其中所述的重組抗原多肽包含氨基酸序列或者其抗原部分或者變體氨基酸序列，或者由氨基酸序列或者其抗原部分或者變體氨基酸序列組成，所述的氨基酸序列選自圖16a-16f中表示的序列，其中所述的變體是圖16a-16f中表示序列的至少ー個氨基酸殘基的缺失、取代或添加。
25.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的微生物細(xì)胞，其中所述的重組抗原多肽包含圖17中表示的氨基酸序列或者其抗原部分或者變體氨基酸序列，或者由圖17中表示的氨基酸序列或者其抗原部分或者變體氨基酸序列組成，其中所述的變體是圖17中表示序列的至少ー個氨基酸殘基的缺失、取代或添加。
26.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的微生物細(xì)胞，其中所述的重組抗原多肽包含圖18中表示的氨基酸序列或者其抗原部分或者變體氨基酸序列，或者由圖18中表示的氨基酸序列或者其抗原部分或者變體氨基酸序列組成，其中所述的變體是圖18中表示序列的至少ー個氨基酸殘基的缺失、取代或添加。
27.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的微生物細(xì)胞，其中所述的重組抗原多肽包含圖19中表示的氨基酸序列或者其抗原部分或者變體氨基酸序列，或者由圖19中表示的氨基酸序列或者其抗原部分或者變體氨基酸序列組成，其中所述的變體是圖19中表示序列的至少ー個氨基酸殘基的缺失、取代或添加。
28.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的微生物細(xì)胞，其中所述的重組抗原多肽包含氨基酸序列或者其抗原部分或者變體氨基酸序列，或者由氨基酸序列或者其抗原部分或者變體氨基酸序列組成，所述的氨基酸序列選自圖20a-20c中表示的序列，其中所述的變體是圖20a-20c中表示序列的至少ー個氨基酸殘基的缺失、取代或添加。
29.根據(jù)權(quán)利要求5所述的微生物細(xì)胞，其中所述的重組抗原多肽包含氨基酸序列或者其抗原部分或者變體氨基酸序列，或者由氨基酸序列或者其抗原部分或者變體氨基酸序列組成，所述的氨基酸序列選自圖21a或21b中表示的序列，其中所述的變體是圖21a或21b中表示序列的至少ー個氨基酸殘基的缺失、取代或添加。
30.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的微生物細(xì)胞，其中所述的重組抗原多肽包含氨基酸序列或者其抗原部分或者變體氨基酸序列，或者由氨基酸序列或者其抗原部分或者變體氨基酸序列組成，所述的氨基酸序列選自圖22a-22f中表示的序列，其中所述的變體是圖22a-22f中表示序列的至少ー個氨基酸殘基的缺失、取代或添加。
31.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的微生物細(xì)胞，其中所述的重組抗原多肽包含氨基酸序列或者其抗原部分或者變體氨基酸序列，或者由氨基酸序列或者其抗原部分或者變體氨基酸序列組成，所述的氨基酸序列選自圖23a-23f中表示的序列，其中所述的變體是圖23a-23f中表示序列的至少ー個氨基酸殘基的缺失、取代或添加。
32.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的微生物細(xì)胞，其中所述的重組抗原多肽包含氨基酸序列或者其抗原部分或者變體氨基酸序列，或者由氨基酸序列或者其抗原部分或者變體氨基酸序列組成，所述的氨基酸序列選自圖24a-24d中表示的序列，其中所述的變體是圖24a-24d中表示序列的至少ー個氨基酸殘基的缺失、取代或添加。
33.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的微生物細(xì)胞，其中所述的重組抗原多肽包含圖25中表示的氨基酸序列或者其抗原部分或者變體氨基酸序列，或者由圖25中表示的氨基酸序列或者其抗原部分或者變體氨基酸序列組成，其中所述的變體是圖25中表示序列的至少ー個氨基酸殘基的缺失、取代或添加。
34.根據(jù)權(quán)利要求1-33中任一項(xiàng)所述的微生物細(xì)胞，其中所述的微生物細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的微生物細(xì)胞，其中所述的細(xì)菌細(xì)胞是埃希氏菌屬(Eschericni spp.ノ。
36.根據(jù)權(quán)利要求34所述的微生物細(xì)胞，其中所述的細(xì)菌細(xì)胞是沙門氏桿菌屬(balmoneila spp.ノ。
37.ー種疫苗組合物，其包含如本文所述的細(xì)菌糖綴合抗原多肽或者其部分。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的組合物，其中所述的組合物包含載體和/或任選地包含佐齊 。
39.根據(jù)權(quán)利要求37或38所述的組合物，其含有如本文所述的兩種或三種不同的糖綴合物抗原肽的混合物。
40.ー種細(xì)胞培養(yǎng)物，其含有根據(jù)權(quán)利要求1-36中任一項(xiàng)所述的微生物細(xì)胞。
41.ー種發(fā)酵罐,其含有根據(jù)權(quán)利要求40所述的微生物細(xì)胞培養(yǎng)物。
42.根據(jù)權(quán)利要求1-36中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞在生產(chǎn)糖綴合的多肽中的應(yīng)用。
43.一種用于生產(chǎn)重組糖綴合多肽的方法，所述的方法包括 i)提供根據(jù)本發(fā)明的微生物培養(yǎng)物； ii)培養(yǎng)所述的微生物培養(yǎng)物；并且 iii)將所述的糖綴合多肽從所述的微生物細(xì)胞或者所述的細(xì)胞培養(yǎng)基中分離。
44.ー種針對細(xì)菌感染接種受試者的方法，其包含使用根據(jù)權(quán)利要求37-39中任ー項(xiàng)所述的有效量的疫苗對所述受試者進(jìn)行免疫。
45.—種載體,其包含核苷酸序列,所述的核苷酸序列選自 i)由如圖Ia表示的核酸序列組成的核酸分子； ii)由在嚴(yán)格的雜交條件下與(i)中的核酸分子雜交的核酸序列所組成的核酸分子并且該核酸序列編碼多肽；其中所述的細(xì)胞表達(dá)重組多肽，該多肽是所述的寡糖基轉(zhuǎn)移酶的底物。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的載體，其中所述的載體包含核苷酸序列，該核苷酸序列編碼如圖Ib中的氨基酸序列所表示的寡糖基轉(zhuǎn)移酶多肽，或者編碼變體多肽并且所述的變體多肽包含經(jīng)修飾的圖Ib中表示的氨基酸序列，所述的修飾是通過至少一個氨基酸殘基的缺失、取代或 添加進(jìn)行并且所述的經(jīng)修飾的氨基酸序列保持或增強(qiáng)了寡糖基轉(zhuǎn)移酶活性。
全文摘要
本公開涉及寡糖基轉(zhuǎn)移酶多肽以及在微生物宿主細(xì)胞中生產(chǎn)糖基化的重組蛋白質(zhì)；并且包括含有糖基化的重組抗原的疫苗。
文檔編號A61K39/02GK102695791SQ201080039421
公開日2012年9月26日 申請日期2010年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月4日
發(fā)明者B·雷恩, R·朗頓 申請人:倫敦衛(wèi)生及熱帶醫(yī)學(xué)學(xué)院