專利名稱：腫瘤細胞的選擇性殺傷方法及用于該方法的裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用特定的UV脈沖閃光來選擇性地殺傷腫瘤細胞的方法及裝置。
背景技術(shù)：
以往，作為破壞癌細胞的方法，已知放射線、Y射線和重粒子射線放射法等。但是， 這些方法存在難以進行存在于機體深部的腫瘤癌組織的定位治療(C > f 4 >卜治療)、 對腫瘤細胞以外的正常組織也會造成損傷的弊端。另外，眾所周知紫外線具有殺菌效果，以往長期使用低壓汞燈(UV燈)作為殺菌燈，但近年來，逐漸開始采用使用氙閃光燈的“光脈沖殺菌”(參照例如專利文獻1)。氙閃光燈能以微秒級的間隔(每1秒鐘數(shù)次 數(shù)十次)瞬間發(fā)出具有被認為殺菌效果好的200 300nm范圍內(nèi)的波長譜的光，每次的能量也可達UV燈(相當于65W)的數(shù)萬倍。上述使用氙閃光燈的光脈沖殺菌是能在極短的時間(1秒以下或數(shù)秒左右)里對普通細菌、霉菌、芽胞菌等發(fā)揮出高殺菌力的方法，在食品等領(lǐng)域內(nèi)已開始實用化。但是，關(guān)于由該氙閃光燈等產(chǎn)生的脈沖光能用于選擇性地殺傷腫瘤細胞這一點尚無報道?，F(xiàn)有技術(shù)文獻專利文獻專利文獻1 日本專利特開2000-107^2號公報

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的技術(shù)問題本發(fā)明的目的是提供一種能選擇性地殺傷腫瘤細胞的方法和裝置。解決技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，對腫瘤細胞和非腫瘤細胞照射由氙閃光燈等發(fā)出的脈沖光時，可以只選擇性地殺傷腫瘤細胞以至其細胞死亡，而使非腫瘤細胞存活，從而完成了本發(fā)明。S卩，本發(fā)明的一個側(cè)面是提供一種腫瘤細胞的選擇性殺傷方法，其特征在于，包括在人或人以外的動物的體外或者人以外的動物體內(nèi)對腫瘤細胞照射至少在230 270nm范圍內(nèi)具有連續(xù)的發(fā)射光譜的脈沖光的步驟；以下將所述脈沖光稱為“UV脈沖閃光”。以下也將該腫瘤細胞的選擇性殺傷方法簡稱為“本發(fā)明的方法”。較好是根據(jù)作為對象的腫瘤細胞的不同，所述UV脈沖閃光在距光源8cm處具有例如以累計輸出計為90 7100J、90 14200J或180 14200J的累計單位面積照射量。換言之，較好是所述UV脈沖閃光以來自UVC波長的能量計具有例如6 480J/cm2、6 960J/ cm2或12 960J/cm2的累計單位面積照射量。較好是照射所述UV脈沖閃光的步驟例如在 1分鐘以內(nèi)。該UV脈沖閃光較好是由氙閃光燈發(fā)出的光。此外，本發(fā)明的一個側(cè)面是提供一種能實施所述腫瘤細胞的選擇性殺傷方法的醫(yī)療用裝置，即一種腫瘤組織治療用裝置，其特征在于，包括脈沖光、即UV脈沖閃光的光源，所述脈沖光至少在230 270nm范圍內(nèi)具有連續(xù)的發(fā)射光譜。以下也將該裝置簡稱為“本發(fā)明的裝置”。作為所述腫瘤組織治療用裝置，可例舉例如內(nèi)窺鏡、激光顯微鏡或體表腫瘤組織照射裝置。作為該裝置所具有的光源，較好是氙閃光燈。發(fā)明效果利用本發(fā)明的方法和裝置，能簡便地在短時間內(nèi)在不導(dǎo)致非腫瘤細胞的細胞死亡的情況下僅殺滅腫瘤細胞?？善诖鲜霰景l(fā)明在針對存在于機體內(nèi)的腫瘤癌組織的定位治療等中的應(yīng)用。附圖的簡單說明

圖1是由氙閃光燈(BHX-200，彗星株式會社(二卜株式會社))發(fā)出的UV脈沖閃光的光源、透過普通(非石英玻璃)玻璃(厚0. 17mm)后、以及透過塑料制盤(FluoroDish FD-35，厚1. 25mm)后的(a)UV區(qū)域(200 400nm)的光譜和(b)UV區(qū)域、可見區(qū)域、紅外區(qū)域(200 950nm)的光譜。圖2是實施例1中的MCF-7 (腫瘤細胞的SEM觀察圖像。[a]照射次數(shù)0 (對照)。 細胞膜表面平滑。[b]照射次數(shù)56(1秒，179. 2J)。細胞質(zhì)萎縮。[c]照射次數(shù)280 (5秒， 896J)?？梢娂毎|(zhì)萎縮和膜變性。[d]照射次數(shù)560(10秒，1792)。無法確認獨立的細胞形態(tài)。因膜變性而導(dǎo)致細胞表面呈突起狀。[e]照射次數(shù)1120(20秒，358釕)。細胞解體加劇，有一部分已不成形。[f]照射次數(shù)2240 (40秒，7168 J)。僅可見核結(jié)構(gòu)，細胞解體逐漸加劇。[g]照射次數(shù)2240(40秒，7168J) UV-C隔離。如果除去UV-C，則與對照同樣可觀察到平滑的細胞膜表面。圖3是實施例1的細胞存活率的測定中的Cos7(非腫瘤細胞)和MCF_7(腫瘤細胞)的激光顯微鏡(LSM510-META)觀察圖像。用PI (碘化丙啶)判定細胞的死活活細胞由于膜結(jié)構(gòu)牢固，因此PI無法滲透至細胞內(nèi)，不被染成紅色；死細胞的膜結(jié)構(gòu)被破壞，PI滲透至細胞內(nèi)與DNA反應(yīng)，呈紅色。[a]Cos7/無照射(對照) 小時后。可觀察到大而扁平的細胞質(zhì)。未見死細胞。[b]Cos7/560次照射(10秒，1792J)24小時后。雖然可見細胞萎縮，但未見死細胞。[c]MCF-7/無照射(對照) 小時后。呈MCF-7特有的圓形細胞形態(tài)。 [d]MCF-7/560次照射(10秒，1792J)24小時后。可見細胞質(zhì)的萎縮，所有細胞已被殺死。圖4是表示實施例1中的UV脈沖閃光照射(照射次數(shù)0，14，28,56, 560) 24小時后的細胞存活率(對于各細胞將照射次數(shù)為0時作為1. 00)的圖。圖5是表示實施例1中的除去了 UV-C的UV脈沖閃光照射(照射次數(shù)0，14，28， 56，560) M小時后的細胞存活率(對于各細胞將照射次數(shù)為0時作為100% )的圖。圖6是表示實施例2中的人白血病細胞株的UV脈沖閃光照射(照射次數(shù)0，14， 56,560,2240)24小時后的細胞存活率(對于各細胞將照射次數(shù)為0時作為100% )的圖。圖7是表示實施例2中的因DNA損傷而發(fā)生了早期凋亡的細胞的比例的圖。圖8是表示實施例3中的人腫瘤細胞株(纖維肉瘤、前列腺癌、惡性絨毛膜上皮癌)的UV脈沖閃光照射(照射次數(shù)0，14，56，560，2M0) M小時后的細胞存活率(對于各細胞將照射次數(shù)為0時作為100% )的圖。圖9是表示實施例4中的小鼠淋巴瘤細胞株的UV脈沖閃光照射(照射次數(shù)0， 14,56,560,2240)24小時后的細胞存活率(對于各細胞將照射次數(shù)為0時作為100% )的圖。圖10是表示實施例5中所用的體表腫瘤組織照射裝置10的圖。(a)整體示意圖； (b)探針4部分的放大圖；(c)探針4前端的放大圖；(d)探針4前端的剖視圖，著色部是照射角75度的范圍。圖11是表示實施例5中使探針的前端抵接于荷瘤小鼠的癌癥部位來照射UV脈沖閃光的模樣的照片。圖12是表示實施例5中的ACHN荷瘤小鼠的腫瘤體積的轉(zhuǎn)變的圖(箭頭為照射曰)。圖13是參考例中的照射量測定方法的示意圖(圖中各構(gòu)件的詳細說明參照參考例的記載)。實施發(fā)明的方式-方法-本發(fā)明的一個側(cè)面是提供一種腫瘤細胞的選擇性殺傷方法，其包括通過如下所述的方式對腫瘤細胞照射UV脈沖閃光的步驟。作為本發(fā)明的方法的適用對象的腫瘤細胞無特別限定，包括癌瘤(來源于上皮組織的惡性腫瘤)、肉瘤(來源于非上皮組織的惡性腫瘤)、白血病、惡性淋巴瘤和良性腫瘤的細胞，以及來源于這些細胞的細胞株。另一方面，非腫瘤細胞是指上述腫瘤細胞以外的正常細胞。本發(fā)明的方法可應(yīng)用于上述腫瘤細胞和非腫瘤細胞混合存在的部位。對于人和人以外的哺乳類及其它動物(實驗動物、寵物等)的腫瘤細胞，本發(fā)明的方法不僅可在體外使用(針對經(jīng)采集、培養(yǎng)的腫瘤細胞)，還可在體內(nèi)使用。即，本發(fā)明的一個側(cè)面還能提供一種在人和人以外的哺乳類的體內(nèi)選擇性地殺傷腫瘤細胞的治療方法和輔助手術(shù)方法。本發(fā)明的方法中所用的UV脈沖閃光在相當于UV-C的紫外線波長區(qū)域內(nèi)，至少在包括約的DNA吸收波長在內(nèi)的230 270nm的范圍內(nèi)具有連續(xù)的發(fā)射光譜，還可以在更大的范圍內(nèi)具有連續(xù)的發(fā)射光譜。UV脈沖閃光的單次的單位面積照射量[(J/cm2)/次]和照射次數(shù)[次]、即作為它們的累計值的累計單位面積照射量[J/cm2]可根據(jù)腫瘤細胞和非腫瘤細胞的種類等，在能選擇性地殺傷腫瘤細胞的范圍內(nèi)調(diào)節(jié)。即，通過將累計單位面積照射量調(diào)節(jié)至規(guī)定范圍內(nèi)，可以實質(zhì)上僅殺傷腫瘤細胞而不殺傷非腫瘤細胞(即使對非腫瘤細胞造成傷害，也控制在能修復(fù)的范圍內(nèi)，不會導(dǎo)致細胞死亡)。如果累計單位面積照射量不足，則無法充分殺滅腫瘤細胞，反之，如果累計單位面積照射量過量，則不僅是腫瘤細胞，連非腫瘤細胞也會大量殺傷或殺滅，因此可適當調(diào)整以期能達到與腫瘤細胞存活率和腫瘤體積等有關(guān)的目標效果。上述累計單位面積照射量[J/cm2]是UV脈沖閃光的光源的單次照射的輸出[J/ 次]和照射次數(shù)[次]、即作為它們的累計值的累計輸出[J]以及該UV脈沖閃光的照射面積[cm2]的函數(shù)，而且如果將光源視作點光源，則UV脈沖閃光的累計單位面積照射量[J/ cm2]與到光源的距離的平方成反比。例如下述實施例1所示，使用氙閃光燈(BHX-200，彗星株式會社)作為UV脈沖閃光的光源、該氙閃光燈到照射部位的距離為8cm時，如果累計輸出在45J以上，則能殺傷某些腫瘤細胞(人乳腺癌培養(yǎng)細胞株和人子宮頸癌細胞株)的半數(shù)以上的細胞G4.8J(14 次)照射M小時后的腫瘤細胞的存活率在50%以下)；如果在90J以上，則能殺傷該腫瘤細胞的大部分的細胞(89. 6J(28次)照射M小時后的腫瘤細胞的存活率在20 40%左右)；如果在900J以上，則能幾乎完全殺滅該腫瘤細胞。此外，在上述條件下，如果累計輸出在20000J以下，則非腫瘤細胞的殺傷程度低，如果在7100J以下，則非腫瘤細胞幾乎完全存活(7168J(2240次)照射M小時后的非腫瘤細胞的存活率將近100% )。因此，例如以人乳腺癌細胞和人子宮頸癌細胞等腫瘤細胞作為對照時，在使非腫瘤細胞幾乎完全存活的同時能殺傷這些腫瘤細胞的大部分的細胞的90 7100J的范圍可以例舉作為上述條件下的UV脈沖閃光的累計輸出的優(yōu)選范圍。以人乳腺癌細胞和人子宮頸癌細胞以外的腫瘤細胞作為適用對象時，在考慮效果的同時，如果需要，也可以采用上述范圍內(nèi)的較高范圍的累計輸出，或者也可以改變上述范圍的上限和/或下限，將所得的不同的范圍作為該腫瘤細胞的優(yōu)選范圍。例如，以與人乳腺癌細胞和人子宮頸癌細胞相比更難殺傷的腫瘤細胞作為對象時，較好是將上限提高至14200J或?qū)⑾孪尢岣咧?80J，將UV脈沖閃光的累計輸出調(diào)整至90 14200J的范圍或 180 14200J的范圍。此外，關(guān)于本發(fā)明的方法中使用上述氙閃光燈時的累計輸出和距離的相關(guān)條件， 可以改變并采用不同的光源、累計輸出和距離的條件，只要累計單位面積照射量達到與之相當?shù)闹导纯伞＜?，例如關(guān)于“累計輸出90 7100J的距光源8cm處的累計單位面積照射量”，只要是與之相當?shù)闹?，則也可以通過不同的累計輸出和到光源的距離來實現(xiàn)。上述氙閃光燈(BHX-200)的累計輸出的值是如實施例1所述根據(jù)電容器容量和電壓算出的理論值，表示該氙閃光燈所發(fā)出的光的整個波長范圍(例如200 IOOOnm)內(nèi)的能量。如下述參考例所示，來自UV-CQOO 300nm)或230 270nm的波長的能量本身是整個上述波長范圍內(nèi)的能量、即上述累計輸出的一部分。此外，根據(jù)下述參考例所示的對比，氙閃光燈(BHX-200)的發(fā)光管的光能、即上述累計輸出可以換算成距該氙閃光燈8cm處的累計單位面積照射量。因此，例如關(guān)于上述“累計輸出90 7100J的距光源8cm處的累計單位面積照射量”，如果是整個波長范圍QOO IOOOnm)內(nèi)的能量(總累計單位面積照射量)，則可換算成約70 5700J/cm2，如果是來自UV-C QOO 300nm)的波長的能量(UVC 累計單位面積照射量)，則可換算成約6 480J/cm2。此外，累計輸出180和14200J的距光源8cm處的累計單位面積照射量分別可換算成約140和11400J/cm2的總累計單位面積照射量、以及約12和960J/cm2的UVC累計單位面積照射量。UV脈沖閃光的單位時間的照射次數(shù)和處理時間(它們的累計值即為上述照射次數(shù))可以在考慮到上述累計單位面積照射量或累計輸出的條件及光源的性能等的同時在合適的范圍內(nèi)調(diào)節(jié)。例如，通過使用每1秒鐘能照射數(shù)次 數(shù)十次的IJ/次以上的UV脈沖閃光的光源，可將照射步驟的時間控制在數(shù)分鐘以內(nèi)，較好是1分鐘、更好是30秒以內(nèi)。UV脈沖閃光的能量在透過玻璃(載玻片、蓋玻片、聚光透鏡等)或塑料(盤等)等后有時會顯著衰減。因此，UV脈沖閃光理想的是直接對腫瘤細胞照射，但采用聚光透鏡等時，不得不使用可期待UV-C透過的石英玻璃原材料，應(yīng)當考慮能量的衰減來調(diào)節(jié)輸出。例如下述參考例所示，用石英透鏡使氙閃光燈(BHX-200)的照射光會聚，然后經(jīng)由石英光纖從包埋有藍寶石珠的探針的前端部進行照射時，非照射部的累計單位面積照射量會有一定程度的衰減。UV脈沖閃光只要能滿足上述條件，則從任何光源發(fā)出的光均可，例如優(yōu)選從氙閃光燈發(fā)出的脈沖光。氙閃光燈能瞬間以較高的峰輸出在1秒鐘內(nèi)連續(xù)發(fā)出數(shù)次至數(shù)十次的閃光，該閃光在紫外區(qū)域(參照圖1)到紅外區(qū)域的范圍內(nèi)具有基于氙氣的較高的連續(xù)光譜。也可將食品領(lǐng)域等內(nèi)所用的具備氙閃光燈的光脈沖殺菌用的照射裝置(例如BHX-200， 彗星株式會社)或其改良產(chǎn)品用于本發(fā)明的方法?，F(xiàn)有的低壓汞燈具有僅在254nm等特定的波長處具有強峰的發(fā)射光譜，不具有 230 270nm范圍內(nèi)的連續(xù)的發(fā)射光譜，UV的能量不足。如果要使用低壓汞燈以上述的累計單位面積照射量照射UV光，則需要長時間的照射，因此不僅對腫瘤細胞、對非腫瘤細胞也會造成顯著傷害，無法選擇性地殺傷腫瘤細胞。-裝置-本發(fā)明的一個側(cè)面是提供一種能實施本發(fā)明的方法的醫(yī)療用裝置，更具體而言是提供一種腫瘤組織治療用裝置。上述本發(fā)明的裝置具備至少在230 270nm范圍內(nèi)具有連續(xù)的發(fā)射光譜的脈沖光 (UV脈沖閃光)的光源，作為該光源，對本發(fā)明的方法而言，如上所述優(yōu)選氙閃光燈。作為本發(fā)明的裝置，可例舉例如內(nèi)窺鏡、激光顯微鏡或體表腫瘤組織照射裝置等。 這些裝置具備用于從光源照射UV脈沖閃光的結(jié)構(gòu)(理想的是將可調(diào)整光源的輸出的設(shè)定計數(shù)器安裝于電源部等)，對于其它結(jié)構(gòu)，如果需要，可以在適當改變的基礎(chǔ)上采用現(xiàn)有的內(nèi)窺鏡、激光顯微鏡、體表腫瘤組織照射裝置等的結(jié)構(gòu)。如果是內(nèi)窺鏡，則例如用光纖引導(dǎo)照明用光以外的、由位于體外的控制裝置側(cè)的光源發(fā)出的UV脈沖閃光，從前端部向治療部位照射。此時，為了在不使UV光衰減的情況下導(dǎo)入體內(nèi)，光纖的原材料優(yōu)選石英玻璃或內(nèi)部具有鏡面結(jié)構(gòu)的材料。此外，也希望開發(fā)出在內(nèi)窺鏡前端內(nèi)藏有小型UV脈沖光發(fā)射部的裝置。如果是激光顯微鏡，則例如以單個細胞的水平向觀察部位和治療部位照射作為光源的激光以外的UV脈沖閃光。此時，如果要與觀察用途共用透鏡光學(xué)系統(tǒng)，則由于透鏡為石英玻璃原材料，可推測價格相當高，因此較好是設(shè)定與觀察光路不同的UV專用光路并切換使用。如果是體表腫瘤組織照射裝置，則例如用具有光源的可動式單元或石英光纖照射裝置(一種探針，其通過石英透鏡聚光，經(jīng)由石英光纖，前端安裝有具有積分球功能的石英或藍寶石珠)引導(dǎo)UV脈沖閃光向治療部位照射?；蛘咴陂_顱、開腹手術(shù)時，也可以在施行外科腫瘤摘除術(shù)后對摘除部位照射以殺滅殘存腫瘤。也可以采用在探針的前端具有刀的功能(與注射針的前端同樣)、能插入體內(nèi)的裝置。[實施例1]材料和方法UV脈沖閃光光源(使用氙閃光燈)BHX-200 (彗星株式會社)共聚焦激光掃描顯微鏡LSM510-META(卡爾蔡司顯微成像公司(Carl Zeiss Microimaging)，德國耶拿)
腫瘤細胞1. MCF-7 (來源于人乳腺癌的細胞株)2·ΒΤ474(來源于人乳腺癌的細胞株)3. Hella(來源于人子宮頸癌的細胞株)非腫瘤細胞1. Cos7 (來源于非洲綠猴腎臟的細胞株)2. MDCK (來源于犬腎臟腎小管上皮細胞的細胞株)首先利用細胞的自發(fā)熒光獲取形態(tài)信息，接著對各細胞用LipfectamindOOO (英杰公司 Gnvitrogen))轉(zhuǎn)染 MBL Azami-Green(phmAGl-MCl)DNA,觀察其熒光。在 5 % CO2,37 °C的環(huán)境下用LSM510-META獲取三維圖像后，將BHX-200設(shè)置在細胞正上方 8cm 的位置，進行 1、5、10、14J8、56、560、1120、2M0、3360、6720 次的 UV 脈沖閃光的照射后，再次獲取三維圖像。單次的發(fā)光能量(輸出)為3.2J(l/2x電容器容量(C) X電壓(V)2=1/2χ (7. 5χ10_6) χ9202Η3. 2)，每1秒鐘的發(fā)光次數(shù)為56次。 同時，在細胞中添加碘化丙啶，確認細胞的死活。此外，照射UV脈沖閃光后繼續(xù)培養(yǎng)M小時，再次觀察，求出死活的比例。MM基于LSM510-META的指紋法(Finger Printing)的自發(fā)熒光觀察以及 hami-Green熒光觀察(參照圖3)的結(jié)果是，所有進行了實驗的細胞中，都自1次照射起觀察到細胞萎縮。照射56次時，呈可見細胞表面的膜結(jié)構(gòu)的變化的形態(tài)，細胞萎縮顯著。用掃描電鏡觀察(參照圖2)，也同樣可見細胞萎縮和細胞膜結(jié)構(gòu)的變化。關(guān)于細胞的照射M小時后的存活率，非腫瘤細胞直至照射560次為止仍為100%， 而腫瘤細胞在照射14次時下降至約40%，在照射觀次時除Hella細胞(40%)外下降至20%，在560次時幾乎達到0% (參照圖4)。S卩，以距光源8cm的距離照射1. 792kJ(= (3.2J)/次X 560次)的UV脈沖閃光時，非腫瘤細胞100%存活，而相對地，腫瘤細胞被殺滅。根據(jù)核的形狀來判斷，還誘發(fā)了凋亡。照射120秒(6720次)時，非腫瘤細胞也有膜結(jié)構(gòu)的變化，還部分觀察到細胞死亡。另一方面，在觀察光路中插入盤狀的塑料覆蓋片(1. 25m厚)和激光顯微鏡的(X)2 培養(yǎng)箱塑料覆蓋片(1.2mm厚)而除去了 UV-(^290nm以下)(參照圖1)的實驗組中，腫瘤細胞和非腫瘤細胞的存活率未見顯著差異(參照圖4)。根據(jù)本次的除去了 UV-C的脈沖光照射的結(jié)果，可見光和近紅外光與本現(xiàn)象無關(guān)， 這就強烈地提示了與UV-C有關(guān)。推測通過照射UV脈沖閃光，腫瘤細胞在短時間內(nèi)發(fā)生了明顯的細胞形態(tài)變化(萎縮)和細胞膜的破壞，細胞質(zhì)內(nèi)物質(zhì)被釋放至細胞外，發(fā)生細胞死亡，未立即死亡的腫瘤細胞也因DNA嘧啶二聚體的形成而誘發(fā)了凋亡，最終細胞死亡。此外，通過形態(tài)觀察，如果考慮到細胞死亡的狀態(tài)，則與非腫瘤細胞相比，腫瘤細胞的UV-C區(qū)域的紫外線敏感性明顯較高，因此可見細胞解體。即，在低紫外線暴露量下，僅腫瘤細胞發(fā)生細胞死亡，非腫瘤細胞不發(fā)生細胞死亡。推測其理由在于腫瘤細胞存在特異性的紫外線受體(吸收體)，提示了提高紫外線敏感性的可能性。推測該受體根據(jù)腫瘤細胞而不同，但其伴隨著細胞的癌化、惡性化，與糖脂、糖蛋白糖鏈的組成變化有關(guān)。
[實施例2]腫瘤細胞株4.人白血病細胞株M0LT/S5.人白血病細胞株M0LT/TMQ 200 (三甲曲沙Trimetrexate (TMQ)抗癌劑200倍抗性株)6.人白血病細胞株K562/S17.人白血病細胞株K562/S28.人白血病細胞株K562/ARA-C (阿糖胞苷Cytarabine抗癌劑抗性株)^^在上述各細胞中添加碘化丙啶(PI)，與實施例1同樣，首先利用細胞的自發(fā)熒光獲取形態(tài)信息，在5% C02、37°C的環(huán)境下用LSM510-META獲取三維圖像后，將BHX-200設(shè)置在細胞正上方8cm的位置，進行0、14、56、560、2240次的UV脈沖閃光的照射后，再次獲取三維圖像。通過PI反應(yīng)確認細胞的死活。此外，照射UV脈沖閃光后繼續(xù)培養(yǎng)M小時，再次觀察，求出死活的比例。然后，通過流式細胞儀分析(FACS Aria,日本碧迪株式會社( ” 卜> · Π 7矢> / >株式會社)。細胞數(shù)=5X IO5個，η = 3)求出細胞的死活比例。結(jié)果示于圖6。如上所述，可知不僅能應(yīng)對實體癌，還能應(yīng)對血液癌，考慮臨床應(yīng)用時，可認為其應(yīng)用范圍極為廣泛。例如，根據(jù)腎臟透析的原理，可以通過將人的血液導(dǎo)入外部UV脈沖閃光裝置、在UV照射后返回體內(nèi)的方法而制成血液癌的治療器。此外還可知，M0LT/TMQ 200和K562/ARA-C雖然均為呈抗癌劑抗性、無法期待抗癌劑治療效果的癌，但由于本發(fā)明的作用機理并非藥理性損傷，而是物理性損傷，因此對于這些癌也能與其它癌同樣地發(fā)揮出非常大的效果。即，即使對于難以治療的癌，基于新作用機理的本方法也可期待其效果，可期待成為患者的福音。此外，對于各細胞，也驗證了與上述同樣地照射規(guī)定次數(shù)的UV脈沖閃光時對早期凋亡(DNA損傷)的影響。采用Armexin V作為標記物，與上述的細胞死活同樣地通過流式細胞儀分析早期凋亡。在凋亡的初期階段，位于細胞膜內(nèi)側(cè)的某些磷脂酰絲氨酸(PS phosphatidylserine)暴露至細胞膜外側(cè)，和與PS的親和性高的Annexin V結(jié)合。Annexin V是35-36kDa的依賴于Ca++而與磷脂結(jié)合的蛋白質(zhì)。在PS暴露至細胞膜外側(cè)后，失去正常的細胞膜結(jié)構(gòu)，開始發(fā)生DNA的片段化和染色質(zhì)的凝集。利用該原理，通過檢測與Armexin V的結(jié)合，可確認早期凋亡細胞。此外，另行準備被檢測物作為無處理對照(non treat cultured control)，在實驗M小時前進行流式細胞儀分析。結(jié)果示于圖7。凋亡的誘導(dǎo)率約為10%以下，因此可以認為本發(fā)明的作用機理與凋亡的相關(guān)性低。[實施例3]腫瘤細胞株9.人纖維肉瘤細胞株 HT-108010.人前列腺癌細胞株 DU14511.人前列腺癌細胞株 PC312.人惡性絨毛膜上皮癌細胞株BeWo方法
在上述各細胞中添加碘化丙啶，與實施例1同樣，首先利用細胞的自發(fā)熒光獲取形態(tài)信息，在5% C02、37°C的環(huán)境下用LSM510-META獲取三維圖像后，將BHX-200設(shè)置在細胞正上方8cm的位置，進行0、14、56、560、2240次的UV脈沖閃光的照射后，再次獲取三維圖像。通過PI反應(yīng)確認細胞的死活。此外，照射UV脈沖閃光后繼續(xù)培養(yǎng)M小時，再次觀察， 求出死活的比例。然后，通過流式細胞儀分析(FACS Aria，日本碧迪株式會社。細胞數(shù)= 5X105f，n = 3)求出細胞的死活比例。結(jié)果示于圖8。這些細胞是被分類為所謂惡性的肉瘤或癌，認為通過施加比普通癌細胞更大量的 UVC暴露量(965J/cm2)可以殺滅。該值低于被認為會對正常細胞產(chǎn)生影響的UVC暴露量 (1447J/cm2)。[實施例4]腫瘤細胞株13.小鼠淋巴瘤 EL-414.小鼠淋巴瘤 A2015.小鼠淋巴瘤 RL male 1^^在上述各細胞中添加碘化丙啶，與實施例1同樣，首先利用細胞的自發(fā)熒光獲取形態(tài)信息，在5% C02、37°C的環(huán)境下用LSM510-META獲取三維圖像后，將BHX-200設(shè)置在細胞正上方8cm的位置，進行0、14、56、560、2240次的UV脈沖閃光的照射后，再次獲取三維圖像。通過PI反應(yīng)確認細胞的死活。此外，照射UV脈沖閃光后繼續(xù)培養(yǎng)M小時，再次觀察， 求出死活的比例。然后，通過流式細胞儀分析(FACS Aria，日本碧迪株式會社。細胞數(shù)= 5X105f，n = 3)求出細胞的死活比例。結(jié)果示于圖9。與人白血病細胞同樣，對于小鼠淋巴瘤細胞也得到了同樣的結(jié)果，這提示了不僅對于人、對于其它動物中的液性癌也能應(yīng)對。[實施例5]體表腫瘤組織照射裝置準備圖10所示的體表腫瘤組織照射裝置10。將來自UV脈沖光源1 (QS0-7016UVSP、 BHX-200中使用的UVC發(fā)射管)的UV脈沖閃光用石英透鏡2 (前側(cè)焦距^mm,后側(cè)焦距 25mm)采集、會聚，在其焦點面設(shè)置直徑1. Omm Φ的石英光纖3的采光口，可以用長1200mm 的石英光纖3引導(dǎo)至探針4的前端進行照射。在探針4的前端包埋1. 5mm的藍寶石珠5，確保照射角為75度。荷瘤小鼠BALB/cA-nu/nu早。自出生后6周起皮下移植ACHN (人腎癌細胞株)，開始荷瘤。 上述荷瘤小鼠的腫瘤直徑腫大至20 30mm后，用上述體表腫瘤組織照射裝置開始照射實驗。在第0、6、18、四和33天，分別將探針的前端抵接于癌癥部位，照射120秒鐘的UV脈沖閃光(參照圖11)。與此同時，作為對照，對非腫瘤部位皮膚進行相同暴露量的照射。荷瘤小鼠的腫瘤腫瘤體積的轉(zhuǎn)變示于圖12。箭頭表示照射日。如圖11所示，荷瘤的腫瘤尺寸為942mm3、1308. 33mm3，是相當大的腫瘤塊，體重為25. Sg。體積自照射后1天起減小，4天后記錄到最初的低值，自次日起轉(zhuǎn)而有增加的趨勢，因此在第6天進行第2次照射。在確認體積的轉(zhuǎn)變的同時進行照射，直至第5次照射為止，通過手術(shù)摘除腫瘤塊(殘骸)。 與此同時，制作福爾馬林石蠟標本、電子顯微鏡標本，實施形態(tài)學(xué)考察。其結(jié)果是，腫瘤細胞壞死、溶解、消失，纖維組織圍繞而包住其周圍。認為體積比減少了約80%后就不再變化的原因在于，腫瘤細胞被消滅，取而代之的是在修復(fù)過程中出現(xiàn)的纖維組織。纖維組織是正常細胞，因此即使受到UV脈沖閃光照射也不會受到影響。此外，體重幾乎沒有變化而維持初始體重的原因可以解釋為由于腫瘤細胞被殺滅，因此被腫瘤榨取的養(yǎng)分被轉(zhuǎn)而用于原本的機體維持，因而得以維持體重。作為對照的正常皮膚照射組中，未能確認到形態(tài)變化。[參考例]照射量測定條件[1]脈沖光源QS0-70106UVSP(BHX-200)頻閃燈電源部(^卜口 #電源部) 相當于HD-200的機器[2]聚光透鏡[3]1200謹長、的石英光纖[4]藍寶石珠[20]測定器受光部浜松光電公司(浜松*卜二夕7 )制UV模塊 Η8496-11 Φ8ι πι計測部京立電機公司(京立電機)制 DEF-2100光具座 X型 IOOOmm長(1)算出實施例1 5中所用的UV脈沖閃光光源“QS0-70106UVSP”(ΒΗΧ-200，彗星株式會社。56Hz/s發(fā)光)的發(fā)光管的發(fā)光能量。結(jié)果示于表1。以下所有表中，1次=1 個脈沖。每1次的“總能量(All energy) ”是通過算式-Λ/2Χ電容器容量(C) X電壓(V)2 求得的值，每1次的“UVC能量(UVCenergy) ”是由波長的成分分析基于該“總能量”求得的值。[表1]發(fā)光管的發(fā)光能量單位J
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1.一種選擇性殺傷腫瘤細胞的方法，其特征在于，包括在人或人以外的動物的體外或者人以外的動物體內(nèi)對腫瘤細胞照射至少在230 270nm范圍內(nèi)具有連續(xù)的發(fā)射光譜的脈沖光的步驟；以下將所述脈沖光稱為“UV脈沖閃光”。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述UV脈沖閃光具有累計輸出90 7100J 的距光源8cm處的累計單位面積照射量。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述UV脈沖閃光具有累計輸出90 14200J 的距光源8cm處的累計單位面積照射量。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述UV脈沖閃光具有累計輸出180 14200J的距光源8cm處的累計單位面積照射量。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述UV脈沖閃光以來自UVC波長的能量計具有6 480J/cm2的累計單位面積照射量。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述UV脈沖閃光以來自UVC波長的能量計具有6 960J/cm2的累計單位面積照射量。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述UV脈沖閃光以來自UVC波長的能量計具有12 960J/cm2的累計單位面積照射量。
8.如權(quán)利要求1 7中任一項所述的方法，其特征在于，照射所述UV脈沖閃光的步驟在1分鐘以內(nèi)。
9.如權(quán)利要求1 8中任一項所述的方法，其特征在于，所述UV脈沖閃光是由氙閃光燈發(fā)出的光。
10.一種腫瘤組織治療用裝置，其特征在于，包括脈沖光、即UV脈沖閃光的光源，所述脈沖光至少在230 270nm范圍內(nèi)具有連續(xù)的發(fā)射光譜。
11.如權(quán)利要求10所述的裝置，其特征在于，所述裝置是內(nèi)窺鏡、激光顯微鏡或體表腫瘤組織照射裝置。
12.如權(quán)利要求10或11所述的裝置，其特征在于，所述光源是氙閃光燈。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供一種能選擇性地殺傷腫瘤細胞的方法和裝置。本發(fā)明的一個側(cè)面是提供一種腫瘤細胞的選擇性殺傷方法，其特征在于，包括在人或人以外的動物的體外或者人以外的動物體內(nèi)對腫瘤細胞照射至少在230～270nm范圍內(nèi)具有連續(xù)的發(fā)射光譜的脈沖光(UV脈沖閃光)的步驟。所述UV脈沖閃光較好是具有例如累計輸出90或180～7100或14200J的距光源8cm處的累計單位面積照射量，換言之，以來自UVC波長的能量計，具有6或12～480或960J/cm2的累計單位面積照射量。較好是照射所述UV脈沖閃光的步驟例如在1分鐘以內(nèi)。所述UV脈沖閃光較好是由氙閃光燈發(fā)出的光。此外，本發(fā)明的一個側(cè)面是提供一種腫瘤組織治療用裝置，其特征在于，包括所述UV脈沖閃光的光源。
文檔編號A61N5/06GK102470254SQ20108003422
公開日2012年5月23日 申請日期2010年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月9日
發(fā)明者伊東丈夫 申請人:學(xué)校法人東海大學(xué), 彗星株式會社