專利名稱：適用于治療骨關(guān)節(jié)炎、韌帶損傷和關(guān)節(jié)失調(diào)的生物材料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種適用于治療骨關(guān)節(jié)炎、肌腱損傷、韌帶損傷、常規(guī)的關(guān)節(jié)和連接組織不調(diào)和皮膚損傷的粘性液態(tài)的生物材料。
背景技術(shù)：
關(guān)節(jié)軟骨特別適用于抵御壓力，因為它既沒有血液供應和淋巴排泄，也完全沒有神經(jīng)末梢。這意味著關(guān)節(jié)軟骨不能自我再生補償其表面損傷，除非其下層的軟骨下層未損傷。因此如果軟骨損傷不深，就不會有再生反應。相反，如果損傷很深并深入軟骨下骨，就會觸發(fā)自我修復過程，因此骨髓干細胞開始軟骨細胞分化過程，該分化過程可導致受損軟骨的部分修復。例如關(guān)節(jié)(如膝蓋)疼痛和腫脹等癥狀的產(chǎn)生，可能是軟骨損傷的結(jié)果，上述癥狀的進一步惡化會發(fā)展成骨關(guān)節(jié)炎。由于關(guān)節(jié)損傷和姿勢缺陷以及與患者年齡有關(guān)的軟骨的正常磨損，這種類型的損傷可經(jīng)常在職業(yè)運動員(由于他們更易于受到外傷)或年老的病人身上出現(xiàn)。實際上，在膝關(guān)節(jié)的軟骨損傷中，包括物理療法和藥物療法的非手術(shù)療法不能實現(xiàn)軟骨損傷完全痊愈。在進行非常具有創(chuàng)新性的關(guān)節(jié)內(nèi)的外科植入療法之后，反而以很好的成功率實現(xiàn)了軟骨損傷完全痊愈?，F(xiàn)有技術(shù)中已知的主要的外科軟骨修復技術(shù)有1、依次通過至少兩個不同的外科步驟來實現(xiàn)自體同源軟骨細胞的移植第一步是微創(chuàng)的，用于病人關(guān)節(jié)的其它非受損區(qū)域或非關(guān)節(jié)軟骨病人的正常的軟骨組織的采集(通過關(guān)節(jié)內(nèi)視鏡檢查法)。采集的樣品于是送到實驗室用于體外細胞的膨脹。一旦軟骨細胞增殖后，接著實際的外科操作是直接在受損位點移植生成的軟骨細胞(以鹽溶液為媒介)， 該生成的軟骨細胞可用自體同源骨膜組織“在原位固定”。這個步驟極其昂貴，因為需要兩次外科手術(shù)和對軟骨細胞的體外培養(yǎng)過程。因而需要病人兩次住院，因此病人需經(jīng)受兩次麻醉和兩次藥理治療。2、第二種較簡單的治療方法是在關(guān)節(jié)表面進行穿孔以到達受損區(qū)域的下軟骨組織，從而允許間葉細胞狀血凝塊的形成，間葉細胞狀血凝塊能到達軟骨的缺陷表面，在該表面這些細胞可部分分化成軟骨細胞。但是，新生成的軟骨組織主要是與原始軟骨相似的纖維質(zhì)的和非透明的，因而，它不具有與原關(guān)節(jié)組織的相同的物理和機械性能。3、已知的治療骨軟骨的損傷的方法是含軟骨細胞和/或間充質(zhì)干細胞的外科培植物或聚合物骨骼的嵌入。在這種情況下，構(gòu)成骨骼的物質(zhì)可以是半合成的多聚糖，例如透明質(zhì)酸(1)的衍生物或者膠原基質(zhì)。如前面所述，這個過程極其昂貴且需要病人兩次住院和兩次手術(shù)。另一類非常常見的連接組織的損傷和/或炎癥類型是韌帶或肌腱的損傷，尤其是跟腱的損傷，特別是在職業(yè)運動員中，因為需要部分或者全部重新構(gòu)建受損的組織，通常需
3要外科手術(shù)治療(作為最嚴重的形式)。迄今為止，用于修復韌帶的外科方法基于組織移植和合成修補物，然而，隨著時間的過去，其效果有限。近期的科學出版物反而已經(jīng)證明干細胞重建受損的肌腱和韌帶組織的能力自相同干細胞采集的間充質(zhì)細胞被導入傷運動員的跟腱，事實上分化成了肌腱細胞(常規(guī)的肌腱細胞)。因為使韌帶柔韌并堅固的膠原質(zhì)產(chǎn)量的增加，肌腱因而得到了修補。最近，不僅在上頌面和骨外科中，而且(和首先)在連接組織外科(特別是在韌帶 /肌腱和皮膚的重建/再生過程中)，富含血小板的血液衍生物的使用越來越普遍，因為這類材料富含營養(yǎng)因子，例如AGF(自體同源生長因子濃縮物)，具體的PDGF-AB和TGFi3等 (3)⑷。事實上這些血液衍生物主要被用于糖尿病患者出現(xiàn)靜脈潰瘍后，刺激受損皮膚的修復過程。上述刺激通常通過不同的方法觸發(fā)，例如a)機械性刺激，b)生長因子的局部施用，c)組織工程產(chǎn)品的局部施用。機械性刺激包括用干法消毒的紗布或手術(shù)刀打磨損傷組織的底部和邊緣直至出血。溶解于血漿中的生長因子和血小板濃縮物的局部施用可使PDGF(具有有絲分裂原和脈管生成作用)、TGF-B (用于刺激纖維原細胞)、EGF(用于刺激表皮細胞和間葉細胞)和 IGF (作為細胞增殖的促進劑)。雖然這些血液衍生物難于對其進行操作且其在原位的持久性持續(xù)時間很短，但是試驗已經(jīng)證明組織血管形成的增加。組織工程產(chǎn)品較新，是以生物相容材料為載體的異源的纖維原細胞和角化細胞的形式，或者以透明質(zhì)酸為載體的自體同源的纖維原細胞的形式。這需要在裝載到載體之前，使用外科實踐從患者身上取細胞，以體外培養(yǎng)。考慮到現(xiàn)有技術(shù)的上述狀態(tài)，關(guān)于細胞成分的關(guān)節(jié)內(nèi)給藥和皮層內(nèi)給藥，和用血小板產(chǎn)品處理肌腱/韌帶或皮膚的受傷區(qū)域(細胞成分和富含血小板的血液衍生物通過專門的注射器給藥)，需要提供一種“載體”，這種載體具有充足的流動性，還能同時確保-優(yōu)良的物理/機械一致性，容許上述給藥保護細胞膜的活性、形態(tài)，以及同時保護載體細胞(vehicled cell)的增殖和分化能力，但，此外，該一致性-允許上述細胞保持在受損位點，而不要求進一步的固定，需要隨后的縫合和藥物處理?；谕瑯拥脑颍枰峁┮环N能維護將被使用的血小板血液衍生物完整性的 “載體”，以保證其中包含的蛋白質(zhì)(即上述的營養(yǎng)因子)的所有生化和酶學特性的完整性， 最重要的是，這使得能在損傷位點保持已給藥的活性成分。

發(fā)明內(nèi)容
現(xiàn)在，本申請發(fā)現(xiàn)借助于本發(fā)明的生物材料可克服現(xiàn)有技術(shù)中的上述缺陷。具體地，根據(jù)本發(fā)明的生物材料包括a)液態(tài)載體，包括含至少一種天然和/或半合成的多聚糖的粘性溶液，并具有在 20°C和剪切速率是D = 350s—1時測定的介于IOOcP和250cP之間的動態(tài)粘度，和/或介于99cSt和之間的運動粘度(測量條件相同)，b)間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)物或即時制備物，和/或c)富含血小板的血液衍生物。這種類型的材料適于骨關(guān)節(jié)炎、軟骨損傷、肌腱損傷(特別是跟腱損傷)、韌帶損傷的治療，通常地，常規(guī)的關(guān)節(jié)和連接組織不調(diào)和皮膚損傷。此外，本申請還涉及包括本發(fā)明的生物材料的藥物組合物，具體地說，不僅適于關(guān)節(jié)和皮層內(nèi)給藥，還可以在損傷部位直接施用。
具體實施例方式關(guān)于本申請，術(shù)語“粘性溶液”在此被用于表示存在兩種或更多種組分的均質(zhì)混合物，在該均質(zhì)混合物中溶質(zhì)，即天然和/或半合成的多聚糖完全溶解在通常為水的溶劑中， 其中術(shù)語“水”被用來表示是用于注射劑和鹽水等的水。上述類型的溶液不能與所謂的凝膠或水凝膠，即半固態(tài)產(chǎn)品混淆，它們的組分不溶于溶劑，而是懸浮于其中，通常是由凝膠和/或溶劑的各種組分間的共價化學型的三維鍵(所謂的交聯(lián))、氫鍵或者范德華鍵的形成而獲得的物質(zhì)構(gòu)成。根據(jù)本發(fā)明，上述生物材料中的液態(tài)載體(a)優(yōu)選含天然和/或半合成的多聚糖的粘性溶液。根據(jù)本發(fā)明一個更優(yōu)選的實施方式，上述液態(tài)載體(a)為基本由天然和/或半合成來源的多聚糖和水組成的粘性溶液。關(guān)于本申請，“基本由......組成”的表述是指上述粘性溶液可能含有第三種成
分，第三種成分占粘性溶液總重量的0. 9%至0. 001%。上述天然來源的多聚糖優(yōu)選自透明質(zhì)酸(HA)、纖維素、膠凝糖、殼質(zhì)、殼聚糖、果膠或胃酸、瓊脂糖、褐藻酸、藻酸鹽、淀粉、多聚甘露糖和聚多糖，上述多聚糖的分子量和分子類型能實現(xiàn)/保證形成具有上述范圍內(nèi)的動態(tài)粘度或運動粘度的粘性溶液(非凝膠體)。上述半合成來源的多聚糖優(yōu)選自本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的透明質(zhì)酸衍生物，例如專利文獻EP216453中介紹的透明質(zhì)酸的芐基酯，透明質(zhì)酸的辛基、十八烷基、十二烷基和十六烷基酰胺衍生物(EP1095064)，和纖維素酯類，例如羧甲基纖維素(CMC)和膠原質(zhì)衍生物。無論如何，這些天然和/或半合成的多聚糖的分子量必須保證粘度在上述范圍內(nèi)，此夕卜，它們必須展示出導致粘性溶液形成，而非凝膠形成的分子特性/理化特性。只有這種類型的粘度，才使得獲得的劑型適于關(guān)節(jié)內(nèi)注射或在肌腱和/或韌帶的損傷部位注射，皮膚損傷的情況下的皮內(nèi)給藥，能同時確保包含其的細胞的最高活力，以及整體保持富含血小板的血液衍生物中包含的營養(yǎng)因子的所有生物化學性質(zhì)和酶性質(zhì)。根據(jù)一個特別優(yōu)選的本發(fā)明的實施例，使用透明質(zhì)酸或其藥學上可接受的鹽，優(yōu)選鈉鹽，平均分子量介于450kDa和730kDa之間(中分子量(MW)HA)；濃度介于5mg/ml和15mg/ml之間，更優(yōu)選為10mg/ml。透明質(zhì)酸或其藥學上可接受的鹽，優(yōu)選鈉鹽，滅菌后測定的平均分子量介于 IOOOkDa和1800kDa之間(高分子量(MW)HA)；濃度介于2mg/ml和12mg/ml之間，更優(yōu)選為6mg/ml 至 8mg/ml0透明質(zhì)酸的辛基酰胺優(yōu)選具有中分子量(MW)，因此透明質(zhì)酸的平均分子量在上述的450kDa至730kDa范圍內(nèi)；透明質(zhì)酸的辛基酰胺濃度為lmg/ml至10mg/ml，更優(yōu)選為^ig/ ml 至 3mg/ml。透明質(zhì)酸的十六烷基酰胺優(yōu)選具有中分子量(MW)，因此透明質(zhì)酸的平均分子量在上述的450kDa至730kDa范圍內(nèi)；透明質(zhì)酸的十六烷基酰胺的濃度為0. 2mg/ml至1. 5mg/ ml,更優(yōu)選 0. 5mg/ml 至 lmg/ml。凝膠糖濃度為ang/ml至8mg/ml，更優(yōu)選％ig/ml。CMC 濃度為 15mg/ml 至 40mg/ml，更優(yōu)選 25mg/ml。間充質(zhì)干細胞可以是自體同源和異源類型的，優(yōu)選來自骨髓、外周血、骨膜、臍帶或脂肪組織。對于本申請的范圍，“富含血小板的血液衍生物”的表述被用來表示所有的富含血小板的血液衍生物，例如，富含血小板的血漿(PRP)，即來自靜脈血離心分離的上層液體； 血小板濃縮物(PC)，即來自富含血小板的血漿離心分離的重液相；以及最后一種，血小板凝膠體，即由于沉淀劑(例如凝血酶)的作用轉(zhuǎn)變?yōu)槟z體的血小板濃縮物⑸。根據(jù)預期的應用及損傷類型可選擇富含血小板的血液衍生物的類型。事實上，上述三種產(chǎn)物含豐富的上述營養(yǎng)因子。根據(jù)本發(fā)明的生物材料包括組分(a)和組分(b)，組分(a)和組分(C)，或者組分 (a)、組分(b)和組分(c)三種組分。此外，優(yōu)選將自體同源的組分(C)加入到包含組分(a)和組分(b)的生物材料中 上述富含血小板的血液衍生物來自同一個患者，且上述制品可以在患者接受上述的關(guān)節(jié)內(nèi)注射或皮內(nèi)給藥前即時制備，或者在上述材料直接施用于受損部位前即時制備。因此根據(jù)本申請，上述藥物組合物可被用于軟骨和骨缺陷治療(主要是即時性的)的矯形術(shù)(包括牙科中的局部施用以促進植入物固定(favour the plants grip))； 和被直接注射到受損的肌腱和/或韌帶的受損部位；或者可在皮膚病學中用作用于皮內(nèi)給藥的注射組合物或通常用于難于愈合/恢復的皮膚潰瘍/損傷的局部治療。實施例1制備含中分子量HA的粘性溶液第一步水合稱量IOOmg的HA鈉鹽多聚糖(500 730KDa麗)以制備最終濃度是10mg/ml的粘性溶液。使用注射劑用的0.9%的氯化鈉鹽溶液、磷酸鹽緩沖液或水使各粉料水合為所需最終體積的一半體積(5ml)，以獲得想要的最終濃度。第二步溶解將如第一步所述獲得的產(chǎn)物在室溫下進行磁力攪拌至少1小時。依次加入剩余體積(5ml)以達到確定的最終濃度，攪拌至少2小時直至粉料完全
溶解后靜置。獲得的溶液經(jīng)高壓滅菌或紫外輻射的方式滅菌，然后，在20°C，剪切速率是D = 350s—1的條件下，用HAAKE RS150型血流速度計測量動態(tài)粘度。獲得的動態(tài)粘度是155cP，因此產(chǎn)物具有153. 6cSt的運動粘度。
實施例2制備含高分子量HA的粘件溶液與實施例1 一樣進行該過程，由高分子量HA粉料制備在WIF級的水中制備最終濃度分別是6mg/ml和8mg/ml的兩種粘性溶液。制備的溶液經(jīng)滅菌，然后在20°C，剪切速率是D = 350^的條件下，用HAAKE RS150 型血流速度計測量動態(tài)粘度。獲得的動態(tài)粘度分別是158cP和M6cP。實施例3制備含膠凝糖的粘件溶液與實施例1 一樣進行該過程，由膠凝糖粉料在鹽溶液中制備最終濃度是％ig/ml的粘性溶液。制備的溶液經(jīng)滅菌，然后在20°C，剪切速率是D = 3508-1的條件下，用HAAKE RS150 型血流速度計測量動態(tài)粘度。獲得的動態(tài)粘度是llOcP。實施例4制備含CMC的粘件溶液與實施例1 一樣進行該過程，由CMC粉料在磷酸鹽緩沖液中制備最終濃度是25mg/ ml的粘性溶液。獲得的溶液經(jīng)滅菌，然后在20°C，剪切速率是D = 350^的條件下，用HAAKE RS150 型血流速度計測量動態(tài)粘度。獲得的動態(tài)粘度是220cP。實施例5泡丨備含Φ分子量(MW)誘日月的辛基酉紐安或誘日月的十六烷基酉紐安的米材牛溶液與實施例1 一樣進行該過程，由中分子量的透明質(zhì)酸的辛基酰胺(或十六烷基酰胺)粉料在0. 9%氯化鈉鹽溶液中制備最終濃度是2mg/ml和3mg/ml (對于十六烷基酰胺， 最終濃度是0. 5mg/ml和lmg/ml)的兩種粘性溶液。獲得的溶液經(jīng)滅菌，然后在20°C，剪切速率是D = 350^的條件下，用HAAKE RS150 型血流速度計測量動態(tài)粘度。獲得的動態(tài)粘度分別是對于透明質(zhì)酸的辛基酰胺為143cP和220cP，對于透明質(zhì)酸的十六烷基酰胺為160cP和230cP。引用的參考文獻(1)EP 0863776 ；(2) “ Fattori di crescita autologhi nella chirurgia ossea ricostruttiva dopo infezione “ Carlo R. Romanon et al，Unita operativa Chirurgia delle ComplicanzeOsteoarticolari Settiche (CO. S. , Istituto Ortopedico Gaetano Pini).⑶“Different preparation methods to obtain components as a source of growth factors for local applications“ R.Zimmermann et al.，Transfusion 2001 ； 41 :1217-1224.
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權(quán)利要求
1.一種生物材料，包括a)液態(tài)載體，所述液態(tài)載體包括含至少一種天然和/或半合成的多聚糖的粘性溶液， 并具有在20°C和剪切速率為D = 350s—1時測定的介于IOOcP和250cP之間的動態(tài)粘度，和 /或相同條件下測定的介于99dt和MSdt之間的運動粘度。b)間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)物或即時制備物，和/或c)富含血小板的血液衍生物。
2.如權(quán)利要求1所述的生物材料，其中，液體形式的所述載體(a)是含天然和/或半合成的多聚糖的粘性溶液。
3.如權(quán)利要求2所述的生物材料，其中，所述粘性溶液基本由所述多聚糖和水組成。
4.如權(quán)利要求1 3中任意一項所述的生物材料，其中，天然來源的所述多聚糖選自由透明質(zhì)酸、膠凝糖、纖維素、殼多糖、殼聚糖、果膠或胃酸、瓊脂糖、褐藻酸、藻酸鹽、淀粉、多聚甘露糖和聚多糖組成的組。
5.如權(quán)利要求1 3中任意一項所述的生物材料，其中，半合成來源的所述多聚糖選自由透明質(zhì)酸衍生物、膠原質(zhì)衍生物和纖維素衍生物組成的組。
6.如權(quán)利要求4所述的生物材料，其中，組分(a)是平均分子量為450kDa至730kDa的透明質(zhì)酸或其藥學上可接受的鹽。
7.如權(quán)利要求5所述的生物材料，其中，所述組分(a)是十六烷基酰胺或具有中分子量 (WM)的透明質(zhì)酸的辛基酰胺。
8.如權(quán)利要求1 7中任意一項所述的生物材料，其中，所述間充質(zhì)干細胞為自體同源型，并選自由骨髓間充質(zhì)干細胞、外周血間充質(zhì)干細胞、骨膜間充質(zhì)干細胞、臍帶間充質(zhì)干細胞或脂肪組織間充質(zhì)干細胞組成的組。
9.如權(quán)利要求1 8中任意一項所述的生物材料，其中，所述富含血小板的血液衍生物選自富含血小板的血漿、血小板濃縮物和血小板凝膠體。
10.如權(quán)利要求1 9中任意一項所述的生物材料，用于骨關(guān)節(jié)炎、軟骨損傷、肌腱損傷、韌帶損傷、關(guān)節(jié)組織失調(diào)、皮膚損傷或潰瘍的治療。
11.如權(quán)利要求10所述的生物材料，其中，所述肌腱損傷為跟腱損傷。
12.如權(quán)利要求1 11中任意一項所述的生物材料，選自由以下材料組成的組包含組分(a)和組分(b)的生物材料，包含組分(a)和組分(c)的生物材料，包含組分(a)、組分 (b)和組分(c)的三種組分的生物材料。
13.包含權(quán)利要求1 12中任意一項所述的生物材料的藥物組合物，適于關(guān)節(jié)內(nèi)給藥和皮層內(nèi)給藥，或直接施用于受損部位。
14.如利要求13所述的藥物組合物，其中，所述富含血小板的血液衍生物和/或間充質(zhì)干細胞為自體同源。
15.如利要求13和14中任意一項所述的藥物組合物，用于軟骨和骨骼的缺陷、肌腱損傷、韌帶損傷或皮膚損傷的治療。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生物材料，包括a)液態(tài)載體，包括含至少一種天然和/或半合成的多聚糖的粘性溶液，并具有在20℃和剪切速率為D＝350s-1時測定的介于100cP和250cP之間的動態(tài)粘度，和/或相同條件下測定的介于99cSt和248cSt之間的運動粘度；b)間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)，和/或c)富含血小板的血液衍生物。上述粘性液態(tài)材料特別適用于骨關(guān)節(jié)炎、韌帶損傷，特別是肌腱損傷和軟骨損傷的治療，并可關(guān)節(jié)內(nèi)給藥、皮層內(nèi)給藥，或原位直接施用，而不會改變其中含有的間充質(zhì)干細胞和/或血小板的性能。
文檔編號A61K35/14GK102470190SQ201080026688
公開日2012年5月23日 申請日期2010年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月2日
發(fā)明者蘭弗蘭科·卡萊加羅, 安娜·瑪麗亞·扎內(nèi)拉托 申請人:菲迪亞醫(yī)藥公司