一種預防和治療骨關節(jié)炎的魚類軟骨提取物的生產(chǎn)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種預防和治療骨關節(jié)炎的魚類軟骨提取物的生產(chǎn)方法，魚類軟骨經(jīng)過混合酶酶解后，用超濾膜截留得到含有分子量小于1000道爾頓的低分子量硫酸軟骨素和膠原蛋白肽的提取物。本發(fā)明采用復合酶水解技術，實現(xiàn)硫酸軟骨素和膠原蛋白的同步水解，實現(xiàn)了魚類軟骨的綜合利用。所得產(chǎn)物為低分子量硫酸軟骨素，解決了硫酸軟骨素臨床應用生物利用率低的問題。該提取物能顯著改善骨關節(jié)炎的癥狀，具有良好的保健和治療功效。
【專利說明】一種預防和治療骨關節(jié)炎的魚類軟骨提取物的生產(chǎn)方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于魚軟骨提取物的生產(chǎn)【技術領域】，具體涉及一種預防和治療骨關節(jié)炎的魚類軟骨提取物的生產(chǎn)方法。
【背景技術】
[0002]硫酸軟骨素與膠原蛋白是形成軟骨基質的主要生物高分子。通常，硫酸軟骨素作為軟骨結構的成分之一，可以加速關節(jié)的修復、保留水分、使營養(yǎng)成分快速滲透至軟骨中。而軟骨組織的II型膠原蛋白，是軟骨再生的重要成分。人類骨關節(jié)炎的病理生理主要是影響軟骨基質中II型膠原蛋白和硫酸軟骨素這兩種成分，以關節(jié)軟骨膠原纖維斷裂、蛋白多糖進行性耗損為特征。因此，硫酸軟骨素和骨膠原蛋白通常作為治療骨性關節(jié)炎的保健食品和藥品應用廣泛。
[0003]雖然硫酸軟骨素在治療骨性關節(jié)炎方面應用廣泛，但近年來研究發(fā)現(xiàn)，硫酸軟骨素的相對分子量大，它的大體積往往妨礙其順利的穿越細胞膜，因而不能在機體內良好地發(fā)揮其多種藥理功能，而低分子量的硫酸軟骨素具有粘度小、溶解性好、易吸收及生物利用度高等特點。近年來，低分子硫酸軟骨素在防治冠心病、關節(jié)炎以及抗腫瘤等方面正日益受到廣泛重視。因此，含低分子量硫酸軟骨素的保健食品和藥品的開發(fā)具有重要的現(xiàn)實意義。
[0004]魚類軟骨是我國水產(chǎn)品加工過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物。魚類軟骨的結構比較松散，主要成分是粘多糖、蛋白質和無機鹽。粘多糖是由氨基己糖和己糖醛酸交替結合形成的酸性雜聚多糖，軟骨中的主要成分為硫酸軟骨素。硫酸軟骨素與膠原蛋白也是魚類軟骨基質的重要組成部分。因此，利 用魚類軟骨生產(chǎn)硫酸軟骨素和膠原蛋白，一方面能實現(xiàn)了魚類軟骨的綜合利用，減少環(huán)境污染；另一方面，可以作為提供硫酸軟骨素和骨膠原蛋白的重要來源。目前，從魚類軟骨中提取硫酸軟骨素和膠原蛋白已經(jīng)引起研究者的重視。專利一種魚軟骨提取物的制備方法及所得的產(chǎn)品(200810200881.6)，通過酶解魚軟骨的方法制備得到含分子量為5000~15000道爾頓硫酸軟骨素魚軟骨提取物。一種魚類軟骨生產(chǎn)硫酸軟骨素聯(lián)產(chǎn)水解膠原蛋白的方法(201310262059.3)，實現(xiàn)硫酸軟骨素和水解膠原蛋白的同步生產(chǎn)。但是上述專利所得產(chǎn)物均未解決硫酸軟骨素分子量過大臨床生物利用率較低的問題。

【發(fā)明內容】

[0005]為解決上述問題，本發(fā)明提供一種預防和治療骨關節(jié)炎的魚類軟骨提取物的生產(chǎn)方法，即制備含有低分子量硫酸軟骨素和膠原蛋白肽的魚類軟骨提取物的方法，以及其在治療骨性關節(jié)炎中的應用。
[0006]本發(fā)明采取的技術方案為:
一種預防和治療骨關節(jié)炎的魚類軟骨提取物的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述的生產(chǎn)方法包括如下步驟:
(I)魚類軟骨預處理:將魚類軟骨洗凈，用水浸泡2h后置于蒸煮鍋中100°C煮30min，撈出后剔除魚肉和油脂，用清水沖洗，切碎成大小為IcmXlcm的塊狀，備用；(2)酶解:向預處理后的魚類軟骨中加入魚軟骨重量的0.8-2倍的水，按照2-10g/kg的用量加入混合酶控制酶解溫度為30-55°C，調節(jié)pH為6.0-8.0，酶解2_6h ；
(3)滅酶:將上述得到酶解液升高溫度為80-100°C進行熱處理10-15min，然后降溫至75°C以下；
(4)離心除雜:采用2000-6000r/min的轉速，離心15-40min，過濾得到上清液；
(5)超濾干燥:上清液用分子量5000的超濾膜截留，收集膜透過液噴霧干燥得到軟骨提取物。
[0007]上述步驟(1)中的魚類軟骨為鮭魚、孔鰩魚或鯊魚中的一種或多種的含軟骨部位。
[0008]上述步驟(2 )中的加入的混合酶是木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和軟骨素酶組成的，添加比例為1:1:1或1:2:1或1:1:2。
[0009]上述步驟(2)中的pH的調節(jié)采用氫氧化鈉或鹽酸。
[0010]上述步驟(4)中的過濾可以添加適量助濾劑白陶土或硅藻土助濾。
[0011]上述步驟(5)中的干燥方法可以采取冷凍干燥。
[0012]上述的方法制得的魚軟骨提取物，其特征在于，所述的魚軟骨提取物中低分子量硫酸軟骨素含量為20-80 %，分子量小于500道爾頓的低分子量硫酸軟骨素占總軟骨素含量的95%以上。
[0013]上述的方法制得的魚軟骨提取物，其特征在于，所述的魚軟骨提取物中的魚膠原蛋白肽含量為20-80%，為一種羥脯氨酸、甘氨酸和脯氨酸含量占35%以上，分子量小于1000道爾頓的小分子膠原蛋白肽占總蛋白肽的95%以上。
[0014]上述的方法制得的魚軟骨提取物，其特征在于，用于制備治療、改善或預防骨關節(jié)炎疾病的保健食品和藥品中。
[0015]上述的保健食品和藥品，其特征在于，所述骨關節(jié)炎包括由退行性骨關節(jié)炎引起的骨損傷或歸因于關節(jié)老化引起的磨損。
[0016]本發(fā)明的有益效果為:
1、本發(fā)明采用復合酶水解技術，實現(xiàn)硫酸軟骨素和膠原蛋白的同步水解，實現(xiàn)了魚類軟骨的綜合利用。
[0017]2、所得產(chǎn)物為低分子量硫酸軟骨素，解決了硫酸軟骨素臨床應用生物利用率低的問題，具有對受損軟骨的修復作用，具有良好的保健和治療功效。
[0018]3、本發(fā)明的含低分子量硫酸軟骨素和膠原蛋白肽的魚類提取物可以作為一種制備治療、改善或預防骨關節(jié)炎疾病的保健食品的候選成分，所述骨關節(jié)炎包括由退行性骨關節(jié)炎引起的骨損傷或歸因于關節(jié)老化引起的磨損。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1魚軟骨提取物中低分子硫酸軟骨素薄層層析圖譜。
[0020]1:硫酸軟骨素；2:二糖、四糖、六糖、八糖、硫酸軟骨素對照品3:魚軟骨提取物中低分子硫酸軟骨素，其中98%以上為二糖(分子量低于500)。
[0021]圖2魚軟骨提取物對兔軟骨損失的病理組織學切片圖譜。
[0022]A-對照組；B-模型組；C_魚類軟骨提取物組；D_硫酸軟骨素組?！揪唧w實施方式】
[0023]魚類軟骨提取物的制備，通過氨基酸分析法檢測膠原蛋白肽純度(總氨基酸含量)及羥脯氨酸、甘氨酸和脯氨酸的含量(質量百分比)；所制得的硫酸軟骨素通過咔唑一硫酸法測得其含量，薄層層析法測定分子量。
[0024]實施例1
將鮭魚軟骨洗凈，用水浸泡2h后置于蒸煮鍋中100°C煮30min，撈出后剔除魚肉和油月旨，用清水沖洗，切碎成大小為IcmXlcm的塊狀，備用；選用已處理的軟骨500g，按料液比1:2加水,用氫氧化鈉或鹽酸調節(jié)pH=7.0,加入木瓜蛋白酶5g/kg、中性蛋白酶5g/kg和軟骨素酶5g/kg?？刂茰囟葹?5°C酶解5h，將得到酶解液升高溫度為80°C進行熱處理15min，然后降溫至70°C，采用2000 r/min的轉速，離心40min，添加適量助濾劑白陶土助濾得到上清液用分子量5000的超濾膜截留，收集膜透過液噴霧干燥得到軟骨提取物。
[0025]制得的魚軟骨提取物含有低分子量硫酸軟骨素和魚膠原蛋白肽，魚軟骨提取物中的魚膠原蛋白肽含量為40%，為一種羥脯氨酸、甘氨酸和脯氨酸含量占35%，分子量為小于1000道爾頓的小分子膠原蛋白肽占總肽的96% ;所述的魚軟骨提取物中低分子量硫酸軟骨素含量為60%，分子量小于500道爾頓的低分子量硫酸軟骨素占總軟骨素含量的98%。
[0026]實施例2
將孔鰩魚軟骨洗凈，用水浸泡2h后置于蒸煮鍋中100°C煮30min，撈出后剔除魚肉和油脂，用清水沖洗，切碎成大小為IcmX Icm的塊狀，備用；選用已處理的軟骨500g，按料液比1:2加水，用氫氧化鈉或鹽酸調節(jié)pH=7.0，加入木瓜蛋白酶5g/kg、中性蛋白酶10g/kg和軟骨素酶5g/kg?？刂茰囟葹?5°C酶解5、6h，將得到酶解液升高溫度為90°C進行熱處理13min,然后降溫至70°C,采用4000 r/min的轉速,離心30min,添加適量助濾劑娃藻土助濾得到上清液用分子量5000的超濾膜截留，收集膜透過液噴霧干燥得到軟骨提取物。
[0027]制得的魚軟骨提取物含有低分子量硫酸軟骨素和魚膠原蛋白肽，魚軟骨提取物中的魚膠原蛋白肽含量為43%,為一種輕脯氨酸、甘氨酸和脯氨酸含量占36% ,分子量為小于1000道爾頓的小分子膠原蛋白肽占總肽的96% ;所述的魚軟骨提取物中低分子量硫酸軟骨素含量為65%，分子量小于500道爾頓的低分子量硫酸軟骨素占總軟骨素含量的98%。
[0028]實施例3
將鯊魚軟骨洗凈，用水浸泡2h后置于蒸煮鍋中100°C煮30min，撈出后剔除魚肉和油月旨，用清水沖洗，切碎成大小為IcmXlcm的塊狀，備用；選用已處理的軟骨500g，按料液比1:2加水,用氫氧化鈉或鹽酸調節(jié)pH=7.0,加入木瓜蛋白酶5g/kg、中性蛋白酶5g/kg和軟骨素酶10g/kg?？刂茰囟葹?5°C酶解5、6h，將得到酶解液升高溫度為100°C進行熱處理IOmin,然后降溫至70°C,采用6000r/min的轉速,離心15 min,添加適量助濾劑白陶土助濾得到上清液用分子量5000的超濾膜截留，收集膜透過液噴霧干燥得到軟骨提取物。
[0029]制得的魚軟骨提取物含有低分子量硫酸軟骨素和魚膠原蛋白肽，魚軟骨提取物中的魚膠原蛋白肽含量為41%，為一種羥脯氨酸、甘氨酸和脯氨酸含量占37%，分子量為小于1000道爾頓的小分子膠原蛋白肽占總肽的97% ;所述的魚軟骨提取物中低分子量硫酸軟骨素含量為63%，分子量小于500道爾頓的低分子量硫酸軟骨素占總軟骨素含量的98%。
[0030]采取實施例2制得的魚類軟骨提取物進行生物活性研究
動物模型制備及分組:將新西蘭大白兔隨機分成4組。分別為對照組(A組)、模型組(B組)、魚類軟骨提取物組(C組)、硫酸軟骨素組(D組)。每組7只。25%烏拉坦(4ml/kg)行耳緣靜脈注射麻醉，麻醉后，在股骨內髁滑車面用電動骨鉆，鉆出直徑3mm、深3mm的全層關節(jié)軟骨缺損區(qū)，造成軟骨缺失，用生理鹽水和80萬單位的青霉素鈉進行沖洗。之后行關節(jié)復位，縫合傷口，關閉膝關節(jié)。對照組不做任何處理。術后注射青霉素鈉80萬，I次/d，連續(xù)3d,并在第5天強化一次，以防感染。
[0031]動物術后喂養(yǎng):術后第二天進行灌胃，每日一次，連續(xù)5周(給藥量按人和動物間體表面積折算的等效劑量比率表計算)。魚類軟骨提取物組和硫酸軟骨素組每日灌胃劑量為0.4g/kg，模型組給予等量的蒸餾水進行灌胃，對照組正常飼養(yǎng)不灌胃。
[0032]實驗取材:灌胃5周后，25%烏拉坦(4ml/kg)經(jīng)腹腔注射麻醉后，從髕上囊部位注射I毫升無菌PBS進入關節(jié)腔，反復活動關節(jié)后，抽取灌洗液，做好標記后置于-80°C冰箱中保存?zhèn)溆茫桓怪鲃用}取血，離心后取血清，標記，放入-80°C冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｇ虚_關節(jié)腔，取關節(jié)并固定于10%甲醛固定液中。
[0033]軟骨修復情況:模型組、魚類軟骨提取物組與硫酸軟骨素組結構均良好，但魚類軟骨提取物組與其他兩組相比軟骨表面較為平整，凹陷基本已填充，肉眼可見缺陷處有乳白色半透明膜樣組織，顏色與正常軟骨相近。模型組與硫酸軟骨素組中肉眼清晰可見股骨內髁滑車面上有凹陷，軟骨表面不平滑與周圍正常軟骨界限清楚，組織修復以纖維組織性修復為主，質量差，顏色與周圍軟骨相近。與對照組相比，軟骨表面仍與正常軟骨表面有一定界限。
[0034] 病理組織學觀察:圖2顯示在損傷修復處均可見初期修復反應。實驗組，HE染色見缺損處已經(jīng)被明顯修復。給予硫酸軟骨素組(D)，損傷處被少量死骨，增生的成骨細胞及纖維組織所填充，而且給予魚類軟骨提取物組(C)發(fā)現(xiàn)表面有增生的骨膜組織生成，底部可見新生骨小梁。相比之下模型組和硫酸軟骨素組損傷處軟骨細胞和纖維組織填充較少，且骨膜亦無形成。
[0035]通過生物活性研究實驗，可以看出本發(fā)明得到的低分子量硫酸軟骨素，具有對受損軟骨的修復作用。因此本發(fā)明的含低分子量硫酸軟骨素和膠原蛋白肽的魚類提取物可以作為一種制備治療、改善或預防骨關節(jié)炎疾病的保健食品的候選成分，所述骨關節(jié)炎包括由退行性骨關節(jié)炎引起的骨損傷或歸因于關節(jié)老化引起的磨損。
【權利要求】
1.一種預防和治療骨關節(jié)炎的魚類軟骨提取物的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述的生產(chǎn)方法包括如下步驟: (1)魚類軟骨預處理:將魚類軟骨洗凈，用水浸泡2h后置于蒸煮鍋中100°C煮30min，撈出后剔除魚肉和油脂，用清水沖洗，切碎成大小為IcmXlcm的塊狀，備用； (2)酶解:向預處理后的魚類軟骨中加入魚軟骨重量的0.8-2倍的水，按照2-10g/kg的用量加入混合酶控制酶解溫度為30-55°C，調節(jié)pH為6.0-8.0，酶解2_6h ； (3)滅酶:將上述得到酶解液升高溫度為80-100°C進行熱處理10-15min，然后降溫至75°C以下； (4)離心除雜:采用2000-6000r/min的轉速，離心15-40min，過濾得到上清液； (5)超濾干燥:上清液用分子量5000的超濾膜截留，收集膜透過液噴霧干燥得到軟骨提取物。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種預防和治療骨關節(jié)炎的魚類軟骨提取物的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述步驟(1)中的魚類軟骨為鮭魚、孔鰩魚或鯊魚中的一種或多種的含軟骨部位。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種預防和治療骨關節(jié)炎的魚類軟骨提取物的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述步驟(2)中的加入的混合酶是木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和軟骨素酶組成的,添加比例為1:1:1或1:2:1或1:1:2。
4.根據(jù)權利要求1所述的一種預防和治療骨關節(jié)炎的魚類軟骨提取物的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述步驟(2)中的pH的調節(jié)采用氫氧化鈉或鹽酸。
5.根據(jù)權利要求1所述的一種預防和治療骨關節(jié)炎的魚類軟骨提取物的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述步驟(4)中的過濾可以添加適量助濾劑白陶土或硅藻土助濾。
6.根據(jù)權利要求1所述的一種預防和治療骨關節(jié)炎的魚類軟骨提取物的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述步驟(5 )中的干燥方法可以采取冷凍干燥。
7.根據(jù)權利要求1所述的方法制得的魚軟骨提取物，其特征在于，所述的魚軟骨提取物中低分子量硫酸軟骨素含量為20-80%，分子量小于500道爾頓的低分子量硫酸軟骨素占總軟骨素含量的95%以上。
8.根據(jù) 權利要求1所述的方法制得的魚軟骨提取物，其特征在于，所述的魚軟骨提取物中的魚膠原蛋白肽含量為20-80%，為一種羥脯氨酸、甘氨酸和脯氨酸含量占35%以上，分子量小于1000道爾頓的小分子膠原蛋白肽占總蛋白肽的95%以上。
9.根據(jù)權利要求1所述的方法制得的魚軟骨提取物，其特征在于，用于制備治療、改善或預防骨關節(jié)炎疾病的保健食品和藥品中。
10.根據(jù)權利要求9所述的保健食品和藥品，其特征在于，所述骨關節(jié)炎包括由退行性骨關節(jié)炎引起的骨損傷或歸因于關節(jié)老化引起的磨損。
【文檔編號】A61K35/60GK103623006SQ201310605720
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年11月26日 優(yōu)先權日:2013年11月26日
【發(fā)明者】劉少芳, 楊慶利, 曹榮軍, 余玉奎, 臺文靜, 陳杰, 姚秀芬, 魯濤 申請人:青島貝爾特生物科技有限公司