專利名稱：類胡蘿卜素和多酚的協(xié)同組合的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種包括多酚和類胡蘿卜素的協(xié)同組合的組合物。更具體地，本發(fā)明提供包括前述化合物的協(xié)同組合的組合物，其可尤其用于抑制各種炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生。
背景技術(shù)：
炎癥過程，其形成非特異性免疫系統(tǒng)的重要部分，以一系列復(fù)雜的化學(xué)和細(xì)胞變化為特征，該變化對面臨微生物劑或者其他可能有害環(huán)境因素的宿主防御是必要的。然而在很多情況下，炎癥可能被不恰當(dāng)?shù)赜|發(fā)，和/或保持在對宿主有害的程度。在此情況下， 可能有需要抑制或者防止炎癥過程的一個或多個方面的發(fā)展，尤其是非感染性炎癥疾病的情況。大量不同的化學(xué)介質(zhì)已經(jīng)顯示在炎癥過程的發(fā)展和控制中被涉及。很多不同實驗室的最近研究表明一氧化氮(NO)作為各種急性和慢性炎癥疾病的重要調(diào)節(jié)劑，所述炎癥疾病包括各種類型的關(guān)節(jié)炎，胃腸疾病，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎性病癥和某些形式的哮喘。因此，已經(jīng)建議抑制NO的產(chǎn)生可為治療和/或控制這些炎癥疾病提供有用的治療機理。而且， 抑制NO的合成也已經(jīng)顯示在某些性質(zhì)上不是原發(fā)性炎癥的病癥或者狀態(tài)中是有用的。因此，例如，實驗中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在2型糖尿病個體中抑制NO的合成可降低葡萄糖攝取進入末端組織(limb tissue)。體內(nèi)NO的產(chǎn)生受一氧化氮合成酶(N0Q家族調(diào)控，該家族包括誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(I-NOS)，其受很多不同的免疫學(xué)刺激(包括脂多糖(LPQ、γ干擾素和白細(xì)胞介素 I(IL-I))激活。NOS的抑制作用在體外和體內(nèi)都可通過使用檸檬酸L-Ng-單甲基精氨酸(L-NMMA) 獲得。另外，幾種其他化合物，包括很多天然產(chǎn)物，也已顯示抑制NO的產(chǎn)生。后者的組包括如葉黃素[Rafi M.M. et al. MoI Nutr Food Res. 2007 Mar ；51 (3) :333-40 ；Choi, J. S. Nutrition. 2006 Jun ；22 (6) :668-71]和番茄紅素[Rafi，Μ. Μ. et al. J Food Sci. 2007 Jan;72(l) :S069_74]等化合物。不過，很多天然產(chǎn)物NO抑制劑的效果和效力已經(jīng)證明不太高。因此，存在改進天然來源的抑制NO產(chǎn)生的組合物的需要。另一個非常重要的炎癥介質(zhì)是α腫瘤壞死因子(TNF-α)，它是多種細(xì)胞類型產(chǎn)生的細(xì)胞因子，包括巨噬細(xì)胞、嗜中性白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。TNF-α在炎癥過程早期占關(guān)鍵位置，并且負(fù)責(zé)刺激其他因子的產(chǎn)生，例如核因子κ B(其反過來引起大范圍促炎基因的活化)。因此，由于它的關(guān)鍵的促炎地位，TNF-α明顯是抗炎藥劑的一個重要的潛在治療靶
點ο第三個重要的炎癥介質(zhì)是前列腺素&(PGE2)，類二十烷酸家族調(diào)節(jié)分子的一員。因此，PGE2在炎癥位置大量產(chǎn)生，在此它作為血管舒張劑，以及(與其他介質(zhì)例如組胺和緩激肽一起)引起血管的滲透性增加，從而對炎癥的大多數(shù)典型信號有貢獻。最后，由炎癥細(xì)胞例如巨噬細(xì)胞和嗜中性白細(xì)胞釋放的另一種促炎介質(zhì)是超氧化物離子。當(dāng)超氧化物離子對殺滅侵入微生物非常有效時，在其他(特別是非感染性)炎性病癥中，這些離子可能引起廣泛的宿主組織損害。當(dāng)考慮控制炎癥狀態(tài)的新方式時，超氧化物離子的產(chǎn)生因此成為潛在有用的治療靶點。本發(fā)明的一個目的是提供可以用來抑制一種或多種重要炎癥介質(zhì)，例如超氧化物離子、NO、TNF-α和/或PGE2的產(chǎn)生的組合物，作為治療或者控制其中包含所述介質(zhì)的病理學(xué)狀態(tài)和過程的方式。本發(fā)明的另一個目的是提供能抑制如上所述炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生的組合物，具有比現(xiàn)有技術(shù)報道的化合物和組合物更大的效果和/或效力。發(fā)明概述本發(fā)明人現(xiàn)已出人意料地發(fā)現(xiàn)，多酚化合物可與類胡蘿卜素在抑制幾種促炎途徑方面協(xié)同地相互作用。尤其是現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，多酚化合物鼠尾草酸引起協(xié)同增強如番茄紅素、葉黃素和胡蘿卜素等某些類胡蘿卜素對炎癥介質(zhì)N0、TNF-a和PGE2的產(chǎn)生的抑制效果。 而且，盡管此協(xié)同效應(yīng)在鼠尾草酸與番茄紅素、β -胡蘿卜素或者葉黃素的二元組合中觀察到，但當(dāng)鼠尾草酸與前述類胡蘿卜素中的兩種組合時的協(xié)同作用要大得多。前述協(xié)同抗炎效果在類胡蘿卜素存在于與其他多酚例如槲皮素、白藜蘆醇和沒食子酸的組合中時也觀察到了。因此本發(fā)明首先涉及包括一種或多種多酚和兩種或多種選自由葉黃素、番茄紅素和胡蘿卜素組成的組的類胡蘿卜素的治療組合物。在一個優(yōu)選實施方案中，用于本發(fā)明組合物的多酚選自由鼠尾草酸(carnosic acid)、槲皮素(quercetin)、白藜蘆醇(resveratrol)、沒食子酸(gallic acid)、菊苣酸 (chicoric ac id)、姜醇(gingerol)和姜黃素(curcumin)組成的組。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的組合物包括多酚化合物鼠尾草酸。在另一個特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的組合物包括多酚化合物槲皮素。在另一個特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的組合物包括多酚化合物白藜蘆醇。在另一個特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的組合物包括多酚化合物沒食子酸。在一個實施方案中，前述治療組合物包括鼠尾草酸、番茄紅素和葉黃素。在另一個優(yōu)選實施方案中，該組合物包括鼠尾草酸、葉黃素和胡蘿卜素。在另一優(yōu)選的實施方案中，該組合物包括番茄紅素、β -胡蘿卜素和鼠尾草酸。在另一個實施方案中，該組合物基本上由番茄紅素、葉黃素和鼠尾草酸組成。在一個更進一步的優(yōu)選實施方案中，該組合物基本上由葉黃素、β -胡蘿卜素和鼠尾草酸組成。在更優(yōu)選的實施方案中，該組合物基本上由番茄紅素、β -胡蘿卜素和鼠尾草酸組成。應(yīng)注意，如在本公開全文中和附加的權(quán)利要求中所用的術(shù)語“基本上由......組
成”是指這樣的情形，其中除提到的成分(即鼠尾草酸以及番茄紅素和/或葉黃素)之外， 本發(fā)明的組合物可包括不顯著影響本發(fā)明的基本性質(zhì)和新穎特征的其他化合物、物質(zhì)和藥劑。在其他優(yōu)選實施方案中，如上公開的優(yōu)選實施方案的組合物可以還包括一種或多種另外的類胡蘿卜素。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，另外的類胡蘿卜素選自由八氫番茄紅素和六氫番茄紅素組成的組。如上公開的組合物的活性成分(即多酚和類胡蘿卜素)可以是純化的化合物、合成化合物或者可存在于與其他成分的混合物中，例如在植物提取物例如迷迭香提取物 (鼠尾草酸的情況)、金盞花提取物(葉黃素的情況)或番茄提取物(例如可以從以色列 LycoRed, Be' er Sheva市售的Lycomato，番茄紅素和其他類胡蘿卜素的情形)中。應(yīng)注意到，如用于本發(fā)明公開的術(shù)語“葉黃素”應(yīng)理解成包括所有葉黃素酯都在其范圍內(nèi)。另外，術(shù)語“葉黃素”也可以將葉黃素和玉米黃質(zhì)(zeaxanthin)的混合物包括在其范圍內(nèi)，因為上述提及的類胡蘿卜素經(jīng)常與葉黃素共存(有時包含0. 1 % -15 %，或更多通常4%-6%的葉黃素含量)。另一方面，本發(fā)明提供在哺乳動物受試者中抑制或者降低超氧化物離子、NO、 TNF-α和/或PGE2的產(chǎn)生的方法，包括向所述受試者施用根據(jù)上文公開的任何實施方案的治療組合物。而且，本發(fā)明也提供一種治療需要這種治療的哺乳動物受試者中病理學(xué)病癥的方法，該病癥中超氧化物離子、NO、TNF-α和/或PGE2作為所述病癥的調(diào)節(jié)劑或者介質(zhì)，其中所述的方法包括給所述受試者施用根據(jù)上文公開的實施方案中任一項的治療組合物。在此方法的一個優(yōu)選實施方案中，所要治療的病癥選自由急性炎性病癥、慢性炎性病癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)，哮喘、鼻炎、特發(fā)性肺纖維化、腹膜炎、心血管炎、心肌缺血、再灌注損傷、動脈粥樣硬化、膿毒病、創(chuàng)傷、II型糖尿病、視網(wǎng)膜病、牛皮癬、胃腸炎癥、肝硬化、腹膜炎和炎性腸疾病、以及神經(jīng)變性疾病例如阿爾茨海默病(AD)組成的組。在上述方法的特別優(yōu)選的實施方案中，哺乳動物受試者是人受試者。盡管在如上公開的方法中，治療組合物可以任何方便的方式給藥，在一個優(yōu)選實施方案中所述的組合物以藥物劑型形式給藥。然而在另一個優(yōu)選實施方案中，治療組合物摻入到食物或者飲料中。另一方面，本發(fā)明涉及一種或多種多酚與兩種或多種類胡蘿卜素的組合在制造治療對抑制N0、TNF-a和/或PGE2的產(chǎn)生有反應(yīng)的病癥的藥物中的用途，其中所述兩種或多種類胡蘿卜素選自由番茄紅素、胡蘿卜素和葉黃素組成的組。在本發(fā)明這方面的一個優(yōu)選實施方案中，該一種或多種多酚選自由鼠尾草酸、槲皮素、白藜蘆醇、沒食子酸、菊苣酸、姜醇和姜黃素組成的組。在本發(fā)明這方面的一個特別優(yōu)選的實施方案中，多酚是鼠尾草酸。在本發(fā)明這方面的另一個特別優(yōu)選的實施方案中，多酚是槲皮素。在本發(fā)明這方面的又一個特別優(yōu)選的實施方案中，多酚是白藜蘆醇。在本發(fā)明這方面的又一個特別優(yōu)選的實施方案中，多酚是沒食子酸。在一個優(yōu)選實施方案中，所要治療的病癥是炎性病癥。在如上公開的用途的一個優(yōu)選實施方案中，所要治療的病癥選自由急性炎性病癥、慢性炎性病癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)、哮喘、鼻炎、特發(fā)性肺纖維化、腹膜炎、心血管炎、心肌缺血、再灌注損傷、動脈粥樣硬化、膿毒病、創(chuàng)傷、II型糖尿病、 視網(wǎng)膜病、牛皮癬、胃腸炎癥、肝硬化、腹膜炎和炎性腸疾病，以及神經(jīng)變性疾病例如阿爾茨海默病(AD)組成的組。在本發(fā)明這方面的一個特別優(yōu)選的實施方案中，鼠尾草酸與番茄紅素和葉黃素兩者組合使用。在本發(fā)明這方面的另一個特別優(yōu)選的實施方案中，鼠尾草酸與番茄紅素和β -胡蘿卜素兩者組合使用。在本發(fā)明這方面的又一個特別優(yōu)選的實施方案中，鼠尾草酸與葉黃素和β -胡蘿卜素組合使用。本發(fā)明的所有上述和其他特點和優(yōu)勢將從如下的其優(yōu)選實施方案的舉例性和非限制性實施例被更進一步闡述。


圖1圖示了鼠尾草酸和番茄紅素在抑制腹膜巨噬細(xì)胞NO的產(chǎn)生方面的協(xié)同相互作用。上圖顯示由純化的番茄紅素獲得的結(jié)果，而下圖代表由富集番茄紅素的番茄提取物得到的結(jié)果。圖加圖解說明了鼠尾草酸與純化的番茄紅素(purified lycopene)之間(上圖) 以及鼠尾草酸與富集番茄紅素的番茄提取物之間(下圖)在抑制腹膜巨噬細(xì)胞NO的產(chǎn)生方面的協(xié)同相互作用。2b圖解說明了在抑制腹膜巨噬細(xì)胞NO的產(chǎn)生方面，番茄紅素與葉黃素、鼠尾草酸和胡蘿卜素的各種組合之間的協(xié)同相互作用。上圖顯示用純化的番茄紅素獲得的結(jié)果，而下圖代表用富集番茄紅素的番茄提取物獲得的結(jié)果。圖2c更進一步圖解說明了在抑制腹膜巨噬細(xì)胞NO的產(chǎn)生方面，番茄紅素與葉黃素、鼠尾草酸和胡蘿卜素的各種組合之間的協(xié)同相互作用。上圖顯示用純化的番茄紅素獲得的結(jié)果，而下圖代表用富集番茄紅素的番茄提取物獲得的結(jié)果。圖3圖解說明了在抑制腹膜巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α方面，番茄紅素與葉黃素、鼠尾草酸和胡蘿卜素的各種組合之間的協(xié)同相互作用。上圖顯示用純化的番茄紅素獲得的結(jié)果，而下圖代表用富集番茄紅素的番茄提取物獲得的結(jié)果。圖4圖解說明了與不包括番茄紅素的組合的無協(xié)同作用相比，番茄紅素與葉黃素、鼠尾草酸和胡蘿卜素的各種組合之間在抑制腹膜巨噬細(xì)胞產(chǎn)生PG&方面的協(xié)同相互作用。圖fe圖解說明了在抑制腹膜巨噬細(xì)胞產(chǎn)生PG&方面，純化的番茄紅素與葉黃素、 鼠尾草酸和胡蘿卜素的不同混合物的各種組合之間的協(xié)同相互作用。圖恥圖解說明了在抑制腹膜巨噬細(xì)胞產(chǎn)生PG&方面，富集番茄紅素的番茄提取物與葉黃素、鼠尾草酸和胡蘿卜素的不同混合物的各種組合之間的協(xié)同相互作用。圖6圖解說明了在抑制LPS-刺激的腹膜巨噬細(xì)胞NO的產(chǎn)生方面，葉黃素、β -胡蘿卜素和鼠尾草酸之間的協(xié)同相互作用。圖7圖解說明了在抑制LPS-刺激的腹膜巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α方面，葉黃素、 β-胡蘿卜素和鼠尾草酸之間的協(xié)同相互作用。圖8圖解說明了在抑制LPS-刺激的腹膜巨噬細(xì)胞NO的產(chǎn)生方面，番茄紅素、葉黃素和各種多酚之間的協(xié)同相互作用。圖A代表用純化的番茄紅素的結(jié)果，而圖B代表用含番茄紅素的番茄提取物(Lyc-O-Mato)獲得的結(jié)果。圖9圖解說明了番茄紅素、葉黃素、β -胡蘿卜素和鼠尾草酸之間在抑制巨噬細(xì)胞超氧化物的產(chǎn)生方面的協(xié)同相互作用。圖A代表使用純化的番茄紅素的結(jié)果，而圖B代表用含番茄紅素的番茄提取物(Lyc-O-Mato)獲得的結(jié)果。
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圖10圖解了在用LPS預(yù)孵化10分鐘后，番茄紅素或者Lyc-O-Mato與葉黃素和鼠尾草酸之間在抑制細(xì)胞核裂解物中在536位絲氨酸上的p65-NFkB磷酸化方面的協(xié)同相互作用。圖的上面部分代表從圖表數(shù)據(jù)獲得的免疫印跡結(jié)果。圖11圖解說明了在抑制總細(xì)胞裂解物中LPS-誘導(dǎo)的一氧化氮合酶(iNOS)和環(huán)氧合酶2 (C0X2)蛋白表達方面，番茄紅素或者Lyc-O-Mato與葉黃素和鼠尾草酸之間的協(xié)同相互作用。優(yōu)詵實施方案的詳細(xì)說明如上文所公開的，本發(fā)明提供包括一種或多種多酚與一種或多種類胡蘿卜素組合的組合物。在本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的實施方案中，該組合物包括鼠尾草酸作為唯一的多酚與一種或多種類胡蘿卜素，該類胡蘿卜素選自由番茄紅素(純化的或者包含在番茄提取物中的)、葉黃素和胡蘿卜素組成的組。在其他優(yōu)選實施方案中，該唯一的多酚成分選自由槲皮素、白藜蘆醇和沒食子酸組成的組。給需要這種治療的受試者施用的組合物中的每種活性劑的優(yōu)選日用量如下鼠尾草酸0· 5到30mg番茄紅素0. 5到30mg葉黃素0·5 到 30mgβ -胡蘿卜素0. 5 到 30mg更優(yōu)選地，每種前述活性劑的日用量在1到5mg的范圍內(nèi)。每種不同活性成分的用量可選擇其重量比在如下的寬范圍內(nèi)番茄紅素葉黃素β -胡蘿卜素鼠尾草酸0. 1-5. 0 0. 1-5. 0 0. 1-5. 0 0. 1-5. 0在組合物的一個優(yōu)選組中，活性成分可以如下重量比范圍組合番茄紅素葉黃素β -胡蘿卜素鼠尾草酸0.1-1.0 0.1-1.0 0. 1-1. 0 0. 1-1. 0在一個優(yōu)選實施方案中，活性成分可以如下比例組合番茄紅素葉黃素β -胡蘿卜素鼠尾草酸1.0 1.0 1. 0 0. 5在另一個優(yōu)選實施方案中，活性成分可以如下比例組合番茄紅素葉黃素β -胡蘿卜素鼠尾草酸1.0 0. 3 0. 3 0. 4在另一優(yōu)選的實施方案里，活性成分可以如下比例組合番茄紅素葉黃素β -胡蘿卜素鼠尾草酸1.0 1.0 1.0 1.0應(yīng)注意到，根據(jù)前述實施方案的優(yōu)選重量比制備的組合物不要求所列出的四種成分必須全部存在。相反，對于該組合物來說，包括鼠尾草酸(或者另一種多酚)與至少兩種所指類胡蘿卜素是足夠的，其中每種這些成分的相對用量根據(jù)上文直接提供的數(shù)據(jù)指示。在另一組優(yōu)選實施方案中，活性成分可以如下重量比例范圍組合番茄紅素葉黃素β -胡蘿卜素鼠尾草酸0. 1-1. 0 0. 1-5. 0 0. 1-1. 0 0. 1-1. 0更優(yōu)選地，活性成分可以如下重量比例范圍組合
番茄紅素葉黃素日-胡蘿卜素鼠尾草酸
0. 1-1. 0 1.0-4.0 0. 1-1. 0 0. 1-1. 0
在具體的優(yōu)選實施方案中，活性成分可以如下重量比例組合
番茄紅素葉黃素鼠尾草酸
0. 1 1. 73 0. 13
番茄紅素葉黃素鼠尾草酸0094]01:1」^ 0 260095]旦-胡蘿、素葉:黃素鼠尾草0096]0.29 1.290.10097]旦-胡蘿、素葉:黃素鼠尾草0098]0.39 1.290.10099]旦-胡蘿、素葉:黃素鼠尾草0100]0.32 3.420.10101]旦-胡蘿、素葉:黃素鼠尾草0102]0.16 1.710.10103]旦-胡蘿、素葉:黃素鼠尾草0104]0.29 1.290.10105]旦-胡蘿、素葉:黃素鼠尾草0106]0.39 1.290.1
0107] 各活性成分可配制成系統(tǒng)或者局部用途。對于系統(tǒng)給藥而言，多酚和類胡蘿卜素 可摻入到ロ服劑型中，例如片劑、囊片劑、膠囊劑、糖漿劑、酏劑、液體劑型等。在其他優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的組合物可局部給藥，例如皮膚或者粘膜上(例 如作為乳膏、乳液、軟膏等)。將本發(fā)明的含多酚和類胡蘿卜素的組合物摻入到各種不同 劑型中的合適方法的更多細(xì)節(jié)可從任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)參考工具書獲得，例如 Remington' s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co，Easton，Pa，USA(1980)。在其他優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的組合物制成適合直接摻入到食物或者飲料中 的食品添加剤。用于制備本發(fā)明的組合物的鼠尾草酸可從多個不同的供應(yīng)商通過商業(yè)獲得，所述 供應(yīng)商包括Alexis Biochemicals, Lausen, Switzerland。類胡蘿卜素從多個不同的供應(yīng) 商獲得，所述供應(yīng)商包括 LycoRed Ltd.，Be' er Sheva, Israel.?；蛘?，組合物的某些成分，例如番茄紅素可以以富集番茄紅素的番茄提取物的形 式摻入到所述的組合物中。一種該番茄提取物是可從LycoRed Ltd. , Beer Sheva, Israel
商業(yè)購買的，商品名為“Lyc-0-Mato ”。制備這種提取物或類似提取物的合適方法描述 在US5，837，311中，其說明書的整體內(nèi)容并入本發(fā)明作為參考。然而，應(yīng)該認(rèn)識到，很多其 它類型的制備方法可用于從各種植物資源獲得含類胡蘿卜素的組合物。另外，該組合物也 可由ー種或多種合成類胡蘿卜素制備而成。下列實施例僅僅是為舉例說明目的提供，并且目的是更具體地解釋和描述本發(fā) 明。但是，本發(fā)明不局限于這些實施例中公開的具體實施方案。0087]
0088]
0089]
0090]
0091]
0092]
0093]
實施例1iSi寸·輔身髓、#■德口 β-古膀__中會目鐘_丨_草印策M 胞中NO、TNF- α和PGE2的產(chǎn)牛方法和材料巨噬細(xì)胞的分離和細(xì)胞接著——腹膜巨噬細(xì)胞從6-8周齡雄性ICR鼠(Harlan， Israel)的腹膜腔收集，其中該ICR鼠已經(jīng)在收集前4天經(jīng)腹膜內(nèi)注射1. 5毫升巰基乙酸培養(yǎng)基(thioglycollate broth) (4% ) 0腹膜巨噬細(xì)胞用PBS洗滌三次，如果需要，進行低滲溶解紅細(xì)胞，產(chǎn)生90-95%的純度。該巨噬細(xì)胞使用FITC綴合的鼠抗鼠F4/80(MCA497F) (Serotec, Oxford, England),FACS (Becton Dickinson, Mountain View, CA) ±白勺夕1 動顯微熒光測定法進行FACS分析鑒定。對于每個樣品，分析了 10，000個光散射門控(light scatter-gated)的活細(xì)胞。腹膜巨噬細(xì)胞和鼠巨噬細(xì)胞系7在包含10 % FCS、 2mLL-谷氨酸；100U/ml 青霉素；100 μ g/ml 鏈霉素(Beit-Haemek，Israel)的 RPMI 1640 培養(yǎng)基中在96孔板中(IXlO6細(xì)胞/孔)在37°C下5%C02氣氛中培養(yǎng)。細(xì)胞在有或沒有鼠尾草酸和/或一種或多種下列類胡蘿卜素存在下用LPS(0. 1-1 μ g/ml)刺激鼠尾草酸、純化的番茄紅素、富集番茄紅素的番茄提取物(LyC-0-MatO ; LycoRed Ltd. ,Be' er Sheva, Israel)、葉黃素和β -胡蘿卜素。將鼠尾草酸和各種類胡蘿卜素溶于DMSO中(終濃度5mM)。將該混合物渦旋并在 37°C水浴中培養(yǎng)(振搖)10分鐘，然后在超聲儀中超聲3次，每次15秒鐘。用這種儲備液， 通過向溫?zé)岬呐囵B(yǎng)基中添加合適的體積配制希望的濃度。溶液中番茄紅素的濃度在提取后按如下確定將0.5ml異丙醇+含有0.025% BHT 的1.5己烷/ 二氯甲烷(1 5V/V)加入到在預(yù)熱的培養(yǎng)基中濃度為20uM而新配制的Iml 的番茄紅素溶液中。渦旋該溶液，通過3000rpm離心10分鐘分離各相。用光譜分析進行測量番茄紅素的含量(吸收峰在471nm)。合適體積的DMS0(0. 1-0. 2% )加入到對照中，計算每根試管相對于對照的百分比抑制率。NO的產(chǎn)生分析——在細(xì)胞培養(yǎng)的上清液中NO的水平采用格里斯試劑(Griess) 和亞硝酸鈉作為標(biāo)準(zhǔn)品通過分析亞硝酸鹽的水平來確定，如Green，L. C，Wagner, D. Α. , Glogowski, J. , Skipper, P. L. , ffishnok, J. S. , andTannenbaum, S. R. (1982) Anal Biochem. 126 :131-138.所述。PGE2的測定一收集靜息細(xì)胞并刺激細(xì)胞的上清液并且立即儲存在-70°C。PGE2 水平通過利用如前所述的葡聚糖覆蓋活性炭(charcaol)放射免疫分析法進行了確定 (Dror N, Tveria L, Meniv I, Ben-Shmuel S, Filipovich T, Fleisher-Berkovich S., Regul" Pept. 2008 150:21-5)。簡言之，100μ1 樣品或者 PGE2I^準(zhǔn)品(Sigma Israel, Rehovot, Israel)在 500 μ 1 抗PGE2抗血清(Sigma Israel, Rehovot, Israel)存在下孵育30分鐘。接著在4°C下加入 [3HjPGE2 (Amersham Biosciences, NJ, USA)保持 Mh。Mh 后，向每個試管中加入 200 μ 1 的冷葡聚糖覆蓋活性炭懸浮液，并在冰上孵育10分鐘。試管在4°C下以3500rpm離心15分鐘。對500 μ 1包含[3H]PGE2-抗-PGE2復(fù)合物的上清液進行計數(shù)，并計算PGE2的量。TNF-α 的產(chǎn)生分析——用 ELISA 試劑盒(Biolegend Inc.，San Diego, CA)定量TNF-α的濃度。統(tǒng)計分析——數(shù)據(jù)以平均值士SEM表示。組之間比較的統(tǒng)計顯著性用Mudent' s 配對的雙尾t檢驗法確定。MM圖 1通過番茄紅素或者Lycomato與鼠尾草酸的組合對NO的產(chǎn)生的劑量依賴性協(xié)同抑制作用。單獨用鼠尾草酸或者類胡蘿卜素分別獲得的結(jié)果如下番茄紅素或者Lycomato 在1-5 μ M范圍內(nèi)引起低水平的NO的產(chǎn)生抑制率。鼠尾草酸(1和2μΜ)分別引起12%和 18%的NO的產(chǎn)生抑制率。把鼠尾草酸加入到番茄紅素或者Lycomato中引起劑量依賴的NO的產(chǎn)生的協(xié)同抑制作用。鼠尾草酸與Lycomato的組合比純化的番茄紅素更有效。圖1代表的結(jié)果是10個獨立實驗一式兩份(duplicate)的平均值士SEM。圖 2a通過兩種成分的最佳低濃度組合抑制NO的產(chǎn)生番茄紅素或者Lycomato與鼠尾草酸，葉黃素和胡蘿卜素。1 μ M番茄紅素或Lycomato與2 μ M鼠尾草酸的組合引起對NO的產(chǎn)生的顯著協(xié)同抑制作用，與番茄紅素相比，當(dāng)存在Lycomato時更有效。1 μ M番茄紅素或者Lycomato與1 μ M葉黃素或者2 μ M β -胡蘿卜素的組合分別弓丨起對NO的產(chǎn)生的疊加作用或者無顯著的協(xié)同抑制作用。番茄紅素或者Lycomato與鼠尾草酸的組合(即類胡蘿卜素與多酚的組合)比兩種類胡蘿卜素的組合更有效。圖 2b通過番茄紅素或者Lycomato與兩種其它成分的最佳低濃度組合抑制NO的產(chǎn)生。番茄紅素或者Lycomato與鼠尾草酸和葉黃素的組合或者與鼠尾草酸和β -胡蘿卜素的組合(濃度與用來產(chǎn)生如圖加所示結(jié)果相同)引起顯著和相似的對NO的產(chǎn)生的協(xié)同抑制作用，而不含鼠尾草酸的組合只引起疊加作用(用橢圓形虛線標(biāo)明)。四種成分的組合(即番茄紅素或者Lycomato與鼠尾草酸、葉黃素和β -胡蘿卜素)相對于三種成分的組合并沒有改進。圖 2C不含番茄紅素或者Lycomato的鼠尾草酸與類胡蘿卜素的組合。葉黃素或者β-胡蘿卜素與鼠尾草酸的組合引起對NO的產(chǎn)生的顯著的和相似的協(xié)同抑制作用(類似于番茄紅素與鼠尾草酸的組合，但比Lycomato與鼠尾草酸組合觀察到的低)。葉黃素和β-胡蘿卜素的組合引起疊加的(或者更低的)效果。這些結(jié)果進一步支持為了獲得最佳的協(xié)同效應(yīng)，類胡蘿卜素和多酚都是需要的。該結(jié)果是3個獨立實驗一式兩份的平均值士SEM。圖 3上圖通過番茄紅素與鼠尾草酸、葉黃素和胡蘿卜素的最佳低濃度的不同組合抑制TNF-α的產(chǎn)生。
與NO的產(chǎn)生相比，在與圖2相同的一組實驗中，TNF-α的產(chǎn)生并不敏感，因為單獨使用時(即不與其他試劑組合)這些試劑沒有一個引起任何可檢測的抑制產(chǎn)生TNF-α的作用。番茄紅素與鼠尾草酸或者與β -胡蘿卜素的組合對產(chǎn)生TNF-α引起低水平的協(xié)同抑制作用分別為10%和8%。類似于對NO的產(chǎn)生的作用，番茄紅素與鼠尾草酸和葉黃素的組合或者與鼠尾草酸和胡蘿卜素的組合對TNF-α的產(chǎn)生引起顯著的和相似的協(xié)同抑制作用，其比不含鼠尾草酸的組合所引起的協(xié)同抑制作用高。鼠尾草酸與所有三種類胡蘿卜素的組合對前述鼠尾草酸與兩種類胡蘿卜素的組合獲得的協(xié)同結(jié)果沒有改進。下圖通過Lycomato與鼠尾草酸、葉黃素和β -胡蘿卜素的最佳低濃度的不同組合抑制TNF-α的產(chǎn)生。在Lycomato存在下，TNF- α的產(chǎn)生得到抑制(10% )(與在番茄紅素存在下缺乏可檢測的抑制形成對比)。Lycomato與每種其它類胡蘿卜素的組合引起比在鼠尾草酸存在下更高的協(xié)同抑制作用。類似于對NO的產(chǎn)生的影響，Lycomato與鼠尾草酸和葉黃素的組合或者與鼠尾草酸和胡蘿卜素的組合引起顯著的和類似的對TNF-α產(chǎn)生的協(xié)同抑制作用，而不含鼠尾草酸的組合引起較小的協(xié)同作用。如純化的番茄紅素的情況，鼠尾草酸與所有三種類胡蘿卜素的組合對前述鼠尾草酸與兩種類胡蘿卜素的組合獲得的協(xié)同結(jié)果并沒有改進。該結(jié)果是3個獨立實驗一式兩份的平均值士SEM。應(yīng)注意，包括Lycomato的組合在抑制TNF-α產(chǎn)生方面與摻入純化的番茄紅素的組合相比更有效。圖 4通過番茄紅素與鼠尾草酸、葉黃素和β -胡蘿卜素的最佳低濃度的不同組合抑制 PGE2的產(chǎn)生。當(dāng)單獨使用時，在與圖2中報告的相同一組實驗中，與NO的產(chǎn)生相比，PG&的產(chǎn)生對鼠尾草酸或者胡蘿卜素更敏感(每種大約20%的抑制率)。番茄紅素與葉黃素、鼠尾草酸或者β -胡蘿卜素的組合引起協(xié)同抑制PGE2的產(chǎn)生。低水平協(xié)同抑制作用只在使用Lycomato與葉黃素和鼠尾草酸的組合中檢測到， 而與鼠尾草酸和胡蘿卜素的組合只引起疊加效應(yīng)。與葉黃素和胡蘿卜素的組合引起疊加性抑制PGE2的產(chǎn)生。從圖4也可知，四種試劑(鼠尾草酸加三種類胡蘿卜素)的組合并沒有改進鼠尾草酸與兩種類胡蘿卜素的組合。圖 5a通過番茄紅素與鼠尾草酸、葉黃素和β -胡蘿卜素的最佳低濃度的不同組合抑制 PGE2的產(chǎn)生。如已經(jīng)在圖4顯示的，圖fe的上圖顯示鼠尾草酸或者β-胡蘿卜素(每種獨立使用)引起高水平抑制PGE2的產(chǎn)生(每種的抑制率大約20% )。番茄紅素與葉黃素、鼠尾草
12酸或者胡蘿卜素的組合引起協(xié)同抑制PGE2的產(chǎn)生。低水平的協(xié)同抑制作用只在番茄紅素與葉黃素和鼠尾草酸的組合的情況下檢測到，而與鼠尾草酸和胡蘿卜素的組合只引起疊加作用。包含葉黃素和胡蘿卜素的組合引起疊加性抑制產(chǎn)生。因此，研究了低濃度(如圖fe下圖所示，在下文中討論)。全部四種活性劑(即鼠尾草酸加三種類胡蘿卜素)的組合并不改進鼠尾草酸與兩種類胡蘿卜素的組合。通過鼠尾草酸、葉黃素和β -胡蘿卜素的最佳低濃度的不同組合協(xié)同抑制PGE2的產(chǎn)生(下圖)葉黃素(0.5μΜ)和β-胡蘿卜素(ΙμΜ)都不能單獨影響PGE2的產(chǎn)生，而鼠尾草酸(ΙμΜ)引起10%的抑制率。在這些條件下，番茄紅素ImM與低濃度的兩種其他成分中的任一種的組合引起協(xié)同抑制作用。所有四種活性劑的組合并不改進三種的組合。圖 5b通過Lycomato與鼠尾草酸、葉黃素和β-胡蘿卜素的最佳低濃度的不同組合抑制 PGE2的產(chǎn)生。上圖顯示Lycomato對抑制PGE2的產(chǎn)生的影響類似于純的番茄紅素，以及相似組合物得到如番茄紅素所顯示的類似效果(圖fe上圖)。通過Lycomato與鼠尾草酸、葉黃素和β-胡蘿卜素的最佳低濃度的不同組合協(xié)同抑制PG&的產(chǎn)生(下圖)。如圖fe所示，葉黃素(0. 5 μ M)和β -胡蘿卜素(1 μ M)單獨都不能影響PGE2的產(chǎn)生，而鼠尾草酸(ΙμΜ)引起10%的抑制率。與β-胡蘿卜素的組合是疊加作用，而與葉黃素或者與鼠尾草酸的組合是協(xié)同作用并且比純化的番茄紅素獲得的結(jié)果高得多(圖如)。 Lycomato與鼠尾草酸和葉黃素的組合或者與鼠尾草酸和β -胡蘿卜素的組合引起顯著的和類似的協(xié)同抑制PGE2的產(chǎn)生。葉黃素和β -胡蘿卜素的組合(不含鼠尾草酸)引起低水平的協(xié)同抑制作用。在這些濃度下，Lycomato與葉黃素和鼠尾草酸的組合引起的協(xié)同抑制作用比使用純化的番茄紅素的組合所產(chǎn)生的結(jié)果高得多。所有四種活性劑的組合(即鼠尾草酸和三種類胡蘿卜素)并沒有改進鼠尾草酸與兩種類胡蘿卜素的組合。圖 6通過葉黃素、β -胡蘿卜素和鼠尾草酸的組合協(xié)同抑制NO的產(chǎn)生。上面兩幅圖(Α和B)說明所測試的組合物的三種成分之間在NO產(chǎn)生方面的協(xié)同相互作用，其中β-胡蘿卜素的終濃度是0.5μΜ。與此類似，包含更高濃度β-胡蘿卜素 (1. 0 μ M ；圖C和D)的組合物也以協(xié)同方式引起抑制NO的產(chǎn)生。在圖6代表的每幅圖中，該三種成分組合物所對應(yīng)的條形圖中，水平線表示如果每種所述成分的作用是疊加的話可預(yù)期的NO的抑制水平。觀察到的抑制水平極大地增加 (條形圖水平線以上的面積，記為“S”)，表明組合物的三種成分協(xié)同地發(fā)揮作用。圖 7通過葉黃素、β -胡蘿卜素和鼠尾草酸的組合協(xié)同抑制TNFa的產(chǎn)生。上面兩幅圖(A和B)說明所測試組合物的三種成分之間對TNF α的產(chǎn)生的協(xié)同相互作用，其中胡蘿卜素的終濃度是0.5μΜ。與此類似，包含更高濃度胡蘿卜素 (1.(^11;圖(和0)的組合物也以協(xié)同方式引起抑制TNF α的產(chǎn)生。在圖7代表的每幅圖中，該三種成分組合物所對應(yīng)的條形圖中，水平線表示如果每種所述成分的作用是疊加的話可預(yù)期的TNF α的抑制水平。觀察到的抑制水平極大地增加(條形圖水平線以上的面積，記為“S”)，表明組合物的三種成分協(xié)同地發(fā)揮作用。實施例2
牛，該多酚詵自由鼠尾草酸、沒食子酸、白藜蘆醇和槲皮素組成的組方法和材料巨噬細(xì)胞的分離和細(xì)胞培養(yǎng)——腹膜巨噬細(xì)胞按上文中實施例1所述收集和培養(yǎng)。試驗試劑的制備——將番茄紅素和葉黃素溶于DMSO中(在測試液中DMSO的體積不超過0. 04%)。將該混合物渦旋并在37°C振動10分鐘，在超聲浴中超聲15秒X 3次。通過加入合適體積的溫?zé)崤囵B(yǎng)基從此儲備溶液中獲得需要的濃度。該溶液的濃度通過計算為向Iml的最高終濃度加入0.5ml異丙醇+1.5ml含0.025 % BHT的己烷/ 二氯甲烷(1 5V/ V)。該溶液進行渦旋作用，通過3000rpm離心10分鐘分離各相。引入光譜分析以檢測營養(yǎng)物水平。將鼠尾草酸、白藜蘆醇、沒食子酸或者槲皮素溶于乙醇(測試溶液中乙醇的體積不超過 0. 0025% )。將合適體積的DMSO和/或乙醇加入到對照中，計算每根試管相對于其對照管的抑制百分比。NO產(chǎn)生分析——細(xì)胞培養(yǎng)的上清液中NO的水平通過使用如上述實施例1所述的格里斯試劑和亞硝酸鈉分析亞硝酸鹽的水平而確定。統(tǒng)計分析——數(shù)據(jù)用平均值士SEM代表。比較各組之間的統(tǒng)計學(xué)顯著性使用 Student ‘ s配對雙尾t檢驗法確定。結(jié)果圖 8A.通過番茄紅素、葉黃素和每種不同的多酚的低濃度組合協(xié)同抑制NO的產(chǎn)生將巨噬細(xì)胞與IyM番茄紅素、ΙμΜ葉黃素以及選自2 μ M鼠尾草酸、2 μ M白藜蘆醇、2 μ M沒食子酸或者2 μ M槲皮素或其組合中的任一種一起在37°C孵育1小時，然后加入 LPS保持16小時。測量NO的產(chǎn)生并計算抑制百分比。分析每個實驗中三種不同濃度的LPS 的影響，因為在不同實驗中細(xì)胞敏感性可能發(fā)生改變。1 μ M番茄紅素、1 μ M葉黃素與2 μ M的鼠尾草酸、白藜蘆醇、沒食子酸或者槲皮素中的任一種的組合，引起顯著的協(xié)同抑制NO的產(chǎn)生(圖中以字母“S”標(biāo)明，其中與代表協(xié)同組合物的每個柱形圖相交叉的水平線代表，如果相互作用是疊加而不是協(xié)同的話時的可預(yù)期的結(jié)果)。每種這些不同組合沒有明顯的不同。如圖所示，在給定濃度測試的每種類胡蘿卜素或者多酚的作用都非常低。如每個圖的水平線所示，協(xié)同作用是疊加作用的大約 3倍尚。B.通過Lyc-0-Mato、葉黃素和每種不同的多酚的低濃度組合協(xié)同抑制NO的產(chǎn)生。巨噬細(xì)胞如A進行處理，但實驗采用Lyc-O-Mato代替番茄紅素進行。
雖然Lyc-O-Mato本身引起與番茄紅素所引起的相似的抑制NO產(chǎn)生的作用，但與 Lyc-O-Mato組合更有效，與疊加作用相比，結(jié)果產(chǎn)生大約四倍的更高的協(xié)同作用。如圖8所示的結(jié)果表示三個不同實驗一式三份的平均值士SEM。實施例3赫 Lvc-0-Mato身·、β -古膀喻口 ■雜白_中船· 制巨噬細(xì)胞中LPS誘導(dǎo)的超氧化物產(chǎn)牛方法和材料巨噬細(xì)胞分離腹膜巨噬細(xì)胞按上述實施例1進行分離和處理。超氧化物的產(chǎn)生巨噬細(xì)胞超氧化物陰離子(02_)的產(chǎn)生通過如現(xiàn)有技術(shù)已知的微量滴定板技術(shù)，以測量超氧化物歧化酶對高鐵細(xì)胞色素c的可抑制性還原而進行了測定。取用于粘附測定的放射性標(biāo)記的巨噬細(xì)胞的等份(5X105細(xì)胞/孔)懸浮在100 μ 1 含高鐵細(xì)胞色素c的培養(yǎng)基(150mM)中。用PMA(50ng/ml)誘導(dǎo)刺激。以在Thermomax Microplate Reader (Molecular Devices, Melno Park, Calif.，USA)上以 2 分鐘間隔持續(xù) 30分鐘的在550nm的吸收度變化來跟蹤高鐵細(xì)胞色素c的還原。測定超氧化物生成的最大速率并以納摩爾仏_/106細(xì)胞/10分鐘表示，使用消光系數(shù)= ZlmT1CmAMM 圖 9上圖(A)通過純化的番茄紅素與鼠尾草酸、葉黃素或者胡蘿卜素的最佳低濃度的不同組合抑制超氧化物的產(chǎn)生。超氧化物的產(chǎn)生在2μ M β-胡蘿卜素存在的情況下被抑制(10% )。番茄紅素與鼠尾草酸或者與胡蘿卜素的組合引起低水平抑制超氧化物的產(chǎn)生，與胡蘿卜素的作用無顯著性差異。類似于對NO的產(chǎn)生的作用(見上文的實施例1)，番茄紅素與鼠尾草酸和葉黃素的組合，或者與鼠尾草酸和胡蘿卜素的組合引起顯著的和類似的協(xié)同抑制超氧化物的產(chǎn)生，其比不含鼠尾草酸的組合引起的協(xié)同抑制作用更高。鼠尾草酸與所有三種類胡蘿卜素的組合并沒有改進鼠尾草酸與兩種類胡蘿卜素的前述組合獲得的協(xié)同作用結(jié)果。下圖(B)通過Lyc-O-Mato與鼠尾草酸、葉黃素或者β -胡蘿卜素的最佳低濃度的不同組合抑制超氧化物的產(chǎn)生。超氧化物的產(chǎn)生在Lyc-O-Mato存在下被抑制(7% )(和在番茄紅素存在下缺乏可檢測的抑制形成對比)。Lyc-O-Mato與每種其它類胡蘿卜素的組合引起低水平抑制超氧化物的產(chǎn)生，其與β -胡蘿卜素或者Lyc-O-Mato的作用相比無顯著性差異。類似于對NO的產(chǎn)生的作用(見上文的實施例1)，Lyc-O-Mato與鼠尾草酸和葉黃素，或者與鼠尾草酸和胡蘿卜素的組合引起顯著的和類似的協(xié)同抑制超氧化物的產(chǎn)生，而不含鼠尾草酸的組合引起的協(xié)同抑制作用較低。在純化的番茄紅素的情況下，鼠尾草酸與所有三種類胡蘿卜素的組合并不改進鼠尾草酸與兩種類胡蘿卜素的前述組合獲得的協(xié)同作用結(jié)果。該結(jié)果是三個獨立實驗一式兩份的平均值士SEM。實施例4
誦i寸番茄紅素或者Lvc-O-Mato與Π十昔素和鼠尾草酸的各種_合抑制LPSi秀導(dǎo)的細(xì)胞核裂解物中536位絲氨酸的D65-NFkB磷酸化與iNOS和C0X2的ιΗ調(diào)節(jié) (up-reRulation)1U炎癥細(xì)胞因子的表達和酶蛋白的表達可通過激活轉(zhuǎn)錄因子細(xì)胞核因子 KB(NFKB)來調(diào)節(jié)，其在慢性炎癥疾病的發(fā)病機理的幾個方面中發(fā)揮重要作用。激活 NFKB是磷酸化、泛素化、和隨后通過I κ B激酶(IKK)的活化而蛋白水解降解I κ B蛋白的結(jié)果。釋放的NF κ B轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核(nuclei)，并結(jié)合于促炎基因例如可誘導(dǎo)氧化氮合酶 (iNOS)和環(huán)氧合酶2(C0X2)、TNF-a和IL-I β的啟動子的基序(motifs)，誘導(dǎo)它們的mRNA 表達。大多數(shù)抗炎藥已顯示通過抑制NF κ B激活途徑抑制這些基因的表達。因此，NFK B抑制劑可用作潛在的治療藥物，在臨床上用于調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)的人類疾病。p65NF κ B RelA可在絲氨酸_276上通過PKA而磷酸化，或者在絲氨酸_536上通過氧化還原敏感機制而磷酸化。已經(jīng)顯示活性氧類(R0Q在NF-κ B激活和炎癥基因表達中起重要作用。本項研究的目的是調(diào)查番茄紅素/Lyc-O-Mato+葉黃素+鼠尾草酸的低濃度組合是否能引起協(xié)同抑制NFk B的激活。NF κ B激活通過其兩種磷酸化形式進行分析ΡΚΑ依賴的絲氨酸_276和氧化還原敏感的絲氨酸-536。巨噬細(xì)胞的分離腹膜巨噬細(xì)胞按上文所述實施例1分離和處理。為了檢測NF- κ B的激活，用LPS處理該細(xì)胞10分鐘。核蛋白提取物的制備——將2 X IO6細(xì)胞懸浮在600 μ 1冰冷卻的ΝΡ-40裂解緩沖液中(0. ΝΡ-40，IOmM Tris-HCl，pH 7. 4, IOmM NaCl, 3mMMgCl2, ImM EDTA，10 μ g/ml 亮抑蛋白酶肽(Ieup印tin)，10 μ g/ml抑肽酶(aprotonin)和ImM PMSF)。該細(xì)胞渦旋15s， 保存在冰上5分鐘，和在4°C下以300克離心10分鐘。然后將得到的沉淀(含細(xì)胞核的級分)立即用電泳樣品緩沖液溶解，通過光學(xué)顯微鏡直接鑒定細(xì)胞核的完整性，其也揭示出該含細(xì)胞核的級分中很少觀察到完整的細(xì)胞(< 2% )?？偧?xì)胞裂解物用Triton X_100，50mM HEPES (pH 7. 5)，150mMNaCl, ImM EDTA, ImM EGTA，10% 甘油，25mM NaF, 10 μ M ZnCl2, ImMPMSF 和 100 μ M 亮抑蛋白酶肽制備。免疫印跡分析通過在7. 5%聚丙烯酰胺SDS凝膠上電泳分離而得到裂解蛋白 (lysae proteins) (35-50 μ g)。溶解的蛋白質(zhì)用電泳轉(zhuǎn)移到硝化纖維上，其用Ponsue紅染色以檢測蛋白質(zhì)譜帶，然后在5%牛奶(milk)的TBS溶液中(IOmM Tris, 135mM NaCl, pH 7.4)封閉。免疫印跡測定按前述方法(17)進行，采用第一抗體？寸65、0 -2和丨而5((^11 Signaling Technology,Beverly,ΜΑ)在4°C孵育過夜，以及第二抗體、超氧化物酶結(jié)合的山羊抗兔或抗鼠抗體(Amersham Biosciences,Buckinghamshire,United Kingdom)室溫孵育 1小時，并且用增強化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測系統(tǒng)(Amersham Biosciences)顯影。對于P-65的免疫印跡檢測，將2X IO6細(xì)胞的核級分立即溶解在電泳樣品緩沖液中，并且在8% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳上(SDS-PAGE)分離。MM
如圖10中所示，在代表性的免疫印跡分析中，在加入LPS保持10分鐘前，添加 1 μ M番茄紅素或者1 μ M Lyc-O-Mato與1 μ M葉黃素和2 μ M鼠尾草酸的組合到腹膜巨噬細(xì)胞中保持1小時，引起細(xì)胞核裂解物中在536位絲氨酸上p65-NFK B磷酸化的顯著的協(xié)同抑制(大約80%)，而每種營養(yǎng)成分單獨根本沒有作用。在通過密度測定法(densitometry) 定量之后，每個磷酸P-65-NFkB帶的強度除以每個核纖層蛋白(Iamin)帶的強度，并且以任意單位表示。顯示的是三個獨立實驗的平均值士SEM。如免疫印跡中所示，p65NF κ B的276位絲氨酸上沒有被磷酸化。這些結(jié)果證明，測試的類胡蘿卜素-多酚組合物引起顯著的協(xié)同抑制NF κ B激活， 該激活由磷酸化536-絲氨酸介導(dǎo)，其中該磷酸化由氧化還原敏感的機制介導(dǎo)。在相同條件下，在加入LPS的Ih前加入營養(yǎng)物組合(以上文詳述的濃度)保持 Mh，引起顯著的抑制總細(xì)胞裂解物中iNOS和C0X2蛋白的表達(圖11)。每營養(yǎng)物單獨并不引起抑制對iNOS或者C0X2的誘導(dǎo)。在通過密度測定法定量之后，每個蛋白帶(iNOS或者COX^的強度除以每個 β-肌動蛋白(β-actin)帶的強度，并且以任意單位表示。顯示的是三個獨立實驗的平均值 士 SEM。這些結(jié)果證明了協(xié)同抑制兩種炎癥酶的誘導(dǎo)，對于iNOS和C0X2分別為大約80% 和大約60%的水平，并且為上文報告的抑制NO的產(chǎn)生和PGE2的釋放提供支持，以及其分子解釋。盡管本發(fā)明的具體實施方案已經(jīng)為舉例說明目的進行了說明，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明可由所屬領(lǐng)域技術(shù)人員在實踐中進行很多修改、變化和修正，而不背離它的精神或者超出權(quán)利要求的范圍。
權(quán)利要求
1.治療組合物，其包含一種或多種多酚和兩種或多種類胡蘿卜素，該兩種或多種類胡蘿卜素選自由葉黃素、番茄紅素和胡蘿卜素組成的組。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的治療組合物，其中所述一種或多種多酚選自由鼠尾草酸、槲皮素、 白藜蘆醇、沒食子酸、菊苣酸、姜醇和姜黃素組成的組。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的治療組合物，其中該多酚是鼠尾草酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的治療組合物，其中該多酚是槲皮素。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的治療組合物，其中該多酚是白藜蘆醇。
6.根據(jù)權(quán)利要求2的治療組合物，其中該多酚是沒食子酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求2的治療組合物，其基本上由番茄紅素、葉黃素和鼠尾草酸組成。
8.根據(jù)權(quán)利要求2的治療組合物，其基本上由葉黃素、β-胡蘿卜素和鼠尾草酸組成。
9.根據(jù)權(quán)利要求2的治療組合物，其基本上由番茄紅素、胡蘿卜素和鼠尾草酸組成。
10.根據(jù)權(quán)利要求7-9中任一項的治療組合物，其中所述的組合物還包括八氫番茄紅ο
11.根據(jù)權(quán)利要求7-9中任一項的治療組合物，其中所述的組合物還包括六氫番茄紅ο
12.根據(jù)權(quán)利要求7-9中任一項的治療組合物，其中所述的組合物還包括八氫番茄紅素和六氫番茄紅素。
13.抑制或者降低哺乳動物受試者中產(chǎn)生超氧化物離子、NO、TNF-α和/或PG&的方法，該方法包括對所述的受試者給予根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項所述的治療組合物。
14.治療病理病癥的方法，所述病理病癥中超氧化物離子、N0、TNF-α和/或PGE2作為需要這種治療的哺乳動物受試者中該病理病癥的調(diào)節(jié)物或者介質(zhì)，其中所述的方法包括對所述受試者給予根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項的治療組合物。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的治療方法，其中所要治療的病癥是炎性病癥。
16.根據(jù)權(quán)利要求14的治療方法，其中所要治療的病癥為選自由下列病癥組成的組 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)、哮喘、鼻炎、特發(fā)性肺纖維化、腹膜炎、心血管炎、心肌缺血、再灌注損傷、動脈粥樣硬化、膿毒病、創(chuàng)傷、II型糖尿病、視網(wǎng)膜病、牛皮癬、 胃腸炎癥、肝硬化、腹膜炎和炎性腸疾病、以及神經(jīng)變性疾病，包括阿爾茨海默病。
17.根據(jù)權(quán)利要求13至16中任一項的方法，其中該哺乳動物受試者是人受試者。
18.根據(jù)權(quán)利要求13至16中任一項的方法，其中該治療組合物以藥物劑型給藥。
19.根據(jù)權(quán)利要求13至16中任一項的方法，其中該治療組合物加入到食物或者飲料中。
20.一種或多種多酚和兩種或多種類胡蘿卜素的組合在制造用于治療對抑制超氧化物離子、NO、TNF-α和/或PGE2的產(chǎn)生有反應(yīng)的病癥的藥物中的用途，該兩種或多種類胡蘿卜素選自由葉黃素、番茄紅素和胡蘿卜素組成的組。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的用途，其中所述一種或多種多酚選自由鼠尾草酸、槲皮素、白藜蘆醇、沒食子酸、菊苣酸、姜醇和姜黃素組成的組。
22.根據(jù)權(quán)利要求20的用途，其中該多酚是鼠尾草酸。
23.根據(jù)權(quán)利要求20的用途，其中該多酚是槲皮素。
24.根據(jù)權(quán)利要求20的用途，其中該多酚是白藜蘆醇。
25.根據(jù)權(quán)利要求20的用途，其中該多酚是沒食子酸。
26.根據(jù)權(quán)利要求20的用途，其中該病癥是炎性病癥。
27.根據(jù)權(quán)利要求20的用途，其中所要治療的病癥選自由下列病癥組成的組類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)、哮喘、鼻炎、特發(fā)性肺纖維化、腹膜炎、心血管炎、心肌缺血、再灌注損傷、動脈粥樣硬化、膿毒病、創(chuàng)傷、II型糖尿病、視網(wǎng)膜病、牛皮癬、胃腸炎癥、肝硬化、腹膜炎和炎性腸疾病、以及神經(jīng)變性疾病，包括阿爾茨海默病。
28.根據(jù)權(quán)利要求20的用途，其中鼠尾草酸與番茄紅素和葉黃素組合使用。
29.根據(jù)權(quán)利要求20的用途，其中鼠尾草酸與番茄紅素和胡蘿卜素組合使用。
30.根據(jù)權(quán)利要求20的用途，其中鼠尾草酸與葉黃素和胡蘿卜素組合使用。
全文摘要
本發(fā)明提供治療組合物，其包括一種或多種多酚和兩種或多種選自由葉黃素、番茄紅素和β-胡蘿卜素組成的組的類胡蘿卜素。本發(fā)明也提供抑制或者降低哺乳動物受試者中產(chǎn)生超氧化物離子、NO、TNF-α和/或PGE2的方法，該方法包括對所述的受試者給予前述治療組合物。
文檔編號A61K31/015GK102355894SQ201080012356
公開日2012年2月15日 申請日期2010年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月19日
發(fā)明者E.帕蘭, J.利維, M.澤爾卡, R.利維, Y.沙羅尼 申請人:利科雷德有限公司