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恒河猴爆發(fā)性肝功能衰竭模型的建立的制作方法

文檔序號:858081閱讀:347來源:國知局
專利名稱:恒河猴爆發(fā)性肝功能衰竭模型的建立的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種恒河猴爆發(fā)性肝功能衰竭模型的制備方法。
背景技術(shù)
急性肝衰竭(fulminant hepatic failure, FHF)臨床常見,多由病毒感染、廣泛肝組織切除、急性藥物或毒物損傷等引起,其基本病理改變?yōu)楦螌嵸|(zhì)細胞大片狀變性壞死。 病人預(yù)后兇險,死亡率非常高。除肝移植外,尚無更好的辦法對其進行治療。受限于供器官的嚴重短缺,細胞移植(成熟肝細胞或干細胞移植)、生物人工肝、組織工程肝等成為當前研究熱點,但其有效性多是在小動物(基本上都是大鼠)上獲得。促進肝細胞再生也是當前研究熱點,但遠未取得讓人滿意的進展,尚未找到能短期內(nèi)顯著促進肝細胞再生的理想藥物。大動物,尤其是靈長類動物的實驗數(shù)據(jù)極為缺乏,制約了這些新的治療方案向臨床過度。建立最接近于人類的靈長類動物AHF模型(急性肝功能衰竭(acute hepatic failure, AHF)),用以評估這些新的治療方法的有效性和安全性,是將其最終應(yīng)用于臨床治療的必經(jīng)途徑。目前爆發(fā)性肝功能衰竭治療研究最常用模型動物是嚙齒類。由于嚙齒類在進化關(guān)系上與人類相距甚遠,以其為研究對象所獲得的實驗數(shù)據(jù)對臨床指導(dǎo)意義不大。所用到的大動物模型僅限于豬和犬,同樣與人存在巨大差異。恒河猴的解剖特點、各系統(tǒng)生理功能及對疾病和治療藥物的反應(yīng)性與人類極為相近,是進行免疫學相關(guān)治療和干細胞移植、異種移植臨床前有效性和安全性評價的敏感動物。利用恒河猴FHF模型評價新型FHF治療藥物, 研究肝臟干細胞或肝細胞移植以及輔助性肝支持措施,如組織工程肝和生物人工肝的治療效果,是國際公認的臨床前實驗體系,對未來這些治療方案的臨床應(yīng)用具有重要的指導(dǎo)意義。因此建立非人靈長類FHF模型成為FHF治療研究和臨床前藥物評價的迫切需要。建立大動物AHF的有以下基本原則(1)可逆性(Reversibility)給予有效治療措施可使動物存活;( 重現(xiàn)性(Iteproducibility):不給予治療,所有動物都將死亡; (3)肝衰竭的致死性(Death from liver failure)肝損傷最終將導(dǎo)致動物死亡;(4)治療窗(Therapeutic window)在動物死亡前有足夠時間給予治療并能評估其療效;(5)大動物模型(Large animal model):能連續(xù)取樣檢測、更接近人類特點;(6)對實驗者無害 (Minimal hazard to personnel)藥品須盡可能對實驗人員無害;(7)接近人的代謝和生理學(Appropriate metabolism/physiology)以便將實驗結(jié)果推廣至人類;(8)動物需有意識(Conscious animal model)用于觀察肝性腦?。?9)符合倫理(Compliance with ethical standards)必須保證實驗動物的福利和倫理規(guī)范。目前肝毒性藥物是建立FHF模型最常用手段。這些藥物包括醋氨酚 (Acetaminophen)、半乳糖野(D-Galactosamine)、硫代乙酷胺(Thioacetamide, TAA) 等。這些藥物誘導(dǎo)的FHF模型均存在各種缺陷,如醋氨酚,其重現(xiàn)性差,相同劑量下動物存活時間差異巨大;伴發(fā)高鐵血紅蛋白血癥、難治性貧血及其他器官損傷。半乳糖酐 (D-Galactosamine)重現(xiàn)性差(死亡率和至死亡的時間差異非常大);費用高(l_2g/kg),不適合在大動物中應(yīng)用。硫代乙酰胺(ThioacetamideJAA)易導(dǎo)致嚴重低血壓、低血糖、低體溫以及腎衰竭,能直接導(dǎo)致神經(jīng)損傷,與肝性腦病無法區(qū)分;對實驗人員有較大毒性。病毒也可誘導(dǎo)FHF發(fā)生,但其復(fù)制困難,生物安全性差。手術(shù)切除全部或大部分肝臟,或完全去血流化,也可建立!FH模型,但由于手術(shù)耗時、創(chuàng)傷大,血流動力學干擾大;除非原位肝移植,否則動物無法存活;肝臟本身并未受到損傷。這類模型適合研究肝移植及肝支持系統(tǒng)。鵝膏蕈堿是有毒蘑菇的主要毒性物質(zhì),為環(huán)肽類生物堿,通過抑制RNA聚合酶造成細胞損傷,其靶器官主要為肝臟和胃腸道。內(nèi)毒素脂多糖為革蘭氏陰性細菌細胞壁主要成分,本身可引起肝細胞損傷。同時,通過激活肝臟內(nèi)單核巨噬細胞,分泌大量炎性介質(zhì),弓丨起肝細胞凋亡。通過門靜脈系統(tǒng)直接給藥,可最大限度降低藥物對其他組織器官的損傷。目前尚未見以大型靈長類動物建立FHF動物模型的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)方案是提供了一種鵝膏蕈堿聯(lián)合內(nèi)毒素脂多糖在制備用于篩選治療爆發(fā)性肝功能衰竭藥物和方法的動物模型中的用途。本發(fā)明的另一技術(shù)方案是提供了恒河猴爆發(fā)性肝功能衰竭模型的建立。本發(fā)明提供了鵝膏蕈堿聯(lián)合內(nèi)毒素脂多糖在制備用于篩選治療爆發(fā)性肝功能衰竭藥物、評價組織工程肝支持系統(tǒng)或肝細胞、干細胞移植治療效果的靈長類動物模型中的用途,其中鵝膏蕈堿的施用劑量為0. lmg/kg,內(nèi)毒素施用劑量為1 μ g/kg。其中,鵝膏蕈堿與脂多糖內(nèi)毒素同時施用,施用方法為單次腹腔滴注。本發(fā)明還提供了一種爆發(fā)性肝功能衰竭動物模型的制備方法,它是將鵝膏蕈堿和脂多糖內(nèi)毒素施用于靈長類動物,鵝膏蕈堿的施用劑量為0. lmg/kg,脂多糖內(nèi)毒素的施用劑量為ι μ g/kg。其中,所述靈長類動物為恒河猴。其中,所述的施用方法為單次腹腔滴注。本發(fā)明還提供了該方法制備得到的爆發(fā)性肝功能衰竭動物模型。本發(fā)明提供了所述的動物模型在篩選治療爆發(fā)性肝功能衰竭的藥物、評價組織工程肝支持系統(tǒng)或肝細胞、干細胞移植治療效果中的應(yīng)用。一種評價組織工程肝支持系統(tǒng)或肝細胞、干細胞移植效果的方法,包括如下步驟a、它是將鵝膏蕈堿聯(lián)合脂多糖內(nèi)毒素施用于靈長類動物,制備爆發(fā)性肝功能衰竭動物模型,鵝膏蕈堿的施用劑量為0. lmg/kg,脂多糖內(nèi)毒素的施用劑量為1 μ g/kg ;b、采用細胞移植或器官移植于該動物模型;C、觀察移植后動物的肝功能影響情況,評價組織工程肝支持系統(tǒng)或肝細胞、干細胞移植效果。其中,a步驟所述靈長類動物為恒河猴。其中,所述的鵝膏蕈堿與脂多糖內(nèi)毒素同時施用,施用方法為單次腹腔滴注。本發(fā)明采用鵝膏蕈堿聯(lián)合內(nèi)毒素脂多糖,通過腹腔給藥,建立恒河猴爆發(fā)性肝功能衰竭模型,本發(fā)明動物模型可以用于嚙齒類動物模型無法完成的生物技術(shù)新藥的評價、以及組織工程肝、生物人工肝和肝細胞、干細胞移植治療技術(shù)的評價。以下通過具體實施方式
對本發(fā)明作進一步的詳細描述,但并不限制本發(fā)明,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明作出各種改變和變形,只要不脫離本發(fā)明的精神,均應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的范圍。


圖1本發(fā)明動物模型給藥前后肝功能、腎功能、心肌酶譜、血淀粉酶、血糖指標的改變。圖IA為谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的改變;圖IB為膽紅素(總膽紅素 TBIL,直接膽紅素DBIL,間接膽紅素IBIL)的改變;圖IC為PT和APTT改變。圖2本發(fā)明動物模型肝臟大體改變。圖2A為正常恒河猴肝臟;圖2B顯示尸檢病變肝臟呈黃色萎縮,肝包膜皺縮,肝邊緣銳利。圖3B為尸檢恒河猴肝臟剖面觀。圖3本發(fā)明動物模型肝組織切片油紅0染色及HE染色。圖3A為給藥后3 活檢油紅0染色,顯示肝細胞嚴重脂肪變;圖:3B為尸檢肝細胞呈大片狀壞死,圖4本發(fā)明動物模型肝臟超聲及超聲增強造影影像學改變。圖示給藥4 后肝臟回聲稍增強,特別是左內(nèi)葉局部區(qū)域,超聲造影可觀察到該區(qū)域呈低灌注,門靜脈血流改變不明顯,肝動脈阻力指數(shù)增高。給藥60h后肝臟實質(zhì)回聲稍增強,彩色多普勒顯示門靜脈流速降低,肝動脈阻力指數(shù)增高。圖5本發(fā)明動物模型肝臟、腦的MRI影像學改變。給藥后24h肝左葉信號稍增高, 提示細胞水腫。給藥后4 肝實質(zhì)信號增高,不均勻。增強減弱區(qū)域增多。給藥后66h,肝實質(zhì)信號不均勻區(qū)增多,廣泛,造影劑攝取不均勻區(qū)增多廣泛,肝膽期信號普遍減低。頭部 MRI提示給藥后4 無明顯異常,給藥后6 彌散圖像顯示出雙側(cè)顳葉、額葉片帶狀異常信號區(qū),提示有超急性期缺血。
具體實施例方式實施例1本發(fā)明動物模型的制備1、材料與方法1.1實驗材料3-4歲雌性和雄性恒河猴3只,無B皰疹病毒、猴逆轉(zhuǎn)錄病毒、猴白血病病毒和免疫缺陷病毒感染;購自成都平安動物繁育基地。1. 2主要試劑鵝膏蕈堿(α-amanitin),購自瑞士Alexis Biochemicals 公司;內(nèi)毒素脂多糖(LPS)購自美國SigmaAldrich公司。其他藥品和耗材均購自華西醫(yī)院利康藥房。1. 3主要溶液的配制鵝膏蕈堿溶液的配制A液取原裝Img/支鵝膏蕈堿粉劑,加入5ml生理鹽水溶解,作為儲存液,4°C短期存放。B液根據(jù)猴體重,按照0. lmg/kg體重,吸取A液稀釋至50ml生理鹽水中,作為工作液。CN 102526034 A
內(nèi)毒素脂多糖溶液的配制A液秤取脂多糖100 μ g,溶解于Iml生理鹽水,作為儲存液,4°C短期存放。B液根據(jù)猴體重,按照1 μ g/kg體重,吸取A液,稀釋至鵝膏蕈堿工作液中。工作液現(xiàn)用現(xiàn)配。1. 4主要儀器1)全自動生化分析儀2)CT :PHILIPS BRILLIANCE 64 排 /16 排3)磁共振SIEMENS TRIO 3T ;SIEMENS AVANTO 1. 5T(MR 對比齊[J :莫迪司 (Gd-BOPTA, multihance))4)超聲PHILIPS BRILLIANCE IU22(超聲對比劑聲諾維(SonoVue,注射用六氟化硫微泡))1. 5實驗方法1. 5. 1恒河猴肝功能、腎功能生化指標,心肌酶譜,血淀粉酶指標測定通過測定上述指標,了解肝、腎、心及胰腺是否存在預(yù)存病變,并獲得試驗前動物基礎(chǔ)值。1)動物禁食10_12h,不禁水;2)根據(jù)動物購入時體重,按15mg/kg肌肉注射氯氨酮(50mg/ml);3)待動物麻醉后,準確稱量體重,并記錄;4)將恒河猴上下肢固定于手術(shù)臺上,下肢小腿后側(cè)備皮暴露大隱靜脈,碘氟消毒;5)20G留滯針穿刺大隱靜脈,自動采血器采集全血6ml (分別做肝功能、腎功能、血常規(guī)、心肌酶譜、血糖和胰淀粉酶測定,并標記為0分鐘數(shù)值)。1. 5. 2恒河猴顱、胸腔、腹腔主要臟器影像學參數(shù)通過CT、MRI及胸腹部超聲,了解腦、心、肺、肝、腎、胰腺等主要臟器是否有預(yù)存病變,并獲得試驗前動物基礎(chǔ)值。1)動物麻醉同上。2)腹部備皮。3)分別采用 PHILIPS BRILLIANCE 64 排 /16 排 CT、SIEMENS TRIO 3T 和 SIEMENS AVANTO 1.5T (增強磁共振采用MR對比劑為莫迪司G d-B0PTA, multihance)磁共振進行全
身掃描,獲取全身主要臟器影像學參數(shù)。4)采用PHILIPS BRILLIANCE IU22超聲,獲取心、肝、脾、腎、胰腺等主要臟器影像學參數(shù)(增強造影采用超聲對比劑聲諾維SonoVue)。5)圖像采集完畢,待動物完全蘇醒,送回籠內(nèi)。1. 5. 3恒河猴肝臟穿刺活檢1)動物麻醉同上。2)上腹部以艾力克紗布對以進針點為中心向周圍至少15em皮膚無遺漏地涂擦。 待艾力克涂液自然干燥后,再用70%酒精棉球?qū)瞬寥ァd伣怼?)于劍突下偏右側(cè)肋緣進針1. 5cm,扳動扳機,獲取肝組織兩條。4)妥善處理創(chuàng)口。
5)分別對獲取的肝組織進行冰凍切片及石蠟包埋切片。冰凍切片用于油紅0染色,觀察肝脂肪變情況。石蠟包埋切片用于HE染色,獲取組織學參數(shù)。6)活檢完畢,待動物完全蘇醒,送回籠內(nèi)。1. 5. 4鵝膏蕈堿及內(nèi)毒素脂多糖注入恒河猴1)動物麻醉同上。2)中上腹部以艾力克紗布對以進針點為中心向周圍至少15cm皮膚無遺漏地涂擦。待艾力克涂液自然干燥后,再用70%酒精棉球?qū)瞬寥ァ?)將輸液針頭插入腹腔,將鵝膏蕈堿及脂多糖混合液50ml滴注到腹腔內(nèi)。滴注過程中多次晃動腹部,使藥物均勻分布于腹腔。4)滴注完畢,拔出針頭,妥善處理創(chuàng)口。5)待動物完全蘇醒,送回籠內(nèi)。給予正常飲食飲水。6)密切觀察動物生命體征。1.5.5恒河猴FHF過程的動態(tài)觀測1)采用上述方法,分別于給藥后每1 進行靜脈采血,檢測肝功能、腎功能、心肌酶譜、血糖、胰淀粉酶指標。2)采用上述方法,分別于給藥后每24h進行影像學(CT、MRI、超聲)檢查。3)采用上述方法,分別于給藥后每24h進行肝穿刺活檢,標本用于冰凍切片油紅0 染色和石蠟包埋切片用于HE染色。4)觀察恒河猴生命體征、行為異常表現(xiàn)。1.5.6恒河猴尸檢1)采用頸胸腹聯(lián)合切口,從下頌正中向下沿前正中線經(jīng)臍的左側(cè)作一直線切開, 止于恥骨聯(lián)合。依次切開皮膚、皮下組織、肌肉,謹慎切開腹膜,切斷胸壁下緣的肌肉,暴露腹腔各臟器。再將胸壁的皮膚連皮下組織和胸大肌一起自胸部中線起剝離,以充分暴露肋骨,用軟骨刀切開肋骨與肋軟骨交界處至胸鎖關(guān)節(jié)處,用肋骨剪剪斷第1肋骨,暴露胸腔。2)檢查腹腔各臟器腹膜表面性狀,色澤,有無滲出物附著,粘連等。腹腔內(nèi)有否積液及氣體,大網(wǎng)膜的位置與臟器有否粘連。各臟器的位置、大小是否正常。檢查腸系膜同時注意其淋巴結(jié)是否腫大。3)檢查胸腔各臟器檢查心、肺的位置,大小,彼此間的關(guān)系,以及縱膈內(nèi)淋巴結(jié)的外觀,大小,硬度。胸膜的色澤,有無炎性滲出物附著及粘連,胸腔有無積液及氣體。沿心臟底部在心包壁作“人”字形剪開,檢查有無滲出物附著及粘連等。4)將頭部盡量向后仰,然后將軟骨刀在下頌角內(nèi)側(cè)向上刺入,并沿骨之內(nèi)緣逐漸向前割斷口底組織一直繞至對側(cè)該處,經(jīng)下頌將舌牽出,沿脊柱前方將頸胸腹臟器聯(lián)合取出ο5)依次取下各臟器,逐一詳細檢查,稱量,測量體積,并檢查臟器切面有無異常。6)自一側(cè)乳突經(jīng)顱頂向另一側(cè)乳突作一切線,切開皮膚后,剝離皮下軟組織及骨膜。切開顳肌后,用細齒鋸沿顱前后圓周切線鋸斷顱骨板全部及內(nèi)板大部(但不要完全鋸斷,以免鋸入腦內(nèi))。再用鑿子、錘,輕輕擊破內(nèi)板之相連部分,用丁字鑿掀起顱頂骨,將硬腦膜與骨分開。剪開上矢狀竇檢查其內(nèi)有無血栓,再沿顱頂鋸緣,將硬腦膜之四周剪斷。于大腦縱裂深處,將大腦鐮前端附著處割開,并拉大腦鐮向后,露出兩側(cè)大腦半球全部表面,用左手托住腦頂部,右手指伸入腦額葉前端下方將之扶起,露出腦神經(jīng)、垂體柄及小腦幕,逐一切斷腦神經(jīng)、垂體柄及小腦幕。最后將刀深入脊管內(nèi),割斷頸髓及椎動脈,取出腦髓。然后用小刀將垂體周圍組織分離,取出垂體。7)觀察有無腦出血、腦水腫等改變。8)各臟器作適當切割后,即放于10%福爾馬林液內(nèi)固定。2.實驗結(jié)果2. 1鵝膏蕈堿聯(lián)合脂多糖導(dǎo)致肝細胞大量壞死從而誘導(dǎo)FHF的發(fā)生恒河猴腹腔滴注鵝膏蕈堿和內(nèi)毒素脂多糖溶液后12h即出現(xiàn)肝臟轉(zhuǎn)氨酶10倍以上的升高,肝臟活檢見肝細胞發(fā)生脂肪變。至Mh,轉(zhuǎn)氨酶升高達50倍左右,膽紅素水平上升,凝血酶原時間(PT)和APTT延長;影像學檢查示肝細胞水腫,其余改變不明顯。至給藥后36h,轉(zhuǎn)氨酶升高達到200-300倍,PT和APTT顯著延長,膽紅素水平顯著上升,肝細胞出現(xiàn)中央靜脈周圍及肝小葉中央?yún)^(qū)大片狀壞死,殘余肝細胞脂肪變明顯。至48h,轉(zhuǎn)氨酶水平下降,膽紅素持續(xù)升高,PT和APTT顯著延長,影像學顯示肝臟左內(nèi)葉局部區(qū)域回聲增強,呈低灌注,門靜脈血流阻力升高。至60h,轉(zhuǎn)氨酶水平繼續(xù)下降,膽紅素水平繼續(xù)升高,PT和 APTT顯著延長,影像學顯示肝臟密度不均,門靜脈血流阻力升高。2. 2鵝膏蕈堿聯(lián)合脂多糖對肝外器官損傷輕微除肝臟出現(xiàn)顯著病變外,血淀粉酶及心肌酶譜及相應(yīng)的影像學指標顯示腎臟、胰腺、心臟無明顯損傷。肌酐水平在給藥后4 顯著升高,但尿酸和尿素水平并無明顯改變。 給藥后3 起,血糖水平持續(xù)下降。2. 3鵝膏蕈堿聯(lián)合脂多糖導(dǎo)致FHF可表現(xiàn)出嚴重的肝性腦病給藥后4 有腦水腫表現(xiàn),恒河猴表現(xiàn)為行為減少、進食減少、嗜睡;給藥后60h恒河猴出現(xiàn)昏睡至昏迷狀態(tài),CT及MRI可見雙側(cè)顳葉、額葉片帶狀異常信號區(qū),提示腦急性缺血。2. 4鵝膏蕈堿聯(lián)合脂多糖給藥后恒河猴均發(fā)生死亡3只恒河猴于給藥后66h_96h內(nèi)死亡。2. 5尸檢及病理學顯示鵝膏蕈堿聯(lián)合脂多糖特異作用于肝細胞,導(dǎo)致肝細胞大量壞死,是最終引起動物死亡的主要原因尸檢顯示腹腔未見明顯積液。肝臟呈急性黃色萎縮,邊緣銳利,包膜皺縮。未見門靜脈血栓形成。肺門、腎門、腸系膜、胃大彎側(cè)淋巴結(jié)呈腫大,大小約綠豆至黃豆大,呈暗黑色。心、肺、腎、胰腺、胃、小腸、結(jié)腸、膀胱、輸尿管、子宮等未見肉眼可見異常。輕度腦水腫,腦溝變淺,腦回增寬。顱底、硬腦膜外、硬腦膜下及蛛網(wǎng)膜下未見出血,腦實質(zhì)未見出血, 無腦疝形成。各主要臟器進行石蠟包埋,切片,HE染色后鏡下觀察并照相。肝肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂,肝竇擴張充血,肝細胞廣泛壞死,殘留少量肝細胞未見再生現(xiàn)象。小葉內(nèi)和匯管區(qū)可見淋巴細胞浸潤。腎腎小球的毛細血管球擴張充血,腎小管上皮細胞水腫,管腔內(nèi)可見蛋白管型, 間質(zhì)血管擴張充血。肺肺泡間隔增寬,肺泡壁毛細血管血管擴張充血。淋巴結(jié)肺門、胃大彎側(cè)、腸系膜、腎門處淋巴結(jié)腫大,結(jié)內(nèi)淋巴細胞大片減少伴出血,組織細胞增生,部分區(qū)域淋巴濾泡增生,增生的濾泡中央血管壁增厚玻變。腦腦膜下淺層腦組織疏松水腫。結(jié)腸灶性區(qū)域結(jié)腸粘膜上皮細胞壞死脫落。心臟心肌纖維波浪狀改變。按下表測定各指標,結(jié)果顯示,本發(fā)明動物模型滿足診斷指標要求,證明本發(fā)明造模成功。表1.人與恒河猴爆發(fā)性肝衰模型比較
人FHF診斷指標人 恒河猴模型病程(發(fā)病到死亡時間)_<10-14d__36-66h
Γ PTA (凝血酶原活性)<40%<10%---
TBIL (總膽紅素)>171umol/L>30倍給藥前對照值
__或>〗0倍正常值上限__
酶膽分離現(xiàn)象有有——本發(fā)明制備的恒河猴爆發(fā)性肝功能衰竭模型具有制作簡單、肝臟損傷的特異性、 肝外毒性小、各項生化指標、影像學指標以及疾病過程和轉(zhuǎn)歸高度類似人爆發(fā)性肝功能衰竭的相應(yīng)改變。從給藥到動物死亡具有較長的治療時間窗,可用于篩選促肝細胞再生藥物, 評估肝移植、組織工程肝、生物人工肝支持系統(tǒng)、肝細胞移植以及干細胞移植的治療效果。實施例2利用本發(fā)明恒河猴爆發(fā)性肝功能衰竭動物模型評價組織工程肝支持系統(tǒng)或肝細胞、干細胞移植效果并建立相關(guān)的評價體系a、按實施例1的方法制備恒河猴爆發(fā)性肝功能衰竭模型,它是將鵝膏蕈堿聯(lián)合脂多糖內(nèi)毒素施用于靈長類動物,鵝膏蕈堿的施用劑量為0. lmg/kg,脂多糖內(nèi)毒素的施用劑量為 ι μ g/kg ;b、采用細胞移植或器官移植于該動物模型;C、觀察移植后動物的肝功能的量化指標影響情況,評價組織工程肝支持系統(tǒng)或肝細胞、干細胞移植效果。經(jīng)過步驟c的評價,如果移植后的動物肝功能指標有明顯改善的,則可以證明采用細胞移植或器官肝移植、組織工程肝、生物人工肝方式治療爆發(fā)性肝功能衰竭的可行性。綜上所述,本發(fā)明制備的爆發(fā)性肝功能衰竭動物模型建模成功,可以用于嚙齒類動物模型無法完成的生物技術(shù)新藥的評價和肝移植、組織工程肝、生物人工肝支持系統(tǒng)、肝細胞移植以及干細胞移植的治療效果的評價。
權(quán)利要求
1.鵝膏蕈堿聯(lián)合內(nèi)毒素脂多糖在制備用于篩選治療爆發(fā)性肝功能衰竭藥物、評價組織工程肝支持系統(tǒng)或肝細胞、干細胞移植治療效果的靈長類動物模型中的用途,其中鵝膏蕈堿的施用劑量為0. lmg/kg,內(nèi)毒素施用劑量為1 μ g/kg。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途,其特征在于鵝膏蕈堿與脂多糖內(nèi)毒素同時施用,施用方法為單次腹腔滴注。
3.一種爆發(fā)性肝功能衰竭動物模型的制備方法,其特征在于它是將鵝膏蕈堿和脂多糖內(nèi)毒素施用于靈長類動物,鵝膏蕈堿的施用劑量為0. lmg/kg,脂多糖內(nèi)毒素的施用劑量為 ι μ g/kg。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的爆發(fā)性肝功能衰竭動物模型的制備方法,其特征在于所述靈長類動物為恒河猴。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的爆發(fā)性肝功能衰竭動物模型的制備方法,其特征在于 所述的施用方法為單次腹腔滴注。
6.權(quán)利要求3-5任一一項所述的方法制備得到的爆發(fā)性肝功能衰竭動物模型。
7.權(quán)利要求6所述的動物模型在評價組織工程肝支持系統(tǒng)或肝細胞、干細胞移植治療效果中的應(yīng)用。
8.一種評價組織工程肝支持系統(tǒng)或肝細胞、干細胞移植效果的方法,包括如下步驟a、它是將鵝膏蕈堿聯(lián)合脂多糖內(nèi)毒素施用于靈長類動物,制備爆發(fā)性肝功能衰竭動物模型,鵝膏蕈堿的施用劑量為0. lmg/kg,脂多糖內(nèi)毒素的施用劑量為lyg/kg;b、采用細胞移植或器官移植于該動物模型;c、觀察移植后動物的肝功能影響情況,評價組織工程肝支持系統(tǒng)或肝細胞、干細胞移植效果。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的篩選藥物的方法,其特征在于a步驟所述靈長類動物為恒河猴。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的篩選藥物的方法,其特征在于所述的鵝膏蕈堿與脂多糖內(nèi)毒素同時施用,施用方法為單次腹腔滴注。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種鵝膏蕈堿聯(lián)合內(nèi)毒素脂多糖在制備用于篩選治療爆發(fā)性肝功能衰竭時促肝細胞再生藥物以及評價組織工程肝支持系統(tǒng)或肝細胞、干細胞移植治療效果的動物模型。其中鵝膏蕈堿的施用方法和劑量為單次腹腔滴注,0.1mg/kg,內(nèi)毒素為1μg/kg。本發(fā)明還提供了一種制備恒河猴爆發(fā)性肝功能衰竭的方法,及該方法制備的爆發(fā)性肝功能衰竭動物模型。本發(fā)明動物模型可以用于嚙齒類動物模型無法完成的生物技術(shù)新藥的評價,還可以用于組織工程肝臟、生物人工肝、肝細胞及干細胞移植治療技術(shù)的評價。
文檔編號A61K31/739GK102526034SQ20101060444
公開日2012年7月4日 申請日期2010年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月24日
發(fā)明者周萍, 夏杰, 張 杰, 李宏霞, 步宏, 王莉, 石毓君, 郭崗 申請人:四川大學華西醫(yī)院, 國家成都中藥安全性評價中心, 成都華西海圻醫(yī)藥科技有限公司
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