專利名稱：用于生產(chǎn)人工肝細(xì)胞的試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種生物醫(yī)學(xué)上使用的試劑，即用于生產(chǎn)人工肝細(xì)胞所需使用的試劑。
背景技術(shù)：
隨著細(xì)胞分離、培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展，分離肝細(xì)胞在懸液中能維持?jǐn)?shù)小時(shí)的代謝活力，它們能執(zhí)行許多代謝功能，并且能保留對激素的敏感性。用原代培養(yǎng)肝細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞移植和構(gòu)建BALS來替代和治療急慢性肝功能衰竭患者正日益受到關(guān)注。然而，由于供肝的廣泛短缺，極大地限制了人源性肝細(xì)胞在細(xì)胞移植和BALS治療等方面的應(yīng)用。最近國內(nèi)外學(xué)者研究表明，在形態(tài)學(xué)和生物功能等方面相比其他動物供肝，豬肝細(xì)胞與人肝細(xì)胞更具有相似性，可以成為BALS合適的異種肝細(xì)胞源。如Nelson和Samuel等用分離的豬肝細(xì)胞構(gòu)建BALS對暴發(fā)性肝衰竭模型動物和急性肝衰竭患者進(jìn)行治療獲滿意效果。
為此制備大量、高活性的豬肝細(xì)胞成了發(fā)展BALS的關(guān)鍵技術(shù)，自Howard和Pesch等于30年前，首次分離到無損傷大鼠肝細(xì)胞并進(jìn)行肝細(xì)胞生理學(xué)研究以來，肝細(xì)胞的分離技術(shù)不斷改進(jìn)，尤其是Seglen的二步灌流法，被證明對分離多種動物肝細(xì)胞均非常有效。近年來本發(fā)明人對大鼠和乳豬肝細(xì)胞進(jìn)行了大量的分離實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)Seglen的二步灌流法對豬肝細(xì)胞消化分離不甚滿意。而豬肝細(xì)胞是最合適的異種肝細(xì)胞源，為BALS治療提供大量、優(yōu)質(zhì)的豬肝細(xì)胞，就必須改進(jìn)對豬肝細(xì)胞的分離培養(yǎng)技術(shù)，并研制對豬肝細(xì)胞分離培養(yǎng)所需使用的專用試劑，本發(fā)明的目的就是提供一套用于生產(chǎn)人工肝細(xì)胞的試劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供的用于生產(chǎn)人工肝細(xì)胞的試劑，包括用于肝細(xì)胞分離的灌流液，肝細(xì)胞洗滌液和肝細(xì)胞培養(yǎng)劑，所述灌流液的組分按重量百分比計(jì)為氯化鈉0.9％，氯化鉀0.042％，碳酸氫鈉0.21％，葡萄糖0.09％，Hepes 0.3％～0.6％，余量為去離子水；在使用前每100毫升中加入0.02～0.05克EDTA，調(diào)節(jié)pH至7.4，4℃保存；或在使用前每100毫升灌流液中加入0.5～1.0克Dispase，調(diào)節(jié)pH至7.5，4℃保存；或在使用前每100毫升灌流液中加入0.03～0.1克膠原酶和0.055克2水氯化鈣(CaCl2·2H2O)，調(diào)節(jié)pH至7.5，4℃保存。
所述肝細(xì)胞洗滌液的組分按重量百分比計(jì)為氯化鈉0.7％，氯化鉀0.0461％，2水氯化鈣(CaCl2·ZH2O)0.013％，Hepes 0.3％～0.6％，牛血清白蛋白0.05～0.15％，余量為去離子水，該洗滌液pH應(yīng)調(diào)至7.4。所述肝細(xì)胞洗滌液的組分按重量百分比計(jì)為6水氯化鎂(MgCl2·6H2O)0.01％，7水硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0.01％，DNase 0.01％～0.03％，余量為去離子水，該洗滌液pH應(yīng)調(diào)至7.4。所述肝細(xì)胞培養(yǎng)劑的組分按重量百分比計(jì)為FBS 10％，胰島素1～0.7摩爾，表皮生長因子2.5微克，地塞米松1～0.6摩爾，余量為William`s Medium E培養(yǎng)基，該培養(yǎng)劑pH為7.4。
具體實(shí)施例方式
為進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，以下通過具體方案進(jìn)一步描述。本方案的配制均以100毫升試劑為例。
1、灌流液(PB)100毫升中含氯化鈉 0.9克氯化鉀 0.042克碳酸氫鈉 0.21克葡萄糖 0.09克Hepes 0.478克余量為去離子水。
根據(jù)豬肝或人肝細(xì)胞分離操作灌流的需要，在使用灌流液前每100毫升灌流液(PB)中加入EDTA 0.037克，制成含EDTA的灌流液(PBE)；調(diào)節(jié)pH至7.4，4℃保存。
根據(jù)多次灌流分離豬肝或人肝細(xì)胞的需要，在使用前在每100毫升灌流液(PB)中加入0.84克Dispase，制成含Dispase的灌流液(PBD)調(diào)節(jié)pH至7.5，4℃保存。
根據(jù)多次灌流分離豬肝或人肝細(xì)胞的需要，灌流操作前，在100毫升灌流液(PB)中加入0.05克膠原酶和0.055克2水氯化鈣(CaCl2·2H2O)，制成含膠原酶和氯化鈣的灌流液(PBC)，調(diào)節(jié)pH至7.5，4℃保存。
2、①肝細(xì)胞洗滌液(WB)每100毫升肝細(xì)胞洗滌液含氯化鈉 0.7克氯化鉀 0.0461克2水氯化鈣(CaCl2·2H2O) 0.013克Hepes 0.238克牛血清白蛋白 0.1克余量為去離子水，調(diào)節(jié)pH至7.4②含DNese的肝細(xì)胞洗滌液(WBD)每100毫升中含
6水氯化鎂(MgCl2·6H2O) 0.01克7水硫酸鎂(MgSO4·7H2O) 0.01克DNase 0.01克余量為去離子水，調(diào)節(jié)pH至7.43、肝細(xì)胞培養(yǎng)劑每100毫升Willian`s Medium E培養(yǎng)基中含F(xiàn)BS10毫升胰島素 1～0.7摩爾表皮生長因子 2.5微克地塞米松 1～0.6摩爾本實(shí)例中的這套試劑用于生產(chǎn)人工肝細(xì)胞獲得較為滿意的效果。適合于分離各種大動物如豬、狗和人肝細(xì)胞用于細(xì)胞移植、生物型人工肝和混合型人工肝治療。
權(quán)利要求
1.用于生產(chǎn)人工肝細(xì)胞的試劑，包括用于肝細(xì)胞分離的灌流液，肝細(xì)胞洗滌液和肝細(xì)胞培養(yǎng)劑，其特征在于所述灌流液的組分按重量百分比計(jì)為氯化鈉0.9％，氯化鉀0.042％，碳酸氫鈉0.21％，葡萄糖0.09％，Hepes 0.3％-0.6％，余量為去離子水。
2.按權(quán)利要求1所述用于生產(chǎn)人工肝細(xì)胞的試劑，其特征在于所述灌流液在使用前每100毫升中加入0.02-0.05克EDTA，調(diào)節(jié)PH至7.4，4℃保存。
3.按權(quán)利要求1所述用于生產(chǎn)人工肝細(xì)胞的試劑，其特征在于所述灌流液在使用前每100毫升中加入0.5-1.0克Dispase，調(diào)節(jié)PH至7.5，4℃保存。
4.按權(quán)利要求1所述用于生產(chǎn)人工肝細(xì)胞的試劑，其特征在于所述灌流液在使用前每100毫升中加入0.03-0.1克膠原酶和0.055克2水氯化鈣，調(diào)節(jié)PH至7.5，4℃保存。
5.按權(quán)利要求1所述用于生產(chǎn)人工肝細(xì)胞的試劑，其特征在于所述肝細(xì)胞洗滌液的組分按重量百分比計(jì)為氯化鈉0.7％，氯化鉀0.0461％，2水氯化鈣0.013％，Hepes 0.3％-0.6％，牛血清白蛋白0.05％-0.15％余量為去離子水；該洗滌液PH應(yīng)調(diào)至7.4。
6.按權(quán)利要求1所述用于生產(chǎn)人工肝細(xì)胞的試劑，其特征在于所述肝細(xì)胞洗滌液的組分按重量百分比計(jì)為6水氯化鎂0.01％，7水硫酸鎂0.01％，DNase 0.01％-0.03％，余量為去離子水；該洗滌液PH應(yīng)調(diào)至7.4。
7.按權(quán)利要求1所述用于生產(chǎn)人工肝細(xì)胞的試劑，其特征在于所述肝細(xì)胞培養(yǎng)劑的組分按重量百分比計(jì)為FBS 10％，胰島素0.7-1摩爾，表皮生長因子2.5微克，地塞米松0.6-1摩爾，余量為William’s Medium E，該培養(yǎng)劑pH為7.4。
全文摘要
一種用于生產(chǎn)人工肝細(xì)胞的試劑，包括用于肝細(xì)胞分離的灌流液，肝細(xì)胞洗滌液和肝細(xì)胞培養(yǎng)劑，本發(fā)明的試劑適用于為肝細(xì)胞研究、肝細(xì)胞移植、生物型人工肝和混合型人工肝的治療而制備較大量的肝細(xì)胞，如適用于分離各種大動物如豬、狗和人的肝細(xì)胞。
文檔編號C12N5/08GK1632108SQ20041008462
公開日2005年6月29日 申請日期2004年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月26日
發(fā)明者李蘭娟, 李君 申請人:浙江大學(xué)