專利名稱：Xyloketal B在制備抗動脈粥樣硬化藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及Xyloketal B在制藥領(lǐng)域中的用途，具體涉及Xyloketal B在制備抗動
脈粥樣硬化藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
Xyloketal類化合物是從南海紅樹林內(nèi)生真菌sp. 2508分離得到的一系 列新化合物，結(jié)構(gòu)珍奇，有10多個，Xyloketal B是其中之一。“三類南海海洋真菌次 級代謝產(chǎn)物的合成研究進(jìn)展”，有機化學(xué)2009年第29卷第3期341-349頁公開了這種化 合物的結(jié)構(gòu)及制備方法。即以間苯三酚為原料經(jīng)過一鍋法、多米諾式反應(yīng)合成得到。中 國專利申請200910042204.0公開了 Xyloketal B在制備治療自由基損傷疾病的藥物中的應(yīng) 用，指出其在治療自由基損傷疾病中療效顯著，尤其適合于治療神經(jīng)元缺血缺氧再灌注 損傷，具有安全無毒，藥理作用強的特點。動脈粥樣硬化(AS)是缺血性心腦血管病的主要病理學(xué)基礎(chǔ)，防治AS則是防 治心腦血管病的重要措施。xyloketal B在抗動脈粥樣硬化中的應(yīng)用還未見報道。。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供Xyloketal B在制備抗動脈粥樣硬化藥物中的應(yīng)用。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案 Xyloketal B在制備抗動脈粥樣硬化藥物中的應(yīng)用。上述抗動脈粥樣硬化包括縮小粥樣硬化斑塊面積、保護血管內(nèi)皮、調(diào)節(jié)血脂水 平、抗氧化應(yīng)激中的一種或幾種。上述調(diào)節(jié)血脂水平是指降低LDL-C (低密度脂蛋白膽固醇)、升高HDL-C (高 密度脂蛋白膽固醇)中的一種或兩種。Xyloketal B在制備抗氧化應(yīng)激藥物中的應(yīng)用，抗氧化應(yīng)激是指抗Ox_LDL (氧
化型低密度脂蛋白)抗體。與現(xiàn)有的Xyloketal B的應(yīng)用相比，本發(fā)明具有以下有益效果
本發(fā)明的化合物Xyloketal B能夠降低ApoE (載脂蛋白E)基因缺陷動脈粥樣硬化 小鼠血清中LDL-C水平，升高其HDL-C水平，能夠顯著減少粥樣斑塊內(nèi)的巨噬細(xì)胞沉 積。體內(nèi)應(yīng)用Xyloketal B可以通過保護血管內(nèi)皮、調(diào)節(jié)血脂水平和體內(nèi)抗氧化應(yīng)激等多 種作用機制防治動脈粥樣硬化。本發(fā)明發(fā)掘了 Xyloketal B新的制藥用途，開拓了一個新 的應(yīng)用領(lǐng)域，且Xyloketal B安全無毒，藥理作用強，具有很好的藥用前景。


圖1 油紅“0”染色分析Xyloketal B對小鼠主動脈內(nèi)膜粥樣斑塊面積的影響， (A)為油紅“0”染色示各組主動脈內(nèi)膜及粥樣斑塊；(B)為定量分析斑塊面積與整個主 動脈內(nèi)膜面積的比值，VxC57BL / 6J, ,P<0.001; ApoE(V ), ,P<0.05; Vehicle,^<0.05;dvs Simv.,i^0.05,n=9 ；
圖2:油紅“0”染色分析XyloketalB對小鼠主動脈竇粥樣斑塊面積的影響，(A) 為油紅“0”染色示各組主動脈竇橫切面及粥樣斑塊；(B)為定量分析斑塊面積與整個 主動脈竇橫切面面積的比值，Vx C57BL / 6J, i^O.OOl; ApoE(+) , 7^0.05; Vehicle, 尸<0.05;d vs Simv.,i^0.05, n=9 ；
圖3 各組小鼠血清LDL-C、HDL-C水平比較，A為血清LDL-C，B為血清 HDL-C, avs C57BL / 6J,片0.001; ApoE(+),片0.05; Vehicle,戶<0.01; d vs Simv., 尸>0.05, n=9 ；
圖4:各組小鼠血清中抗Ox-LDL抗體水平比較，Vx C57BL / 6J,片0.001; Vx ApoE("),代0.05; Vx Vehicle,尸<0.05;d vs Simv.,尸>0.05, n=9 ；
圖5 各組小鼠主動脈竇斑塊內(nèi)mac-3沉積比較(40X)；
圖6:免疫熒光方法比較各組小鼠主動脈根部血管內(nèi)皮標(biāo)識物PECAM-1的表達(dá)，紅 色示血管內(nèi)皮細(xì)胞，藍(lán)色示DAPI復(fù)染細(xì)胞核，各組左側(cè)圖示完整血管橫切面，(10X); 右側(cè)圖為白色小方框局部區(qū)域放大，(40X)。
具體實施例方式
實施例1 Xyloketal B對動脈粥樣硬化小鼠斑塊面積的影響 (一)材料與方法 1、藥物
Xyloketal B,白色粉末。先溶于DMSO，貯存濃度80mmol/L，保存于4°C備用，
給藥時以10%丙二醇生理鹽水稀釋后，經(jīng)腹腔注射給藥(XyloketalB終濃度14mg/ kg d)。辛伐他汀購自杭州默沙東制藥有限公司(40mg片劑，批號為07279)，給藥 時研成粉末，溶于去離子水中灌胃給藥(辛伐他汀終濃度為10mg/kg d)。2、實驗動物分組、喂養(yǎng)及給藥
本實驗選用apoE基因敲除小鼠(品系C57BL/6J，雄性，清潔級，5周齡)及野生型 雄性C57BL / 6J小鼠。所有動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，共分成5組，包括野生型C57BL / 6J小鼠組(9只)及4組apoE基因敲除小鼠(n = 9)模型組(ApoE(+))、溶劑對 照組(ApoE(+).Vehicle])、辛伐他汀組(ApoE(+)+Simvastatin )、Xyloketal B 防治組( ApoE(+)+Xyl-B )。給藥和喂飼方案如下
①野生型雄性C57BL/ 6J小鼠組高脂飼料喂養(yǎng)；
②模型組高脂飼料喂養(yǎng)；
③溶劑對照組給予高脂飼料喂養(yǎng)，同時腹腔注射溶劑(按XyloketalB終濃度 14mg/kg d計算10%丙二醇生理鹽水給予量，但不含Xyloketal B )；
④XyloketalB防治組給予高脂飼料喂養(yǎng)，同時腹腔注射XyloketalB (終濃度 14mg/kg d)；
⑤辛伐他汀組給予高脂飼料喂養(yǎng)，同時灌胃給予辛伐他汀(lOmg/kg d)。高脂動物飼料(western-type diet, WD)由廣東省實驗動物中心提供，由普通小 鼠飼料加入脂肪和膽固醇(含21%脂肪和0.15%膽固醇，w/w)制成，輻照消毒。所有 動物寄養(yǎng)在中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院清潔級動物實驗室，均喂養(yǎng)高脂飼料。按照上述動物分組，將5組小鼠按組別在層流架中分籠喂養(yǎng)，自由飲水?dāng)z食，室溫控制在24°C左右， 12小時白天/夜晚周期，每天用紫外燈消毒一次。所有動物同步給藥，每天一次，實驗 到第16周末結(jié)束，此時小鼠為22周齡。3、形態(tài)學(xué)檢測方法(油紅“0”染色)
將動物麻醉后斷頭處死，在劍突下剪開皮膚，小心打開小鼠腹腔，暴露胸腔，迅速 用眼科剪在心尖處剪開一小口，從該傷口處進(jìn)針，灌注生理鹽水8 10分鐘(灌注速度 為4mL/分鐘)，然后灌注4%多聚甲醛固定液8 10分鐘。解剖分離出心臟，主動脈。 主動脈在10%甲醛中固定24小時后，用顯微眼科剪縱向剪開。用PBS洗3次，0.3%油 紅“0”染色液染色，然后在60%異丙醇中脫去未染上的油紅“0”，用蒸餾水清洗。 用顯微鏡觀察主動脈竇部和主動脈弓處紅色的動脈粥樣硬化斑塊的情況，并應(yīng)用全自動 圖像分析系統(tǒng)，統(tǒng)計分析各組動物主動脈粥樣硬化斑塊的面積占主動脈內(nèi)膜總面積的百 分比。4、統(tǒng)計分析方法
結(jié)果用mean士 S.E.M.表示。組間分析用spsslO.O軟件包進(jìn)行單因素方差分析 (ANOVA)檢驗，戶<0.05時為統(tǒng)計學(xué)上有顯著性差異。(二)實驗結(jié)果
1、Xyloketal B對小鼠主動脈粥樣硬化斑塊面積的影響
主動脈油紅“0”染色結(jié)果如圖1，野生型C57BL / 6J小鼠組、模型組 (ApoE(+))、溶劑對照組(ApoE(+)+Vehicle)、辛伐他汀組(ApoE (+)+Simvastatin)、 Xyloketal B防治組(ApoE (+) +xyl_B)的主動脈粥樣斑塊面積分別為0、20.1 士 1.5%、 20.7士5.2%、12.9士2.0%、9.4士 1.0%。 野生型C57BL / 6J小鼠組未見斑塊形成，模型
組、溶劑對照組均有明顯的斑塊形成，與野生型C57BL / 6J小鼠組比較具有顯著性差異 CP<0.05,n=9)。模型組、溶劑對照組相比無顯著性差異(i^0.05,n=9)。Xyloketal B 防治組的斑塊面積與溶劑對照組相比明顯減少(戶<0.05, n=9)、辛伐他汀組斑塊面積與 模型組相比較明顯減少(戶<0.05, n=9)，但Xyloketal B組與辛伐他汀組兩組斑塊面積并 無顯著性差異，(戶>0.05,n=9)。B表示定量分析斑塊面積與整個主動脈內(nèi)膜面積的比 值。、Xyloketal B對小鼠主動脈竇粥樣硬化斑塊面積的影響
主動脈竇冰凍切片油紅“0”染色結(jié)果如圖2A，圖2B示定量分析結(jié)果，野生型 C57BL / 6J小鼠組、模型組、溶劑對照組、辛伐他汀組、Xyloketal B防治組的主動脈竇 處粥樣斑塊面積分別為 0、32.7士2.4%、36.9士4.1%、29.9士3.8%、21.6士2.8%。野生型 C57BL / 6J小鼠組未見粥樣硬化斑塊，模型組、溶劑對照組均有明顯的斑塊形成，與野 生型C57BL / 6J小鼠組比較有顯著性差異(戶<0.05,n=9)，但模型組、溶劑對照組相比 無顯著性差異(i^0.05,n=9)。Xyloketal B防治組的斑塊面積與溶劑對照組相比明顯減 少(戶<0.05，n=9)、辛伐他汀組斑塊面積與模型組相比較明顯減少(戶<0.05, n=9)，但 Xyloketal B組與辛伐他汀組兩組斑塊面積并無顯著性差異。(戶>0.05, n=9)。B表示定 量分析斑塊面積與整個主動脈竇橫切面面積的比值。(三)實驗討論及化合物評價
上述結(jié)果表明ApoE基因缺陷動脈粥樣硬化小鼠模型建模成功，Xyloketal B在所用劑量下有明顯的縮小斑塊面積的作用。ApoE基因缺陷動脈粥樣硬化小鼠模型是國際公認(rèn)的 動脈粥樣硬化動物模型，其發(fā)病機制和病理改變與人類動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS) 過程相似。Xyloketal B在整體動物模型的應(yīng)用實驗表明該化合物可防治AS。載脂蛋白E(ApoE)是34kDa大小的多功能糖蛋白，主要在肝臟合成，是CM、 VLDL、IDL和部分HDL的重要組分，ApoE作為一種配體可參與LDL受體介導(dǎo)的血漿 脂蛋白的清除，并參與膽固醇的再分布、轉(zhuǎn)運和胞內(nèi)膽固醇的外流等重要環(huán)節(jié)，在脂類 代謝中發(fā)揮重要作用。ApoE基因敲除小鼠動物模型能很好地重現(xiàn)人類AS發(fā)病過程中粥 樣硬化斑塊形成的全部時期，是國際公認(rèn)的AS模型。他汀類藥物是目前臨床應(yīng)用廣泛的抗動脈粥樣硬化藥物，其抗動脈粥樣硬化作 用的靶點是通過選擇性阻斷膽固醇(CH)合成的限速酶(HMG-CoA還原酶)，影響CH 生物合成，同時代償性地促進(jìn)LDL受體合成，加速LDL降解，從而有效地降低血脂。我 們在實驗中采用辛伐他汀(Simvastatin)作為陽性對照藥物，發(fā)現(xiàn)Xyloketal B在所用劑量 下其縮小斑塊面積的效應(yīng)與辛伐他汀作用類似。我們先前的研究發(fā)現(xiàn)Xyloketal B在體外對氧化低密度脂蛋白(Ox_LDL)誘導(dǎo) 的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型有明顯保護作用，提示Xyloketal B具有極強的抗 氧化應(yīng)激損傷和保護血管內(nèi)皮作用。Ox-LDL誘導(dǎo)血管內(nèi)皮損傷是動脈粥樣硬化發(fā)病過 程中的血管內(nèi)皮病變的重要機制，因此我們以往的研究已提示該化合物可能在氧化應(yīng)激 相關(guān)疾病中(如AS)具有保護血管內(nèi)皮的作用。但我們先前研究無法證實Xyloketal B是 否具有抗AS療效。另外，許多在體外細(xì)胞實驗中針對AS相關(guān)發(fā)病機制有效的藥物，在 整體動物模型上并未如預(yù)期觀察到良好療效，本實驗則在國際公認(rèn)的AS整體動物模型上 新發(fā)現(xiàn)其防治動脈粥樣硬化的療效，使其成為抗動脈粥樣硬化新藥的可能性大大增加。近年研究提示，抗AS藥物除了直接對抗高血脂的有害作用以外，其抗AS效應(yīng) 還得益于非降脂作用機制，如①改善內(nèi)皮功能。②抗炎癥反應(yīng)。③促進(jìn)斑塊穩(wěn)定。 ④抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖及遷移。⑤抑制LDL的氧化修飾。⑥抗氧化作用。我們針 對Xyloketal B的抗AS機制進(jìn)行了研究(見實施例2_3)。實施例2 Xyloketal B對動脈粥樣硬化小鼠血脂水平和抗Ox_LDL抗體的影響
(一)材料與方法
1、藥物準(zhǔn)備，動物模型分組、給藥見實施例1
2、血漿和試劑健康人新鮮血漿購于中山大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科，Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether) -N,N,N' , N，-tetraacetic acid (EGTA)，聚乙二醇(PEG 6000)，瓊脂糖(agarose)，考馬斯亮藍(lán)G-250，均購自Sigma公司。酶法檢測血脂分析 直接高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)試劑盒、直接低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)試 劑盒。購自中生北控生物科技股份有限公司。血清抗Ox-LDL抗體測定試劑盒(Protein Detector ELISA Kit)購自 Kirkegaard Perry Labs 公司。3、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)的分離、提純和氧化
采用密度梯度離心法分離血漿LDL。用密度1.006 g/ml的溶液(0.85% NaCl，0.01% EDTA，pH7.6)來配置密度為1.400 g/ml的溴化鈉(Na&)母液，然后用母液按不同比 例稀釋分別得到密度為1.063 g/ml和1.020 g/ml的密度液。取健康人新鮮血漿100 ml, 裝入透析袋中，分離前用聚乙二醇濃縮至32 ml，用固體NaBr調(diào)節(jié)血漿密度達(dá)1.200 g/
6ml。在離心管中分別加入密度為1.200 g/ml的血漿5 ml,密度為1.063 g/ml的密度液4 ml,密度為1.020 g/ml的密度液4 ml。在4°C，50,000 rpm離心5 h。離心后，吸取淡 黃色脂蛋白帶即為所需的LDL。將LDL于透析液(20mMTris_Cl，150mMNaCl, 300 U M EDTA, 15mMNaN3，pH7.4)中 4°C透析 24h，期間換液 3 次。LDL 用 0.45 y m 微孔濾膜過濾除菌，于4°C避光保存?zhèn)溆?。用Bradford法測定蛋白含量。用瓊脂糖凝膠 電泳法鑒定LDL純度。氧化主要步驟如下LDL用PBS調(diào)節(jié)蛋白濃度至0.5 1 mg蛋 白/ml。將LDL用無EDTA的PBS透析24 h以除去EDTA。每1 ml LDL加入100 u M CuS04溶液50 ii 1，使得CuS04終濃度為5 ii M，于37°C下氧化24h，然后在含200 y M EDTA的PBS中室溫下透析24 h。Ox_LDL用0.45 u m微孔濾膜過濾除菌，于4°C避光 保存?zhèn)溆?。采用硫代巴比妥酸反?yīng)物質(zhì)(thiobarbituricacid reactive substances，TBARS ) 測定法、改良Schuh法和相對電泳遷移率(relative electropherosis mobility，REM)鑒定 LDL和ox-LDL的純度。4、血生化檢測方法
動物實驗于第16周末結(jié)束時，全部動物禁食(但不禁水)8h，小鼠麻醉后，自小鼠 眼眶靜脈采血，室溫靜置3h后離心(4°C，4000rpm, 15min)，分離血清，一 20°C保存 備用。分別使用直接高密度脂蛋白膽固醇試劑盒、直接低密度脂蛋白膽固醇試劑盒分析 血清HDL-C、LDL-C水平。檢測時設(shè)3復(fù)孔，取平均值。5、血清抗氧化型低密度脂蛋白抗體水平的測定
按試劑盒Protein Detector ELISA Kit說明，測定血清中ox-LDL抗體的水平[以 Ox-LDL與天然LDL的吸光度(Optical Density ,OD)的差值來表示]。6、統(tǒng)計學(xué)處理
數(shù)據(jù)資料以mean士S.E.M.表示。組間分析用spsslO.O軟件包進(jìn)行單因素方差分析 (ANOVA)檢驗，戶<0.05時為統(tǒng)計學(xué)上有顯著性差異。(二)實驗結(jié)果
1、不同實驗組小鼠血清HDL-C、LDL-C水平的比較
如圖3A，野生型C57BL / 6J小鼠組、模型組、溶劑對照組、辛伐他汀組、Xyloketal B 防治組血清 LDL-C 水平分別為0.8士0.04mmol/L、15.99士0.61 mmol/L、16.00士0.85 mmol/L、12.14士0.73 mmol/L、13.4士0.78 mmol/L。ApoE 基因缺陷小鼠血清 LDL-C 水平明顯升高，Xyloketal B、辛伐他汀均可明顯降低動脈粥樣硬化小鼠血清中LDL_C 水平，Xyloketal B與辛伐他汀組LDL_C水平無顯著差異。如圖3B，野生型C57BL / 6J小鼠組、模型組、溶劑對照組、辛伐他汀組、Xyloketal B防治組血清HDL-C水平 分別為3.07 士0.24mmol/l、2.2 士0.13mmol/l、2.1 士0.14mmol/l、2.63 士0.13mmol/l、 2.78士0.24mmol/l。ApoE基因缺陷小鼠血清HDL-C水平明顯降低，Xyloketal B、辛伐他 汀均可明顯升高動脈粥樣硬化小鼠血清中HDL-C水平,Xyloketal B與辛伐他汀組HDL_C 水平無顯著差異。2、不同實驗組小鼠血清抗氧化型低密度脂蛋白抗體水平的比較
檢測血清中抗Ox-LDL抗體水平，如圖4所示，野生型C57BL / 6J小鼠組、模型組、 溶劑對照組、辛伐他汀組、Xyloketal B防治組抗Ox-LDL抗體水平分別為0.11 士0.05、0.51 士0.06、0.54士0.09、0.33 士0.01、0.24士0.07。ApoE 基因缺陷小鼠血清抗 Ox_LDL 抗 體水平顯著升高，Xyloketal B、辛伐他汀均可明顯降低ApoE小鼠血清中抗Ox_LDL抗體 水平。Xyloketal B組與辛伐他汀組的抗Ox_LDL抗體水平無顯著性差異。(三)實驗討論及化合物評價
脂質(zhì)代謝障礙的病人極易發(fā)生動脈粥樣硬化，具有很高的患冠心病的風(fēng)險，降低血 漿中低密度脂蛋白膽固醇(LDL)或升高HDL既是抗AS的重要機制，也是預(yù)防心血管 疾病發(fā)生發(fā)展的一個重要措施。我們的實驗結(jié)果提示，Xyloketal B能夠降低ApoE基因缺陷動脈粥樣硬化小 鼠血清中LDL-C水平，升高其HDL-C水平。其調(diào)血脂強度與辛伐他汀無顯著性差 異。Xyloketal B還能夠減低降低血清中抗Ox-LDL自身抗體水平，這一作用可能得益于 Xyloketal B的抗氧化應(yīng)激作用。LDL升高是AS發(fā)生發(fā)展過程中一個最重要的病理生理學(xué)機制。當(dāng)血漿LDL 水平升高時，可促使動脈內(nèi)膜產(chǎn)生氧自由基及其他代謝產(chǎn)物，使進(jìn)入內(nèi)皮的LDL發(fā)生氧 化，成為Ox-LDL，Ox-LDL能抑制其本身與受體結(jié)合，并抑制巨噬細(xì)胞移動，因而不 能像正常LDL那樣移出內(nèi)膜或被巨噬細(xì)胞所清除，于是便大量沉積在內(nèi)膜下。沉積的 Ox-LDL可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加和內(nèi)皮功能損傷，使LDL向動脈內(nèi)膜下的遷移進(jìn)一 步增加。此外Ox-LDL還促使內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞介素-6 (IL-6)、腫瘤壞死因子-a
(TNF-a )，并促使血管細(xì)胞表面黏附因子-1 (VCAM-1)的大量產(chǎn)生，使血流中的 單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附并大量進(jìn)入內(nèi)皮下，攝取脂質(zhì)并轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞，后者進(jìn)一步 攝取脂質(zhì)而轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞，粥樣斑塊進(jìn)一步發(fā)展增大。血漿中HDL是拮抗AS發(fā)生發(fā)展的保護性因素。大量流行病學(xué)研究和動物實驗 表明，血漿HDL水平與AS的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)，當(dāng)血漿LDL-膽固醇水平降低，HDL-膽固 醇水平升高時，膽固醇可以從動脈粥樣硬化斑塊中被清除。HDL有抗動脈粥樣硬化發(fā)生 發(fā)展的作用已得到肯定。臨床上治療高脂血癥的藥物大多數(shù)能明顯增加HDL-膽固醇水 平，如煙酸和他汀類藥物。LDL在機體內(nèi)氧化修飾后產(chǎn)生Ox-LDL，Ox-LDL具有免疫原性，能刺激機體 產(chǎn)生抗Ox-LDL抗體，血清中因此能檢測到抗Ox-LDL自身抗體。目前公認(rèn)，Ox_LDL 自身抗體的增加是體內(nèi)LDL氧化易感性增加的一個生物標(biāo)志物，反映機體氧化應(yīng)激的水 平?；加信c氧化應(yīng)激有關(guān)疾病的病人，血清中抗Ox-LDL自身抗體增加。Ox-LDL和 抗Ox-LDL抗體在斑塊內(nèi)形成的免疫復(fù)合物可促進(jìn)脂質(zhì)向單核/巨噬細(xì)胞的集中，可激 活泡沫細(xì)胞分泌各種炎癥因子?？贵w水平的高低可作為預(yù)測急性冠脈事件和評價動脈粥 樣硬化危險的因子。Xyloketal B的抗Ox_LDL抗體水平與辛伐他汀無顯著差異，說明 Xyloketal B具有抗Ox_LDL抗體的作用。實施例3 Xyloketal B對動脈粥樣硬化小鼠斑塊內(nèi)成分和動脈內(nèi)皮損傷的影響 (一)材料與方法
1、藥物準(zhǔn)備，動物模型分組、給藥方法見實施例1
2、其它實驗材料Mac-3( BD Bio sciences)、CD31 ( [PECAM-1]) (BD Pharmingen) 防脫載玻片、顯微鏡蓋玻片、鼠兩步法檢測試劑盒、兔兩步法檢測試劑 盒、DAB顯色試劑盒、免疫熒光二抗(均購自北京中杉金橋生物公司)、中性樹脂膠(北京化學(xué)試劑四廠)、丙酮(廣州市化學(xué)試劑有限公司)。3、免疫組化和免疫熒光檢測方法
免疫組化實驗步驟(1)冰凍切片使用一 20°C丙酮固定10分鐘，PBS洗5分鐘。 (2) 0.3%H202甲醇液(封閉內(nèi)源性酶)10分鐘。(3)水洗后經(jīng)PBS洗2次。(4) 牛血清白蛋白室溫孵育30分鐘。(5)甩掉牛血清白蛋白滴加適當(dāng)稀釋度的特異性抗 體，置濕盒中4°C過夜。(6) PBS洗3次，每次5分鐘。(7)滴加適當(dāng)稀釋的酶標(biāo)抗體 標(biāo)本上，37 °C孵育30分鐘。(8) PBS洗3次，每次5分鐘。(9)顯色。在酶的底物 溶液中於顯微鏡下觀察控制呈色反應(yīng)，以結(jié)果清晰，背景無非特異性染色為度。(10) 自來水充分沖洗。(11)用Mayer，s蘇木素復(fù)染胞核。(12)封片。DAB呈色，可 經(jīng)酒精脫水，二甲苯透明，樹膠封片。(13)對照染色。設(shè)空白對照、陽性對照。免疫熒光實驗步驟(1)冰凍切片使用一 20°C丙酮固定10分鐘，PBS洗5分 鐘。(2)水洗后經(jīng)PBS洗2次。(3)牛血清白蛋白室溫孵育30分鐘。(4)甩掉 牛血清白蛋白滴加適當(dāng)稀釋度的特異性抗體，置濕盒中4°C過夜。(5) PBS洗3次，每 次5分鐘。(6)滴加適當(dāng)稀釋的熒光標(biāo)記抗體標(biāo)本上，37°C孵育30分鐘。(11)用 DAPI復(fù)染胞核，5分鐘。(12)封片。(13)對照染色。設(shè)空白對照、陽性對照。(二)實驗結(jié)果
1、不同實驗組小鼠主動脈竇斑塊內(nèi)mac-3的比較
如圖5所示，模型組和溶劑對照組的主動脈竇斑塊基底部可見明顯mac-3特異性染 色，特異性染色部位延伸至斑塊核心及斑塊肩部。辛伐他汀組和Xyloketal B防治組斑塊 內(nèi)染色不明顯，外膜側(cè)的染色改變也不明顯，提示辛伐他汀和Xyloketal B能夠有效地抑 制斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞的沉積。2、不同實驗組小鼠主動脈根部PECAM-1免疫熒光結(jié)果
如圖6所示，PECAM-1特異性染色為紅色熒光，用以觀察內(nèi)皮的結(jié)構(gòu)。細(xì)胞核采 用DAPI染色，呈藍(lán)色。如圖7所示，模型組和溶劑對照組的血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)不完整呈蟲 蝕狀，血管內(nèi)皮損傷嚴(yán)重，斑塊內(nèi)部有大量的新生血管。辛伐他汀組和Xyloketal B防治 組與未治療AS實驗組相比，內(nèi)皮較完整，光滑，血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷程度明顯減輕，提 示Xyloketal B能恢復(fù)血管內(nèi)皮層的連續(xù)性和完整性。(三)實驗討論及化合物評價
動脈粥樣斑塊內(nèi)有大量的巨噬細(xì)胞和脂質(zhì)沉積。斑塊巨噬細(xì)胞與脂蛋白相互作用貫 穿斑塊的形成和發(fā)展過程。一方面巨噬細(xì)胞通過細(xì)胞內(nèi)多種酶(如脂氧化酶)和活性氧 對LDL起氧化修飾作用，使細(xì)胞表現(xiàn)出一定的泡沫化傾向。另一方面，正常細(xì)胞表面 存在的低密度脂蛋白受體(LDL receptor, LDL-R)能夠攝取天然LDL，這一作用受到細(xì) 胞內(nèi)膽固醇的反饋性抑制，以避免LDL-R過多攝取天然LDL。當(dāng)天然LDL被氧化修飾 形成ox-LDL后，它不再被LDL-R識別，而是經(jīng)巨噬細(xì)胞上的ox_LDL受體識別而被攝 取。由于該受體途徑不存在反饋性抑制，因而巨噬細(xì)胞不斷攝取ox-LDL，最終導(dǎo)致泡沫 細(xì)胞的形成。本實驗提示Xyloketal B能夠顯著減少粥樣斑塊內(nèi)的巨噬細(xì)胞的沉積，但具 體機制尚不清楚。內(nèi)皮功能不全不僅是形成動脈粥樣硬化病變的始動因素，也貫穿整個動脈粥樣 硬化發(fā)生發(fā)展過程。功能不全的內(nèi)皮細(xì)胞合成分泌一氧化氮(NO)及前列環(huán)素等舒張
9血管的活性物質(zhì)減少，表達(dá)多種炎癥因子增多，促進(jìn)炎癥的發(fā)生，并導(dǎo)致斑塊穩(wěn)定性減 弱。本實驗表明XyloketalB能恢復(fù)血管內(nèi)皮層的連續(xù)性和完整性，保護血管內(nèi)皮。
權(quán)利要求
1.XyloketalB在制備抗動脈粥樣硬化藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述抗動脈粥樣硬化包括縮小粥樣硬化斑 塊面積、保護血管內(nèi)皮、調(diào)節(jié)血脂水平、抗氧化應(yīng)激中的一種或幾種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述調(diào)節(jié)血脂水平是指降低LDL-C、升 高HDL-C中的一種或兩種。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述抗氧化應(yīng)激是指抗Ox-LDL抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了Xyloketal B在制備抗動脈粥樣硬化藥物中的應(yīng)用。實驗證明，Xyloketal B對動脈粥樣硬化損傷具有縮小斑塊面積和調(diào)血脂作用，可以通過保護血管內(nèi)皮、調(diào)節(jié)血脂水平，如降低LDL-C、升高HDL-C和體內(nèi)抗氧化應(yīng)激等多種作用機制防治動脈粥樣硬化。本發(fā)明Xyloketal B在制備抗動脈粥樣硬化藥物中的應(yīng)用開拓了Xyloketal B的新應(yīng)用領(lǐng)域，并且Xyloketal B安全無毒，藥理作用強，有很好的藥用前景。
文檔編號A61P9/14GK102018699SQ20101058659
公開日2011年4月20日 申請日期2010年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月14日
發(fā)明者劉捷, 劉燦昭, 龐冀燕, 林永成, 王冠蕾, 解煜 申請人:中山大學(xué)