專利名稱：重組對(duì)蝦蛋白sf-p9及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)、藥物，以及動(dòng)物、植物病害防治領(lǐng)域。更具體涉及一種含有對(duì)蝦肽基因penaeidine的重組基因工程菌株P(guān)icAia pas tor is X-33/pPIC6 α A/Pen, 一種重組對(duì)蝦蛋白SF-P9的氨基酸序列及其對(duì)應(yīng)的DNA序列，一種對(duì)蝦蛋白F-P6的氨基酸序列及其對(duì)應(yīng)的DNA序列，以及含對(duì)蝦蛋白SF-P9和F-P6的藥物組合物。同時(shí)還涉及一種表達(dá)重組對(duì)蝦蛋白SF-P9的酵母重組基因工程菌株/7ZcAia pas tor is X_33/pPIC6 α A/Pen 的構(gòu)建方法，本發(fā)明涉及的對(duì)蝦蛋白SF-P9和F-P6具有明顯的抗革蘭氏陽性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌感染的生物學(xué)活性，以及抗真菌感染活性和抗病毒感染的生物學(xué)活性，同時(shí)還涉及對(duì)蝦蛋白SF-P9和F-P6具有抑殺腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)活性。對(duì)蝦蛋白SF-P9和F-P6作為制備治療或預(yù)防動(dòng)物和植物的細(xì)菌、真菌、病毒病和腫瘤病的藥物中的用途，同時(shí)還涉及對(duì)蝦蛋白SF-P9和F-P6在醫(yī)藥、化妝品、食品、飼料等產(chǎn)品制劑中的用途。
背景技術(shù)：
抗菌肽廣泛分布于哺乳動(dòng)物、兩棲動(dòng)物、甲殼動(dòng)物、軟體動(dòng)物、植物和昆蟲等多種生物體內(nèi)(Ryan et al. , 1998, Harder et al. , 1997, Chan et al. , 1996, Destoumieux et al.,1997, Chan Bae Park. , 1997, Francisco et al. , 1998, Cociancich et al.，1994)。 抗菌肽是特定基因編碼的一類小分子多肽，具有廣譜高效的抗細(xì)菌活性，某些抗菌肽還具有抗真菌、抗原蟲、抗病毒、抗腫瘤細(xì)胞的功能(張永蓮等，2002，Michael C et al., 2003Leuschner et al，2004，Mader et al，2005)。對(duì)蝦抗菌肽Penaeidin是普遍存在于對(duì)蝦中的一類活性物質(zhì)。在大西洋白對(duì)蟲下(Litopenaeus setiferus)、斑節(jié)對(duì)蟲下(Peneaus monodon)、中國對(duì)蟲下(Fenneropenaeus chinensis)禾口曰本對(duì)蟲下(Penaeus japonicus)等甲殼動(dòng)物中均有 Penaeidins0 Penaeidin 在蝦類的先天免疫應(yīng)答中具有重要的作用(BachSre et al，2004)。目前，已發(fā)現(xiàn)PEN2、 PEN3、PEN4 (PenBase V2. 1) 3 個(gè)亞群(subgroup)。Penaeidins在一級(jí)、二級(jí)結(jié)構(gòu)上具有抗菌肽的基本共性，但在結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能上的共同特征是(1)分子量小。(2)都是陽離子肽(等電點(diǎn)分別為9. 34，另一個(gè)的等電點(diǎn)為 9. 84)。(3)N-端富含脯氨酸Pro，推測(cè)Penaeidins富含脯氨酸的N-端結(jié)構(gòu)介導(dǎo)Penaeidin 與靶細(xì)胞的相互作用而非直接發(fā)揮抗菌活性。同時(shí)，Penaeidins的富含脯氨酸結(jié)構(gòu)域決定了抗微生物肽的靶微生物的種類特異性。(4) C-端富含半胱氨酸Cys，C端含有6個(gè)半胱氨酸，具有3個(gè)分子內(nèi)二硫鍵，C端成環(huán)狀(Destoumieux et al，1997)。C-端富含Cys區(qū)域表面具有抗菌活性所必需的疏水性特點(diǎn)，從而Penaeidins具有對(duì)革蘭氏陽性菌G+和革蘭氏陰性菌G-的廣譜抗菌活性。(5)PenaeidinS C-端區(qū)域具有一個(gè)保守的幾丁質(zhì)結(jié)合模體，具有粘合幾丁質(zhì)的特性(BachSre et al，1999)。Penaeidins通過與真菌細(xì)胞壁上的幾丁質(zhì)相互作用而發(fā)揮其抗真菌活性。(6) Penaeidins具有翻譯后修飾的特性，如成熟 Penaeidin-2和Penaeidinla的C-端以酰胺化形式存在，這種翻譯后修飾可能與穩(wěn)定蛋白的螺旋結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)多肽與細(xì)胞膜之間的靜電作用相關(guān)。(7) Penaeidins的N端和C端可協(xié)同作用。Penaeidins的N端帶正電，自由伸展，該區(qū)域先微弱地錨定到細(xì)胞膜上。由于C 端具有疏水性，高度穩(wěn)定，故C端與細(xì)胞膜的疏水相互作用加強(qiáng)這種錨定效果。最后，肽鏈粘貼在細(xì)胞膜表面，或者插入膜上的孔洞而發(fā)揮作用(Yang et al，2003)。兩種結(jié)構(gòu)域的協(xié)同作用決定了 penaeidin對(duì)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的廣譜抗菌活性。對(duì)蝦肽 penaeidin具有抗細(xì)菌、抗真菌、抗病毒、抗腫瘤的作用(Destoumieux et al, 1999，Cuthbertson et al，2002)。同時(shí)，Penaeidin參與噬菌細(xì)胞對(duì)細(xì)菌的識(shí)別過程， 使細(xì)菌凝聚，增強(qiáng)免疫細(xì)胞的能力(Munoz et al，2002)。對(duì)蝦肽penaeidin具有廣闊的應(yīng)用前景。傳統(tǒng)抗生素通過阻斷大分子生物合成的機(jī)制而發(fā)揮抗菌活性。目前，致病菌的抗藥性日益嚴(yán)重，迫使人們尋找新一代的抗菌藥代替抗生素。Penaeidins具有廣譜抗菌作用， 其抗菌機(jī)理獨(dú)特，不易導(dǎo)致病原體耐藥性。同時(shí)，Penaeidins分子較小，對(duì)熱穩(wěn)定，水溶性好，對(duì)宿主無毒副作用。Penaeidins有望成為一類無毒、無殘留的新型抗菌、抗病毒、抗腫瘤藥物。Penaeidins還可作為一種新型環(huán)保的飼料添加劑，并改善養(yǎng)殖水體。

發(fā)明內(nèi)容
在本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供了一種重組對(duì)蝦蛋白SF-P9，一種表達(dá)重組對(duì)蝦蛋白 SF-P9的酵母基因工程菌株，重組對(duì)蝦蛋白SF-P9的制備方法，一種含有效劑量重組對(duì)蝦蛋白SF-P9的藥物組合物，以及重組對(duì)蝦蛋白SF-P9在制備治療或預(yù)防抗細(xì)菌感染藥物、抗真菌感染藥物、抗病毒感染藥物、抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供了一種重組對(duì)蝦蛋白SF-P9，該蛋白包括SEQ ID No. 2 所示的氨基酸序列。本發(fā)明的目的之一在于提供了一種DNA分子，該DNA分子編碼上述的重組對(duì)蝦蛋白SF-P9。較佳的，所述的DNA分子編碼包括SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列的融合蛋白。 更佳的，所述的DNA分子包括SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。本發(fā)明的目的之一在于提供一種含有南美白對(duì)蝦Penaeidin基因的重組基因工程酵母菌株，其特征在于該菌株是一種高效、分泌表達(dá)重組對(duì)蝦蛋白SF-P9的重組基因工程菌株/7ZcAia pas tor is X_33/pPIC6 α A/Pen，該菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC No: M209126。利用該基因工程菌株P(guān)icAia pas tor is X-33/ pPIC6 α A/Pen，可高效、穩(wěn)定地分泌表達(dá)基因工程重組對(duì)蝦蛋白SF-P9。本發(fā)明在構(gòu)建對(duì)蝦肽penaeidin基因工程菌株、表達(dá)對(duì)蝦抗菌肽的同時(shí)，采取融合蛋白表達(dá)方式，選擇畢赤酵母X-33宿主，構(gòu)建了對(duì)蝦肽penaeidin分泌型表達(dá)載體，構(gòu)建了畢赤酵母重組基因工程菌株P(guān)icAia pastor is X_33/pPIC6 α A/Pen。利用畢赤酵母重組基因工程菌株/7ZcAia pastor is X_33/pPIC6 α A/Pen,分泌表達(dá)了重組融合對(duì)蝦蛋白SF-P9。本發(fā)明的目的之一是在于提供了一種表達(dá)重組對(duì)蝦蛋白SF-P9的酵母重組基因工程菌株/7ZcAia pas tor is X_33/pPIC6 α A/Pen的構(gòu)建方法，方法簡便，操作方便，該宿主細(xì)胞包含重組對(duì)蝦蛋白SF-P9的核苷酸序列。本發(fā)明通過基因工程技術(shù)，采用酵母基因工程菌株制備對(duì)蝦抗菌肽，具有生產(chǎn)步驟簡單、成本低、產(chǎn)量高的特征。這種畢赤酵母表達(dá)體系具有外源基因——對(duì)蝦肽penaeidin整合穩(wěn)定、分泌表達(dá)重組融合對(duì)蝦蛋白SF-P9、發(fā)酵工藝成熟、宿主細(xì)胞能迅速生長進(jìn)行高密度發(fā)酵的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明通過篩選獲得高效分泌表達(dá)重組融合對(duì)蝦蛋白SF-P9的畢赤酵母基因工程菌株，通過優(yōu)化畢酵母發(fā)酵條件提高重組融合對(duì)蝦蛋白SF-P9的表達(dá)量。本發(fā)明的目的之一還在于提供一種重組對(duì)蝦蛋白SF-P9的制備方法。利用重組基因工程菌株/7ZcAia pas tor is X_33/pPIC6 α A/Pen，表達(dá)重組對(duì)蝦蛋白SF-P9。采用Ni2+柱親和層析法，獲得純化的基因工程重組對(duì)蝦蛋白SF-P9。該表達(dá)量高，并且是分泌、融合表達(dá)，安全性高，利于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明的目的之一是在于提供一種具有生物活性的重組對(duì)蝦蛋白SF-P9，其分子量為約9. 1 kDa。該蛋白具有廣譜抗菌作用，對(duì)革蘭氏陽性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌均具有明顯的抗菌活性；對(duì)真菌的感染均具有明顯的抗真菌活性；對(duì)病毒的感染具有明顯的抗病毒活性；具有明顯的抑制腫瘤細(xì)胞生長的活性。本發(fā)明的目的之一在于提供了一種藥物組合物，該組合物包含有效劑量的上述重組對(duì)蝦蛋白SF-P9，以及藥學(xué)上可接受的增效劑、乳化劑、穩(wěn)定劑、粘附劑、稀釋劑或賦形劑或膠囊劑或載體。本發(fā)明還涉及重組對(duì)蝦蛋白SF-P9在制備治療或預(yù)防細(xì)菌感染藥物中的應(yīng)用本發(fā)明還涉及重組對(duì)蝦蛋白SF-P9在制備治療或預(yù)防真菌感染藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及重組對(duì)蝦蛋白SF-P9在制備治療或預(yù)防病毒感染藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所制備的對(duì)蝦蛋白SF-P9是一種融合蛋白。對(duì)蝦蛋白SF-P9具有抗細(xì)菌、 抗真菌、抗病毒等微生物的生物學(xué)活性，對(duì)蝦蛋白SF-P9對(duì)革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、 真菌、病毒等均具抑制作用，并且對(duì)蝦蛋白SF-P9在很低的濃度下即可抑制微生物生長。因此，對(duì)蝦蛋白SF-P9可替代傳統(tǒng)抗生素，作為新一代的抗菌藥和抗病毒藥來源，對(duì)提高生物醫(yī)藥、畜產(chǎn)品品質(zhì)，推動(dòng)綠色生物科技的發(fā)展具有非常重要的意義和廣闊的應(yīng)用前景。本發(fā)明還涉及重組對(duì)蝦蛋白SF-P9在制備治療或預(yù)防腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所制備的對(duì)蝦蛋白SF-P9具有抑制腫瘤細(xì)胞生長、對(duì)腫瘤細(xì)胞具有殺傷或抑制作用的生物學(xué)活性。因此，對(duì)蝦蛋白SF-P9可作為一種新型抗腫瘤藥物，用于各種惡性腫瘤的治療，具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。在本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供了一種對(duì)蝦蛋白F-P6，對(duì)蝦蛋白F-P6的制備方法， 一種含有效劑量對(duì)蝦蛋白F-P6的藥物組合物，以及對(duì)蝦蛋白F-P6在制備治療或預(yù)防抗細(xì)菌感染藥物、抗真菌感染藥物、抗病毒感染藥物、抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供了一種對(duì)蝦蛋白F-P6，該蛋白包括SEQ ID No. 4所示的氨基酸序列。本發(fā)明的目的之一在于提供了一種DNA分子，該DNA分子編碼上述的對(duì)蝦蛋白 F-P6.較佳的，所述的DNA分子編碼包括SEQ ID No. 4所示的氨基酸序列的融合蛋白。更佳的，所述的DNA分子包括SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列。本發(fā)明的目的之一在于提供一種對(duì)蝦蛋白F-P6的制備方法。采用腸激酶切割對(duì)蝦蛋白SF-P9，制備對(duì)蝦蛋白F-P6。本發(fā)明的目的之一是在于提供一種具有生物活性的對(duì)蝦蛋白F-P6，其分 子量為約 6.3 kDa。該蛋白具有廣譜抗細(xì)菌作用；對(duì)真菌的感染均具有明顯的抗菌活性；對(duì)病毒的感染具有明顯的抗病毒活性；具有明顯的抑制腫瘤細(xì)胞生長的活性。本發(fā)明的目的之一在于提供了一種藥物組合物，該組合物包含有效劑量的上述對(duì)蝦蛋白F-P6，以及藥學(xué)上可接受的增效劑、乳化劑、穩(wěn)定劑、粘附劑、稀釋劑或賦形劑或膠囊劑或載體。本發(fā)明涉及對(duì)蝦蛋白F-P6在制備治療或預(yù)防細(xì)菌感染藥物中的應(yīng)用本發(fā)明涉及對(duì)蝦蛋白F-P6在制備治療或預(yù)防真菌感染藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明涉及對(duì)蝦蛋白F-P6在制備治療或預(yù)防病毒感染藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所制備的對(duì)蝦蛋白F-P6具有抗細(xì)菌、抗真菌、抗病毒等微生物的生物學(xué)活性。因此，對(duì)蝦蛋白F-P6可替代傳統(tǒng)抗生素，作為新一代的抗菌藥和抗病毒藥來源。本發(fā)明涉及對(duì)蝦蛋白F-P6在制備治療或預(yù)防腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所制備的對(duì)蝦蛋白F-P6具有抑制腫瘤細(xì)胞生長、對(duì)腫瘤細(xì)胞具有殺傷或抑制作用的生物學(xué)活性。的生物學(xué)活性。因此，對(duì)蝦蛋白F-P6可作為一種新型抗腫瘤藥物， 用于各種惡性腫瘤的治療，
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物包括有效劑量的對(duì)蝦蛋白SF-P9或者對(duì)蝦蛋白F-P6，以及藥學(xué)上可接受的增效劑、乳化劑、穩(wěn)定劑、粘附劑、 稀釋劑或賦形劑或膠囊劑或載體。因此，組合物可以是片劑、膠囊劑、顆粒劑、溶液劑、混懸齊U、乳劑、凝膠劑、納米制劑等。組合物可制成單元或多元?jiǎng)┬?，各種劑型包含為了產(chǎn)生所期望的治療或者預(yù)防效果的預(yù)定量活性成分——對(duì)蝦蛋白SF-P9或者對(duì)蝦蛋白F-P6，以及合適的藥劑學(xué)稀釋 劑或賦形劑或膠囊劑等。該藥物組合物在醫(yī)藥、化妝品、食品、飼料等產(chǎn)品制劑中，可根據(jù)具體情況采用有效劑量的對(duì)蝦蛋白SF-P9或者對(duì)蝦蛋白F-P6。其中，本發(fā)明涉及的對(duì)蝦蛋白SF-P9和F-P6 具有明顯的抗細(xì)菌、抗真菌和抗病毒感染活性。對(duì)蝦蛋白SF-P9和F-P6具有抑殺腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)活性。對(duì)對(duì)蝦蛋白SF-P9和F-P6可應(yīng)用于治療或預(yù)防動(dòng)物和植物的細(xì)菌、真菌、 病毒病和腫瘤病，以及醫(yī)藥、化妝品、食品、飼料等產(chǎn)品制劑中。 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施
本發(fā)明以南美白對(duì)蝦為材料，提取總RNA，設(shè)計(jì)特異引物Pl和P2。上游引物Pl: 5’ GAATTCTACAGGGGCGGTTACACA 3'。下游引物 P2:5，TCTAGAGCCTTGTCATCGTCATCTCCTTTTACTA AGTGACAACA 3，。通過RT_PCR、PCR擴(kuò)增，得到其Penaeidin成熟肽編碼區(qū)序列，核苷酸序列為
tacaggggcg gttacacagg cccgataccc aggccaccac ccattggaag accaccgttc60
agacctgttt gcaatgcatg ctacagactt tccgtctcag atgctcgcaa ttgctgcatc 120 aagttcggaa gctgttgtca cttagtaaaa gga153
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種編碼重組對(duì)蝦蛋白SF-P9對(duì)應(yīng)的核酸，其序列為SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所提供的一種重組對(duì)蝦蛋白SF-P9，其序列為 SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。該蛋白為基因工程融合蛋白，其N端氨基酸是EF。其C 端氨基酸是DDDDKALEQKLISEEDLNSAVDHHHHHH。其中含有Penaeidin成熟肽編碼區(qū)所對(duì)應(yīng)的氨基酸序列YRGGYTGPIPRPPPIGRPPFRPVCNACYRLSVSDARNCCIKFGSCCHLVKG
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所用PPIC6 α A質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)下游帶有His. Tag，表達(dá)的重組對(duì)蝦蛋白SF-P9為分泌的融合蛋白，其分子質(zhì)量約9. 1 kDa。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，通過PCR引物的設(shè)計(jì)，在對(duì)蝦Penaeidin成熟肽編碼區(qū)下游引入腸激酶位點(diǎn)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種宿主細(xì)胞——Pichia pastor is X33，該宿主細(xì)胞基因組包含編碼本發(fā)明所述的重組對(duì)蝦蛋白SF-P9的核苷酸序列，或者包含編碼本發(fā)明所述的重組對(duì)蝦蛋白SF-P9的DNA片斷。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種畢赤酵母重組基因工程菌株，該菌株分類命名為畢赤酵母 X-33/pPIC6a A/Pen Pichia pas tor is X_33/pPIC6 a A/Pen。保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址中國.武漢.武漢大學(xué)，保藏日期2009年6月20 曰，保藏編號(hào)CCTCC No: M209126o在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種表達(dá)重組對(duì)蝦蛋白SF-P9的畢赤酵母重組基因工程菌株/7ZcAia pas tor is X_33/pPIC6 a A/Pen的制備方法。它包括下列步驟
Α、南美白對(duì)蝦總RNA的提取及cDNA第一條鏈的合成采集南美白對(duì)蝦血淋巴，獲得血細(xì)胞，提取總 RNA，并按 Promega 公司 Universal Riboclone cDNA Synthesis System 試劑盒操作手冊(cè)進(jìn)行，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈。B、PCR擴(kuò)增Penaeidin基因以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA第一條鏈為模板，上游引物Pl 5，GAATTCTACAGGGGCGGTTACACA 3，(下劃線處為內(nèi)切酶位點(diǎn))。下游引物P2:5’I￡ TAGAGCCTTGTCATCGTCATCTCCTTTTACTAAGTGACAACA 3，(下劃線處為內(nèi)切酶損aI 位點(diǎn))。利用PCR儀擴(kuò)增，獲得獲得191 bp目的基因片段。C、重組質(zhì)粒pGEM-T/Pen的構(gòu)建和鑒定回收PCR產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物連接到pGEM_T (購自Promega公司)載體上，轉(zhuǎn)化五coli JM109 (購自hvitrogen公司)感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含X-gal、IPTG和Amp抗性的LB平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，用PCR和限制性內(nèi)切酶酶切鑒定、DNA測(cè)序分析鑒定重組質(zhì)粒pGEM-T/Pen。D、重組穿梭質(zhì)粒pPIC6 α A/Pen的構(gòu)建和鑒定用和損aI分別雙酶切質(zhì)粒 pPIC6 α A (購自hvitrogen公司)和質(zhì)粒pGEM-T/Pen DNA，將Penaeidin基因定向插入質(zhì)粒pPIC6aA，轉(zhuǎn)化五coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，在含300 μ g/ml殺稻瘟素(Blasticidin)的 LB平板上篩選陽性克隆，獲得大腸桿菌菌株五cWi JM109 (pPIC6aA/Pen)。用PCR、限制性內(nèi)切酶酶切鑒定和DNA測(cè)序分析鑒定重組穿梭質(zhì)粒pPIC6 a A/Pen。Ε、重組穿梭質(zhì)粒pPIC6 a A/Pen轉(zhuǎn)化PicAia pas tor is X-33，獲得畢赤酵母重組基因工程菌株 PicAia pas tor is X_33/pPIC6 a A/Pen。a. 重組穿梭質(zhì)粒pPIC6 α A/Pen DNA的線性化制備質(zhì)粒pPIC6 α A/Pen DNA 15-20μ g，經(jīng)RNaseA消化，然后用限制性內(nèi)切酶fee I進(jìn)行酶切線性化，沉淀過夜。b. Pichia pas tor is X-33 感受態(tài)細(xì)胞的制備挑取 PicAia pas tor is X-33 單菌落，QPichia pas tor is X-33 購自 hvitrogen 公司。)接種于 5mlYPD 中，30°C、260rpm 振搖培養(yǎng)過夜，離心收集菌體，經(jīng)0. IM LiCl處理制備PicAia pas tor is X_33感受態(tài)細(xì)胞。c.轉(zhuǎn)化采用線性化的重組穿梭質(zhì)粒pPIC6 α A/Pen DNA轉(zhuǎn)化PicAia pastor is X-33感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含300 μ g/ml殺稻瘟素(Blasticidin)的YPD平板上。30°C，培養(yǎng) 2^3天，觀察單菌落的形成。同時(shí)，按同樣方法轉(zhuǎn)化線性化空載體質(zhì)粒PPIC6 α Α,作為陰性對(duì)照。F. 畢赤酵母重組基因工程菌株P(guān)icAia pasioris X-33/pPIC6 α A/Pen的篩選與鑒定提取畢赤酵母重組基因工程菌株A'cAia pas tor is X_33/pPIC6 α A/Pen基因組， Wichia pas tor is X_33/pPIC6 α A/Pen基因組DNA為模板，用酵母醇氧化酶通用引物p5 ‘ AOXl 與 p3 ‘ AOXl 進(jìn)行 PCR 鑒定，同時(shí)設(shè) PicAia pas tor is X_33/pPIC6 α A 基因組 DNA 和 PicAia pas tor is X-33 基因組 DNA 兩個(gè)對(duì)照。畢赤酵母重組基因工程菌株P(guān)icAia pas tor is X_33/pPIC6 α A/Pen的鑒定結(jié)果結(jié)果表明目的基因penaeidin已被準(zhǔn)確地整合到畢赤酵母PicAia pas tor is X-33基因組的特定位點(diǎn)中。G.測(cè)序結(jié)果表明penaeidin基因已正確定向整合到畢赤酵母PicAia pas tor is X-33基因組的特定位點(diǎn)中。一種基因工程表達(dá)、分離和純化的重組對(duì)蝦蛋白SF-P9，其序列為SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列。一種基因工程表達(dá)、分離和純化的重組對(duì)蝦蛋白SF-P9 對(duì)應(yīng)的核酸，其序列為SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種利用畢赤酵母重組基因工程菌株P(guān)ichiei pastor is X_33/pPIC6 α A/Pen表達(dá)對(duì)蝦蛋白SF-P9的方法。它包括下列步驟
A、挑取畢赤酵母重組基因工程菌株P(guān)icAia pas tor is X_33/pPIC6 α A/Pen單菌落，接種于25ml BMGY培養(yǎng)液中。，300rpm,培養(yǎng)至0D6(I(I=2. 0 6. 0。用滅菌離心管，5000rpm離心lOmin，收集菌體，轉(zhuǎn)接到IOOmL BMMY液體培養(yǎng)基中。B,28°C,300rpm振搖培養(yǎng)96 h，其中每隔12 h按培養(yǎng)液的0. 5%體積補(bǔ)充無水甲
醇，誘導(dǎo)表達(dá)重組對(duì)蝦蛋白SF-P9。C、誘導(dǎo)6 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h后，分別取樣，15, OOOrpm 離心lOmin，收集發(fā)酵上清，上清樣品于_80°C低溫冷凍保存。D、采用 16% Tricine-SDS-PAGE 和 Western Blot 方法，檢測(cè)對(duì)蝦蛋白 SF-P9 的表達(dá)。16% Tricine-SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，畢赤酵母重組基因工程菌株P(guān)icAia pas tor is X-33/pPIC6 α A/Pen在甲醇誘導(dǎo)前無表達(dá)。陰性對(duì)照畢赤酵母菌株P(guān)icAia pas tor is X_33/ pPIC6 α A經(jīng)甲醇誘導(dǎo)后72h，無表達(dá)。畢赤酵母重組基因工程菌株P(guān)icAia pas tor is X_33/ 卩扣6(1六^^11經(jīng)甲醇誘導(dǎo)后對(duì)、48、72、96 h后，均表達(dá)了基因工程重組對(duì)蝦蛋白SF-P9， SF-P9分子量與預(yù)期相符，為約9. 1 kDa。畢赤酵母重組基因工程菌株P(guān)icAia pas tor is X-33/pPIC6 α A/Pen經(jīng)甲醇誘導(dǎo)24h后，開始少量表達(dá)基因工程重組對(duì)蝦蛋白SF-P9。隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長，誘導(dǎo)48、7 后，SF-P9表達(dá)量逐漸增大，72h表達(dá)量達(dá)到最大。Western Blot的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明畢赤酵母重組基因工程菌株P(guān)icAia pas tor is X-33/pPIC6aA/Pen經(jīng)甲醇誘導(dǎo)，表達(dá)了基因工程重組對(duì)蝦蛋白SF-P9。該蛋白質(zhì)帶能和兔抗南美白對(duì)蝦penaeidin蛋白抗血清發(fā)生特異性反應(yīng)，所設(shè)對(duì)照PicAia pastor is X_33/ PPIC6 α A蛋白質(zhì)帶均不能與兔抗南美白對(duì)蝦penaeidin蛋白抗血清反應(yīng)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種制備對(duì)蝦蛋白SF-P9的方法。它包括下列步驟
A、挑取畢赤酵母重組基因工程菌株P(guān)icAia pas tor is X_33/pPIC6 α A/Pen單菌落，接種于25ml BMGY培養(yǎng)液中。，300rpm,培養(yǎng)至0D6(I(I=2. 0 6. 0。用滅菌離心管，5000rpm離心lOmin，收集菌體，轉(zhuǎn)接到IOOmL BMMY液體培養(yǎng)基中。B,28°C,300rpm振搖培養(yǎng)96 h，其中每隔12 h按培養(yǎng)液的0. 5%體積補(bǔ)充無水甲醇。C、誘導(dǎo)72 h后，15，OOOrpm離心lOmin，收集發(fā)酵上清，上清樣品于_80°C冷凍保存。
9
D、上清樣品用1 XBinding Buffer透析、然后用0. 45 μ m的濾膜過濾。樣品循環(huán)方式通過Ni++柱，使帶有6 XHis的蛋白樣品流動(dòng)相充分與Ni++柱中的Ni++相結(jié)合。分別采用IXBinding Buffer ;60mM咪唑；IOOmM咪唑；150mM咪唑梯度洗滌留在柱內(nèi)的少量樣品和與Ni++柱結(jié)合的非目的蛋白。用IXElute Buffer洗脫與Ni++柱結(jié)合的目的蛋白，分部收集。E、采用 16% Tricine-SDS-PAGE 和 Western Blot 方法，用考馬斯亮藍(lán) R250 染色檢測(cè)樣品中重組對(duì)蝦蛋白SF-P9。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明純化樣品有約為9. 1 kDa的單一特異性蛋白質(zhì)SF-P9條帶。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，檢測(cè)了對(duì)蝦蛋白SF-P9的生物活性。對(duì)蝦蛋白SF-P9具有廣譜抗菌作用，對(duì)革蘭氏陽性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌的感染均具有明顯的抗菌活性；對(duì)真菌的感染均具有明顯的抗菌活性；對(duì)病毒的感染具有明顯的抗病毒活性；具有明顯的抑制腫瘤細(xì)胞生長的活性。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，采用噻唑藍(lán)(MTT)法和管碟法，檢測(cè)對(duì)蝦蛋白SF-P9 對(duì)革蘭氏陽性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌的活性。MTT法檢測(cè)對(duì)蝦蛋白SF-P9的抗細(xì)菌活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)蝦蛋白SF-P9不僅對(duì)革蘭氏陽性菌有很好的抑殺作用，對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌也有廣譜抑菌特性。其中，對(duì)蝦蛋白SF-P9對(duì)枯草芽孢桿菌的MIC值約為0. 028ymol/L ；對(duì)副溶血弧菌的MIC值約為0. 028、. 056 μ mol/L ；對(duì)短小芽孢桿菌、副溶血弧菌、鼠傷寒沙門氏菌、銅綠假單胞菌的MIC值在0. 028^0. 056 μ mol/L之間；對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC值在 0. 089 0. 112 μ mol/L之間；對(duì)大腸桿菌JM109的MIC值在0. 056 0. 112 μ mol/L之間；對(duì)蘇云金芽孢桿菌的MIC值為約為0. 099 μ mol/L。管碟法測(cè)定對(duì)蝦蛋白SF-P9的抗細(xì)菌活性的抑菌效價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)藤黃微球 MMicrococcus luteus, IU桿菌肽標(biāo)準(zhǔn)樣品的抑菌圈直徑為3. 0cm, 3. 125 μ g/mL Amp的抑菌圈直徑為2. 7cm, 0. 446 μ mol/L對(duì)蝦蛋白SF-P9的抑菌圈直徑為3. Icm0 0. 446 μ mol/L 對(duì)蝦蛋白SF-P9與IU的桿菌肽及3. 125 μ g/mL的Amp活性相當(dāng)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，采用藥敏紙片法和雙碟法，檢測(cè)對(duì)蝦蛋白SF-P9抗真菌的生物活性。采用藥敏紙片法檢測(cè)對(duì)蝦蛋白SF-P9抗真菌活性試驗(yàn)表明，對(duì)蝦蛋白 SF-P9對(duì)黑曲霉有較強(qiáng)的抑制作用。Pichia pastor is X_33/pPIC6 α A/Pen在1. 5%甲醇誘導(dǎo)下，表達(dá)有活性的對(duì)蝦蛋白SF-P9，16 μ mol/L對(duì)蝦蛋白SF-P9純品對(duì)該黑曲霉有抑制活性。雙碟法測(cè)定對(duì)蝦蛋白SF-P9抗黑曲霉IC5tl的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明對(duì)蝦蛋白SF-P9對(duì)黑曲霉具有明顯的抗菌活性和很好的抑制效果。對(duì)蝦蛋白SF-P9抗黑曲霉IC5tl值為0. 586ymol/ L0 上層培養(yǎng)基分別含有 0. 000 μ mol/L,0. 064 μ mol/L,0. 128 μ mol/L,0. 256 μ mol/L、 0. 512 μ mol/L和1. 024 μ mol/L對(duì)蝦蛋白SF-P9，其對(duì)應(yīng)的的各平皿菌苔直徑分別為 4. 50cm、4. 50cm、4. 3cm、3. 9cm、3. 7cm、2. 2cm (上述數(shù)據(jù)為重復(fù)5次實(shí)驗(yàn)的平均值)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，檢測(cè)了對(duì)蝦蛋白SF-P9對(duì)流感病毒(A型H3N2)增殖的影響，對(duì)蝦蛋白SF-P9對(duì)流感病毒(A型H3N2)在雞胚中的增殖具有明顯的抑制作用。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，采用MTT法測(cè)定測(cè)對(duì)蝦蛋白SF-P9對(duì)人肝腫瘤細(xì)胞系HepG2細(xì)胞生長的影響。對(duì)蝦蛋白SF-P9對(duì)HepG2細(xì)胞生長影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同濃度的對(duì)蝦蛋白SF-P9作用腫瘤細(xì)胞H印G2 24h后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著對(duì)蝦蛋白SF-P9濃度的增加，抑制率逐漸增加。40 μ g/mL對(duì)蝦蛋白SF-P9可抑殺50. 31%的HepG2細(xì)胞， 20 μ g/mL對(duì)蝦蛋白SF-P9可抑殺11. 92%的!fepG2細(xì)胞，30 μ g/mL對(duì)蝦蛋白SF-P9可抑殺 43. 17%的H印G2細(xì)胞，60 μ g/mL對(duì)蝦蛋白SF-P9可抑殺65. 80%的H印G2細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種編碼對(duì)蝦蛋白F-P6對(duì)應(yīng)的核酸，其序列為SEQ ID NO. 3所示核苷酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所提供的一種對(duì)蝦蛋白F-P6，其序列為SEQ ID No.4所示的氨基酸序列。該蛋白為融合蛋白，其C端氨基酸是DDDDK。其中含有 Penaeidin 成熟肽編碼區(qū)所對(duì)應(yīng)的氨基酸序列YRGGYTGPIPRPPPIGRPPFRPVCNACYRLSVSDAR NCCIKFGSCCHLVKG。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種采用腸激酶切割對(duì)蝦蛋白SF-P9，制備對(duì)蝦蛋白F-P6的方法。它包括下列步驟
A、Ni-NTASuperflow柱親和層析法純化得對(duì)蝦蛋白SF-P9純品，調(diào)整其濃度為 100 μ g/mL ；
B、取1支1.5mLEppendorf管，依次加入以下樣品90 μ L對(duì)蝦蛋白SF-P9，10 μ L IOX 酶切緩沖液(10Χ 酶切緩沖液500 mM Tris-HCl, pH 8.0 (22° C)，10 mM CaC12, 1% Tween-20 ；稱取60. 5g Tris-base，溶于950 mL去離子水中，濃HCl調(diào)節(jié)pH至8. 0，加 1.47g CaC12*2H20、10mL Tween-20，混勻，定容至1L。室溫存放。)，反應(yīng)體積100 μ L，加入0.60unit腸激酶。37°C保溫4小時(shí)(h)。C、收集酶切后樣品，置_20°C保存?zhèn)溆?。采?6% Tricine-SDS-PAGE和^festern Blot方法，用考馬斯亮藍(lán)R250染色檢測(cè)樣品中對(duì)蝦蛋白F-P6。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在0. 60 imit/ΙΟΟμ L腸激酶、37°C、酶切4h的條件下，酶切對(duì)蝦蛋白SF-P9，可制備特異性的、分子量約為6. 3 kDa對(duì)蝦蛋白F-P6。一種分離和純化的對(duì)蝦蛋白F-P6，其序列為SEQ ID NO. 4 所示氨基酸序列。一種分離和純化的對(duì)蝦蛋白F-P6對(duì)應(yīng)的核酸，其序列為SEQ ID NO. 3所示核苷酸序列。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，檢測(cè)了對(duì)蝦蛋白F-P6的生物活性。對(duì)蝦蛋白F-P6具有廣譜抗菌作用，對(duì)革蘭氏陽性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌均具有明顯的抗菌活性；對(duì)真菌的感染均具有明顯的抗菌活性；對(duì)病毒的感染具有明顯的抗病毒活性；具有明顯的抑制腫瘤細(xì)胞生長的活性。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，采用噻唑藍(lán)(MTT)法和管碟法，檢測(cè)對(duì)蝦蛋白F-P6 對(duì)革蘭氏陽性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌的活性。MTT法檢測(cè)對(duì)蝦蛋白F-P6的抗細(xì)菌活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)蝦蛋白F-P6對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC值為0. 095 0. 120ymol/L ；對(duì)短小芽孢桿菌的MIC值為0. 033 0. 063 μ mol/L ；對(duì)蘇云金芽孢桿菌的MIC值約為0. 115 μ mol/ L ；對(duì)枯草芽孢桿菌的MIC值約為0. 031 μ mol/L ；對(duì)溶藻弧菌的MIC值約為0. 036 μ mol/ L ；對(duì)副溶血弧菌的MIC值為0. 033 0. 062 μ mol/L ；對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的MIC值為 0. 030 0· 064 μ mol/L ；對(duì)大腸桿菌JM109的MIC值為0. 063 0. 121 μ mol/L ；對(duì)銅綠假單胞菌的 MIC 值為 0. 036 0. 067 μ mol/L。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，檢測(cè)了對(duì)蝦蛋白F-P6對(duì)流感病毒(A型H3N2)增殖的影響，對(duì)蝦蛋白F-P6對(duì)流感病毒(A型H3N2)在雞胚中的增殖具有明顯的抑制作用。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，采用MTT法測(cè)定測(cè)對(duì)蝦蛋白F-P6對(duì)人肝腫瘤細(xì)胞系HepG2細(xì)胞生長的影響。對(duì)蝦蛋白F-P6對(duì)H印G2細(xì)胞生長影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同濃度的對(duì)蝦蛋白F-P6作用腫瘤細(xì)胞H印G2 24h后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著對(duì)蝦蛋白F-P6濃度的增加，抑制率逐漸增加。40 μ g/mL對(duì)蝦蛋白F-P6可抑殺51. 02%的H印G2細(xì)胞，20 μ g/ mL對(duì)蝦蛋白F-P6可抑殺12. 06%的!fepG2細(xì)胞，30 μ g/mL對(duì)蝦蛋白F-P6可抑殺45. 98%的 HepG2細(xì)胞，60 μ g/mL對(duì)蝦蛋白F-P6可抑殺67. 42%的!fepG2細(xì)胞。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果
(1)抗菌肽是由生物體特定基因編碼產(chǎn)生的一類小分子多肽，天然對(duì)蝦肽penaeidin 的天然產(chǎn)量有限，從對(duì)蝦中獲取對(duì)蝦肽penaeidin步驟復(fù)雜，產(chǎn)量極低。目前主要是通過基因工程技術(shù)和化學(xué)合成方法獲得抗菌肽。但是，如果采用化學(xué)合成方法獲得對(duì)蝦肽 penaeidin，則步驟復(fù)雜、產(chǎn)量低、成本較高。隨著分子生物學(xué)和生物技術(shù)的發(fā)展，人們利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)抗菌肽已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展。Durvasula等[Durvasula RV，Gumbs A, Panackal A, et al. Prevention of insectbone disease an approach using transgenic symbiotic bacteria[J ] . Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94 :3274 -3278.]在昆蟲細(xì)胞內(nèi)表達(dá)了 cecropin A和cecropin B。王志興等[王志興，賈士榮. 抗菌肽分泌型載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因馬鈴薯中蛋白的胞外分泌.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，1996 ，4 (3) :277-觀6.]將抗菌肽cecropinB基因通過構(gòu)建嵌合基因方式導(dǎo)入馬鈴薯，延遲了植株青枯病的發(fā)生，降低了病情指數(shù)。因此，本發(fā)明通過基因工程技術(shù)，采用酵母基因工程菌株制備對(duì)蝦抗菌肽，具有生產(chǎn)步驟簡單、成本低、產(chǎn)量高的特征。(2)對(duì)蝦肽penaeidin抗菌廣譜，采用基因工程技術(shù)，宿主表達(dá)的抗菌肽可能會(huì)對(duì)宿主本身產(chǎn)生抑制作用，達(dá)不到理想的高效表達(dá)結(jié)果。因此，本發(fā)明在構(gòu)建對(duì)蝦肽 penaeidin基因工程菌株、表達(dá)對(duì)蝦抗菌肽的同時(shí)，采取融合蛋白表達(dá)方式，選擇畢赤酵母 X-33宿主，構(gòu)建了對(duì)蝦肽penaeidin分泌型表達(dá)載體，構(gòu)建了畢赤酵母重組基因工程菌株 Pichia pas tor is X_33/pPIC6 α A/Pen。利用畢赤酵母重組基因工程菌株 PicAia pas tor is X-33/pPIC6aA/Pen，分泌表達(dá)了重組融合對(duì)蝦蛋白SF-P9。這種畢赤酵母表達(dá)體系具有外源基因——對(duì)蝦肽penaeidin整合穩(wěn)定、分泌表達(dá)重組融合對(duì)蝦蛋白SF-P9、發(fā)酵工藝成熟、宿主細(xì)胞能迅速生長進(jìn)行高密度發(fā)酵的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明通過篩選獲得高效表達(dá)重組融合對(duì)蝦蛋白SF-P9的畢赤酵母基因工程菌株，通過優(yōu)化畢酵母發(fā)酵條件提高重組融合對(duì)蝦蛋白SF-P9的表達(dá)量。(3)本發(fā)明所制備的對(duì)蝦蛋白SF-P9是一種融合蛋白。對(duì)蝦蛋白SF-P9具有抗細(xì)菌、抗真菌、抗病毒等微生物感染的生物學(xué)活性，對(duì)蝦蛋白SF-P9對(duì)革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌、病毒等均具抑制作用，并且對(duì)蝦蛋白SF-P9在很低的濃度下即可抑制微生物生長。因此，對(duì)蝦蛋白SF-P9可替代傳統(tǒng)抗生素，作為新一代的抗菌藥和抗病毒藥來源，對(duì)提高生物醫(yī)藥、畜產(chǎn)品品質(zhì)，推動(dòng)綠色生物科技的發(fā)展具有非常重要的意義和廣闊的應(yīng)用前景。(4)本發(fā)明所制備的對(duì)蝦蛋白SF-P9具有抑制腫瘤細(xì)胞生長、對(duì)腫瘤細(xì)胞具有殺傷或抑制作用的生物學(xué)活性。因此，對(duì)蝦蛋白SF-P9可作為一種新型抗腫瘤藥物，用于各種惡性腫瘤的治療，具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。(5)本發(fā)明所制備的對(duì)蝦蛋白F-P6具有抗細(xì)菌、抗真菌、抗病毒等微生物感染的生物學(xué)活性。因此，對(duì)蝦蛋白F-P6可替代傳統(tǒng)抗生素，作為新一代的抗菌藥和抗病毒藥來源。(6)本發(fā)明所制備的對(duì)蝦蛋白F-P6具有抑制腫瘤細(xì)胞生長、對(duì)腫瘤細(xì)胞具有殺傷或抑制作用的生物學(xué)活性。因此，對(duì)蝦蛋白F-P6可作為一種新型抗腫瘤藥物，用于各種惡性腫瘤的治療，
(7)本發(fā)明所采用的畢赤酵母基因工程表達(dá)系統(tǒng)是一種安全的表達(dá)系統(tǒng)。目前已經(jīng)成功地采用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了多種醫(yī)用的蛋白質(zhì)，安全無毒，對(duì)人、畜及環(huán)境無毒無害。(8)本發(fā)明所采用的畢赤酵母基因工程表達(dá)系統(tǒng)利于對(duì)蝦蛋白SF-P9產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。目前，已經(jīng)有成型的發(fā)酵設(shè)備和生產(chǎn)方法，有利于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。


本發(fā)明的上述和其它目的，特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)可顯而易見地從下面對(duì)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例的詳細(xì)描述和附圖示出的內(nèi)容得到，不同視圖中相同的參考符號(hào)代表相同的部分。附圖并不一定是按比例示出，其重點(diǎn)在于說明本發(fā)明的實(shí)施和效果。圖1為一種重組質(zhì)粒pGEM-T/Pen的PCR和酶切鑒定圖譜
泳道 1，DL2000 ；泳道 2，PCR 產(chǎn)物；泳道 3，pGEM-T/Pen/^boR I+^ind III ；泳道 4， pGEM-T/Pen /^boRI ；泳道 5，pGEM-T/Pen plasmid ；泳道 6，marker III. 圖2為一種重組穿梭質(zhì)粒pPIC6 α A/Pen的構(gòu)建過程圖
圖3為一種畢赤酵母重組基因工程菌株P(guān)icAia pas tor is X_33/pPIC6 α A/Pen的鑒定
圖譜
泳道1，marker DL2000 ；泳道2，ddH20為模板，以Pl和P2為引物的PCR產(chǎn)物；泳道 3，酵母菌株P(guān)ichia pas tor is X_33/pPIC6 α A基因組DNA為模板，以Pl和P2為引物的 PCR產(chǎn)物；泳道4，畢赤酵母重組基因工程菌株P(guān)icAia pas tor is X_33/pPIC6 α A/Pen基因組DNA為模板，以Pl和P2為引物的PCR產(chǎn)物；泳道5，ddH20為模板，以p5' AOXl Pichia primer和p3' AOXl Pichia primer為引物的PCR產(chǎn)物。泳道6，畢赤酵母菌株P(guān)icAia pas tor is X_33/pPIC6 α A 基因組 DNA 為模板，以 p5 ‘ AOXl Pichia primer 和 p3 ‘ AOXl Pichia primer為引物的PCR產(chǎn)物。泳道7，畢赤酵母重組基因工程菌株P(guān)icAia pas tor is X-33/pPIC6aA/Pen 基因組 DNA 為模板，以 p5' AOXl Pichia primer 和 p3 ‘ AOXl Pichia primer為引物的PCR產(chǎn)物。圖4為一種16% Tricine-SDS-PAGE檢測(cè)重組對(duì)蝦蛋白SF-P9表達(dá)的圖譜
泳道1，Pichia pastries X_33/pPIC6 α A經(jīng)甲醇誘導(dǎo)72小時(shí)；泳道2，蛋白質(zhì)Marker ； 泳道 3，Pichia pas tor is X_33/pPIC6 α A/Pen 經(jīng)甲醇誘導(dǎo) 96h ；泳道 4，Pichia pas tor is X-33/pPIC6a A/Pen 經(jīng)甲醇誘導(dǎo) 72h MiLPichia pas tor is X_33/pPIC6 a A/Pen 經(jīng)甲醇誘導(dǎo) 48h ；泳道 6，Pichia pas tor is X_33/pPIC6 a A/Pen 經(jīng)甲醇誘導(dǎo) Mh ；泳道 7，Pichia pas tor is X_33/pPIC6 a A/Pen 誘導(dǎo)前。圖5為一種Wfestern blot檢測(cè)重組對(duì)蝦蛋白SF-P9的圖譜
泳道 1，蛋白質(zhì) Marker ；泳道 2, Pichia pas tor is X_33/pPIC6 α A/Pen 經(jīng)甲醇誘導(dǎo) 72h 的發(fā)酵液；泳道3，經(jīng)Ni-NTA親和層析純化獲得的重組對(duì)蝦蛋白SF-P9 ；泳道4，泳道2轉(zhuǎn)NC 膜的Wfestern blot對(duì)應(yīng)條帶；泳道5，泳道3轉(zhuǎn)NC膜的^festern blot對(duì)應(yīng)條帶。
13
圖6為一種對(duì)蝦蛋白F-P6的制備和Western blot鑒定圖譜
泳道1為蛋白Marker ；泳道2為純化得到的對(duì)蝦蛋白SF-P9 ；泳道3為對(duì)蝦蛋白SF-P9 經(jīng)腸激酶酶切后得到的對(duì)蝦蛋白F-P6 ；泳道4為泳道3轉(zhuǎn)PVDF膜的Western blot對(duì)應(yīng)條
市ο圖7為一種管碟法 測(cè)定對(duì)蝦蛋白SF-P9的抗細(xì)菌活性效價(jià)的圖譜
1為空白組0. 02M PBS, ρΗ7· 4 ；2為對(duì)照組3. 125μ g/mL Amp ；3為對(duì)照組桿菌肽(1U); 4為樣品組0. 446 μ mol/L對(duì)蝦蛋白SF-P9。圖8為一種藥敏紙片法檢測(cè)對(duì)蝦蛋白SF-P9抗黑曲霉活性的圖譜
1 為兩性霉素(AmB) 50mg/mL -’2% Pichia pastries X-33/pPIC 6 α A 在 1. 5% 甲醇終濃度下誘導(dǎo)36h的發(fā)酵上清液；3為Pichia pas tor is X_33/pPIC6 α A/Pen在1. 5%甲醇終濃度下誘導(dǎo)36h的發(fā)酵上清液；4為經(jīng)Ni-NTA親和層析純化的16 μ mol/L對(duì)蝦蛋白SF-P9。圖9為一種雙碟法測(cè)定對(duì)蝦蛋白SF-P9抗黑曲霉IC5tl的圖譜
廣3號(hào)皿中培養(yǎng)基上層分別加入了對(duì)蝦蛋白SF-P9。其中，1號(hào)皿上層培養(yǎng)基含有0. 000 μ mol/L對(duì)蝦蛋白SF-P9，1號(hào)皿菌苔直徑為4. 5cm ;2號(hào)皿上層培養(yǎng)基含有0.512 μ mol/L對(duì)蝦蛋白SF-P9，2號(hào)皿菌苔直徑為3. 7cm ;3號(hào)皿上層培養(yǎng)基含有 1. 024 μ mol/L對(duì)蝦蛋白SF-P9，3號(hào)皿菌苔直徑為2. 2cm。圖10為一種對(duì)蝦蛋白SF-P9對(duì)腫瘤細(xì)胞!fepG2生長的影響圖譜圖11為一種對(duì)蝦蛋白F-P6對(duì)腫瘤細(xì)胞!fepG2生長的影響圖譜。
具體實(shí)施例方式通過結(jié)合下述具體實(shí)施例，闡明本發(fā)明。但是，應(yīng)理解的是，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1南美白對(duì)蝦Penaeidin基因的擴(kuò)增和克隆 1.擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)和合成
根據(jù)對(duì)蝦肽P e η - 2基因，設(shè)計(jì)一對(duì)引物P1和P 2，引物由上海生工生物工程有限公司合成，經(jīng)PAGE純化。Pl和P2的核苷酸序列分別為上游引物Pl : 5’ GAATTCTACAGGGGCGGTTACACA 3'。下游引物 P2:5，TCTAGAGCCTTGTCATCGTCATCTCCTTTTACTA AGTGACAACA 3，。2.南美白對(duì)蝦總RNA的提取及cDNA第一條鏈的合成
將南美白對(duì)蝦飼養(yǎng)于通氧22°C的水箱中待用。選取蛻皮間期健康蝦，用DEPC處理過的滅菌水漂洗后，用2. 5mL 一次性注射器從蝦的腹竇處收集血淋巴750 μ L，加入等體積的抗凝劑(ρΗ7. 0)，鏡檢記數(shù)，取細(xì)胞含量為IXlO7的血淋巴于4°C、800g離心15min，移去上清，收集血細(xì)胞。按照Qiagen公司RNeasy Mini Kit的產(chǎn)品說明書提取總RNA。將提取到的RNA溶液貯存于-80°C，以備用。以 Oligo (dT) 15 為引物，采用 Promega 公司的 Universal Riboclone cDNA Synthesis System試劑盒，按照操作手冊(cè)進(jìn)行，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈。具體操作步驟如下將以下試劑加入到經(jīng)DEPC浸泡并滅菌處理過的PCR反應(yīng)管中25mM MgC12,4yL； 10X反轉(zhuǎn)錄緩沖液，2μ ;10πιΜ dNTP混合物，2 μ L ；重組的RNasin 核糖核酸酶抑制劑， 0. 5μ L ；24υ/μ L AMV 反轉(zhuǎn)錄酶，0. 8 μ L ;0·Oligo (dT) 15 引物 WL ；總 RNA，3 μ L ；無核酸酶的水，2. 7 μ L0反應(yīng)條件為42°C，1小時(shí)；95°C，5分鐘；3°C，5分鐘。將合成的cDNA 第一鏈存放于-80 °C備用。3.南美白對(duì)蝦penaeidin (簡稱pen)基因的PCR擴(kuò)增
按照Reverse Transcription Reaction試劑盒操作手冊(cè)，以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA第一條鏈為模板，PCR擴(kuò)增目的基因Penaeidin。PCR反應(yīng)體系10Xreaction buffer,5y L ； 1. 5mM MgC12,3y L ；0. 2mM dNTP, 1 μ L ；20pmol 上游引物 Pl，1 μ L ;20pmol 下游引物 Ρ2， 1 μ L ;5U / μ L Taq DNA聚合酶1 μ L ；模板6 μ L ；加無菌水至終體積為50 μ L。PCR反應(yīng)條件95°C，5min;94°C，30 s ；53°C，45 s ；72°C 30s (35 個(gè)循環(huán))；72°C，5 min。PCR 擴(kuò)增目的基因Penaeidin產(chǎn)物經(jīng)1. 2%的瓊脂糖凝膠電泳，有一約為191bp DNA帶，與預(yù)測(cè)結(jié)果相符。4.南美白對(duì)蝦pen基因的克隆 (I)PCR產(chǎn)物的回收
采用DNA膠回收試劑盒(Omega公司產(chǎn)品)，按照Omega公司DNA膠回收試劑盒說明書回收目的基因片段。具體操作步驟如下
①PCR產(chǎn)物經(jīng)1. 瓊脂糖凝膠電泳(IXTAE)，用紫外燈觀察電泳情況，當(dāng)要回收的 DNA帶與其他帶完全分離時(shí)，停止電泳，在紫外燈下用刀片切下欲回收帶，用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化。②在Eppendorf管中將膠搗碎，加入等體積的溶膠液Binding Buffer，65°C水浴 7min，其間每anin輕搖Eppendorf管一次直至膠完全融解。③將融解的樣品加入層析柱中，12000rpm離心lmin，棄去液體。④加 300 μ L Binding Buffer,離心棄去液體。⑤力口 750 μ L Washing Buffer,離心棄去液體。⑥重復(fù)步驟⑤1次。⑦空柱子12000rpm離心Imin以甩干液體。⑧將柱子放于1.5mL Eppendorf■管，加入 30 μ L Elution buffer，37°C保溫 2min， 12000rpm離心lmin，收集離心液，貯存于_20°C。(2)目的基因pen片段克隆入pGEM_T載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEM_T/Pen
將以上純化的PCR產(chǎn)物克隆于pGEM-T載體，pGEM-T載體購自Promega公司。反應(yīng)體系為2 X Ligation buffer，5. O μ L ;pGEM_T 載體，0. 5 μ L ;PCR 產(chǎn)物，4. 0yL;T4 DNA ligase，0. 5 μ L ；無加菌ddH20至10 μ L。在冰上混合上述液體，16°C連接15h。(3)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
①感受態(tài)細(xì)胞的制備采用冷氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。挑取單個(gè)五coli JM109菌落，接種于5mL LB培養(yǎng)基中，37°C、220rpm培養(yǎng)過夜，次日取上述菌液按比例1 100 再接種于50mL LB培養(yǎng)液中，37°C，220rpm振蕩，待菌液OD值為0. 6時(shí)，取1. 5mL菌液加入無菌的Eppendorf離心管中，4，OOOrpm離心lOmin，棄上清。加入800 μ L冰預(yù)冷的0. IM氯化鈣，輕輕振蕩重懸菌體沉淀，冰浴30min。4，OOOrpm離心lOmin，棄上清。加入100 μ L冰預(yù)冷的0. IM氯化鈣重懸沉淀，4°C保存，7 10天內(nèi)使用。②質(zhì)粒轉(zhuǎn)化五coli JM109感受態(tài)細(xì)胞取上述連接產(chǎn)物10 μ L加入100 μ L感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴60分鐘，42°C熱休克90秒，再置冰浴2分鐘，加入390 μ L新鮮LB液體培養(yǎng)基，370C，150rpm輕搖，50min。取100 μ L菌液涂布于含5-溴-4氯-3吲哚-D-半乳糖苷(X-gal，Promega公司產(chǎn)品)、異丙基硫代半乳糖苷(IPTG，，Promega公司產(chǎn)品)和Amp 抗性的LB平板上，37 °C培養(yǎng)過夜，觀察結(jié)果，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。挑取白色菌落，快速提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR和酶切鑒定。(4)重組質(zhì)粒pGEM-T/Pen的鑒定
隨機(jī)挑取10個(gè)單克隆白斑，擴(kuò)大培養(yǎng)后用質(zhì)粒提取試劑盒(Qiagen公司產(chǎn)品)抽提質(zhì)粒。①重組質(zhì)粒pGEM-T/Pen的PCR鑒定
以重組質(zhì)粒pGEM-T/Pen DNA為模板，用實(shí)施例1中的引物PI、P2擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物為 191bp，與預(yù)測(cè)結(jié)果相符，表明目的基因penaeidin已克隆入pGEM_T載體中。重組質(zhì)粒 pGEM-T/Pen的PCR鑒定結(jié)果見附圖1。②重組質(zhì)粒pGEM-T/Pen的酶切鑒定
酶切反應(yīng)體系質(zhì)粒 15 μ 1 ;10XM buffer 2 μ 1 -,EcoRl 1 μ 1 -Jbal 1 μ 1 ；H2O 1 μ 1 ； 總體積20μ1。37°C水浴酶切4小時(shí)，然后進(jìn)行1. 瓊脂糖凝膠鑒定。重組質(zhì)粒pGEM-T/ Pen^.BcoRI+IbaI 雙酶切，得到約 3000bp 和 191bp 的預(yù)期DNA片斷，pGEM-T/Pen經(jīng)&0RI 單酶切，得到單一約3190bp的預(yù)期DNA片斷。重組質(zhì)粒pGEM-T/Pen的酶切鑒定結(jié)果見附圖1。(5)核苷酸序列測(cè)定
質(zhì)粒pGEM-T/Pen DNA經(jīng)PCR和酶切鑒定后，隨機(jī)選取陽性克隆送北京華大基因公司進(jìn)行DNA測(cè)序分析。pGEM-T/Pen質(zhì)粒經(jīng)全自動(dòng)測(cè)序分析，pen基因核苷酸序列為
tacaggggcg gttacacagg cccgataccc aggccaccac ccattggaag accaccgttc60
agacctgttt gcaatgcatg ctacagactt tccgtctcag atgctcgcaa ttgctgcatc 120 aagttcggaa gctgttgtca cttagtaaaa gga153
實(shí)施例2重組穿梭質(zhì)粒pPIC6 α A/Pen的構(gòu)建和鑒定 1.重組穿梭質(zhì)粒PPIC6 α A/Pen的構(gòu)建
提取重組質(zhì)粒pGEM-T/Pen，用和損al雙酶切，得到目的片段Pen ；同樣酶切 PPIC6 α A空載體。將雙酶切后得到的Pen與空載體pPIC6 α A DNA片斷在T4DNA連接酶的作用下16°C過夜，得到重組質(zhì)粒pPIC6 α A/Pen。連接反應(yīng)體系如下
pPIC6aA 載體 DNA 片斷2μ 1 ；penaeidin DNA 片斷10μ 1 ；Τ4 DNA buffer 1. 5μ 1 ； Τ4 DNA 連接酶1. 5 μ 1。用該重組質(zhì)粒pPIC6aA/Pen轉(zhuǎn)化大腸桿菌五co/i JM109感受態(tài)細(xì)胞，在含 300 μ g/ml殺稻瘟素(Blasticidin)的LB平板上篩選陽性克隆，獲得大腸桿菌菌株五coli JM109 (pPIC6aA/Pen)。采用裂解法，提取質(zhì)粒pPIC6 a A/Pen DNA (參見分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版))。2.重組穿梭質(zhì)粒pPIC6 a A/Pen的鑒定
用PCR、限制性內(nèi)切酶酶切鑒定和DNA測(cè)序分析鑒定重組穿梭質(zhì)粒pPIC6 a A/Pen。(1)重組穿梭質(zhì)粒pPIC6 a A/Pen的PCR鑒定
以質(zhì)粒PPIC6 a A/Pen DNA為模板，用實(shí)施例1中的引物P1、P2擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物為約191bp,與預(yù)測(cè)結(jié)果相符，表明目的基因Penaeidin已克隆入pPIC6 α A載體中。(2)重組穿梭質(zhì)粒pPIC6 α A/Pen的酶切鑒定
酶切反應(yīng)體系質(zhì)粒 15μ 1 ；IOXM buffer 2 μ 1 -,EcoRl 1 μ 1 -,Xbal 1 μ 1 ；Η20 1 μ 1 ； 總體積20 μ 1。37°C水浴酶切4小時(shí)，然后進(jìn)行1. 2%瓊脂糖凝膠鑒定。重組質(zhì)粒pPIC6 α A/Pen EcoRl ^WXbal 雙酶切，得到約 3400bp 和 19Ibp 的預(yù)期DNA片斷。(3)重組穿梭質(zhì)粒pPIC6 α A/Pen的測(cè)序結(jié)果
將重組質(zhì)粒PPIC6 α A/Pen DNA送上海聯(lián)眾生物工程有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序分析。采用DNA雙脫氧法測(cè)定核苷酸序列，測(cè)序引物為T7啟動(dòng)子引物，全自動(dòng)測(cè)序分析。測(cè)序結(jié)果表明pen基因已正確定向插入穿梭質(zhì)粒pPIC6 α A/Pen中。重組穿梭質(zhì)粒pPIC6 α A/Pen的構(gòu)建過程見附圖2。實(shí)施例3 重組穿梭質(zhì)粒 pPIC6 α A/Pen 壊 VCPichia pas tor is X-33 1.重組穿梭質(zhì)粒pPIC6 α A/Pen DNA的線性化
小量制備重組質(zhì)粒pPIC6a A/Pen DNA15-20 μ g，用RNaseA在37°C消化30 min，然后在 60 μ L體系中用限制性內(nèi)切酶fee I進(jìn)行酶切線性化，37°C水浴鍋中保溫4h后，用苯酚氯仿(25 24)抽提一次，氯仿異戊醇(24 :1)抽提一次，加0. 1體積的3M的乙酸鈉(pH5. 2)、 2. 5倍體積的無水乙醇，混勻置于_20°C沉淀過夜，4°C、12000rpm離心20min，棄上清，用超純水配置的75%的乙醇洗2次，自然晾干后，用5-10yL TE溶液溶解沉淀，-20°C保存?zhèn)溆谩?用限制性內(nèi)切酶I酶切線性化載體質(zhì)粒pPIC6aA，作為陰性對(duì)照。用超純水分別配置IM LiCl和50% PEG,分別用0. 22 μ m微孔濾膜過濾除菌；用 1. 5mL Eppendorf管分裝，密封，4°C保存?zhèn)溆?。將鮭魚精擔(dān)體DNA用TE (pH8. 0)配成^ig/ mL的溶液，沸水中水浴加熱5min，然后立即插在冰上直接使用或_20°C保存?zhèn)溆谩?. PicAia pasioris X-33 感受態(tài)細(xì)胞的制備
用無菌牙簽挑取一酵母PicAia pas tor is X_33單菌落，接種于5mL YPD中，30°C、 ^Orpm振搖培養(yǎng)過夜，第二天取200 μ L酵母菌液接種于20mL YPD，30°C、280rpm振搖培養(yǎng)到OD600為0. 6 0. 8時(shí)，轉(zhuǎn)至無菌離心管，室溫(20-25°C以下相同)、4000rpm離心lOmin，去上清，收集菌體，用25ml無菌ddH20重懸，室溫、4000rpm離心lOmin，去上清，收集菌體，再用 Iml無菌ddH20重懸，轉(zhuǎn)到1. 5mL的Eppendorf管中，室溫、4000rpm離心IOmin,去上清，收集菌體，加ImL 0. IM LiCl重懸菌體，12，OOOg離心15 sec，棄盡上清，用400 μ L 0. IM LiCl 重懸菌體，用1. 5mL的Eppendorf管，每管100 μ L分裝使用，該酵母感受態(tài)細(xì)胞即制即用。3.轉(zhuǎn)化
將以上制備的100 μ L酵母感受態(tài)細(xì)胞，12，OOOg離心15 sec，棄盡上清，向該 Eppendorf管中嚴(yán)格按以下順序加入試劑240 μ 1 50% PEG, 36 μ 1 1 M LiCl，25 μ 1 2 mg/ml鮭魚精擔(dān)體DNA和50 μ 1線性化的pPIC6 α A/Pen DNA (無菌水中)。在漩渦振蕩器上劇烈振動(dòng)大約lmin，使各試劑成分充分混合均勻，細(xì)胞充分懸浮后；將混合液在30°C條件下靜置孵育30min，接著42°C熱激2(T25min，然后室溫下 6，000-8，OOOrpm離心5 min，棄上清，用ImL YPD重懸細(xì)胞，30°C、200 rpm振搖培養(yǎng)，1 h后取細(xì)胞培養(yǎng)液100 μ 1涂布于含300 μ g/ml殺稻瘟素(Blasticidin)的YPD平板上。(YPD 培養(yǎng)基的配制10 g酵母抽提物，20 g蛋白胨完全溶解后定容至900 ml。固體培養(yǎng)基另加
1720 g瓊脂粉，蒸汽高壓15磅滅菌20 min，用前加100 ml過濾除菌的20%葡萄糖。)將平板放于30°C培養(yǎng)箱，培養(yǎng)2 3天，觀察單菌落的形成。將該經(jīng)轉(zhuǎn)化的菌株命名為畢赤酵母重組基因工程菌株 PicAia pas tor is X_33/pPIC6 α A/Pen。同時(shí)，按同樣方法轉(zhuǎn)化線性化空載體質(zhì)粒pPIC6 α Α,獲得畢赤酵母菌株P(guān)idia pas tor is X_33/pPIC6 α Α,作為陰性對(duì)照。實(shí)施例4畢赤酵母重組基因工程菌株 Pichia pas tor is X_33/pPIC6 α A/Pen 的鑒定 1.酵母基因組的提取
從YPD平板上挑取酵母單菌落，分別接種于:3ml YPD培養(yǎng)液中，將1. 5ml過夜培養(yǎng)液轉(zhuǎn)到1.5ml的Eppendorf管中，室溫、12000rpm離心lmin，棄上清，將細(xì)胞重懸于50 μ L STES 緩沖液中；向酵母懸液中加入50 μ L酸洗過的玻璃珠。每管加入20yL TE (pH7.6)，然后加入60 μ L苯酚氯仿(25 24),蓋緊蓋子。先振蕩lmin，使有機(jī)相和水相充分混合，然后每振蕩30sec就將Eppendorf管插在冰上，重復(fù)振蕩6次。室溫、12000rpm離心8min，將上層的水相轉(zhuǎn)移到1. 5ml的Eppendorf管中，分別加1/10體積的3 mol/L的NaAc (ρΗ5· 3)、 2. 5倍體積的無水乙醇，_20°C沉淀20min，4°C、12000rpm下離心lOmin，去上清，沉淀用75% (體積比)乙醇洗滌1次，12000rpm離心2min，去上清，空氣干燥沉淀后，將沉淀溶解于40 μ L TE Buffer (pH7. 6)，_20°C凍存?zhèn)溆?。? μ L該酵母基因組DNA樣品作瓊脂糖電泳檢測(cè)。2. PCR 鑒定
由上海生工生物工程公司分別合成酵母醇氧化酶通用引物p5' AOXl Pichia primer 禾口 p3 ‘ AOXl Pichia primer。弓| 物 p5 ‘ AOXl Pichia primer 序列為5 ‘ GCAAATGGCATTCTGACATCC 3 ‘；弓丨物 p3 ‘ AOXl Pichia primer 序列為 5' GACTGGTTCCAATTGACAAGC 3'，
取廣10 μ L畢赤酵母重組基因工程菌株P(guān)icAia pastor is X_33/pPIC6 α A/Pen基因組 DNA樣品作為PCR鑒定的模板。采用酵母醇氧化酶通用引物p5' AOXl Pichia primer與 p3' AOXl Pichia primer為引物，進(jìn)行PCR鑒定。同時(shí)，采用實(shí)施例1中的引物PI、P2進(jìn)行 PCR 鑒定。PCR 反應(yīng)條件為95°C 5 min, 94°C 30 s, 55°C 30 s, 72°C 2 min 30 s, 30 個(gè)循環(huán)后，72 °C IOmin。畢赤酵母重組基因工程菌株P(guān)icAia pas tor is X_33/pPIC6 α A/Pen的鑒定結(jié)果見附圖3，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明目的基因penaeidin已被準(zhǔn)確地整合到畢赤酵母PicAia pas tor is X-33基因組的特定位點(diǎn)中。3.測(cè)序鑒定
制備酵母重組基因工程菌株P(guān)icAia pas tor is X_33/pPIC6 α A/Pen基因組DNA，送上海聯(lián)眾生物工程有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序分析。采用DNA雙脫氧法測(cè)定核苷酸序列，測(cè)序引物為酵母醇氧化酶通用引物p5' AOXl Pichia primer禾口 p3' AOXl PicAia primer,全自動(dòng)測(cè)序分析。測(cè)序結(jié)果表明penaeidin基因已正確定向整合到畢赤酵母PicAia pastor is X-33基因組的特定位點(diǎn)中。對(duì)蝦蛋白SF-P9對(duì)應(yīng)的核酸序列為SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。對(duì)蝦蛋白SF-P9的氨基酸序列為SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。經(jīng)上述篩選、鑒定正確的畢赤酵母重組基因工程菌株P(guān)icAia pastor is X-33/PPIC6 α A/Pen，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，該菌株在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏編號(hào)為CCTCC No: M209126。實(shí)施例5基因工程對(duì)蝦蛋白SF-P9的表達(dá)
利用畢赤酵母重組基因工程菌株P(guān)icAia pas tor is X_33/pPIC6 α A/Pen表達(dá)基因工程重組對(duì)蝦蛋白SF-P9。1.培養(yǎng)基和試劑的配制
YP培養(yǎng)基的配制稱取IOg酵母抽提、20g蛋白胨，用600mL雙蒸水完全溶解后后，加雙蒸水定容到700mL。121°C滅菌20 min。10 X YNB培養(yǎng)基的配制稱取3 不含氨基酸且不含(NH4) 2S04的YNB (酵母氮源)， IOOg (MM)2SO4完全溶解在800mL雙蒸水中，使YNB完全溶解，定容到IOOOmL, 0. 22 μ m微孔濾膜過濾除菌，4°C保存。500XB的配制20mg生物素(Biotin)，用ImM NaOH完全溶解后，用雙蒸水定容至IOOmL, 0. 22 μ m微孔濾膜過濾除菌，4°C保存?zhèn)溆谩?0XM的配制將200mL甲醇和800mL雙蒸水混合均勻，0. 22μπι微孔濾膜過濾除
菌，4°C保存。10XG的配制將IOOmL甘油和900mL雙蒸水混合均勻，115°C滅菌15min，4°C保存。10XPBS (1M 磷酸鉀緩沖液，ρΗ6· 0)的配制將 132 mL IM K2HPO4 和 868 mL IM KH2PO4 混合均勻，KOH 或 H3PO4 調(diào)至 pH6.0。121°C滅菌 20 min，4°C保存。BMGY 培養(yǎng)基的配制70 mL YP 培養(yǎng)基，10 mL 10XYNB 培養(yǎng)基，10 mL 10XPBS, 10 mL 10XG，200 μ L 500ΧΒ。BMMY 培養(yǎng)基的配制70 mL YP 培養(yǎng)基，10 mL 10XYNB 培養(yǎng)基，10 mL 10XPBS, 10 mL 10ΧΜ，200 μ L 500ΧΒ。2. 挑取畢赤酵母重組基因工程菌株/7ZcAia pastor is X_33/pPIC6 α A/Pen單菌落，接種于25ml BMGY培養(yǎng)液中。28°C，300rpm，培養(yǎng)至0D_=2. 0 6· 0。用滅菌離心管， 5000rpm離心lOmin，收集菌體，轉(zhuǎn)接到IOOmL BMMY液體培養(yǎng)基中。3. 28°C,300rpm振搖培養(yǎng)96 h，其中每隔12 h按培養(yǎng)液的0. 5%體積補(bǔ)充無水甲醇，誘導(dǎo)表達(dá)重組對(duì)蝦蛋白SF-P9。4.誘導(dǎo)6 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h后，分別取樣，15, OOOrpm 離心1 Omin，收集發(fā)酵上清，上清樣品于-80°C低溫冷凍保存。實(shí)施例6對(duì)蝦蛋白SF-P9的檢測(cè)
采用16% Tricine-SDS-PAGE和Wfestern Blot方法，檢測(cè)畢赤酵母重組基因工程菌株 Pichia pas tor is X_33/pPIC6 α A/Pen經(jīng)甲醇誘導(dǎo)的樣品中重組對(duì)蝦蛋白SF-P9的表達(dá)。 同時(shí)，設(shè)經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)72小時(shí)的PicAia pas tor is X_33/pPIC6 α A樣品作為陰性對(duì)照。1. 16% Tricine-SDS-PAGE 的檢測(cè)
16% Tricine-SDS-PAGE 實(shí)驗(yàn)操作參照《分子克隆》(Joe Sambrook, David Russell et al. , Molecular Cloning: A Laboratry Manual, Cold Spring Harbor Lab [CSHL] Press, 2001)進(jìn)行。樣品中加入4XI~riCine樣品緩沖液。(4XI~riCine樣品緩沖液的配制在 5mL 2XTris/HCl, pH7. 0 中溶解 1. 2g SDS，加入 0.6g β-巰基乙醇，3 g 甘油，5mg考馬斯亮藍(lán)G-250，補(bǔ)加雙蒸水至終體積10mL。用0. 45 μ m濾膜過濾。)用考馬斯亮藍(lán)染液染色。(考馬斯亮藍(lán)染液配制0.25g考馬斯亮藍(lán)G-250，IOOmL乙酸，900 mL雙蒸水，充分溶解后用Whatman 1號(hào)濾紙過濾。)用10%醋酸液脫色。16% Tricine-SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果見附圖4所示。16 % Tricine-SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，畢赤酵母重組基因工程菌株P(guān)ichia pas tor is X_33/pPIC6 α A/Pen在甲醇誘導(dǎo)前無表達(dá)。陰性對(duì)照畢赤酵母菌株/7ZcAia pas tor is X_33/pPIC6 α A經(jīng)甲醇誘導(dǎo)后72h，無表達(dá)。畢赤酵母重組基因工程菌株P(guān)icAia pas tor is X_33/pPIC6 α A/Pen經(jīng)甲醇誘導(dǎo)后24、48、72、96 h后，均表達(dá)了基因工程重組對(duì)蝦蛋白SF-P9，SF-P9分子量與預(yù)期相符，為約9. 1 kDa。畢赤酵母重組基因工程菌株P(guān)icAia pas tor is X_33/pPIC6 α A/Pen經(jīng)甲醇誘導(dǎo)24h后，開始少量表達(dá)基因工程重組對(duì)蝦蛋白 SF-P9。隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長，誘導(dǎo)48、72h后，SF-P9表達(dá)量逐漸增大，72h表達(dá)量達(dá)到最大。2. Western Blot 的檢測(cè)
采用Western Blot方法，實(shí)驗(yàn)操作參照《分子克隆》進(jìn)行，具體操作如下 檢測(cè)畢赤酵母重組基因工程菌株P(guān)icAia pas tor is X_33/pPIC6 α A/Pen經(jīng)甲醇誘導(dǎo)的樣品中重組對(duì)蝦蛋白SF-P9的表達(dá)，并設(shè)經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)72小時(shí)的PicAia pas tor is X-33/pPIC6 α A樣品作為陰性對(duì)照。(1)轉(zhuǎn)膜:
A.浸泡NC膜將NC膜平鋪于去離子水面，靠毛細(xì)作用自然吸水后再完全浸入水中 IOmin以排除氣泡，隨后浸泡入轉(zhuǎn)移液中(電轉(zhuǎn)液的制備Tris 3. 0g, Gly 14. 4g, M-OH 200ml，加去離子水至1，000ml。加入3. 6 ml 10% SDS 180μ1。)。將濾紙浸入轉(zhuǎn)移液中。B.取膠將18% SDS-PAGE膠卸下，左上切角，在轉(zhuǎn)移液中稍稍浸泡一下，置于潔凈玻璃板上，按順序鋪上膜與每側(cè)三張濾紙。用玻棒逐出氣泡，剪去濾紙與膜的過多部分。C.轉(zhuǎn)膜采用干轉(zhuǎn)方法。用電轉(zhuǎn)液淋洗石墨電極，濾紙吸干，鋪上膠，再滴少許電轉(zhuǎn)液，以1. 5mA/cm2凝膠面積轉(zhuǎn)移1_2小時(shí)。(2)封閉及雜交
A.封閉將NC膜從電轉(zhuǎn)槽中取出，用去離子水與PBST或TTBS稍加漂洗，在30ml TBST 中加入3g脫脂牛奶混勻，將NC膜置于封閉液中封閉過夜。B.結(jié)合一抗一抗為兔抗南美白對(duì)蝦penaeidin蛋白抗血清。將封閉過夜的NC 膜用雙蒸水漂洗幾次后置于30 ml TBST中，并加入15μ 1 —抗，室溫輕搖一小時(shí)。C.洗滌一抗孵育結(jié)束后，用PBST漂洗膜后再浸洗三次，每次5-lOmin。D.結(jié)合二抗二抗為辣根過氧化物酶交聯(lián)的羊抗兔IgGs。將NC膜置于30ml TBST 中，并加入3 μ L 二抗，室溫輕搖一小時(shí)。Ε.重復(fù)步驟C。F.室溫以 PBS 洗膜 15 min。G.在IOmL ddH20中按順序依次加入DAB顯色液，后將膜浸泡于DAB顯色液中 10-30 min，直至蛋白條帶出現(xiàn)。H.以PBS清洗以終止顯色反應(yīng)。Western Blot的檢測(cè)結(jié)果見附圖5。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明畢赤酵母重組基因工程菌株 Pichia pas tor is X_33/pPIC6 α A/Pen經(jīng)甲醇誘導(dǎo)，表達(dá)了基因工程重組對(duì)蝦蛋白SF-P9。
20該蛋白質(zhì)帶能和兔抗南美白對(duì)蝦penaeidin蛋白抗血清發(fā)生特異性反應(yīng)，所設(shè)對(duì)照Pidia pas tor is X_33/pPIC6 α A蛋白質(zhì)帶均不能與兔抗南美白對(duì)蝦penaeidin蛋白抗血清反應(yīng)。實(shí)施例7對(duì)蝦蛋白SF-P9的制備
采用Ni2+柱親和層析法，獲得純化的基因工程重組對(duì)蝦蛋白SF-P9。具體操作方法如
下
(1)挑取畢赤酵母重組基因工程菌株P(guān)icAia pas tor is X_33/pPIC6 α A/Pen單菌落， 接種于25ml BMGY培養(yǎng)液中。，300rpm，培養(yǎng)至0D6(I(I=2. 0 6. 0。用滅菌離心管，5000rpm 離心lOmin，收集菌體，轉(zhuǎn)接到IOOmL BMMY液體培養(yǎng)基中。(2) 28°C,300rpm振搖培養(yǎng)96 h，其中每隔12 h按培養(yǎng)液的0. 5%體積補(bǔ)充無水甲醇。(3)誘導(dǎo)72 h后，15，OOOrpm離心lOmin，收集發(fā)酵上清，上清樣品于_80°C冷凍保存。(4)上清樣品用 IXBinding Buffer 透析(8X Binding Buffer 配制4 M NaCl, 160 mM Tris-HCl, 40 mM imidazole, pH 7· 9)、然后用 0· 45 μ m 的濾膜過濾。用 IXBinding Buffer 定容至 IOOml Ni++柱層析樣品。用 10 床 IXBinding Buffer，20 床無菌水清洗柱床；用 10 床 IXCharge Buffer (5mM NiS04)，結(jié)合 Ni++；再用 10 床 IXBinding Buffer平衡柱床。樣品循環(huán)方式通過Ni++柱，使帶有6XHis的蛋白樣品流動(dòng)相充分與Ni++ 柱中的Ni++相結(jié)合。分別采用50床IXBinding Buffer ；75床60mM咪唑；75床IOOmM咪唑； 30床150mM咪唑梯度洗滌留在柱內(nèi)的少量樣品和與Ni++柱結(jié)合的非目的蛋白。用1 XElute BufferC4X Elute Buffer 的配制4 M imidazole, 2 M NaCl, 80 mM Tris-HCl, pH 7.9) 洗脫與Ni++柱結(jié)合的目的蛋白，分部收集，ImL/管。(5) Ni++柱用IXElute Buffer繼續(xù)洗脫，洗脫柱中全部蛋白；再用1 XMrip Buffer (4X Strip Buffer 的配制2 M NaCl, 400 mM EDTA, 80 mM Tris-HCl, pH 7.9)
洗柱子。(6)采用實(shí)施例6中所述的16% Tricine-SDS-PAGE和Western Blot方法，用考馬斯亮藍(lán)R250染色檢測(cè)樣品中重組對(duì)蝦蛋白SF-P9。結(jié)果如附圖5所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明純化樣品有約為9. 1 kDa的單一特異性蛋白質(zhì)SF-P9條帶。實(shí)施例8對(duì)蝦蛋白F-P6的制備和鑒定
采用腸激酶酶切對(duì)蝦蛋白SF-P9，制備對(duì)蝦蛋白F-P6。腸激酶是一種切割位點(diǎn)高度專一的絲氨酸蛋白酶，其識(shí)別序列為DDDDK，在賴氨酸殘基的C-端切割多肽。具體方法如下
1.Ni-NTA Superflow柱親和層析法純化得對(duì)蝦蛋白SF-P9純品，調(diào)整其濃度為 100 μ g/mL ；
2.取1支1.5 mLEppendorf管，依次加入以下樣品90yL對(duì)蝦蛋白SF-P9，10yL 10X 酶切緩沖液(10X 酶切緩沖液500 mM Tris-HCl, pH 8. 0 (22° C)，10 mM CaC12, 1% Tween-20 ；稱取60. 5g Tris-base，溶于950 mL去離子水中，濃HCl調(diào)節(jié)pH至8. 0，加 1.47g CaC12*2H20、10mL Tween-20，混勻，定容至1L。室溫存放。)，反應(yīng)體積100 μ L，加入0.60unit腸激酶。37°C保溫4小時(shí)(h)。3.收集酶切后樣品，置-20°C保存?zhèn)溆?。采用?shí)施例6中所述的16%Tricine-SDS-PAGE和^festern Blot方法，用考馬斯亮藍(lán)R250染色檢測(cè)樣品中對(duì)蝦蛋白 F-P6。結(jié)果如附圖6所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在0.60 1111^/1001^腸激酶、371、酶切411的條件下，酶切對(duì)蝦蛋白SF-P9，制備了特異性的、分子量約為6. 3 kDa對(duì)蝦蛋白F-P6。對(duì)蝦蛋白F-P6的氨基酸序列為SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列。對(duì)蝦蛋白F-P6對(duì)應(yīng)的核酸序列為SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列。實(shí)施例9樣品中蛋白質(zhì)含量的確定
收集的對(duì)蝦蛋白SF-P9和F-P6樣品裝入經(jīng)處理的透析袋中，放入盛有IOOOmL PBS緩沖液(PH6. 9)燒杯中，4°C透析、過夜。采用Bradford法確定對(duì)蝦蛋白SF-P9 SF-P9和F-P6 的含量，用mg/mL標(biāo)定。Bradford法具體操作如下
(1)將0、1、2、3、4、5、6 μ L lmg/ml牛血清白蛋白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)溶液依次加入酶標(biāo)微孔板中，用PBS補(bǔ)足50 μ L0(2)向每孔中加入200 μ L Bradford試劑工作液(0. 1 %考馬斯亮藍(lán)G250，5%乙
醇，8.5%磷酸)。振蕩、混勻后，室溫放置2分鐘。(3)用酶標(biāo)儀測(cè)BSA蛋白各濃度的OD57tl值(λ =570nm)。以BSA蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，以BSA蛋白各濃度的OD57tl值為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。(4)用同樣方法測(cè)定樣品的OD57tl值，用標(biāo)準(zhǔn)曲線中確定樣品的濃度。實(shí)施例10對(duì)蝦蛋白SF-P9和F_P6抗細(xì)菌的生物活性測(cè)定
采用噻唑藍(lán)(MTT)法和管碟法，檢測(cè)對(duì)蝦蛋白SF-P9和F-P6對(duì)革蘭氏陽性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌的活性。實(shí)驗(yàn)菌種包括金黃色葡萄球菌(Ste/7如A^occm aureus、、 短小芽孢桿菌{Bacillus pumilus )、蘇云金芽孢桿菌{Bacillus thuringiensis )、枯草芽孢桿菌(bacillus mega terium )、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus )、副溶血弧菌 (.Bibrio ParaAewo斤iic^s)、大腸桿菌 JM109 (.Escherichia coli JM109)、銅綠假單胞菌 iPseudomonas aeruginosa^)^ ^ 1 ^ ^Π 1 (.salmonella typhimurium) (Φ Hi^rMJflff 物保藏中心提供)。1. MTT法檢測(cè)對(duì)蝦蛋白SF-P9和F_P6的抗細(xì)菌活性
(1)將受試細(xì)菌培養(yǎng)過夜，用生理鹽水調(diào)整細(xì)菌濃度至2-7 X IO5 CFU/mL。(2)用無菌微量加樣器向無菌96孔微孔板中每孔加入稀釋菌液50 μ L，再分別在各孔中加入待測(cè)樣品50 yL，混勻。同時(shí)，設(shè)ddH20作為陰性對(duì)照、氨芐青霉素(Amp)作為陽性對(duì)照。每種樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔。37°C恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)12-16 h。(3)分別在各孔中加入10 μ L 5 mg/mL的噻唑藍(lán)(MTT)溶液，37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-4 h至反應(yīng)完全。(4)分別在各孔中加入90 μ L 二甲基亞砜(DMS0)，反復(fù)吹打混勻，使藍(lán)色晶體充分溶解，在570nm處測(cè)量OD值。(5)計(jì)算存活率。存活率=(A570樣品處理/A570空白處理)X 100%。(6)MTT法檢測(cè)對(duì)蝦蛋白SF-P9的抗細(xì)菌活性結(jié)果詳見表1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)蝦蛋白SF-P9不僅對(duì)革蘭氏陽性菌有很好的抑殺作用，對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌也有廣譜抑菌特性。 其中，對(duì)蝦蛋白SF-P9對(duì)枯草芽孢桿菌的MIC值約為0. 028ymol/L ；對(duì)副溶血弧菌的MIC值約為0. 028^0. 056 μ mol/L ；對(duì)短小芽孢桿菌、副溶血弧菌、鼠傷寒沙門氏菌、銅綠假單胞菌的MIC值在0. 028 0. 056ymol/L之間；對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC值在0. 089 0. 112ymol/ L之間；對(duì)大腸桿菌JM109的MIC值在0. 056 0. 112μπι01/1之間；對(duì)蘇云金芽孢桿菌的MIC 值為約為0. 099 μ mol/L。對(duì)蝦蛋白F-P6對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC值為0. 095 0. 120 μ mol/ L ；對(duì)短小芽孢桿菌的MIC值為0. 033、. 063 μ mol/L ；對(duì)蘇云金芽孢桿菌的MIC值約為 0. 115 μ mol/L ；對(duì)枯草芽孢桿菌的MIC值約為0. 031 μ mol/L ；對(duì)溶藻弧菌的MIC值約為 0. 036 μ mol/L ；對(duì)副溶血弧菌的MIC值為0. 033 0. 062 μ mol/L ；對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的MIC 值為0. 030 0· 064 μ mol/L ；對(duì)大腸桿菌JM109的MIC值為0. 063 0. 121 μ mol/L ；對(duì)銅綠假單胞菌的MIC值為0. 036 0. 067 μ mol/L。
表1對(duì)蝦蛋白SF-P9和F-P6抗細(xì)菌活性測(cè)定
權(quán)利要求
1.一種基因工程表達(dá)、分離和純化的重組對(duì)蝦蛋白SF-P9，其序列為SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列。
2.一種基因工程表達(dá)、分離和純化的重組對(duì)蝦蛋白SF-P9對(duì)應(yīng)的核酸，其序列為SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列。
3.一種表達(dá)重組對(duì)蝦蛋白SF-P9的基因工程菌株，其特征在于所述的菌株是酵母重組基因工程菌株/7ZcAia pas tor is X-33/pPIC6 α A/Pen, CCTCC No: M209126。
4.權(quán)利要求3所述的一種表達(dá)重組對(duì)蝦蛋白SF-P9的酵母重組基因工程菌株P(guān)idia pastor is X_33/pPIC6 α A/Pen的構(gòu)建方法，其步驟是A、南美白對(duì)蝦總RNA的提取及cDNA第一條鏈的合成采集南美白對(duì)蝦血淋巴，獲得血細(xì)胞，提取總 RNA，并按 Promega 公司 Universal Riboclone cDNA Synthesis System 試劑盒操作手冊(cè)進(jìn)行，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈；B、PCR擴(kuò)增Penaeidin基因以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA第一條鏈為模板，上游引物Pl 5，GAATTCTACAGGGGCGGTTACACA 3，，下游引物 P2 :5，TCTAGAGCCTTGTCATCGTCATCTCCTTTTACT AAGTGACAACA 3’，利用PCR儀擴(kuò)增，獲得獲得191 bp目的基因片段；C、重組質(zhì)粒pGEM-T/Pen的構(gòu)建和鑒定回收PCR產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物連接到pGEM_T載體上，轉(zhuǎn)化五coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含X-gal、IPTG和Amp抗性的LB平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，用PCR和限制性內(nèi)切酶酶切鑒定、DNA測(cè)序分析鑒定重組質(zhì)粒pGEM-T/Pen ；D、重組穿梭質(zhì)粒pPIC6aA/Pen的構(gòu)建和鑒定用和損al分別雙酶切質(zhì)粒 pPIC6 a A和質(zhì)粒pGEM-T/Pen DNA，將Penaeidin基因定向插入質(zhì)粒pPIC6 α Α，轉(zhuǎn)化五coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，在含300 μ g/ml殺稻瘟素的LB平板上篩選陽性克隆，獲得大腸桿菌菌株 E. coli JM109 (pPIC6aA/Pen)，用PCR、限制性內(nèi)切酶酶切鑒定和DNA測(cè)序分析鑒定重組穿梭質(zhì)粒PPIC6 a A/Pen ；E、重組穿梭質(zhì)粒pPIC6 a A/Pen轉(zhuǎn)化PicAia pas tor is X_33，獲得畢赤酵母重組基因工 MM^Pichia pas tor is X-33/pPIC6 a A/Pen ；a.重組穿梭質(zhì)粒pPIC6 α A/Pen DNA的線性化制備質(zhì)粒pPIC6 α A/Pen DNA 15-20 μ g，經(jīng)RNaseA消化，然后用限制性內(nèi)切酶fee I進(jìn)行酶切線性化，沉淀過夜；b.Pichia pas tor is X-33感受態(tài)細(xì)胞的制備挑取PicAia pas tor is X-33單菌落，接種于5mlYPD中，30°C、260rpm振搖培養(yǎng)過夜，離心收集菌體，經(jīng)0. IM LiCl處理制備Pichia pas tor is X-33感受態(tài)細(xì)胞；c.轉(zhuǎn)化采用線性化的重組穿梭質(zhì)粒pPIC6α A/Pen DNA轉(zhuǎn)化PicAia pastor is X-33 感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含300 μ g/ml殺稻瘟素的YPD平板上，30°C，培養(yǎng)2 3天，按同樣方法轉(zhuǎn)化線性化空載體質(zhì)粒PPIC6 α Α,作為陰性對(duì)照；F、畢赤酵母重組基因工程菌株P(guān)icAiapas tor is X_33/pPIC6 α A/Pen的篩選與鑒定 提取畢赤酵母重組基因工程菌株P(guān)icAia pas tor is X_33/pPIC6 α A/Pen基因組，以PicAia pas tor is X_33/pPIC6 α A/Pen基因組DNA為模板，用酵母醇氧化酶通用引物p5' AOXl與 p3' AOXl 進(jìn)行 PCR 鑒定，同時(shí)設(shè) PicAia pas tor is X_33/pPIC6 α A 基因組 DNA 私 Pichia pas tor is X_33基因組DNA兩個(gè)對(duì)照；G、測(cè)序結(jié)果表明penaeidin基因已正確定向整合到畢赤酵母PicAiapas tor is X-33 基因組的特定位點(diǎn)中。
5.權(quán)利要求1所述的一種重組對(duì)蝦蛋白SF-P9在制備治療或預(yù)防細(xì)菌感染藥物中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求1所述的一種重組對(duì)蝦蛋白SF-P9在制備治療或預(yù)防真菌感染藥物中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1所述的一種重組對(duì)蝦蛋白SF-P在制備治療或預(yù)防病毒感染藥物中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1所述的一種重組對(duì)蝦蛋白SF-P在制備治療或預(yù)防腫瘤藥物中的應(yīng)用。
9.一種分離和純化的對(duì)蝦蛋白F-P6，其序列為SEQ ID NO. 4所示氨基酸序列。
10.一種分離和純化的對(duì)蝦蛋白F-P6對(duì)應(yīng)的核酸，其序列為SEQ ID NO. 3所示核苷酸序列。
11.權(quán)利要求9所述的一種制備對(duì)蝦蛋白F-P6的方法，其步驟是A、Ni-NTASuperflow柱親和層析法純化得對(duì)蝦蛋白SF-P9，調(diào)整其濃度為100 μ g/mL ；B、取1支1.5mLEppendorf管，依次加入以下樣品90 μ L對(duì)蝦蛋白SF-P9，10 μ L IOX 酶切緩沖液，反應(yīng)體積100 μ L，加入0. 60unit腸激酶，37°C保溫4小時(shí)；C、收集酶切后樣品，置_20°C保存?zhèn)溆茫捎?6%Tricine-SDS-PAGE和Western Blot 方法，用考馬斯亮藍(lán)R250染色檢測(cè)樣品中對(duì)蝦蛋白F-P6，在0. 60 unit/100 μ L腸激酶、 37°C、酶切4h的條件下，酶切對(duì)蝦蛋白SF-P9，制備分子量為6. 3 kDa對(duì)蝦蛋白F-P6。
12.權(quán)利要求9所述的一種對(duì)蝦蛋白F-P6在制備治療或預(yù)防細(xì)菌感染藥物中的應(yīng)用。
13.權(quán)利要求9所述的一種對(duì)蝦蛋白F-P6在制備治療或預(yù)防真菌感染藥物中的應(yīng)用。
14.權(quán)利要求9所述的一種對(duì)蝦蛋白F-P6在制備治療或預(yù)防病毒感染藥物中的應(yīng)用。
15.權(quán)利要求9所述的一種對(duì)蝦蛋白F-P6在制備治療或預(yù)防腫瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組對(duì)蝦蛋白SF-P9及制備方法和用途，編碼該重組對(duì)蝦蛋白SF-P9的氨基酸序列及其對(duì)應(yīng)的DNA序列，含該DNA序列的酵母重組基因工程菌株P(guān)ichiapastorisX-33/pPIC6αA/Pen，CCTCCNo:M209126，利用該工程菌株表達(dá)重組對(duì)蝦蛋白SF-P9。本發(fā)明還公開了一種對(duì)蝦蛋白F-P6及制備方法和用途，編碼該對(duì)蝦蛋白Pen6的氨基酸序列及其對(duì)應(yīng)的DNA序列。重組對(duì)蝦蛋白SF-P9中含有腸激酶位點(diǎn)，經(jīng)腸激酶酶切后獲得對(duì)蝦蛋白F-P6。對(duì)蝦蛋白SF-P9和F-P6具有明顯的抗細(xì)菌、抗真菌和抗病毒感染的生物活性。對(duì)蝦蛋白SF-P9和F-P6具有明顯的抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用。對(duì)蝦蛋白SF-P9和F-P6在制備治療或預(yù)防動(dòng)物和植物的細(xì)菌、真菌和病毒病藥物、抗腫瘤藥物中的用途。
文檔編號(hào)A61P35/02GK102190718SQ201010572929
公開日2011年9月21日 申請(qǐng)日期2010年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月3日
發(fā)明者唐檢秀, 孟小林, 徐進(jìn)平, 王健 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)