專利名稱：抗對蝦白斑綜合癥病毒工程蛋白tat-vp28及制備和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因生物工程技術(shù)領(lǐng)域。更具體涉及一種重組融合蛋白TAT-VP^亞單位疫苗，同時還涉及一種大腸桿菌基因工程菌株的制備方法，具體涉及構(gòu)建和高效表達(dá)可溶一種蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域多肽(TAT-PTD)和對蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)囊膜蛋白VP^融合蛋白的基因工程菌株；還涉及上述菌株表達(dá)的融合蛋白在抗對蝦白斑綜合癥病毒的藥物中的用途。
背景技術(shù)：
上世紀(jì)80年代以來，世界對蝦養(yǎng)殖業(yè)高速發(fā)展，隨著環(huán)境的日益破壞，病害問題加劇，已經(jīng)成為阻礙對蝦養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要因素。對蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)是對全球?qū)ξr養(yǎng)殖業(yè)危害最大的病原之一。對蝦白斑綜合癥病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV) 自1992年首次在臺灣爆發(fā)以來，先后分別在日本、東南亞、北美等國家爆發(fā)，在全球范圍內(nèi)對蝦養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。1995年，聯(lián)合國糧油組織(FAO)，國際獸藥局(OIE) 以及亞太地區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖發(fā)展網(wǎng)絡(luò)中心(NACA)將其列為需要報告的水生動物病毒性疫病之一。近年來各國專家學(xué)者們對白斑綜合癥病毒進(jìn)行了深入研究，探討了其形態(tài)結(jié)構(gòu)、基因組成、分類學(xué)、感染宿主以及與病毒感染相關(guān)的蛋白。為防治WSSV感染提供了重要的理論依據(jù)。WSSV是一種有囊膜的環(huán)狀雙鏈DNA病毒，其形態(tài)學(xué)與桿狀病毒相似，呈長桿狀，具有雙層囊膜。完整的病毒粒子主要包括囊膜、核衣殼及病毒核心三部分。WSSV有較廣的宿主范圍，除了可以感染蝦、蟹類等甲殼動物外，橈足類及部分節(jié)肢動物也可以成為該病毒的傳播者及攜帶者。WSSV的主要結(jié)構(gòu)蛋白有VP15、VP19、VP24, VP26, VP^，編碼這些蛋白的閱讀框通過對其N-端氨基酸序列的測定已確定。VP19、VP^是主要的囊膜蛋白。對VP^ 蛋白的結(jié)構(gòu)分析可以發(fā)現(xiàn)，VP28蛋白的結(jié)構(gòu)中存在5個潛在的N-糖基化位點，2個潛在的 0-糖基化位點及9個可能的磷酸化位點。同時，在蛋白的N-端存在強(qiáng)疏水區(qū)，且這個區(qū)域中包含一個理論上的跨膜結(jié)構(gòu)域。van Hulten第一次利用VP^蛋白的抗體中和實驗證明了該蛋白與 WSSV 感染的早期過程有關(guān)(van Hulten，Μ. C. W.，ffitteveldt, J.，Snippe， Μ. , Vlak, J. Μ. . White spot syndrome virus envelope protein VP28 is involved in the systemic infection of shrimp[J] · Virology,2001b,285 :228-233.)。在van Hulten 的研究基礎(chǔ)上，Yi進(jìn)一步研究了 VP^蛋白在WSSV感染過程中的具體作用，進(jìn)一步證明了 VP28蛋白參與WSSV對蝦細(xì)胞的吸附及侵入過程(Yi, G.，Wang，Ζ.，Qi，Y.，Yao, L.，Qian, J., Hu, L. . VP28 of white spot syndrome virus is involved in the attachment and penetration into shrimp cells [J]. J. Biochem. Mol. Biol，2004，37 :726-734.)。近年來研究發(fā)現(xiàn)能夠與VP^蛋白相互作用的宿主細(xì)胞表面蛋白主要有PmRab7、HSP70 (heat shock cognate protein 70) > STAT (signal transducer and activator of transcription)。近年來各國學(xué)者一直致力于對WSSV流行病學(xué)及致病機(jī)理的研究，以尋找防治WSSV感染的措施和方法。目前防治方法主要有利用免疫增強(qiáng)劑來增強(qiáng)對蝦抗病毒的感染能力、利用抗體中和作用來阻斷WSSV的感染、利用疫苗提高對蝦抗WSSV病毒的能力。目前研究證明能夠增強(qiáng)對蝦抗WSSV感染能力的免疫增強(qiáng)劑主要有脂多糖 (Lip0p0lySacCharides，LPQ，葡聚糖(Glucan)。Zhu研究的滅活疫苗能夠在蝦體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫應(yīng)答并保護(hù)蝦抵抗WSSV的感染，滅活疫苗是以二乙烯亞胺(Binary ethylenimine, BEI)作為滅活劑的，BEI作為滅活劑時WSSV的囊膜蛋白可以保持完整(Fei Zhu, Huahua Du, Zhi-Guo Miao, Hai-Zhi Quan, Zi-Rong Xu. Protection of Procambarus clarkii against white spot syndrome virus using inactivated WSSV[J]. Fish & Shellfish Immunology. 2009,26 :685-690)。Witteveldt利用原核表達(dá)載體在大腸桿菌中重組表達(dá) VP28融合蛋白，將純化的VP^融合蛋白通過肌肉注射到對蝦體內(nèi)，在肌肉注射后第2天及第25天分別進(jìn)行病毒攻擊實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，VP^融合蛋白注射組存在較高的相對存活率(Jeroen ffitteveldt, Just M. Vlak, Marielle C. W. , van Hulten. Protection of Penaeus monodon against white spot syndrome virus using a WSSV subunit vaccine [J], Fish & Shellfish Immunology. 2004，16 :571-579)。Du 利用昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)重組的VP^蛋白，重組蛋白經(jīng)肌肉注射進(jìn)入鰲蝦體內(nèi)。并注射后第10天進(jìn)行病毒攻擊實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)昆蟲細(xì)胞表達(dá)的重組蛋白與對照組相比，對鰲蝦有較好的保護(hù)作用(Huahua Du, Zirong Xu, Xiaofeng ffu, Weifen Li, Wei Dai. Increased resistance to white spot syndrome virus in Procambarus clarkii by injection of envelope protein VP28 expressed using recombinant baculovirus[J]. Aquaculture. 2006,260 39-43)。Xu利用桿狀病毒(HyNPV)表達(dá)系統(tǒng)在家蠶體內(nèi)分別表達(dá)重組的VP^及VP19蛋白，并將帶有重組蛋白的家蠶勻漿液包裹蝦飼料，連續(xù)投喂克氏原鰲蝦30天。投喂結(jié)束后即進(jìn)行病毒攻擊，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，VP^蛋白組及VP19蛋白組的相對存活率分別為94. 7%和89. 5%。這說明與肌肉注射相比，口服的亞單位疫苗同樣可以對克氏原鰲蝦產(chǎn)生保護(hù)作用(Zirong Xu a, Huahua Du, Yaxiang Xu, Jianyi Sun, Jian Shen. Crayfish Procambarus clarkii protected against white spot syndrome virus by oral administration of viral proteins expressed in silkworms[J]. Aquaculture. 2006 253,179-183) ο Xu利用畢赤酵母(Pichia pastoris)對VP^及VP19蛋白進(jìn)行真核表達(dá)， 并將表達(dá)的重組蛋白經(jīng)蝦飼料包裹后投喂克氏原鰲蝦。連續(xù)投喂25天后，分別在結(jié)束投喂后的第3天及第21天進(jìn)行病毒攻擊實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，VP28及VP19蛋白投喂組存在較高的相對存活率(Zi Rong Xu, Shi Juan Bai，Jian Yu Sun, Wei Fen Li and Jian Shen. Protection of Procambarus clarkii against white spot syndrome virus using recombinant oral vaccine expressed in Pichia pastoris[J]Fish & Shellfish Immunology April 2007，Pages 295-307)。Fu利用枯草芽孢桿菌高效地分泌表達(dá)重組的 VP^蛋白，并將表達(dá)的重組蛋白經(jīng)蝦飼料包裹后投喂中國對蝦，連續(xù)投喂20天后，分別于第3天、14天、觀天進(jìn)行病毒攻擊，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，蛋白投喂組的相對存活率達(dá)到了 83.3%。Rajesh以殼聚糖納米顆粒作為轉(zhuǎn)運(yùn)載體，將帶有vp^基因的DNA疫苗包裹在其中，并通過口服的方式免疫對蝦。在免疫后第7、15、30天分別進(jìn)行病毒攻擊實驗，并得到了較好的保護(hù)效果，相對存活率分別為85%、65%、50% (S. Rajesh Kumar, C. Venkatesan, Μ. Sarathi, V. Sarathbabu, John Thomas, K. Anver Basha, Α. S.Sahul Hameed. Oral delivery of DNA construct using chitosan nanoparticles to protect the shrimpfrom white spot syndrome virus (WS SV)[J].Fish& Shellfish Immunology. 2009,26 6429-437.)。Ning以減毒的沙門氏菌作為轉(zhuǎn)運(yùn)載體，將帶有基因的真核表達(dá)載體 pcDNA3. 1轉(zhuǎn)化入減毒的沙門氏菌中，并將重組菌以口服的方式免疫克氏原鰲蝦。在免疫后第7、15、25天分別進(jìn)行病毒攻擊實驗，結(jié)果得到的相對存活率分別為88. 3%,66. 7%和 56. 7 % (Jian-Fang Ning, Wei Zhu, Jin-Ping Xu, Cong-Yi Zheng, Xiao-Lin Meng. Oral delivery of DNA vaccine encoding VP28 against white spot syndrome virus in crayfish by attenuated Salmonella typhimurium. Vaccine[J]· 2009,27 :1127-1135)。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(protein transduction domain,PTD)或稱細(xì)胞穿膜肽(cell penetrating peptides, CPPs)是一條以肽為載體的有效運(yùn)輸各種物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞及細(xì)胞核的系統(tǒng)。通過PTD攜帶的物質(zhì)有全長蛋白質(zhì)、DNA、化學(xué)藥物、寡核苷酸、40nm磁珠和200nm 脂質(zhì)體等。現(xiàn)在研究最多、應(yīng)用范圍最廣的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域來源于人免疫缺陷病毒1型(HIV-I)
(Trans-activating transcriptional activator, Tat) Tat 胃白 43. 3個功能結(jié)構(gòu)域，分別是位于N-端的酸性區(qū)，主要起反式激活的功能；位于第22-37位氨基酸之間的DNA結(jié)合區(qū)，該區(qū)域富含半胱氨酸；位于第47-60位氨基酸之間的堿性區(qū)，是主要的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，參與Tat蛋白的細(xì)胞內(nèi)化作用。Tat蛋白共有86個氨基酸，是HIV復(fù)制所必需的調(diào)節(jié)因子。khwarze等確定具有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的最小肽段是47-57，由11個氨基酸組成，其序列為YGRKKRRQRRR，該段等電點12. 7，為堿性多肽，轉(zhuǎn)導(dǎo)速度快，效率高。TAT 可以將與之相連的多肽或全長蛋白質(zhì)在數(shù)分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞，而且在體內(nèi)可以通過血液循環(huán)運(yùn)輸至腦組織，跨越血腦屏障進(jìn)入神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)。目前已有幾十種化合物和蛋白質(zhì)被成功轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入不同的細(xì)胞或者跨越血腦屏障，并表現(xiàn)出了相應(yīng)的生物活性，而且已將多種變性的蛋白質(zhì)，如半乳糖苷酶轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入小鼠體內(nèi)并恢復(fù)了生物活性，被帶入細(xì)胞的分子基本上保留了它們各自原有的活性。TAT蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域序列中由于有6個精氨酸和2個賴氨酸殘基，因此是帶有高度正電荷的多肽。以不帶電荷的丙氨酸替代其中的任何一個堿性氨基酸殘基都會使穿膜活性降低，而替代序列中的其他氨基酸殘基時穿膜活性則不會發(fā)生改變。這說明TAT穿膜肽所帶的正電荷是其穿膜功能所必需的，因此推測這些正電荷很可能是能夠與真核細(xì)胞的細(xì)胞膜發(fā)生強(qiáng)的靜電作用，從而介導(dǎo)了穿膜過程。對TAT蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的親和性分析發(fā)現(xiàn)，它能夠與許多細(xì)胞膜表面的陰離子通過靜電作用強(qiáng)烈地結(jié)合，與之結(jié)合的細(xì)胞表面分子可以是核仁素、蛋白聚糖等。此外，研究發(fā)現(xiàn)TAT蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域不會因為手性結(jié)構(gòu)的改變而影響其穿膜活性，其手性分子與自然結(jié)構(gòu)具有相同的穿膜活性。這說明這種TAT蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域很可能不依賴于特定的結(jié)合位點。然而，多肽的長度是影響穿膜效率的重要因素。穿膜效率與精氨酸的個數(shù)有關(guān)，含有6個或者更多精氨酸的多肽要比含有少于5 個精氨酸多肽的穿膜效率高一些，在多肽小于15個氨基酸時，穿膜效率會隨著多肽大小的增加而增強(qiáng)。大于15個氨基酸的多肽雖然也可具有穿膜活性，但其效率卻會明顯減小。盡管對于TAT蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的穿膜功能研究的比較多，但是到目前為止，關(guān)于TAT蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域進(jìn)入細(xì)胞的分子機(jī)制還沒有完全研究清楚。早期研究認(rèn)為是通過直接轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制穿過細(xì)胞膜，且是不依賴于能量的，但最近的研究也有與這一觀點不同的結(jié)果。盡管其進(jìn)入細(xì)胞的機(jī)制還沒有完全研究透徹，但TAT蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的應(yīng)用已經(jīng)十分廣泛。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種大腸桿菌基因工程菌株，該菌株可以表達(dá)蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域多肽(TAT-PTD)和對蝦白斑綜合癥病毒囊膜蛋白VP^基因工程融合蛋白 TAT-VP^。其優(yōu)點是表達(dá)量大且可溶，易于工業(yè)化生產(chǎn)，成本低，安全性好。本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種重組融合蛋白TAT-VP^亞單位疫苗的制備方法，能夠預(yù)防對蝦白斑綜合癥(WSS)，與表達(dá)的重組融合蛋白VP^亞單位疫苗相比，在預(yù)防對蝦白斑綜合癥上有更高，更長的保護(hù)效果。本發(fā)明的再一個目的是基因工程融合蛋白在制備治療或預(yù)防對蝦白斑綜合癥病毒的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的融合蛋白TAT-VP^能夠有效的預(yù)防對蝦白斑綜合癥(WSS)。重組融合蛋白TAT-VP^經(jīng)過鰲蝦口服后，融合蛋白TAT-VP^可以穿過蝦腸組織而進(jìn)入鰲蝦血淋巴，使亞單位疫苗可以不經(jīng)肌肉注射而直接進(jìn)入血淋巴中，通過血淋巴在蝦體內(nèi)的循環(huán)，使其融合蛋白到達(dá)不同的組織，增加了于WSSV病毒的競爭中和的作用，同時也爭強(qiáng)了蝦的免疫酶活作用。本發(fā)明的創(chuàng)新之處在于，本發(fā)明專利利用大腸桿菌表達(dá)TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和 WSSV囊膜蛋白VP^的融合蛋白，意在防治WSS。通過基因工程生產(chǎn)的TAT-VP^融合蛋白可以作為抗WSS病原的微生物藥物應(yīng)用于對蝦養(yǎng)殖業(yè)，能夠顯著提高對蝦的免疫力和抗病能力。本發(fā)明另一個創(chuàng)新之處在于，將蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域多肽TAT和VP^融合表達(dá)。TAT可以攜帶VP^蛋白不經(jīng)肌肉注射而直接進(jìn)入血淋巴中。蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域多肽TAT目前還沒有直接應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)，但其獨特的穿膜效率十分具有吸引力。解決了使亞單位疫苗可以不經(jīng)肌肉注射而直接進(jìn)入血淋巴中，使其具有實際操作的可行性。而且本發(fā)明公開的基因工程菌株的構(gòu)建方法可以應(yīng)用于大規(guī)模的養(yǎng)殖業(yè)中，表達(dá)量大，操作簡單，成本低。本發(fā)明的技術(shù)方案如下本發(fā)明的技術(shù)要點之一是表達(dá)基因工程重組融合蛋白TAT-VP^的大腸桿菌基因工程菌株的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)。本實驗所涉及的分子生物學(xué)方法為常規(guī)方法，為本領(lǐng)域人員所熟悉。本發(fā)明中未詳細(xì)闡述的請參見《分子克隆實驗指南》J.薩姆布魯克，D. W.拉塞爾等主編。一種重組融合蛋白TAT-VP^亞單位疫苗的制備方法，其步驟如下1. WSSV的VP^基因的制備(I)WSSV病毒基因組的制備在冰上取患病對蝦的鰓、胃和心臟，冰浴勻漿，然后加入蛋白酶K(100ug/ml)，在沸水中煮15分鐘，立即冰浴5分鐘，12000rpm離心10分鐘，取
其上清置4°C保存。(2) PCR 擴(kuò)增 VP28 基因根據(jù) GeneBank 中已經(jīng)發(fā)表的 WSSV (GeneBank :EU414753) 的序列設(shè)計PCR引物，以上述上清作為模板DNA，PCR擴(kuò)增目的基因VP^，PCR產(chǎn)物通過DNA 凝膠電泳檢測，回收PCR產(chǎn)物并將其克隆到pGEM-T載體(在promega公司購置)中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109(在INVITR0GEN公司購置)，挑取單菌落培養(yǎng)，用堿裂解法小量(15-20ug) 提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，并進(jìn)行測序，得到的陽性克隆子即為包含VP^基因的大腸桿菌， 命名為 pGEM-T-vp28。
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2.融合基因tat-vp^的制備及表達(dá)載體的構(gòu)建(I)PCR擴(kuò)增1站-叩觀基因上游引物為3條、下游引物為1條分三次PCR合成 tat-vp28 以 pGEM-T-vp28 質(zhì)粒為模板，上游引物 Pl :CAGCGTCGTCGTGGATCCATGGATCTTTCTT TCA，下游引物 1 :GGCCTCGAGCTACTCGGTCTCAGTGCCAGAGTA (劃線處為 Xhol 位點)，退火溫度 56°C，做PCR擴(kuò)增目的片段(片段大小為636bp)，電泳并作回收；以上一步回收產(chǎn)物為模板，上游引物 P2 CGTAAAAAACGTCGTCAGCGTCGTCGTGGATCC，下游引物 1 GGCCTCGAGCTACTCGGT CTCAGTGCCAGAGTA (劃線處為Xhol位點)，退火溫度56°C做PCR，做PCR擴(kuò)增目的片段電泳并作回收；以上一步回收產(chǎn)物為模板，上游引物P3 GCGGAATTCGGCTATGGCCGTAAAAAACGTCGT (劃線處為 EcoRI 位點)，下游引物 1GGCCTCGAGCTACTCGGTCTCAGTGCCAGAGTA (劃線處為 Biol 位點)，退火溫度56°C做PCR。PCR擴(kuò)增目的基因TAT-VP^ (片段大小為666bp)，，PCR產(chǎn)物通過DNA凝膠電泳檢測，回收PCR產(chǎn)物并將其克隆到pGEM-T載體(在promega公司購置) 中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109 (在INVITR0GEN公司購置)，挑取單菌落培養(yǎng)，用堿裂解法小量提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，并進(jìn)行測序，得到的陽性克隆子即為包含TAT-VP^基因的大腸桿菌，命名為 pGEM-T-tat-vp28。(2)融合基因tat-vp^表達(dá)載體的構(gòu)建用EcoR I和Biol I雙酶切質(zhì)粒 PGEMT-TAT-VP28 和質(zhì)粒 pET48a(+)(在 INVITROGEN 公司購置)，目的片段 TAT-VP28 和開環(huán)pET48a(+)膠回收后16°C連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落培養(yǎng)， 用堿裂解法小量提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，得到的陽性克隆子即為包含TAT-VP^基因的大腸桿菌，命名為 pET48a(+) -TAT-VP^。3大腸桿菌基因工程菌的制備將質(zhì)粒pET48a(+)-TAT-VP28(Iul)轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)(大腸桿菌BL21 (DE3) 本實驗室保存，這樣描述絕對不行，請將大腸桿菌BL21 (DE3)的來源寫明，寫明文獻(xiàn)出處) 感受態(tài)細(xì)胞。PCR鑒定篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，所得陽性克隆即為本發(fā)明涉及的能夠融合表達(dá) TAT-VP^ 的重組基因工程菌株 Escherichia coli BL21 (pET_28a-TAT_VP28)。4基因工程融合蛋白TAT-VP^的表達(dá)重組基因工程菌株Escherichia coli BL21 (pET-28a-TAT-VP28)的單菌落接種到20ml新鮮液體MDG(含終濃度為的30ug/ml卡納霉素)培養(yǎng)基中。37°C 200rpm搖床培養(yǎng)過夜。將5ml過夜培養(yǎng)物分別同時接種到200ml乳糖自動誘導(dǎo)ZYM5052 (含終濃度為的30ug/ml卡納霉素)培養(yǎng)基。200rpm搖床培養(yǎng)3小時后，18°C低溫自動誘導(dǎo)IMi后，離心12000g，4°C，IOmin收集菌體，用IOmMPBS(pH8. 0)重懸超聲波破碎，離心收集上清和沉淀并用SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白的表達(dá)。以優(yōu)化后的條件擴(kuò)大培養(yǎng)，超聲波破碎后，離心(12000g，4°C，20min)收集上清。融合蛋白TAT-VP^的純化按Ni-NTA說明書進(jìn)行，用 SDS-PAGE檢測蛋白純化結(jié)果，得到純化的TAT-VP^。其特征在于融合蛋白具有穿蝦腸功能和融合蛋白的分子量為27. SKDa0本發(fā)明的技術(shù)要點之二是鰲蝦口服TAT-VP^蛋白的穿腸功能鑒定。在本發(fā)明的一個實施例中提供了鰲蝦口服基因工程融合蛋白后，融合蛋白在蝦體內(nèi)穿腸鑒定的方法，即ELISA檢測TAT-VP^蛋白的穿腸功能。方法如下(1)將純化的VP^抗體于PBS緩沖液中稀釋100倍，并于96孔酶標(biāo)板中每孔加入 100 μ L。將酶標(biāo)板的小孔用封口膜封口后置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中溫育池，使抗體包被于酶標(biāo)板底部。(2)棄去酶標(biāo)板小孔中的樣品，于每空中加入100 μ L 5% (質(zhì)量體積比)BSA，用封口膜封口后置于冰箱中4°C封閉過夜。(3)甩干酶標(biāo)板小孔中的封閉液，于每孔中加入300 μ L PBST緩沖液，浸泡5min，
并間歇振動酶標(biāo)板使洗滌更加充分。重復(fù)操作本步驟三次。(4)分別吸取抗凝血淋巴100 μ L加入酶標(biāo)板小孔中，同時以只加PBS緩沖液不加抗凝血淋巴的酶標(biāo)板小孔作為空白對照。將酶標(biāo)板的小孔用封口膜封口后置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中溫育lh，使血淋巴中的抗原與包被在酶標(biāo)板中的抗體充分結(jié)合。(5)重復(fù)步驟(3)三次。(6)將辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的VP^抗體于PBST緩沖液中稀釋200倍，于酶標(biāo)板小孔中每孔加入100 μ L。用封口膜封口后置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中溫育lh，使HRP標(biāo)記的VP^抗體與抗原充分結(jié)合。(7)重復(fù)步驟(3)三次。(8)于酶標(biāo)板小孔中每孔中加入300 μ L PBS緩沖液，浸泡5min，并間歇振動酶標(biāo)板使洗滌更加充分。(9)于酶標(biāo)板小孔中每孔加入100μ L顯色液，用封口膜封口后于37°C恒溫培養(yǎng)箱中避光顯色20min。(10)于酶標(biāo)板小孔中每孔加入50 μ L終止液，終止顯色反應(yīng)。并用酶標(biāo)儀在490nm 波長下測定各孔的光吸收值。本發(fā)明ELISA結(jié)果表明以鎳離子親和層析分別純化TAT-VP^及VP^蛋白，純化后的蛋白經(jīng)口免疫克氏原鰲蝦1. 5小時后，抽取血淋巴并利用雙抗體夾心ELISA檢測抗原VP^。結(jié)果表明鰲蝦口服TAT-VP^蛋白后，鰲蝦血淋巴中檢測到了陽性結(jié)果，而VP^蛋白組則未檢測到陽性結(jié)果。這一結(jié)果表明，TAT能夠攜帶與其融合表達(dá)的VP^蛋白穿過鰲蝦的腸組織，并進(jìn)入鰲蝦血淋巴中。一種大腸桿菌基因工程菌株，其特征在于，該菌株為重組基因工程菌株 Escherichia coli BL21 (DE3)pET-28a-TAT-VP28, CCTCC NO :M2010296。所述的重組基因工程菌株Escherichia coli BL21 (D&)pET_28a-TAT_VP28，重組質(zhì)粒hcherichia coli BL21 (DE3)pET48a-TAT-VP^為本發(fā)明所構(gòu)建。所述的重組大腸桿菌菌株 Escherichia coli BL21 (DE3)pET-28a-TAT-VP28 是具有質(zhì)粒 Escherichia coli BL21 (DE3)pET-28a-TAT-VP28 的大腸桿菌菌株，保藏編號CCTCC NO :M201(^96，保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學(xué)，保藏日期2010年11月 10 日，分類命名大腸桿菌 BL21(D&)pET-28a-TAT-VP28 Escherichia coli BL21(DE3) pETj8a-TAT-VP^。所述的編碼基因 BL21 (DE3) pET-28a-TAT-VP28 是具有 SEQUENCE NO. 1 的核苷酸序列的蛋白編碼基因。所述的蛋白BL21 (DE3) pET-28a-TAT-VP28是具有SEQUENCE NO. 2的氨基酸序列的蛋白。一種分離的蛋白質(zhì)，其序列為SEQUENCE NO. 2所示的氨基酸序列。該大腸桿菌菌株有以下特征最適生長溫度為37°C，在普通LB瓊脂培養(yǎng)基上菌落形態(tài)為光滑型，菌落邊緣整齊，表面有光澤、濕潤、光滑、呈白灰色。E. coli. BL21 (DE3)用于高效表達(dá)克隆于含有噬菌體T7啟動子的表達(dá)載體的基因。T7噬菌體RNA聚合酶位于λ噬菌體 DE3區(qū)，該區(qū)整合于BL21的染色體上。
本發(fā)明與現(xiàn)有報道的單一 VP^亞單位疫苗相比，其優(yōu)勢在于(1)本發(fā)明所涉及的TAT-VP^重組蛋白，TAT可以攜帶VP^蛋白不經(jīng)肌肉注射而直接進(jìn)入血淋巴中。解決了使亞單位疫苗可以不經(jīng)肌肉注射而直接進(jìn)入血淋巴中，使其具有實際操作的可行性。而且本發(fā)明公開的基因工程菌株的構(gòu)建方法可以應(yīng)用于大規(guī)模的養(yǎng)殖業(yè)中，表達(dá)量大，操作簡單，成本低。( 與表達(dá)的VP^亞單位疫苗在預(yù)防對蝦白斑綜合癥上有更高，更長的保護(hù)效果。TAT-VP^重組蛋白通過血淋巴在蝦體內(nèi)的循環(huán)，使其融合蛋白到達(dá)不同的組織，增加了于WSSV病毒的競爭中和的作用，同時也爭強(qiáng)了蝦的免疫酶活作用。


圖1為一種重組表達(dá)質(zhì)粒pET_28a (+) -TAT-VP28的構(gòu)建過程示意圖。圖2為一種重組表達(dá)質(zhì)粒pET_28a (+) -TAT-VP28的酶切和PCR鑒定示意圖。1. D2000 2. TAT-VP28 PCR 3. pET_28a (+) -TAT-VP28 質(zhì)粒 4. pET_28a (+) -TAT-VP28 單切/Xho I 5. pET18a(+)-TAT-VP28 雙切/EcoR I、Xho I 6. MarkerIV0圖3為一種SDS-PAGE鑒定示意圖。M 蛋白 Marker (Fermentas #SM0431)1 未誘導(dǎo)的 pET18a-vp^ (BL21)2 自動誘導(dǎo)后破碎的pET18a-vp^ (BL21)3 自動誘導(dǎo)后的pET18a_vp^(BL21)上清4 純化的VP^融合蛋白5 未誘導(dǎo)的 pET-28a-tat_vp^ (BL21)6 自動誘導(dǎo)后破碎的 pET18a-tat-vp^ (BL21)7 自動誘導(dǎo)后的 pET18a-tat-vp^ (BL21)上清8 純化的TAT-VP^融合蛋白圖4為一種鰲蝦血淋巴的ELISA檢測示意圖。圖5為一種重組融合蛋白TAT-VP^亞單位疫苗的保護(hù)效果示意圖。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖及具體實施例子對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。在實施例中涉及的所有培養(yǎng)基和分子生物學(xué)操作方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。本實驗所涉及的分子生物學(xué)方法為常規(guī)方法，為本領(lǐng)域人員所熟悉。本發(fā)明中未詳細(xì)闡述的請參見《分子克隆實驗指南》J.薩姆布魯克，D. W.拉塞爾等主編。實施例1 :tat_vp^基因的制備。(I)WSSV病毒基因組的制備在冰上取患病對蝦的鰓、胃和心臟，冰浴勻漿，然后加入蛋白酶K(100ug/ml)，在沸水中煮15分鐘，立即冰浴5分鐘，12000rpm離心10分鐘，取
其上清置4°C保存。(2) PCR 擴(kuò)增 VP28 基因根據(jù) GeneBank 中已經(jīng)發(fā)表的 WSSV (GeneBank :EU414753) 的序列設(shè)計PCR引物，以上述上清作為模板DNA，PCR擴(kuò)增目的基因VP^，PCR產(chǎn)物通過DNA 凝膠電泳檢測，回收PCR產(chǎn)物并將其克隆到pGEM-T載體(在promega公司購置)中，挑取單菌落用堿裂解法小量提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，并進(jìn)行測序得到的陽性克隆子即為包含VP^基因的大腸桿菌，命名為pGEM-T-vp^，用于基因的增殖和保藏。(3) PCR擴(kuò)增tat-vp^基因上游引物為3條、下游引物1 分三次PCR合成 tat-vp28 以 pGEM-T-vp28 質(zhì)粒為模板，上游引物 Pl :CAGCGTCGTCGTGGATCCATGGATCTTTCTT TCA,下游引物 1 GGCAAGCTTCTACTCGGTCTCAGTGCCAGAGTA,退火溫度 56°C，做 PCR 擴(kuò)增目的片段，電泳并作回收；以上一步回收產(chǎn)物為模板(蘸取少許)，上游引物P2 :CGTAAAAAACGTC GTCAGCGTCGTCGTGGATCC,下游引物 1GGCAAGCTTCTACTCGGTCTCAGTGCCAGAGTA,退火溫度 56 °C 做PCR，電泳并作回收；以上一步回收產(chǎn)物為模板(蘸取少許)，上游引物P3 :GCGGAATTCG GCTATGGCCGTAAAAAACGTCGT,下游引物 1GGCAAGCTTCTACTCGGTCTCAGTGCCAGAGTA,退火溫度 56°C做 PCR。PCR 反應(yīng)體系 JOXiTaq Buffer with KCl 2. 5uL, MgCl2 (25mM) 1. 5uL, dNTP Mixture (2. 5mM) luL，上下游引物各 luU25pmol)，模板 IuL, Taq DNA 聚合酶(1U/uL) IuL, 加無菌水至終體積50uL。PCR反應(yīng)條件為；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 50s (30個循環(huán))； 72°C IOmin0 得到 TAT-VP28 的 PCR 產(chǎn)物。實施例2 :PCR產(chǎn)物的回收、純化和亞克隆。將實施例1中得到的TAT-VP^的PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳，在紫外燈下迅速切下欲回收的條帶，用TIANGEN瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化，將單一的目的DNA條帶放入干凈的Eppendorf管中，稱取重量。向膠塊中加入三倍體積的溶膠液PN(凝膠重為0. Ig, 其體積可視為IOOuL,以此類推)。50°C水浴10分鐘，其間每2分鐘溫和上下翻轉(zhuǎn)Eppendorf 管，以確保膠塊充分溶解。將所得溶液取750uL加入到一個吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，室溫O0-25°C以下相同)放置2分鐘，12000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。向吸附柱中加入600uL漂洗液，12000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。再向吸附柱中加入600uL漂洗液，12000rpm離心1分鐘， 倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中?？罩?2000rpm離心2分鐘，盡量除盡漂洗液。將吸附柱放入一個干凈的Eppendorf管中，室溫放置數(shù)分鐘，徹底晾干，防止殘留的漂洗液影響下一步的實驗。向吸附膜中間位置懸空滴加30uL洗脫緩沖液，室溫放置2分鐘， 12000rpm離心2分鐘。PCR產(chǎn)物的亞克隆將回收、純化的PCR產(chǎn)物與pGEM-T (在promega公司購置)連接，連接體系如下
IOxLigation BufferIulpGEM-T載體2ul純化后的PCR產(chǎn)物6ulT4 DNALigaseIul總反應(yīng)體系IOul連接反應(yīng)液4°C水浴放置過夜。實施例3 質(zhì)粒pGEM-tat-vp^的構(gòu)建。氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞其步驟是(1)用接種環(huán)挑取固體LB平板上新活化的大腸桿菌JM109單菌落，接種到20ml 液體LB培養(yǎng)基(將Ig蛋白胨、0. 5g酵母粉、Ig NaCl溶解在75ml ddH20中，調(diào)整pH值至7. 0，最后加ddH20定容至100ml，分裝于五個三角瓶里，115磅滅菌處理20min后備用)中， 37 0C，250rpm搖床活化過夜。(2)無菌條件下取60ul上述活化的大腸桿菌于新鮮的20ml液體LB培養(yǎng)基中， 370C，250rpm搖床培養(yǎng)3小時左右至OD6tltl值為0. 4-0. 6。(下述所有步驟均需無菌操作)(3)無菌條件下取1. 5ml上述菌液于無菌Eppendorf管中，在冰上放置10分鐘，使培養(yǎng)物冷卻至0°c。4000rpm，4°C離心10分鐘，用移液槍吸干上清。(4)加入300ul冰預(yù)冷的0. IMCaCl2溶液重懸菌體沉淀，冰浴30分鐘，4000rpm，4°C 離心10分鐘，用移液槍吸干上清。(5)加入IOOul冰預(yù)冷的0. IMCaCl2溶液重懸沉淀，即得感受態(tài)細(xì)胞，置于4°C保存，24小時內(nèi)使用為宜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞其步驟是(1)無菌條件下取連接反應(yīng)液IOul，加入到IOOul大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞中， 輕輕混勻，冰浴30分鐘。(下述所有步驟均需無菌操作)(2) 42 °C水浴中熱激90秒，迅速移至冰中冰浴2_3分鐘。(3)加入800ul液體LB培養(yǎng)基，37°C，150rpm輕搖，溫育45分鐘使細(xì)菌復(fù)蘇。(4)4000rpm離心10分鐘，吸取700ul上清棄去，將剩余菌液用移液槍輕輕混勻。(5)將上述菌液用無菌三角玻棒均勻涂布在含IOul IM IPTG，40ul 20mg/ml X-gal,10ul 200mg/ml Amp的LB平板上，正向放置1_2小時，直至液體被全部吸收，倒置平板于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。有此法可以制備得到E. coli JM109 pGEMT_TAT_VP^的菌落。陽性正向重組子pGEMT-TAT-VP^的酶切鑒定用堿裂解法小量(15_20ug)提取Ε· coli PGEMT-TAT-VP28，對所提質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，酶切體系如下(1)重組質(zhì)粒pGEMT-TAT-VP^的雙酶切
質(zhì)粒pGEMT- TAT-VP28 IOx Buffer Xhol I EcoR I加無菌水至終體積20ul。酶切反應(yīng)條件均為37°C，反應(yīng)時間2-3個小時，酶切產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果。實施例4 融合基因的制備和表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。(1)重組表達(dá)質(zhì)粒pET48a(+)-TAT-VP^的構(gòu)建其步驟是用EcoR I 和 Xhol I 雙酶切質(zhì)粒 pGEMT_TAT_VP28 和質(zhì)粒 pET18a(+)(在 INVITR0GEN公司購置)，目的片段TAT-VP^和開環(huán)pET48a (+)膠回收后16°C連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，方法如下①無菌條件下取連接反應(yīng)液IOul，加入到IOOul大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞中，輕
JM109 pGEMT-TAT-VP28 質(zhì)粒
8ul 2ul Iul Iul
11輕混勻，冰浴30分鐘。(下述所有步驟均需無菌操作)下表為連接體系
IOxLigation BufferIul
pET-28a ( + )載體2ul
純化后的PCR產(chǎn)物6ul
T4 DNALigaseIul
總反應(yīng)體系IOul②42 V水浴中熱激90秒，迅速移至冰中冰浴2分鐘。③將上述菌液用無菌三角玻棒均勻涂布在含終濃度為30ug/ml卡納霉素的LB平板上，正向放置1-2小時，直至液體被全部吸收，倒置平板于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。挑取單克隆pET-28a (+) -TAT-VP28/JM109于500ul新鮮液體LB培養(yǎng)基(含終濃度為的30ug/ml 卡納霉素)中，37°C，300rpm搖床培養(yǎng)3_4小時，以此菌液為模板，上游引物P1、P2、P3、下游引物1為引物進(jìn)行PCR初步鑒定，其產(chǎn)物為TAT-VP^全長融合基因。將PCR鑒定所得陽性克隆的菌液轉(zhuǎn)接50ul于20ml新鮮液體LB培養(yǎng)基(含終濃度為30ug/ml的卡納霉素)中， 37°C，300rpm搖床培養(yǎng)過夜，堿裂解法小量(15_20ug)提取質(zhì)粒，用EcoR I和Biol I雙酶切鑒定陽性重組子，重組質(zhì)粒命名為pET48a(+)-TAT-VP28，并測序與DNA序列完全一致， 符合翻譯閱讀框。重組表達(dá)質(zhì)粒pET48a(+)-TAT-VP^的構(gòu)建過程見附圖1，酶切及PCR鑒定見附圖2。實施例5 大腸桿菌基因工程菌的制備。將質(zhì)粒pET48a(+)-TAT-VP28 (Iul)轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞。PCR鑒定篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，所得陽性克隆即為本發(fā)明涉及的能夠融合表達(dá)TAT-VP^的重組基因工程菌株 Escherichia coli BL21 (pET-28a-TAT-VP28) 實施例6 基因工程融合蛋白TAT-VP^的表達(dá)。重組基因工程菌株hcherichia coli BL21 (pET48a-TAT-VP28)的單菌落接種到 20ml新鮮液體MDG(含終濃度為的30ug/ml卡納霉素)培養(yǎng)基中。37°C 200rpm搖床培養(yǎng)過夜。MDG培養(yǎng)基配方稱取0. 55g葡萄糖-H20、0. 28g天門冬氨酸鹽-H2O,用移液器分別吸取 20 X 的混合鹽 5ml (其中含有 500mmol/L 的 Nei2HPO4、500mmol/L 的 KH2P04、lmol/L 的 NH4C1、 1 OOmmo 1/L 的 Na2SO4) UOOX 的 MgSO4 (200mmol/L) 1ml，加入去離子水定容至 100ml。115°C 高壓滅菌20min備用。將5ml過夜培養(yǎng)物分別同時接種到200ml乳糖自動誘導(dǎo)ZYM5052(含終濃度為的30ug/ml卡納霉素)培養(yǎng)基。ZYM5052培養(yǎng)基配方稱取IOg胰蛋白胨、5g酵母提取物、 0. 55g葡萄糖-H20、2. Ig乳糖-H20、6. 3g甘油，用移液器吸取20X的混合鹽50ml (其中含有 500mmol/L 的 Na2HPO4,500mmol/L 的 KH2PO4Umol/L 的 NH4Cl、100mmol/L 的 Na2SO4) ,U00X 的MgSO4 10ml，加入去離子水定容至1000ml。115°C高壓滅菌20min備用。37°C，200rpm搖床培養(yǎng)3小時后，18°C低溫自動誘導(dǎo)16h。將誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后小量取樣的Eppendorf管于室溫以12000rpm離心1分鐘，棄去上清，加IOOul無菌水重懸菌體沉淀。分別取上述樣品各 20ul 于 20ul 2XSDS 凝膠加樣緩沖液(IOOmM Tris_Cl、200mM β-巰基乙醇、4% SDS、0. 2%溴酚藍(lán)、20%甘油)中，100°C加熱10分鐘，樣品可貯存于-4°c，以備在凝膠上加樣。 融化樣品，于室溫以12000rpm離心1分鐘。取IOul加樣到丙烯酰胺濃度為12% SDS聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，卸下凝膠，在考馬斯亮藍(lán)染色液(Ig考馬斯亮藍(lán)R_250，450ml甲醇， 450ml ddH20, IOOml冰醋酸)中染色2個小時，然后用脫色液GOml甲醇，IOml乙酸，50ml ddH20)脫色，每隔30分鐘換液一次，直至背景脫干凈為止。融合蛋白TAT-VP^W SDS-PAGE 鑒定見附圖3。實施例7 融合蛋白TAT-VP^的純化。(1)融合蛋白TAT-VP^提取。按照實施例6中的誘導(dǎo)表達(dá)方法發(fā)酵IL重組基因工程coli BL21 (pET-28a-TAT-VP28)，于室溫4000rpm離心20min，收集并稱量濕菌體。取Ig濕菌體加入到 30ml lysis buffer (1 OmM咪唑，20mM Tris-HCl, 500mM NaCl 溶解于400ml ddH20，調(diào)整 PH至7. 9，最后加ddH20定容至500ml)，于_20°C反復(fù)凍融三次，在進(jìn)行超聲破碎，工作 4秒，間歇4秒)，待菌液破碎至清亮。將破碎后的菌液于4°C，IOOOOrmp離心20分鐘，分別收集菌體沉淀和上清液。(2) Ni-NTA Superflow柱親和層析法純化融合蛋白TAT-VP^。①將上述30ml上清液用濾頭(微孔濾膜尺寸Φ 25mm，孔徑0. 45ul)過濾，然后加入到平衡好的柱子中，用蠕動泵以lml/min的速率，4°C三次循環(huán)上樣，使融合蛋白前端的Hk6與Ni2+充分結(jié)合。收集流出液，即穿漏液。(下述所有步驟均在4°C下進(jìn)行)②用50ml lysis Buffer以lml/min的速率洗柱，以洗脫下柱內(nèi)未與Ni2+結(jié)合的蛋白。③用50ml 含 20mM 咪唑的 Wash BufferQOmM 咪唑，20mM Tris-HCl, 500mM NaCl 溶解于400ml ddH20,調(diào)整PH至7. 9，最后加ddH20定容至500ml)以lml/min的速率洗柱，以洗脫下Ni2+柱上的非目的蛋白。④用Elute Buffer Q50mM咪唑，20mM Tris-HCl, 500mM NaCl 溶解于400ml ddH20, 調(diào)整PH至7. 9，最后加ddH20定容至500ml)以lml/^iin的速率洗柱，收集目的蛋白 TAT-VP^。一個 Eppendorf 管 1ml，收集 10 管。⑤取收集的蛋白進(jìn)行丙烯酰胺濃度為12% SDS-PAGE檢測純化效果。(3)超濾濃縮純化后的融合蛋白TAT-VP^并置換Elute Buffer。①將純化后的蛋白用移液槍轉(zhuǎn)移至超濾管(截留分子量為10KD)中，4°C，4700g離心20分鐘，棄去收集管中的廢液。②加入PBS(8gNaCl，0. 2gKCl，1. 44gK2HP04，0. 24gKH2P04，HCl 調(diào) pH 值至 7. 4，加水定容至IOOOml，15磅20min滅菌處理后備用)至刻度線，4°C，4700g離心20分鐘，棄去收集
管中的廢液。重復(fù)次步驟3次。③不加PBS，4°C，4700g離心20分鐘，棄去收集管中的廢液，用200ul的移液槍小
心地收集樣品。實施例8 =ELISA檢測TAT-VP^蛋白的穿腸功能。(1)酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)相關(guān)溶液顯色液
稱取0. 47g檸檬酸，0. 92g Νει2ΗΡ04-12Η20，定容至100ml，即配制成底物緩沖液。臨用時于底物緩沖液中加入40mg鄰苯二胺、0. Iml H2O2，混勻即可。終止液2mol/L的 H2S04。PBS 緩沖液分別稱取8.5g NaCl,2. 85g Na2HPO4-12H20,0. 2g KC1、0. 27g KH2PO4,加入去離子水定容至1000ml。PBST 緩沖液于1000ml PBS緩沖液中加入0. 5_2ml吐溫-20。5% (質(zhì)量體積比)BSA 稱取0. 5g BSA，溶于IOml PBST緩沖液中。(2)實驗材料實驗用克氏原鰲蝦(Cambarus clarkii)購自武漢市水產(chǎn)市場，體重15_20g左右， 購回后飼養(yǎng)于本實驗室，飼養(yǎng)溫度26°C左右，同時每天喂食換水一次。新購買的鰲蝦于實驗室至少喂養(yǎng)十五天待鰲蝦狀態(tài)穩(wěn)定后方可用于實驗。(3)VP28抗血清的純化兔抗VP^蛋白的抗血清由本實驗室制備，并保存于_70°C。利用^witrogen公司的ftOtein A作為親和層析介質(zhì)純化VP^抗血清，具體步驟如下①取Iml抗血清用ftOtein A親和層析專用的Binding Buffer稀釋至IOml，于冷凍離心機(jī)中4°C、10，OOOrpm離心IOmin0②取上清，并用0. 4 μ m濾膜過濾，以備上樣。③用移液器吸取ftOtein A Sepharose CL-4B填料裝入層析柱至1ml，用大量去離子水沖洗填料，并用Binding Buffer平衡。④將過濾好的樣品借助恒流泵以一定的流速緩慢流過平衡好的填料，并將穿漏液重復(fù)上樣兩次。⑤樣品與填料充分結(jié)合后，用適量的Binding Buffer以一定的流速流過填料，流出液用蛋白核酸檢測儀檢測0D·，待OD值持續(xù)為0時即停止洗滌。⑥Elution Buffer以緩慢的速度流過填料洗脫IgGs，并將洗脫液分別收集于印pendorf管中。為了較好的保持IgGs的抗體活性，立即向每管洗脫液中加入IOOyL Neutralizing Buffer 并混勻。④SDS-PAGE電泳分析純化的IgGs，測定IgGs的蛋白濃度。(4)抗凝血淋巴的制備將純化并已測定濃度的TAT-VP^及VP^分別投喂鰲蝦，每只鰲蝦投喂200 μ L蛋白溶液。同時將只投喂PBS緩沖液的鰲蝦作為陰性對照。1. 后用Iml —次性無菌注射器于鰲蝦的圍心腔內(nèi)取血淋巴200 μ L，并立即加入含有等體積抗凝劑的印pendorf管中， 以防止血淋巴凝固。將血淋巴在離心機(jī)中于300g離心5min后，吸取上清液用于ELISA檢測。鰲蝦血淋巴抗凝劑(27mmol/L檸檬酸、336mmol/LNaCl、115mmol/L 葡萄糖-H20、 9mmol/L EDTA)分別稱取 7. 74g 檸檬酸、19. 65g NaCl、22. 77g 葡萄糖-H20,3. 35g EDTA-Na2,加入適量去離子水使其完全溶解，并加入NaOH調(diào)pH至7. 0，最后加入去離子水定容至1000ml。(5)雙抗體夾心ELISA檢測抗原①將純化的VP^抗體于PBS緩沖液中稀釋100倍，并于96孔酶標(biāo)板中每孔加入 100 μ L。將酶標(biāo)板的小孔用封口膜封口后置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中溫育池，使抗體包被于酶標(biāo)板底部。②棄去酶標(biāo)板小孔中的樣品，于每空中加入100 μ L 5% (質(zhì)量體積比)BSA，用封口膜封口后置于冰箱中4°C封閉過夜。③甩干酶標(biāo)板小孔中的封閉液，于每孔中加入300 μ L PBST緩沖液，浸泡5min，并
間歇振動酶標(biāo)板使洗滌更加充分。重復(fù)操作本步驟三次。④分別吸取抗凝血淋巴100 μ L加入酶標(biāo)板小孔中，同時以只加PBS緩沖液不加抗凝血淋巴的酶標(biāo)板小孔作為空白對照。將酶標(biāo)板的小孔用封口膜封口后置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中溫育lh，使血淋巴中的抗原與包被在酶標(biāo)板中的抗體充分結(jié)合。⑤重復(fù)步驟(3)三次。⑥將辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的VP^抗體于PBST緩沖液中稀釋200倍，于酶標(biāo)板小孔中每孔加入100 μ L。用封口膜封口后置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中溫育lh，使HRP標(biāo)記的VP^抗體與抗原充分結(jié)合。⑦重復(fù)步驟(3)三次。⑧于酶標(biāo)板小孔中每孔中加入300 μ L PBS緩沖液，浸泡5min，并間歇振動酶標(biāo)板使洗滌更加充分。⑨于酶標(biāo)板小孔中每孔加入100 μ L顯色液，用封口膜封口后于37°C恒溫培養(yǎng)箱中避光顯色20min。⑩于酶標(biāo)板小孔中每孔加入50 μ L終止液，終止顯色反應(yīng)。并用酶標(biāo)儀在490nm 波長下測定各孔的光吸收值。數(shù)據(jù)見下表表一雙抗體夾心ELISA檢測抗原VP^實驗數(shù)據(jù)
權(quán)利要求
1.一種分離的基因工程融合蛋白，其序列為SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。
2.一種分離的基因工程融合蛋白，其序列為SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。
3.一種大腸桿菌基因工程菌株，其特征在于，該菌株為重組基因工程菌株federicAia coli BL21 (DE3) pET-28a-TAT-VP28，CCTCC NO: M2010296。
4.權(quán)利要求3所述的一種大腸桿菌基因工程菌株的制備方法，其步驟是A、WSSV的VP^基因的制備首先在冰上取患病對蝦的鰓、胃和心臟，冰浴勻漿，然后加入蛋白酶K :100ug/ml，在沸水中煮15分鐘，立即冰浴5分鐘，12000rpm離心10分鐘，取上清置4°C保存，設(shè)計PCR引物，以上清作為模板DNA，PCR擴(kuò)增目的基因VP28，PCR產(chǎn)物通過 DNA凝膠電泳檢測，回收PCR產(chǎn)物并將其克隆到pGEM-T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，挑取單菌落用堿裂解法提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，并進(jìn)行測序，得到的陽性克隆子即為包含VP^ 基因的大腸桿菌，為PGEM-T-VP28，用于基因的增殖和保藏；TAT-VP28融合基因的制備通過PCR的方法擴(kuò)增蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域多肽TAT，并與VP^ 基因融合，將PCR產(chǎn)物克隆到pGEM-T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，挑取單菌落用堿裂解法提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，并進(jìn)行測序，得到的陽性克隆子即為包含TAT-VP^基因的大腸桿菌，為pGEM-T- TAT-VP28，用于基因的增殖和保藏；C、融合基因表達(dá)載體的構(gòu)建首先雙酶切重組質(zhì)粒pGEM-T-TAT-VP^和質(zhì)粒pET_28a (+ )，膠回收含TAT-VP^基因的片段和開環(huán)pETj8a ( + )片段，16°C連接后轉(zhuǎn)化到感受態(tài) E. coli JM109中，所得到的陽性克隆子是本發(fā)明涉及的TAT-VP^融合基因的大腸桿菌，命名為 pET-28a ( + ) -TAT-VP28 ；D、大腸桿菌基因工程菌的制備將質(zhì)粒ρΕΤ48ει( + )-TAT-VP^轉(zhuǎn)化到感受態(tài)BL21 (DE3)中，PCR鑒定篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，所得陽性克隆即為表達(dá)TAT-VP^的大腸桿菌基因工程菌株；E、基因工程融合蛋白的制備將上述活化的基因工程菌轉(zhuǎn)接到乳糖自動誘導(dǎo)培養(yǎng)基中發(fā)酵，融合蛋白TAT-VP^表達(dá)。
5.權(quán)利要求1或2所述的一種基因工程融合蛋白在制備治療或預(yù)防對蝦白斑綜合癥病毒的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗對蝦白斑綜合癥病毒工程蛋白TAT-VP28及制備和用途。其序列為SEQIDNO1所示的核苷酸和SEQIDNO2所示的氨基酸序列，菌株為重組基因工程菌株EscherichiacoliBL21(pET-28a-TAT-VP28)。從對蝦蝦體中提取WSSV并通過PCR獲得VP28基因，通過PCR的方法擴(kuò)增TAT-VP28序列，然后構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a(+)-TAT-VP28。將重組質(zhì)粒pET-28a(+)-TAT-VP28轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)?；蚬こ倘诤系鞍自谥苽渲委熁蝾A(yù)防對蝦白斑綜合癥病毒的藥物中的應(yīng)用。表達(dá)量大且可溶，易于工業(yè)化生產(chǎn)，成本低，安全性好。在預(yù)防對蝦白斑綜合癥上有更高，更長的保護(hù)效果。
文檔編號A61P31/12GK102206660SQ201010572930
公開日2011年10月5日 申請日期2010年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月3日
發(fā)明者孟小林, 寧建芳, 張毅, 徐進(jìn)平, 王健 申請人:武漢凱肽來生物科技有限公司