專利名稱：豬傳染性胃腸炎病毒、流行性腹瀉病毒二聯(lián)蛋黃抗體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行 性腹瀉病毒二聯(lián)蛋黃抗體及其制備方法。
背景技術(shù)：
豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉是目前證實(shí)的引起豬發(fā)生腹瀉的重要的兩個(gè)病毒 性傳染性病。這兩種疾病主要對仔豬的影響較大，是引起仔豬死亡的主要病毒性腹瀉病。這 兩種病常常混合感染，在流行病學(xué)、臨床癥狀、病理解剖學(xué)變化上都非常相似，很難區(qū)別到 底是哪一種病毒感染，而且發(fā)病急速，在發(fā)病后近幾個(gè)小時(shí)就可波及全群，主要是造成哺乳 期仔豬的大批死亡，給養(yǎng)豬生產(chǎn)造成巨大的損失。豬傳染性胃腸炎(PorcineTransmissible Gastroenteritis, TGE)是由冠狀 病毒科(Coronaviridae)、冠狀病毒屬(Coronavirus)的豬傳染性胃腸炎病毒(Porcine Transmissible Gastroenteritis virus,TGEV)引起的以豬嘔吐、腹瀉、脫水為特征的傳染 病，對新生仔豬具有高度致死率，通常為100%。雖然不同年齡的豬對這種病毒均易感，但5 周齡以上的豬感染后，死亡率很低。1945年Doyle在美國首次報(bào)道了這一疾病以后，世界上 許多國家都相繼報(bào)道了豬傳染性胃腸炎。我國從1956年在廣東省首次發(fā)生這種疾病后，全 國大多數(shù)省份也有豬傳染性胃腸炎的發(fā)生，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了嚴(yán)重危害。豬流行性腹瀉(Porcine Epidemic Diarrhae, PED)是冠狀病毒科 (Coronaviridae)、冠狀病毒屬(Coronavirus)的豬流行性腹瀉病毒(Porcine Epidemic Diarrhae virus,PEDV)引起的一種豬腸道傳染病，以水瀉、嘔吐和脫水為特征。各種年齡的 豬均易感，哺乳仔豬、架子豬或育肥豬的發(fā)病率可達(dá)100%，尤其哺乳仔豬受害最為嚴(yán)重。 豬流行性腹瀉主要發(fā)生在冬季和早春天氣較為寒冷的季節(jié)，但在夏季也可發(fā)生。上世紀(jì)70 年代初期許多國家相繼報(bào)道了豬流行性腹瀉的發(fā)生，我國上世紀(jì)80年代開始陸續(xù)有發(fā)生 豬流行性腹瀉的報(bào)道。目前主要用疫苗免疫母豬來預(yù)防這兩種疾病的發(fā)生。由于還沒有針對病毒性疾病 的特效藥物，因此在臨床治療上主要采取對癥治療和用抗生素類藥物預(yù)防并發(fā)癥的發(fā)生， 其治療效果不理想。此外，由于這兩種疾病發(fā)病急速，出現(xiàn)腹瀉后，仔豬大多由于腹瀉而脫 水，很快就會衰竭而死亡。因此，在生產(chǎn)中急需一種針對豬傳染性胃腸炎、流行性腹瀉病毒 性疾病均具有特異性、治療效果好且療效迅速的治療制劑。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的主要目的在于提供一種豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉 病毒二聯(lián)蛋黃抗體及其制備方法。技術(shù)方案本發(fā)明中，所述“PK15”為豬腎細(xì)胞，"Vero"為非洲綠猴腎細(xì)胞。
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所述“飽和甲醛水溶液”為市售40%甲醛水溶液。本發(fā)明一方面提供了一種豬傳染性胃腸炎、流行性腹瀉病毒二聯(lián)蛋黃抗體的制備 方法。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明技術(shù)方案步驟如下1)免疫用疫苗的制備分別用豬腎傳代細(xì)胞、非洲綠猴腎傳代細(xì)胞培養(yǎng)豬傳染性胃腸炎病毒及豬流行性 腹瀉病毒，分別濃縮后用作抗原，將兩種抗原充分混合后滅活，加入免疫增強(qiáng)劑及白油佐 劑，制備油包水型豬傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹瀉病毒二聯(lián)滅活疫苗，做為免疫用疫 苗；2)免疫用步驟1)制備的免疫用疫苗對非免疫產(chǎn)蛋雞進(jìn)行多次免疫，免疫次數(shù)> 2，優(yōu)選 地，本發(fā)明的免疫次數(shù)> 4，本發(fā)明實(shí)施例中免疫次數(shù)為4次。3)從步驟2)免疫產(chǎn)蛋雞產(chǎn)出雞蛋中收集蛋黃液，提取豬傳染性胃腸炎和流行性 腹瀉病毒二聯(lián)蛋黃抗體，純化后，凍干。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的傳染性胃腸炎病毒抗原的制備包括以下步驟將傳染性胃 腸炎病毒液接種在PK15單層細(xì)胞上，同時(shí)設(shè)立不接毒細(xì)胞對照，在37°C溫度下CO2培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)，至75%細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變時(shí)收毒，中和試驗(yàn)測定毒價(jià)，濃縮后用作抗原。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的流行性腹瀉病毒抗原的制備包括以下步驟將流行性腹瀉 病毒液接種于Vero單層細(xì)胞上，同時(shí)設(shè)立不接毒細(xì)胞對照，在37°C溫度下CO2培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)，至75%細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變時(shí)收毒，中和試驗(yàn)測定毒價(jià)，濃縮后用作抗原。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的步驟1)中豬傳染性胃腸炎病毒和流行性腹瀉病毒按體積 比1 0. 8 1 1. 2混合，混合后兩種病毒的毒價(jià)均彡1. OX 106_°TCID5Q/ml。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的步驟1)中將豬傳染性胃腸炎病毒和流行性腹瀉病毒抗原 滅活后，分別加入終濃度為體積比0. 01% 0. 05%的脂多糖和終濃度為體積比0. 2% 0. 8%的酵母葡聚糖作為免疫增強(qiáng)劑，與所述病毒液的總體積的2倍量的白油佐劑乳化，制 備油包水型豬傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹瀉病毒二聯(lián)滅活疫苗作為免疫用疫苗。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的步驟2)中免疫程序?yàn)樵谑酌馇?0日，每日用體積比 1 % 5 %的黃芪多糖供雞飲用，提升雞體整體免疫力，首免前7日每羽雞皮下注射牛結(jié)核 分枝桿菌多糖核酸0. 1 0. 5ml、弗氏完全佐劑100 300 μ g，進(jìn)行免疫剌激。首免時(shí)胸部肌肉多點(diǎn)注射免疫用疫苗1 2ml ；2周后進(jìn)行二免，注射免疫用疫苗 1 2ml及牛結(jié)核分枝桿菌多糖核酸0. 1 0. 5ml ；再隔2周后進(jìn)行三免，注射免疫用疫苗 2 4ml及牛結(jié)核分枝桿菌多糖核酸0. 2 0. 8ml ；再隔4 8周后進(jìn)行四免，注射免疫用 疫苗2 4ml。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的步驟3)中二免后1周開始每隔7天抽樣測定高免雞蛋蛋黃 中抗豬傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹瀉病毒特異抗體效價(jià)；抗體效價(jià)均達(dá)到1 128以 上收集蛋黃，用于制備豬傳染性胃腸炎病毒和流行性腹瀉病毒二聯(lián)蛋黃抗體。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的步驟3)中充分?jǐn)嚢枋沟包S呈均勻膏狀，加入等體積經(jīng)滅菌 并冷卻的蒸餾水，攪拌混勻，滅活；在隔層反應(yīng)罐中加入相當(dāng)于原蛋黃6倍體積的pH值為 4. 2的滅菌蒸餾水，并降溫至1 4°C，然后將滅活的蛋黃液加入，邊加邊攪拌，4 8°C靜置
54h;離心分離上清液并轉(zhuǎn)入另一反應(yīng)罐中，按體積比為總量的0.2%加入辛酸，攪拌均勻， 室溫放置2 4h ；用濾布過濾后，再用K型多層板框過濾至澄清，按體積比為總量的0. 1% 加入飽和甲醛水溶液于上述濾液中，充分?jǐn)嚢杌靹?，室溫放?4h，期間振搖數(shù)次，過濾除 菌，用截留分子量為IOOOKDa的超濾膜過濾除病毒，即可得到提純的豬傳染性胃腸炎病毒 和流行性腹瀉病毒二聯(lián)蛋黃抗體。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的步驟3)中抗體效價(jià)檢測步驟如下將收集的蛋黃液用濃度為0. 01mol/L pH為7. 2的磷酸鹽緩沖液倍比稀釋后加入 瓊脂凝膠周圍孔中，中間孔中加入步驟一中經(jīng)離心濃縮純化的豬傳染性胃腸炎病毒(或流 行性腹瀉病毒)抗原，置濕盒中37°C溫箱反應(yīng)24h，以出現(xiàn)沉淀帶的最高稀釋度的蛋黃液為 該蛋黃液的豬傳染性胃腸炎病毒(或流行性腹瀉病毒)的抗體效價(jià)。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的豬傳染性胃腸炎病毒和流行性腹瀉病毒二聯(lián)蛋黃抗體為凍 干二聯(lián)蛋黃抗體。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的步驟3)中豬傳染性胃腸炎病毒和流行性腹瀉病毒二聯(lián)蛋 黃抗體凍干程序是將提純并經(jīng)檢驗(yàn)合格的蛋黃抗體液小量分裝于西林瓶，于凍干機(jī)上凍 干過夜，凍干過程中溫度最低降至_38°C，維持3 4h至完全凍干，然后逐漸恢復(fù)至室溫，取 出貯存于4°C。本發(fā)明另一方面是提供了一種豬傳染性胃腸炎病毒、流行性腹瀉病毒二聯(lián)蛋黃抗 體。本發(fā)明的又一方面為豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉病毒二聯(lián)蛋黃抗體在豬傳染 性胃腸炎病毒和流行性腹瀉疾病臨床治療及預(yù)防中的應(yīng)用。技術(shù)效果與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的豬傳染性胃腸炎病毒和流行性腹瀉病毒二聯(lián)蛋黃抗體 及其制備方法，具有以下有益效果本發(fā)明采用的免疫程序，保證了在首免后12 16周豬傳染性胃腸炎病毒和流行 性腹瀉病毒二聯(lián)蛋黃抗體都可達(dá)1 512，兩種的抗體效價(jià)同時(shí)獲得較高的水平，從而實(shí) 現(xiàn)對二種疾病——豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉同時(shí)起到治療和預(yù)防的效果。其次，由于 獲得蛋黃二聯(lián)抗體，與單獨(dú)病毒的蛋黃抗體相比，還具有生產(chǎn)程序簡單，生產(chǎn)成本降低的優(yōu) 點(diǎn)ο本發(fā)明豬傳染性胃腸炎病毒和流行性腹瀉病毒二聯(lián)蛋黃抗體進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物為1日齡未吃初乳的仔豬，試驗(yàn)組動(dòng)物用豬傳染性胃腸炎病毒和流行性腹瀉病毒口服 攻毒，然后口服飼喂本發(fā)明的豬傳染性胃腸炎病毒和流行性腹瀉病毒二聯(lián)蛋黃抗體。另設(shè) 攻毒未用抗體組、不攻毒未用抗體組、不攻毒用抗體組3組作為對照試驗(yàn)，結(jié)果表明本發(fā) 明豬傳染性胃腸炎病毒和流行性腹瀉病毒二聯(lián)蛋黃抗體對豬傳染性胃腸炎病毒和流行性 腹瀉病毒引起的仔豬腹瀉具有明顯的治療作用，稀釋成1 32后飼喂攻毒的1日齡小豬， 對小豬保護(hù)率100%。豬流行性腹瀉病毒與豬傳染性胃腸炎病毒同屬冠狀病毒科，二者致病的臨床癥狀 又極其相似，且一般呈混合感染，各個(gè)年齡的豬均可感染，最明顯的特征就是水瀉，發(fā)病率 較高，仔豬死亡率較高。其作用機(jī)理一般都是吸附于小腸粘膜上，感染上皮細(xì)胞而使小腸吸 收和代謝紊亂，造成腹瀉的發(fā)生。因此，提高豬小腸局部免疫能力，抑制病原在小腸粘膜的
6吸附和增殖是治療和預(yù)防傳染性胃腸炎和流行性腹瀉的關(guān)鍵。本發(fā)明豬傳染性胃腸炎病毒 和流行性腹瀉病毒二聯(lián)蛋黃抗體通過口服直接被小腸吸收，提高了小腸的局部免疫力，抑 制了病原對小腸粘膜的吸附和增殖。由上可以看出，與現(xiàn)有技術(shù)比較，用本發(fā)明方法提供了一種豬傳染性胃腸炎病毒 和流行性腹瀉病毒二聯(lián)蛋黃抗體的制備方法。本發(fā)明方法制備的豬傳染性胃腸炎病毒和流 行性腹瀉病毒二聯(lián)蛋黃抗體，用于預(yù)防和治療豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉這兩種疾病， 攻毒對比實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明蛋黃抗體治療組仔豬腹瀉癥狀則明顯減輕，一周左右逐漸恢復(fù)，未 出現(xiàn)死亡情況。本發(fā)明所述豬傳染性胃腸炎病毒和流行性腹瀉病毒二聯(lián)蛋黃抗體具有治療 效果迅速、療效顯著的優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這 些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，下列實(shí)施例中未提及的具體實(shí)驗(yàn) 方法，通常按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。實(shí)施例1豬傳染性胃腸炎病毒和流行性腹瀉病毒二聯(lián)蛋黃抗體的制備1.免疫用疫苗的制備1. 1傳染性胃腸炎病毒增殖及抗原的制備將傳染性胃腸炎病毒液接種3瓶PK15細(xì)胞，每瓶細(xì)胞接種Iml病毒液，瓶底面 積25cm2，蓋好瓶蓋，橫臥瓶管輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，使病毒液與整個(gè)細(xì)胞單層充分接觸，在37°C溫 度下吸附40min，其間每隔IOmin晃動(dòng)1次，無需吸棄病毒液，直接加含2%胎牛血清的 DMEM(Dulbecco' s Modified Eagle Medium)細(xì)胞維持培養(yǎng)液5ml，同時(shí)設(shè)立細(xì)胞對照，在 37°C溫度下0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后倒掉維持液進(jìn)行換液。逐日觀察細(xì)胞病變，若72h 后感染細(xì)胞病變不明顯，則收獲細(xì)胞懸液-20 20°C反復(fù)凍融3次后在4°C條件下3000rpm 離心30min取上層清液繼續(xù)在細(xì)胞上盲傳，盲傳至第二代出現(xiàn)細(xì)胞病變，至75%細(xì)胞出現(xiàn) 細(xì)胞病變時(shí)收毒，"20 20°C反復(fù)凍融3次，然后在4°C條件下，3000rpm離心30min，除去 細(xì)胞碎片，收集上層清液，濃縮后用作抗原。1. 2流行性腹瀉病毒增殖及抗原的制備將流行性腹瀉病毒液接種于Vero細(xì)胞單層上，同時(shí)設(shè)立細(xì)胞對照，37°C CO2培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)。逐日觀察細(xì)胞病變，若72h后感染細(xì)胞病變不明顯，則收獲細(xì)胞懸液-20 20°C 反復(fù)凍融3次后于4°C條件下3000rpm離心30min，取上層清液繼續(xù)在細(xì)胞上盲傳，盲傳至 第三代出現(xiàn)細(xì)胞病變，至75%細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變時(shí)，表現(xiàn)為細(xì)胞融合和圓縮，部分細(xì)胞脫 落，出現(xiàn)空斑化。此時(shí)收獲細(xì)胞懸液，-20 20°C反復(fù)凍融3次后在4°C條件下，3000rpm離 心30min，除去細(xì)胞碎片，收集上清液，濃縮后用作抗原。1. 3疫苗的制備豬傳染性胃腸炎病毒抗原和流行性腹瀉病毒抗原按體積比1 1. 03混合，混合后 兩種病毒抗原的毒價(jià)均為1. OX 106_3TCID5ciAil。分別加入終濃度為體積比0. 03%的脂多糖 和終濃度為體積比0. 5%的酵母葡聚糖作為免疫增強(qiáng)劑，與2倍量的白油佐劑乳化，制備油 包水型豬傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹瀉病毒二聯(lián)滅活疫苗作為免疫用疫苗。2.免疫非免疫產(chǎn)蛋雞
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免疫程序?yàn)樵谑酌馇?0日，每日用體積比3%的黃芪多糖供雞飲用，提升雞體整 體免疫力，首免前7日每羽雞皮下注射“牛結(jié)核分枝桿菌多糖核酸” 0. 2ml、弗氏完全佐劑 200 μ g，進(jìn)行免疫剌激。首免時(shí)胸部肌肉多點(diǎn)注射免疫用疫苗Iml ；2周后進(jìn)行二免，注射免疫用疫苗Iml 及“牛結(jié)核分枝桿菌多糖核酸” 0. 2ml ；再隔2周后進(jìn)行三免，注射免疫用疫苗2ml及“牛結(jié) 核分枝桿菌多糖核酸” 0. 4ml ；再隔6周后進(jìn)行四免，注射免疫用疫苗2ml。3. 二聯(lián)蛋黃抗體制備3. 1蛋黃的收獲及滅活二免后1周開始收集經(jīng)抽檢合格的免疫雞所產(chǎn)高免雞蛋，將蛋殼消毒，采取手工 或機(jī)械打蛋。充分除去蛋清(白)、胚盤和系帶，收集蛋黃。充分?jǐn)嚢枋沟包S呈均勻膏狀，加 入等體積經(jīng)121°C 30min滅菌并冷卻的蒸餾水，攪拌混勻，62. 5°C加熱滅活30min。3. 2抗體的酸化蒸餾水法提純先在隔層反應(yīng)罐中加入相當(dāng)于原蛋黃6倍體積的pH值為4. 2的滅菌蒸餾水，并 降溫至4°C。然后，將滅活的蛋黃液加入，邊加邊攪拌，4°C靜置4h。管式低溫連續(xù)離心機(jī) HOOOrpm離心分離上清液并轉(zhuǎn)入另一反應(yīng)罐中。3. 3抗體的辛酸法提純按體積比為總量的0.2%加入辛酸，攪拌均勻，室溫放置4h。用濾布過濾后，再用 K型多層板框過濾至澄清，再按體積比為總量的0. 加入飽和甲醛溶液于上述濾液中，充 分?jǐn)嚢杌靹颍覝胤胖?4h，期間振搖數(shù)次。3. 4過濾除菌用0. 22 μ m微孔濾芯過濾除菌。用截留分子量為IOOOKDa的超濾膜過濾除病毒。4.提純的蛋黃抗體凍干將提純并經(jīng)檢驗(yàn)合格的蛋黃抗體液小量分裝于西林瓶，于凍干機(jī)上凍干過夜，凍 干過程中溫度最低降至_38°C，維持4h至完全凍干，然后逐漸恢復(fù)至室溫，取出貯存于4°C。實(shí)施例2豬傳染性胃腸炎病毒和流行性腹瀉病毒二聯(lián)蛋黃抗體效價(jià)檢測1.實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備豬傳染性胃腸炎病毒和流行性腹瀉病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，由中國農(nóng)業(yè) 科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供；抗原，由實(shí)施例1制備；瓊脂糖、打孔器、16#針頭、剪刀、鑷 子、酒精燈、記號筆、潔凈平皿、水浴鍋。2.豬傳染性胃腸炎病毒(或流行性腹瀉病毒)瓊擴(kuò)抗原的制備用聚乙二醇 (PEG-20000)干粉包埋透析袋進(jìn)行抗原濃縮。透析袋的處理方法0. 5mol/L EDTA_2Na Iml加IOg碳酸氫鈉，補(bǔ)蒸餾水至500ml， PH值調(diào)至8. 0 ；透析袋放上述液體中煮沸IOmin ；取出透析袋蒸餾水清洗干凈，再放蒸餾水 中煮沸IOmin ；將40ml病毒液倒入處理后的透析袋中，扎緊袋口，放在干凈鋁盒中，用聚乙 二醇(PEG-20000)干粉包埋透析袋，放4°C透析。觀察透析袋中液體剩余3 4ml時(shí)取出， 吸出濃縮的抗原即為制備的瓊擴(kuò)抗原。3. 1 %瓊脂糖平板的準(zhǔn)備取濃度為0. 01mol/L, pH為7. 2的磷酸鹽緩沖液IOOml，加Ig瓊脂糖，8. Og的NaCl， 煮沸融化后濾去沉淀，加0. 01%的硫柳汞防腐，冷卻到50°C左右膠制瓊脂板。在直徑90mm 的平皿中注加融化的瓊脂糖16ml。瓊脂糖厚度不少于2.8mm，4°C冷卻后打孔。
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4.操作步驟4. 1取瓊脂糖平板用六角形七孔模具打孔，孔徑5mm，孔距為3mm。瓊脂用打孔器打 孔后，在酒精燈外焰上過一下，對孔的底部進(jìn)行封口，以防蛋黃液滲漏。4. 2抗原標(biāo)定中間孔加豬傳染性胃腸炎病毒(或流行性腹瀉病毒)標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，周圍孔從最 上方孔開始依次加入抗原原液、2倍稀釋的抗原、4倍稀釋的抗原、8倍稀釋的抗原、16倍稀 釋的抗原、32倍稀釋的抗原。每孔加液40μ 1，加樣完畢后，將瓊脂糖板放在鋪有濕紗布的 帶蓋容器中，并用支持物將瓊脂糖平板放穩(wěn)，置37°C溫箱濕盒內(nèi)反應(yīng)24 72h，直至沉淀線 產(chǎn)生。以出現(xiàn)沉淀線最明顯的稀釋度的抗原作為標(biāo)準(zhǔn)抗原。4. 3抗體效價(jià)的測定將收獲的待測定抗體效價(jià)的蛋黃液用0. 01mol/L pH為7. 2的磷酸鹽緩沖液作倍 比稀釋，稀釋度分別為1倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍及更高的稀釋倍數(shù)。中間孔中加 入標(biāo)定的豬傳染性胃腸炎病毒(或流行性腹瀉病毒)抗原，周圍孔中加入不同稀釋度的抗 體，其中1孔加入標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，每孔加液40μ 1，加樣完畢后，將瓊脂糖板放在鋪有濕紗布 的帶蓋容器中，并用支持物將瓊脂糖平板放穩(wěn)，置37°C溫箱濕盒內(nèi)反應(yīng)24 72h，直至沉淀 線產(chǎn)生。以觀察到沉淀線的抗體最大稀釋倍數(shù)為檢測樣品的抗體效價(jià)。5.結(jié)果判定陽性血清與對應(yīng)抗原孔中間形成一條清晰、致密的沉淀線時(shí)，才能進(jìn)行判定。陽性被檢蛋黃液與抗原孔中間形成沉淀線，并與陽性血清沉淀線彎曲環(huán)連，判為 陽性⑴。可疑沉淀線不清晰或陽性對照沉淀線向被檢血清孔微彎時(shí)，判為可疑(士)?？?疑樣品應(yīng)予重檢，重檢結(jié)果相同時(shí)應(yīng)判為陽性(+)。陰性無沉淀線出現(xiàn)為陰性。沉淀線與陽性對照沉淀線交叉或不相連時(shí)，均屬非特 異性反應(yīng)。判為陰性(_)。6.檢測結(jié)果二免后1周采集蛋黃液檢測，以后每隔7天檢測一次，一直到首免后24周。結(jié)果 顯示，采用本發(fā)明的免疫程序，在首免后12 16周豬傳染性胃腸炎病毒和流行性腹瀉病毒 二聯(lián)蛋黃抗體效價(jià)都可達(dá)1 512，首免后3 24周，豬傳染性胃腸炎病毒和流行性腹瀉病 毒二聯(lián)蛋黃抗體效價(jià)均> 1 256。實(shí)施例3豬傳染性胃腸炎病毒和流行性腹瀉病毒二聯(lián)蛋黃抗體治療試驗(yàn)取1日齡未吃初乳仔豬16頭，試驗(yàn)動(dòng)物房溫度控制在25 30°C，采用人工哺乳 方法，每隔2h飼喂1次牛奶，飼喂觀察1天后隨機(jī)分為4個(gè)小組，分別為攻毒治療組(4 頭)、攻毒不治療組(4頭)、治療不攻毒組(4頭)和不治療不攻毒組(4頭)。攻毒所用 病毒為超濾的豬傳染性胃腸炎病毒和流行性腹瀉病毒，經(jīng)濃度為0. 01mol/L pH為7. 2的 磷酸鹽緩沖液10倍稀釋后直接口服，攻毒劑量為最小發(fā)病量的5倍，每頭仔豬攻毒劑量相 同，觀察仔豬攻毒后的腹瀉情況。待仔豬剛開始出現(xiàn)腹瀉癥狀時(shí)治療組飼喂豬傳染性胃腸 炎病毒和流行性腹瀉病毒二聯(lián)蛋黃抗體，治療所用蛋黃抗體為提純級樣品，瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn) 測定蛋黃抗體效價(jià)為1 32。不治療組飼喂等量生理鹽水，逐日觀察每頭仔豬腹瀉癥狀 和豬傳染性胃腸炎病毒和流行性腹瀉病毒二聯(lián)蛋黃抗體治療效果，以糞便指數(shù)和死亡率2個(gè)指標(biāo)判斷治療效果。糞便指數(shù)按照Sherman等(Sherman D Μ, Acres S D，Sadowski P L, et al. Protection of calves against fatal enteric colibacillosis by orally administered Escherichia coli K99_specipic monoclonal antibody [J]· Infect Immun, 1974，10 :770_782.)制定的標(biāo)準(zhǔn)判定，即O分為正常，糞便固態(tài)成形；1分為輕度腹 瀉，糞便稀軟成形；2分為中度腹瀉，糞便呈黃色水樣；3分為重度腹瀉，糞便呈水樣噴射。攻毒后12 24h所有仔豬均出現(xiàn)不同程度的黃色水瀉，攻毒治療組在口服豬傳染 性胃腸炎病毒和流行性腹瀉病毒二聯(lián)蛋黃抗體1天后腹瀉癥狀減輕，2天后變?yōu)辄S色稀糞， 3天后糞便變粘稠，4 5天后變?yōu)槌尚蔚能浖S；不攻毒治療組與不攻毒不治療組仔豬精神 狀態(tài)正常，無腹瀉癥狀；攻毒不治療組仔豬腹瀉呈水樣噴射，2 3天后因極度脫水死亡。結(jié) 果見表1。表1仔豬攻毒治療后不同天數(shù)死亡情況及糞便指數(shù)
組別 1天 2天 3天 4天 5天 死亡率 _(%)
攻毒治療組4/4(2.5)4/4(2.0)2/4(0.5)0/4(0)0/4(0)0
攻毒不治療組4/4(3.0)2/2(3.0)1/1(3.0) 00100%
治療不攻毒組0/4(0) 0/4(0)0/4(0)0/4(0)0/4(0)0
不治療不攻毒組0/4(0) 0/4(0)0/4(0)0/4(0)0/4(0)_0注分母為存活仔豬數(shù)，分子為腹瀉仔豬數(shù)；括號內(nèi)為平均糞便指數(shù)試驗(yàn)結(jié)果表明不攻毒的兩組仔豬未出現(xiàn)腹瀉癥狀；攻毒不治療組仔豬在第一天 就出現(xiàn)嚴(yán)重的腹瀉癥狀，糞便呈水狀噴射，仔豬迅速消瘦，仔豬3天全部死亡；攻毒治療組 仔豬在出現(xiàn)腹瀉癥狀，用蛋黃抗體治療后，該組仔豬腹瀉癥狀則明顯減輕，糞便由黃色水樣 腹瀉變?yōu)辄S色稀糞，后逐漸成形，一周左右恢復(fù)健康，未出現(xiàn)死亡情況。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
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權(quán)利要求
一種豬傳染性胃腸炎病毒和流行性腹瀉病毒二聯(lián)蛋黃抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟1)免疫用疫苗的制備分別用豬腎傳代細(xì)胞、非洲綠猴腎傳代細(xì)胞培養(yǎng)豬傳染性胃腸炎病毒及豬流行性腹瀉病毒，分別濃縮后用作抗原，將兩種抗原充分混合后滅活，加入免疫增強(qiáng)劑及白油佐劑，制備油包水型豬傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹瀉病毒二聯(lián)滅活疫苗，做為免疫用疫苗；2)免疫用步驟1)制備的免疫用疫苗對非免疫產(chǎn)蛋雞進(jìn)行免疫，免疫次數(shù)≥2；3)從步驟2)免疫產(chǎn)蛋雞產(chǎn)出雞蛋中收集蛋黃液，提取豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉病毒二聯(lián)蛋黃抗體，純化后，凍干。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟1)中豬傳染性胃腸炎病毒抗原 的制備包括以下步驟將傳染性胃腸炎病毒液接種在PK15單層細(xì)胞上，同時(shí)設(shè)立不接毒細(xì) 胞對照，在37°C溫度下CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至75%細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變時(shí)收毒，中和試驗(yàn)測定 毒價(jià)，濃縮后用作抗原。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述步驟1)中流行性腹瀉病毒抗原的制備 包括以下步驟將流行性腹瀉病毒液接種于Vero單層細(xì)胞上，同時(shí)設(shè)立不接毒細(xì)胞對照， 在37°C溫度下CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至75%細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變時(shí)收毒，中和試驗(yàn)測定毒價(jià)，濃 縮后用作抗原。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟1)中豬傳染性胃腸炎病毒抗原 和流行性腹瀉病毒抗原按體積比1 0.8 1 1.2混合，混合后兩種病毒抗原的毒價(jià)均 彡 1. 0X 106 0TCID50/ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟1)中將豬傳染性胃腸炎病毒 和流行性腹瀉病毒混合抗原滅活后，分別加入體積比0. 01% 0. 05%的脂多糖和體積比 0. 2% 0. 8%的酵母葡聚糖作為免疫增強(qiáng)劑，與所述病毒液的總體積2倍量的白油佐劑 乳化，制備油包水型豬傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹瀉病毒二聯(lián)滅活疫苗作為免疫用疫田ο
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟2)中免疫程序?yàn)樵谑酌馇?0 日，每日用體積比1 % 5 %的黃芪多糖供雞飲用，提升雞體整體免疫力，首免前7日每羽雞 皮下注射牛結(jié)核分枝桿菌多糖核酸0. 1 0. 5ml、弗氏完全佐劑100 300 μ g，進(jìn)行免疫剌 激；首免時(shí)胸部肌肉多點(diǎn)注射免疫用疫苗1 2ml ；2周后進(jìn)行二免，注射免疫用疫苗1 2ml及牛結(jié)核分枝桿菌多糖核酸0. 1 0. 5ml ；再隔2周后進(jìn)行三免，注射免疫用疫苗2 4ml及牛結(jié)核分枝桿菌多糖核酸0. 2 0. 8ml ；再隔4 8周后進(jìn)行四免，注射免疫用疫苗 2 4ml。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟3)中二免后1周開始每隔7天 抽樣測定高免雞蛋蛋黃中抗豬傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹瀉病毒特異抗體效價(jià)；抗體 效價(jià)均達(dá)到1 128以上收集蛋黃，用于制備豬傳染性胃腸炎病毒和流行性腹瀉病毒二聯(lián) 蛋黃抗體。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟3)中充分?jǐn)嚢枋沟包S呈均勻膏狀，加入等體積經(jīng)滅菌并冷卻的蒸餾水，攪拌混勻，滅活；在隔層反應(yīng)罐中加入相當(dāng)于原蛋 黃6倍體積的pH值為4. 2的滅菌蒸餾水，并降溫至1 4°C，然后將滅活的蛋黃液加入，邊 加邊攪拌，4 8°C靜置4h ；離心分離上清液并轉(zhuǎn)入另一反應(yīng)罐中，按體積比為總量的0. 2% 加入辛酸，攪拌均勻，室溫放置2 4h ；用濾布過濾后，再用K型多層板框過濾至澄清，按體 積比為總量的0. 1 %加入飽和甲醛水溶液于上述濾液中，充分?jǐn)嚢杌靹?，室溫放?4h，期 間振搖數(shù)次，過濾除菌，用截留分子量為IOOOKDa的超濾膜過濾除病毒，即可得到提純的豬 傳染性胃腸炎病毒和流行性腹瀉病毒二聯(lián)蛋黃抗體。
9.一種由權(quán)利要求1 8任意一項(xiàng)方法制備的豬傳染性胃腸炎病毒和流行性腹瀉病毒 二聯(lián)蛋黃抗體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的豬傳染性胃腸炎病毒和流行性腹瀉病毒二聯(lián)蛋黃抗體，其 特征在于，所述二聯(lián)蛋黃抗體為凍干二聯(lián)蛋黃抗體。
11.如權(quán)利要求9所述的豬傳染性胃腸炎病毒和流行性腹瀉病毒二聯(lián)蛋黃抗體在豬傳 染性胃腸炎和流行性腹瀉疾病的臨床治療及預(yù)防中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種豬傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹瀉病毒二聯(lián)蛋黃抗體及其制備方法。包括以下步驟1)免疫用疫苗的制備；2)免疫；3)提取豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉病毒二聯(lián)蛋黃抗體，純化后，凍干。本發(fā)明采用了特別免疫程序，豬傳染性胃腸炎病毒和流行性腹瀉病毒二聯(lián)蛋黃抗體效價(jià)高。本發(fā)明方法制備的豬傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹瀉病毒二聯(lián)蛋黃抗體具有效果明顯、特異性高、治療效果迅速、療效確實(shí)、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)，具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號A61P31/14GK101948536SQ20101027319
公開日2011年1月19日 申請日期2010年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月10日
發(fā)明者喬榮岑, 孫進(jìn)忠, 張?jiān)S科 申請人:洛陽普萊柯生物工程有限公司