專(zhuān)利名稱(chēng)：油乳劑疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及禽用油乳劑疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
我國(guó)禽肉產(chǎn)品屢遭封關(guān)，1996年8月1日至2001年5月24日，歐盟以我國(guó)出口的 禽肉中含有動(dòng)物疫病和農(nóng)藥、獸藥殘留等為由對(duì)我國(guó)封關(guān)5年。2004年歐盟又以禽流感為 由全面禁止進(jìn)口我國(guó)禽肉產(chǎn)品，直到2008年8月才宣布解除我國(guó)禽肉產(chǎn)品禁令。剛解除禁 令又遇“配額”難題。解決所有問(wèn)題的先決條件就是要提高我國(guó)禽產(chǎn)品質(zhì)量。為減少禽病 害發(fā)生，同時(shí)為避免長(zhǎng)期應(yīng)用抗生素、激素類(lèi)產(chǎn)品所造成的菌群失調(diào)，耐藥菌株增加及藥物 殘留等負(fù)面影響，以發(fā)展優(yōu)質(zhì)，無(wú)公害的禽產(chǎn)品，保證我國(guó)家禽產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展并參與國(guó) 際市場(chǎng)的競(jìng)爭(zhēng)，具有良好免疫效果的疫苗將起極其重要的作用。目前，預(yù)防和控制家禽傳染病除生物安全措施外，主要依靠疫苗免疫，特別是通過(guò) 油乳劑疫苗的免疫。油性佐劑疫苗是已公認(rèn)的可有效強(qiáng)化免疫性的疫苗。油乳劑疫苗的生 物安全性高，具有用最小量的抗原，最少的接種次數(shù)，延長(zhǎng)免疫刺激時(shí)間，使機(jī)體產(chǎn)生足夠 量的抗體的特點(diǎn)，所以乳化品質(zhì)優(yōu)良的油乳劑苗是保證免疫效果的前提。在現(xiàn)有的油乳劑 疫苗(簡(jiǎn)稱(chēng)“油苗”)生產(chǎn)過(guò)程中，通常添加2%的硬脂酸鋁來(lái)增加其穩(wěn)定性，但其粘度較大 引起免疫注射的應(yīng)激反應(yīng)較大，如導(dǎo)致嚴(yán)重接種反應(yīng)、形成無(wú)菌性化膿損害和接種部位周 圍形成肉芽腫等，可產(chǎn)生外部可見(jiàn)的浮腫、腫脹、硬結(jié)和壞死。而且人們懷疑在接種部位有 殘留的可能，這便妨礙了疫苗的使用，這種現(xiàn)象在肉雞免疫中表現(xiàn)得尤為明顯?；谶@個(gè)原 因，使用含有礦物油的油性佐劑的疫苗有時(shí)是受到一定限制的。對(duì)于油性佐劑疫苗而言，已知這種疫苗不僅在免疫強(qiáng)化作用方面，而且在疫苗的 穩(wěn)定性方面，都在相當(dāng)大的程度上受到乳劑類(lèi)型、所用油性成分以及所結(jié)合的表面活性劑 種類(lèi)等因素的影響。尤其就滅活疫苗來(lái)說(shuō)，制備出一種具有在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)能誘導(dǎo)產(chǎn)生充分 免疫保護(hù)作用，并有著良好再現(xiàn)性的疫苗，是非常困難的。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的主要目的在于提供一種油乳劑疫苗，由體積百分比33. 3%的 水相與體積百分比66. 7%的油相構(gòu)成，其中水相由能夠誘導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答的疫苗抗原、親 水性非離子型表面活性劑和水構(gòu)成，油相由礦物油、卵磷脂、丙二醇、異甘露醇單油酸脂和 親油性非離子型表面活性劑構(gòu)成。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的疫苗抗原為滅活的禽類(lèi)病毒性微生物，包括新城疫病毒、禽 流感病毒、支氣管炎病毒、減蛋綜合癥病毒、法氏囊病毒或上述滅活病毒的任意一種病毒或 任意幾種病毒的混合物。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的親水性非離子型表面活性劑為吐溫-80。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的親油性非離子型表面活性劑為司盤(pán)-80。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的礦物油為白油佐劑。
優(yōu)選地，本發(fā)明所述的異甘露醇單油酸脂通過(guò)以下方式制備油酸甲酯、異甘露醇 與甲醇鈉在25 50mmHg真空度下加熱至100°C，保持lh，冷至室溫，加入己烷，過(guò)濾除去異 甘露醇，在218°C 220°C及0. 175mmHg大氣壓力下蒸餾得到異甘露醇單油酸脂。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的油乳劑疫苗，由以下體積百分比組分構(gòu)成水相為 29. 33% 32%疫苗抗原、0. 44% 1. 33%親水性非離子型表面活性劑、0. 89% 2. 67% 水；油相為0. 67% 3. 33%的卵磷脂、0. 67% 3. 33%的丙二醇、0. 67% 3. 33%的異甘 露醇單油酸脂、1. 33% 10%的親油性非離子型表面活性劑、46. 68% 63. 33%礦物油。本發(fā)明的另一目的在于提供一種油乳劑疫苗的制備方法，包括以下步驟1)水相的制備將親水性非離子型表面活性劑用水以3倍體積稀釋?zhuān)缓?21°C高 壓滅菌30min后冷卻至室溫，混合均勻備用，再加入疫苗抗原使親水性非離子型表面活性 劑最終占總體積的2. 67 % 8 %，疫苗抗原最終占總體積的88 % 96 % ；2)油相的制備將礦物油、丙二醇、卵磷脂和異甘露醇單油酸脂混合均勻?yàn)樽魟?再與親油性非離子型表面活性劑混勻做為油相，經(jīng)121°C高壓滅菌30min后冷卻至室溫， 使親油性非離子型表面活性劑最終占總體積的2% 15%、丙二醇最終占總體積的 5%、卵磷脂最終占總體積的 5%、異甘露醇單油酸脂最終占總體積的 5% ；3)乳化按油相水相=2 1的體積比，先將油相倒入乳化罐，攪拌轉(zhuǎn)速為 9，000 13，OOOrpm，溫度10 20°C的情況下，將水相以0. 6ml/s的速度加入油相中，再繼 續(xù)以速度13，500 17，500rpm乳化3 7min，獲得油乳劑疫苗。技術(shù)效果本發(fā)明的禽用油乳劑疫苗，通過(guò)不斷的探索研究，確定了添加了丙二醇、卵磷脂和 異甘露醇單油酸脂三種成份，并以合適的比例構(gòu)成，達(dá)到了替代硬脂酸鋁的目的，降低了疫 苗粘度更利于吸收，從而減少留存，在接種部位表現(xiàn)出優(yōu)異的局部安全性，并且在較長(zhǎng)時(shí)間 內(nèi)表現(xiàn)出較強(qiáng)的誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生能力。通過(guò)調(diào)整油相和水相的配方及其比例，減少了免疫注 射引起的應(yīng)激反應(yīng)，且不影響疫苗的穩(wěn)定性及免疫效果，從而也就提高了疫苗質(zhì)量。這種疫 苗即使在低粘度區(qū)域穩(wěn)定性也較高，副反應(yīng)較小，誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生能力以及保持高水平的抗 體產(chǎn)生的能力都很強(qiáng)。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的結(jié)果，本發(fā)明油乳劑疫苗既使不含硬脂酸鋁，它所顯示的免 疫作用也與含硬脂酸鋁疫苗的作用相當(dāng)，且與含硬脂酸鋁的油苗相比，本發(fā)明的疫苗有更 好的局部吸收能力。此外，本發(fā)明實(shí)施例的結(jié)果也表明，按照本發(fā)明的方法制備的油乳劑疫 苗同樣具有高穩(wěn)定性，在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)顯示出極好的功效，同時(shí)粘度更低，易于注射，注射引起 的應(yīng)激反應(yīng)更小，對(duì)動(dòng)物體更安全，而且不會(huì)產(chǎn)生常規(guī)油佐劑疫苗所引起的較大應(yīng)激反應(yīng)， 如常見(jiàn)的免疫注射部位浮腫、腫脹、硬結(jié)和壞死等問(wèn)題都得以解決。另一方面，由于疫苗黏 度降低，在接種家禽后，更容易吸收，不會(huì)產(chǎn)生藥物殘留的情況，符合食品安全的要求，有利 于禽類(lèi)產(chǎn)品的出口。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明中試驗(yàn)了滅活的禽類(lèi)病毒性微生物做為疫苗抗原，優(yōu)選能夠通過(guò)收獲雞胚 尿囊液獲得病毒性抗原的禽類(lèi)病毒；本發(fā)明試驗(yàn)了滅活的禽流感病毒、新城疫病毒、支氣管 炎病毒、減蛋綜合癥病毒、法氏囊病毒或上述滅活病毒的兩種或幾種混合物，均可以本發(fā)明的方法制備油乳劑，上述幾種油乳劑疫苗均有良好的效果。而上述幾種禽類(lèi)病毒制備獲得 的油乳劑疫苗只是抗原的成分有所不同，其它成分沒(méi)有任何差異，所以更換抗原對(duì)本發(fā)明 沒(méi)有任何的影響，均能達(dá)到本發(fā)明的目的，制備方法也完全相同，可視為對(duì)禽流感病毒、新 城疫病毒的等同替換。因此，在本發(fā)明實(shí)施例中僅以禽流感病毒、新城疫病毒為例對(duì)疫苗制 備與效果進(jìn)行詳述，其他的禽類(lèi)病毒的油乳劑疫苗的制備與效果均可參照禽流感病毒、新 城疫病毒的油乳劑疫苗的制備與效果的實(shí)施例，在此不再贅述。本發(fā)明實(shí)施例中親水性非離子型表面活性劑使用了吐溫-80，本發(fā)明還可使用其 他本領(lǐng)域常見(jiàn)的親水性非離子型表面活性劑，如吐溫-85。本發(fā)明實(shí)施例中親油性非離子型表面活性劑使用了司盤(pán)-80，本發(fā)明還可使用其 他本領(lǐng)域常見(jiàn)的親油性非離子型表面活性劑，如司盤(pán)-85 ；本發(fā)明實(shí)施例中礦物油使用了白油佐劑，本發(fā)明還可使用其他本領(lǐng)域常見(jiàn)的礦物 油，如弗氏不完全佐劑。本發(fā)明試驗(yàn)了由以下體積百分比組分構(gòu)成的油乳劑疫苗水相為29. 33% 32%疫苗抗原、0. 44% 1. 33%親水性非離子型表面活性劑、0. 89% 2. 67%水；油相為 0. 67% 3. 33%的卵磷脂、0. 67% 3. 33%的丙二醇、0. 67% 3. 33%的異甘露醇單油酸 脂、1. 33% 10%的親油性非離子型表面活性劑、46. 68% 63. 33%礦物油。
本發(fā)明實(shí)施例中的新城疫疫苗、禽流感疫苗的組成為 水相
新城疫疫苗(或禽流感疫苗)抗原29. 33 % 32 %
親水性非離子型表面活性劑0. 44% 1. 33%
水0.89% 2.67%
油相
卵磷脂
丙二醇
異甘露醇單油酸脂 親油性非離子表面活性劑 礦物油
0. 67% 3. 33% 0. 67% 3. 33%
0.67% 3. 33%
1.33% 10% 46. 68% 63. 33%
為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這 些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，下列實(shí)施例中未提及的具體實(shí)驗(yàn) 方法，通常按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。本發(fā)明實(shí)施例中，除另有說(shuō)明外，所有份數(shù)和百分比均按體積計(jì)算。實(shí)施例1本發(fā)明方法與常規(guī)方法制備新城疫疫苗及其比較試驗(yàn)一.本發(fā)明方法制備新城疫抗原油乳劑疫苗1.將親水性非離子型表面活性劑吐溫-80，加水以3倍體積稀釋?zhuān)缓笤?21°C高 壓滅菌30min后冷卻至室溫備用；取血球凝集(HA)效價(jià)為81og2的新城疫抗原與經(jīng)3倍體 積水稀釋121°C滅菌30min的吐溫-80混合均勻?yàn)樗唷?.將白油、丙二醇、卵磷脂和異甘露醇單油酸脂混合均勻?yàn)樽魟?，再與司盤(pán)-80混 勻?yàn)橛拖?，?jīng)121°C高壓滅菌30min，冷卻至室溫備用。3.按油相水相=2 1的體積比例，先將油相倒入乳化罐，攪拌轉(zhuǎn)速為11，OOOrpm，溫度18°C的情況下，水相加入油相的速度為0. 6ml/s，再繼續(xù)以速度15，500rpm 乳化5min，制備三批疫苗，批號(hào)分別為0901、0902和0903。制備的油乳劑疫苗0901、0902和0903，組成成分(百分比均為體積比)如下表1 表1新城疫抗原油乳劑疫苗各批次組成比例
權(quán)利要求
油乳劑疫苗，其特征在于，由體積百分比33.3％的水相與體積百分比66.7％的油相構(gòu)成，其中水相由能夠誘導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答的疫苗抗原、親水性非離子型表面活性劑和水構(gòu)成，油相由礦物油、卵磷脂、丙二醇、異甘露醇單油酸脂和親油性非離子型表面活性劑構(gòu)成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述油乳劑疫苗，其特征在于，所述疫苗抗原為滅活的禽類(lèi)病毒性 微生物，包括新城疫病毒、禽流感病毒、支氣管炎病毒、減蛋綜合癥病毒、法氏囊病毒或上述 滅活病毒的任意一種病毒或任意幾種病毒的混合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述油乳劑疫苗，其特征在于，所述親水性非離子型表面活性劑為 吐溫-80。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述油乳劑疫苗，其特征在于，所述親油性非離子型表面活性劑為 司盤(pán)-80。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述油乳劑疫苗，其特征在于，所述礦物油為白油佐劑。
6.按照權(quán)利要求1所述的油乳劑疫苗，其特征在于，所述異甘露醇單油酸脂通過(guò)以下 方式制備油酸甲酯、異甘露醇與甲醇鈉在25 50mmHg真空度下加熱至100°C，保持lh，冷 至室溫，加入己烷，過(guò)濾除去異甘露醇，在218°C 220°C及0. 175mmHg大氣壓力下蒸餾得到 異甘露醇單油酸脂。
7.按照權(quán)利要求1所述的油乳劑疫苗，其特征在于，由以下體積百分比組分構(gòu)成水 相為29. 33 % 32 %疫苗抗原、0. 44 % 1. 33 %親水性非離子型表面活性劑、0. 89 % 2. 67%水；油相為0. 67% 3. 33%的卵磷脂、0. 67% 3. 33%的丙二醇、0. 67% 3. 33% 的異甘露醇單油酸脂、1. 33% 10%的親油性非離子型表面活性劑、46. 68% 63. 33%礦 物油。
8.—種如權(quán)利要求1 7任意一項(xiàng)的油乳劑疫苗的制備方法，其特征在于，包括以下步驟1)水相的制備將親水性非離子型表面活性劑用水以3倍體積稀釋?zhuān)缓?21°C高壓滅 菌30min后冷卻至室溫，混合均勻備用，再加入疫苗抗原使親水性非離子型表面活性劑最 終占總體積的2. 67% 8%，疫苗抗原最終占總體積的88% 96% ；2)油相的制備將礦物油、丙二醇、卵磷脂和異甘露醇單油酸脂混合均勻?yàn)樽魟?，再與 親油性非離子型表面活性劑混勻做為油相，經(jīng)121°C高壓滅菌30min后冷卻至室溫，使親油 性非離子型表面活性劑最終占總體積的2% 15%、丙二醇最終占總體積的 5%、卵 磷脂最終占總體積的 5%、異甘露醇單油酸脂最終占總體積的 5% ；3)乳化按油相水相=2 1的體積比，先將油相倒入乳化罐，攪拌轉(zhuǎn)速為9，000 13，OOOrpm，溫度10 20°C的情況下，將水相以0. 6ml/s的速度加入油相中，再繼續(xù)以速度 13，500 17，500rpm乳化3 7min,獲得油乳劑疫苗。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種禽用油乳劑疫苗及其制備方法，是一種油乳劑疫苗，水相的體積分?jǐn)?shù)為33.3％，油相的體積分?jǐn)?shù)為66.7％，其中水相含有疫苗抗原和親水性非離子型表面活性劑；油相含有礦物油、卵磷脂、丙二醇、異甘露醇單油酸脂和親油性非離子型表面活性劑。該疫苗不含硬脂酸鋁，能在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持較高的抗體產(chǎn)生能力，并解決注射疫苗引起的動(dòng)物的應(yīng)激反應(yīng)以及疫苗殘留問(wèn)題。
文檔編號(hào)A61K39/295GK101933903SQ20101027321
公開(kāi)日2011年1月5日 申請(qǐng)日期2010年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月28日
發(fā)明者喬榮岑, 孫進(jìn)忠, 張?jiān)S科 申請(qǐng)人:洛陽(yáng)普萊柯生物工程有限公司