專利名稱：一種復(fù)方丹參片的質(zhì)量控制方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物分析技術(shù)中質(zhì)量控制方法領(lǐng)域，尤其涉及一種復(fù)方丹參片的質(zhì)量 控制方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
心腦血管疾病是嚴(yán)重危害人類的常見疾病。近年來，由于社會的發(fā)展，工作、生活、 及環(huán)境的變化，心腦血管疾病呈上升趨勢。復(fù)方丹參制劑多用來治療心腦血管疾病，例如復(fù) 方丹參片、復(fù)方丹參滴丸、冠心丹參滴丸等。這些復(fù)方丹參制劑(均含有丹參、三七)因其配 方不同，或者配方比例不同，或者提取精制方法不同，或者劑型不同，治療效果也有所差異。以“君、臣、佐、使”相互制約和協(xié)調(diào)的復(fù)方制劑，強調(diào)從整體上發(fā)揮作用，多半不是 針對某個靶點，也不是若干成分的簡單加合，僅靠單一成分的檢測降低了鑒別的準(zhǔn)確和專 屬性，不能代表中藥制劑的整體功效，不能反映其內(nèi)在質(zhì)量，及不能解決偽品摻雜等問題。 中藥指紋圖譜是一種綜合的、可量化的化學(xué)鑒定手段，可以鑒別真?zhèn)危u價原料藥材、半成 品和成品質(zhì)量的均一性和穩(wěn)定性，體現(xiàn)了中藥作用的整體性和模糊性。近年來，國外對草藥 產(chǎn)品的質(zhì)量評價大力提倡色譜指紋圖譜。通過圖譜主要特征峰的峰位，面積或比例，反映出 化學(xué)成分的種類及數(shù)量的特征性，有效地判別真?zhèn)危u價優(yōu)劣。色譜指紋圖譜分析成為鑒別 中藥真實性及評價質(zhì)量一致性和產(chǎn)品穩(wěn)定性的可行的模式。復(fù)方丹參片是由丹參、三七為主要原料制成的復(fù)方制劑，臨床上用于治療心腦血 管疾病、冠心病、心絞痛、心肌缺血等各類疾病，其治療效果已經(jīng)得到臨床的驗證。但目前復(fù) 方丹參片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅選取丹參的一、二個活性成分或指標(biāo)成分進行含量測定，并以其含 量多少來判定質(zhì)量，具有一定的片面性，不完善，缺乏全面有效的質(zhì)量控制方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是彌補已有技術(shù)的不足，目的在于提供一種有效可靠 的復(fù)方丹參片的質(zhì)量控制方法。本發(fā)明的另一目的是提供上述控制方法的應(yīng)用。為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是，一種復(fù)方丹參片的質(zhì)量控制方法，包 括如下步驟(1)制備含丹參素鈉、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A、二氫丹參酮I、隱丹 參酮、丹參酮I、丹參酮II A的混合對照品溶液；(2)制備復(fù)方丹參片含水醇溶液作為供試品溶液；(3)采用高效液相色譜法分析上述對照品溶液，色譜條件色譜柱為十八烷基硅 烷鍵合硅膠為填料，采用梯度洗脫，流動相A為乙腈酸水溶液，流動相B為乙腈；(4)測定吸取供試品溶液注入液相色譜儀，按照高效液相色譜法測定，得到復(fù)方 丹參片高效液相色譜指紋圖譜；(5)比較并根據(jù)對照品溶液的色譜圖和供試品溶液的指紋圖譜監(jiān)控復(fù)方丹參片的質(zhì)量。
優(yōu)選地，步驟(3)中所述高效液相色譜法的梯度洗脫程序如下Omin時，流動相A 流動相B ==1000 ；
40min時，流動相A流動相B=7030
60min時，流動相A流動相B=4060
85min時，流動相A流動相B=1585其中，上述比例為體積比。優(yōu)選地，步驟(3)中所述高效液相色譜法的流速1. OOOml/min。優(yōu)選地，步驟(3)中所述高效液相色譜法的進樣體積10μ 1 20μ 1。優(yōu)選地，步驟(3)中所述高效液相色譜法的檢測波長為274nm 286nm。優(yōu)選地，步驟(3)中所述流動相A為10%乙腈0. 4%甲酸水溶液。優(yōu)選地，步驟(3)中所述高效液相色譜法的柱溫20°C 30°C。優(yōu)選地，步驟(2)中所述制備復(fù)方丹參片供試品溶液的制備方法如下取復(fù)方丹 參片，除去包衣，用含水甲醇或含水乙醇提取，濾過，制成供試品溶液。優(yōu)選地，步驟(3)和步驟(4)中所述指紋圖譜有25個特征峰，各特征峰的保留 時間分另1J 為 6min、12min、21min、24min、25min、27min、29min、30min、31min、33min、35min、 48min、53min、56min、60min、62min、63min、66min、68min、71min、75min、76min、77min、 85min、88min，其中保留時間為 6min、24min、25min、27min、30min、60min、66min、68min、 75min的9個色譜峰依次與對照品溶液的色譜圖中丹參素鈉、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、 丹酚酸A、二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮II A相同。另外，本發(fā)明還提供一種復(fù)方丹參片的質(zhì)量控制方法的應(yīng)用，是應(yīng)用于鑒別復(fù)方 丹參片。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果以復(fù)方丹參片中的主要有效成分丹 參化學(xué)組分為指標(biāo)建立起來的HPLC指紋圖譜，代表著復(fù)方丹參片大部分藥理活性，能有效 地表征復(fù)方丹參片的質(zhì)量。從而實現(xiàn)對復(fù)方丹參片最大可能的化學(xué)成分進行檢測，有利于 對產(chǎn)品質(zhì)量的全面控制。以復(fù)方丹參片中丹參各有效成分指紋圖形作為一個整體看待，注 重各個構(gòu)成指紋特征峰前后順序和相互關(guān)系，避免只測定一、二個化學(xué)成分兒判定復(fù)方丹 參片整體質(zhì)量的片面性。本發(fā)明的方法建立了復(fù)方丹參片的指紋圖譜技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，通過指紋 圖譜中共有峰的有無及特征，有效地全面監(jiān)控半成品和成品的質(zhì)量，監(jiān)控生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定 性，保證其質(zhì)量的穩(wěn)定、均一、可控。本發(fā)明還具有方法先進、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好、可操作性 等優(yōu)點。本發(fā)明采用高效液相色譜法構(gòu)建了復(fù)方丹參片的指紋圖譜，利用高效液相色譜指 紋特征可全面監(jiān)控復(fù)方丹參片的質(zhì)量，且通過建立的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜可以監(jiān)控半成品與成品 生產(chǎn)工藝過程的穩(wěn)定性。本發(fā)明提高了復(fù)方丹參片成品、半成品的質(zhì)量監(jiān)控標(biāo)準(zhǔn)，有效的避 免了產(chǎn)品偽造，保證該品種的正常生產(chǎn)、流通秩序。


圖1是本發(fā)明的復(fù)方丹參片標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，圖中從左到右的箭頭所指分別是特征 峰1至25 ；圖2是混合對照品與復(fù)方丹參片指紋圖譜對應(yīng)的色譜圖，圖中峰號1、2、3、4、5、6、7、8、9依次指示為丹參素鈉、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A、二氫丹參酮I、隱丹參 酮、丹參酮I、丹參酮II A。
具體實施例方式為了本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠更好地理解本發(fā)明所提供的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體 實施例進行闡述。一種復(fù)方丹參片的質(zhì)量控制方法，包括以下步驟(1)制備含丹參素鈉、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A、二氫丹參酮I、隱丹 參酮、丹參酮I、丹參酮II A的混合對照品溶液，各組分的濃度均為0. 4mg/ml ；(2)制備復(fù)方丹參片含水醇溶液作為供試品溶液；(3)采用高效液相色譜法分析上述對照品溶液和供試品溶液，色譜條件色譜柱 為十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料；采用梯度洗脫，流動相A為10%乙腈0.4%甲酸水溶液； 流動相B為乙腈；梯度洗脫程序如下，其中下述比例為體積比Omin時，流動相A 流動相B =1000 ；
40min時，流動相A流動相B=7030
60min時，流動相A流動相B=4060
85min時，流動相A流動相B=1585流速1. 000ml/min,進樣體積10 20 μ 1 ；檢測波長280nm ；柱溫25°C ；(4)測定精密吸取供試品溶液注入液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，得到復(fù) 方丹參片高效液相色譜指紋圖譜；(5)比較并根據(jù)對照品溶液的色譜圖和供試品溶液的指紋圖譜監(jiān)控復(fù)方丹參片的質(zhì)量。上述質(zhì)量控制方法步驟(2)中所述復(fù)方丹參片含水醇溶液的制備方法如下取復(fù) 方丹參片，除去包衣，用含水甲醇或含水乙醇提取，濾過，制成供試品溶液。更具體地，該步 驟為取本品，糖衣片除去糖衣，薄膜衣片除去薄膜衣，研細，取約0.5 2g，精密稱定，置具 塞錐形瓶中，精密加入含水甲醇或含水乙醇10 40ml，密塞，稱定重量，超聲處理5 30 分鐘，放冷，再稱定重量，用含水甲醇或含水乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，用 0. 45 μ m微孔濾膜濾過，作為成品供試品溶液。所述梯度洗脫的步驟也可用表1表示表1梯度洗脫表 按照本發(fā)明的方法，通過對多批次復(fù)方丹參片構(gòu)建的高效液相色譜指紋圖譜并進 行分析比較，找出其共有特征峰，標(biāo)出各共有特征峰的保留時間Rt，得到復(fù)方丹參片標(biāo)準(zhǔn) 指紋圖譜。其共有峰為25個，其保留時間Rt值分別為6min、12min、21min、24min、25min、 27min、29min、30min、31min、33min、35min、48min、53min、56min、60min、62min、63min、 66min、68min、71min、75min、76min、77min、85min、88min,其中 Rt 值為 6min、24min、25min、 27min、30min、60min、66min、68min、75min的9個色譜峰經(jīng)確證為丹參素鈉、迷迭香酸、紫草 酸、丹酚酸B、丹酚酸A、二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮II A0以上色譜峰構(gòu)成了 復(fù)方丹參片的指紋特征。1儀器與試藥1. 1 儀器DI0NEX SUMMIT P680 高效液相色譜儀(ASI-100TM 自動進樣器、PDA-100 二極管陣列檢測器、變色龍色譜工作站)；色譜柱=Dikma PLATISIL ODS(250mmX4. 6mm, 5 μ m) ο1.2試藥10批成品及對應(yīng)的半成品，均由廣州白云山和記黃埔中藥有限公司提 供。實驗中液相色譜所用試劑乙腈均為色譜純，其余所用試劑均為分析純，水為超純水。2.方法與結(jié)果2. 1成品供試品溶液的制備分別取本品10片，研細，取約1. 0g，精密稱定，置具塞 錐形瓶中，精密加入70%甲醇(或70%乙醇)20ml，密塞，稱定重量，超聲處理(功率360W， 頻率35kHz) 30分鐘，放冷，再稱定重量，用70%甲醇(或70%乙醇)補足減失的重量，搖勻， 濾過，取續(xù)濾液，用0. 45 μ m微孔濾膜濾過，作為成品供試品溶液。半成品供試品溶液的制備取本品流膏約0. 5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密 加入70%甲醇(或70%乙醇)50ml，密塞，稱定重量，超聲處理(功率360W，頻率35kHz) 30 分鐘，放冷，再稱定重量，用70%甲醇(或70%乙醇)補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾 液，用0. 45 μ m微孔濾膜濾過，作為半成品供試品溶液?；旌蠈φ掌啡芤旱闹苽浞謩e稱取丹參素鈉、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸 A、二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮II A對照品約4mg，精密稱定，用甲醇定容于 IOml量瓶中，制成每Iml含丹參素鈉、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A、二氫丹參酮I、 隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮II A各0. 4mg的混合對照品溶液。2. 2高效液相色譜分析精密吸取成品及半成品供試品溶液10 μ 1，進樣；色譜條 件色譜柱為Dikma PLATISIL ODS C18，25(kimX4. 6謹(jǐn)，5 μ m ；流動相為流動相A為10%乙 腈0. 4%甲酸水溶液；流動相B為乙腈，采用表2的梯度洗脫方式表2梯度洗脫表 流速1. 000ml/min,進樣體積10 μ 1 ；檢測波長280nm ；柱溫25°C ；得到復(fù)方丹參片 高效液相色譜指紋圖譜。2. 3共有峰確定將上述得到的多批次復(fù)方丹參片的高效液相色譜指紋圖譜經(jīng) 《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版》進行比較，共有模式(參照指紋圖譜)共出 現(xiàn) 25 個。其保留時間 Rt 值分別為 6min、12min、21min、24min、25min、27min、29min、30min、 31min、33min、35min、48min、53min、56min、60min、62min、63min、66min、68min、71min、 75min、76min、77min、85min、88min ；25 個共有特征峰中，其中 Rt 值為 6min、24min、25min、 27min、30min、60min、66min、68min、75min的9個色譜峰經(jīng)確證為丹參素鈉、迷迭香酸、紫草 酸、丹酚酸B、丹酚酸A、二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮II A ；它們構(gòu)成了復(fù)方丹 參片的指紋特征，可作為復(fù)方丹參片的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，具體見圖1。對比混合對照品色譜圖㈧及復(fù)方丹參片指紋圖譜(B)，確定了復(fù)方丹參片中的9 個成分，具體見圖2，圖中A為混合對照品，B為復(fù)方丹參片。2. 4精密度試驗取同一個復(fù)方丹參片供試品溶液連續(xù)進樣6次，檢測指紋圖譜， 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版》進行評價，結(jié)果表明供試品溶液相似度 均大于0.996，儀器的精密度良好。精密度結(jié)果見表3:表3精密度結(jié)果 2. 5穩(wěn)定性考察取同一個復(fù)方丹參片供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12、24、 48小時進樣，檢測指紋圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版》進行評價， 結(jié)果表明供試品溶液相似度均等于1，供試品溶液在放置48小時內(nèi)穩(wěn)定。穩(wěn)定性結(jié)果見表
4 表4穩(wěn)定性結(jié)果
2. 6重復(fù)性試驗取同一批復(fù)方丹參片供試品6份，按“成品及半成品供試品溶液 的制備”項下方法制備，分別進樣，檢測指紋圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng) 2004A版》進行評價，結(jié)果表明供試品溶液相似度均大于0. 999，方法重復(fù)性好。結(jié)果見表 5 表5重復(fù)性結(jié)果 以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出的是，上述優(yōu)選實施方式不應(yīng)視為對 本發(fā)明的限制，本發(fā)明的保護范圍應(yīng)當(dāng)以權(quán)利要求所限定的范圍為準(zhǔn)。對于本技術(shù)領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，還可以做出若干改進和潤飾，這些改 進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。
權(quán)利要求
一種復(fù)方丹參片的質(zhì)量控制方法，其特征在于，包括如下步驟(1)制備含丹參素鈉、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA的混合對照品溶液；(2)制備復(fù)方丹參片含水醇溶液作為供試品溶液；(3)采用高效液相色譜法分析上述對照品溶液，色譜條件色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料，采用梯度洗脫，流動相A為乙腈酸水溶液，流動相B為乙腈；(4)測定吸取供試品溶液注入液相色譜儀，按照高效液相色譜法測定，得到復(fù)方丹參片高效液相色譜指紋圖譜；(5)比較并根據(jù)對照品溶液的色譜圖和供試品溶液的指紋圖譜監(jiān)控復(fù)方丹參片的質(zhì)量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)方丹參片的質(zhì)量控制方法，其特征在于，步驟(3)中所述高效液相色譜法的梯度洗脫程序如下Omin時，流動相A 流動相B ==100 0 ；40min時，流動相A流動相B=70 3060min時，流動相A流動相B=40 6085min時，流動相A流動相B=15 85其中，上述比例為體積比。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)方丹參片的質(zhì)量控制方法，其特征在于，步驟(3)中所述高 效液相色譜法的流速1. OOOml/min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)方丹參片的質(zhì)量控制方法，其特征在于，步驟(3)中所述高 效液相色譜法的進樣體積10 μ 1-20 μ 1。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)方丹參片的質(zhì)量控制方法，其特征在于，步驟(3)中所述高 效液相色譜法的檢測波長為274nm 286nm。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)方丹參片的質(zhì)量控制方法，其特征在于，步驟(3)中所述流 動相A為10%乙腈0.4%甲酸水溶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)方丹參片的質(zhì)量控制方法，其特征在于，步驟(3)中所述高 效液相色譜法的柱溫20°C 30°C。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)方丹參片的質(zhì)量控制方法，其特征在于，步驟(2)中所述復(fù) 方丹參片含水醇溶液的制備方法如下取復(fù)方丹參片，除去包衣，用含水甲醇或含水乙醇提 取，濾過，制成供試品溶液。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)方丹參片的質(zhì)量控制方法，其特征在于，步驟(3)和步 驟(4)中所述指紋圖譜有25個特征峰，各特征峰的保留時間分別為6min、12min、21min、 24min、25min、27min、29min、30min、31min、33min、35min、48min、53min、56min、60min、 62min、63min、66min、68min、71min、75min、76min、77min、85min、88min,其中保留時間為 6min、24min、25min、27min、30min、60min、66min、68min、75min 的 9 個色譜峰依次與對照品 溶液的色譜圖中丹參素鈉、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A、二氫丹參酮I、隱丹參 酮、丹參酮I、丹參酮II A相同。
10.權(quán)利要求1所述的復(fù)方丹參片的質(zhì)量控制方法的應(yīng)用，是應(yīng)用于鑒別復(fù)方丹參片。
全文摘要
本發(fā)明公開一種復(fù)方丹參片的質(zhì)量控制方法，包括如下步驟(1)制備混合對照品溶液；(2)制備復(fù)方丹參片含水醇溶液作為供試品溶液；(3)采用高效液相色譜法分析上述對照品溶液，色譜條件色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料，采用梯度洗脫，流動相A為乙腈酸水溶液，流動相B為乙腈；(4)測定吸取供試品溶液注入液相色譜儀，按照高效液相色譜法測定，得到復(fù)方丹參片高效液相色譜指紋圖譜；(5)比較并根據(jù)對照品溶液的色譜圖和供試品溶液的指紋圖譜監(jiān)控復(fù)方丹參片的質(zhì)量。本發(fā)明還公開了一種質(zhì)量控制方法的應(yīng)用，是應(yīng)用于鑒別復(fù)方丹參片。本發(fā)明的目的提供一種更為有效可靠的復(fù)方丹參片的質(zhì)量控制方法。
文檔編號A61P9/10GK101912440SQ20101025149
公開日2010年12月15日 申請日期2010年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月6日
發(fā)明者姚小華, 李楚源, 林青, 肖曉麗, 黃琳 申請人:廣州白云山和記黃埔中藥有限公司