專利名稱：一種新型螺旋藻源降血壓肽及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型螺旋藻源降血壓肽的制備、純化方法，可應(yīng)用于營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品、保 健性功能食品及藥品，屬食品生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
生物活性肽是指對(duì)生物機(jī)體的生命活動(dòng)有益或具有生理作用的肽類化合物。人類 攝取的蛋白質(zhì)經(jīng)過消化道的多種酶水解后，不是僅以氨基酸的形式吸收，更多的是以低肽 的形式被直接吸收，而且二肽和三肽的吸收速度比同一組成的氨基酸要快。因此，生物活性 肽的生物學(xué)意義主要體現(xiàn)在其吸收機(jī)制優(yōu)于氨基酸和具有氨基酸不可比擬的生理功能兩 個(gè)方面。近些年來，大量的科學(xué)證據(jù)表明天然食物資源是分離、獲取生物活性肽的寶貴來 源，采用酶法將天然蛋白質(zhì)水解后，大分子的蛋白質(zhì)酶切成小分子的肽段，不但利于消化吸 收，而且可以獲得多種生物活性肽。國(guó)內(nèi)外對(duì)食源低聚肽的研究結(jié)果表明，經(jīng)酶解后得到食 用肽類制品具有易吸收、抗氧化、抗疲勞、降血脂、降血壓、增強(qiáng)免疫力等一系列生理功能， 同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，食源性肽的生物活性和其原料來源、分子量大小、氨基酸序列與組成有密切 關(guān)系。迄今為止，國(guó)內(nèi)外研究者相繼從牛乳、奶酪、海洋魚類、小麥、玉米、大豆、大米等天然 食物來源中獲取具有不同生理活性的低聚肽。食源性肽類具有原料來源廣泛、可規(guī)?；?產(chǎn)、產(chǎn)品功能廣泛、價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)，已成為國(guó)際上極具發(fā)展?jié)摿Φ墓δ苄栽?。目前全世界有將近十億人口患高血壓，高血壓正成為嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之 一。雖然卡托普利(Captopril)等人工合成血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制劑具有顯著的降 血壓效果，然而這類降血壓藥物屬酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，它們對(duì)酶活性部位的抑制是可逆的， 藥物作用時(shí)間不長(zhǎng)，停藥后會(huì)使血壓反彈；而且，這類藥物被吸收和排泄的速度較快，經(jīng)腎 臟排出易損害腎功能，同時(shí)也會(huì)引起諸多的副作用，例如咳嗽、過敏、皮疹、水腫、心律失常 和腎臟損害等，所以研發(fā)更為安全的天然來源ACE抑制劑十分必要。ACE抑制肽的研究在國(guó) 外從上世紀(jì)六、七十年代開始，而在國(guó)內(nèi)則從九十年代后期開始才逐有報(bào)道。國(guó)內(nèi)外研究者 已從不同的天然食物來源中分離出ACE抑制肽，如蝮蛇、牛奶、金槍魚、酪蛋白等，不同來源 的ACE抑制肽在氨基酸數(shù)目、序列和活性上均存在較大差異。螺旋藻(Spirulina platensis)為藍(lán)藻屬的一個(gè)種，富含蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、 維生素、礦物質(zhì)和酶類等多種營(yíng)養(yǎng)成分，具有護(hù)肝、抗氧化、防病毒、抗癌和增強(qiáng)免疫等生理 功能。螺旋藻蛋白質(zhì)占螺旋藻干重的55% 70%，相對(duì)于一般概念上營(yíng)養(yǎng)豐富的雞蛋(蛋 白質(zhì)含量16% 18%)、大豆(33% 35%)、魚(17% 25% )等，螺旋藻是迄今發(fā)現(xiàn)的蛋 白質(zhì)含量最高的物種之一。螺旋藻蛋白質(zhì)包含18種氨基酸，具有人體必需的全部8種氨基 酸，并且在組成配比上最接近于世界糧農(nóng)組織(FAO)規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)，是獲得天然活性肽的潛 在寶貴資源。目前，螺旋藻主要以干粉形式直接應(yīng)用食品行業(yè)，由于其溶解性質(zhì)的局限性， 不利于人體吸收，使其應(yīng)用受到一定的限制。本研究采用蛋白酶解和色譜分離技術(shù)，獲取一 種高活性的ACE抑制肽，成果可廣泛應(yīng)用于保健性功能食品及藥品領(lǐng)域，具有巨大的實(shí)用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服大分子蛋白質(zhì)吸收性差以及目前活性肽品種混雜不清、活性 和純度不高方面的不足，獲得具有高體內(nèi)降血壓作用的螺旋藻源降血壓肽。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用超低溫凍融與超聲波破碎相結(jié)合的方法，將螺旋藻 粉懸浮水中(料液比1 5 1 10)，懸浮液用液氮-水浴25 30°C法凍融2 5次。 采用超聲波破碎3 5min，以4000g 8000g的速率離心20 40min，得到螺旋藻蛋白質(zhì)溶 液。然后采用Alcalase 2. 4L酶水解所述螺旋藻蛋白質(zhì)溶液，酶解pH值7 9，酶與底物的 比例為0. 02 0. 05 (ν/ν)，混合均勻后，酶解溫度40°C 60°C，酶解時(shí)間6 10小時(shí)。酶 解結(jié)束后混合液在沸水浴中加熱8 15min滅酶，然后調(diào)節(jié)pH值至7. 0。所獲產(chǎn)物經(jīng)不同 分子量大小的MWCO 10000D、5000D、3000D超濾膜過濾，獲得具有不同分子量多肽的濾液。隨后，以體外ACE抑制活性為指標(biāo)，通過凝膠過濾色譜、反相高效液相色譜對(duì)所提 取多肽進(jìn)行純化，純化后的多肽使用全自動(dòng)蛋白多肽序列分析儀和質(zhì)譜分析儀進(jìn)行鑒定， 并檢測(cè)對(duì)主要胃腸蛋白酶的體外消化穩(wěn)定性。純化后多肽的鑒定序列為異亮氨酸_谷氨酰 胺-脯氨酸(Ile-Gln-Pro, IQP)，IC50值為5. 77士0. 09 μ mol/L，在主要胃腸蛋白酶的消化 下能保持良好的抑制活性?；钚噪牡捏w內(nèi)降血壓效果以原發(fā)性高血壓大鼠(SHR)為模型進(jìn) 行驗(yàn)證，證實(shí)具有良好的體內(nèi)降血壓效果，可應(yīng)用于保健性功能食品及藥品領(lǐng)域。在鑒定出序列后，此種具有高體內(nèi)降血壓作用的螺旋藻源降血壓肽也可利用肽自 動(dòng)合成儀通過多肽合成方法人工合成，也可從其他蛋白來源中酶解制備，具有顯著的體外 ACE抑制活性和體內(nèi)降血壓作用。


下面對(duì)附圖進(jìn)行簡(jiǎn)要說明。圖1為螺旋藻堿性蛋白酶酶解液(0 3000D)經(jīng)Superdex Peptide HR 10/30柱 凝膠過濾色譜圖(下圖)和各色譜峰的ACE抑制活性(上圖)。圖2是經(jīng)Cosmosil MS-II C18柱第一次反相高效液相色譜圖(下圖)和各色譜 峰的ACE抑制活性(上圖)。圖3是經(jīng)Cosmosil MS-II C18柱第二次反相高效液相色譜圖。圖4是純化后螺旋藻源ACE抑制肽的質(zhì)譜分析圖。圖5是螺旋藻源ACE抑制肽IQP對(duì)SHR大鼠的24h降血壓效果。㈧SHR大鼠口 服IQP后24h內(nèi)的加權(quán)收縮壓變化；⑶SHR大鼠口服IQP后24h內(nèi)的加權(quán)舒張壓變化。結(jié) 果數(shù)據(jù)以“平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。在單因素方差分析后，采用Esumi Co. Ltd.(日本東 京)的Excel Toukei 6. 0版軟件進(jìn)行Scheffe多重比較分析。η = 5，相同時(shí)間點(diǎn)的數(shù)值 未包含相同字母表示差異顯著，P < 0. 05。圖6是螺旋藻源ACE抑制肽IQP對(duì)SHR大鼠的一周降血壓效果。(A) SHR大鼠口 服IQP —周期間的加權(quán)收縮壓變化；(B) SHR大鼠口服IQP —周期間的加權(quán)舒張壓變化。結(jié) 果數(shù)據(jù)以“平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。在單因素方差分析后，采用Esumi Co. Ltd.(日本東 京)的ExcelToukei 6. 0版軟件進(jìn)行Scheffe多重比較分析。η = 5，同一天的數(shù)值未包含相同字母表示差異顯著，P < 0. 05。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，但并不限制本發(fā)明的 范圍。其具體工藝路線由以下步驟構(gòu)成1.螺旋藻蛋白酶解液的制備取20g螺旋藻粉懸浮在160mL MiIli-Q水中，懸浮液用液氮-水浴25_30°C法凍融 五次。采用超聲波破碎(200W，振幅60% )3min，在4°C下以6000g的速率離心30min，離心 后去除沉淀，得到蛋白上清液，除一部分以Bio-Rad Protein Assay法測(cè)定蛋白質(zhì)含量外， 其余上清液迅速真空冷凍干燥并在_20°C下貯藏以備用。底物濃度為2% (相當(dāng)于20mg/mL)的螺旋藻蛋白質(zhì)溶液，調(diào)節(jié)pH值至8. 5，加入 Alcalase2. 4L酶(酶與底物的比例為0. 04 (ν/ν))，混合均勻后，于50°C的溫度條件下水解 10小時(shí)。酶解反應(yīng)結(jié)束的反應(yīng)液在沸水浴中加熱IOmin進(jìn)行酶滅活，以終止水解反應(yīng)。然 后迅速置于冰上，調(diào)節(jié)pH值至7. 0。在6000g、4°C條件下經(jīng)截留分子量為10000D的Vivascience超濾膜過濾去除酶。 濾液再經(jīng)過MWCO 5000和MWCO 3000D的超濾膜在4°C、6000g下超濾，得到分子量大小范圍 為0 3000、3000 5000、5000 10000D的水解液。不同分子量范圍的水解液迅速真空 冷凍干燥得到干燥粉末并在-20°C下貯藏備用。ACE抑制劑活性測(cè)定采用熒光共振能量轉(zhuǎn) 移法測(cè)定(表1)，分子量范圍在0 3000D的酶解液的IC5tl值最低，即ACE抑制活性最高。表1不同分子量范圍酶解液的ACE抑制活性
_分子量范圍(D)_IC50 (mg.mL-1)_Alcalase0-30000.2302 ± 0.0211
3000-5000 1.1517 ±0.1004 _5000-10000_3.0268 ±0.1117_2.螺旋藻源ACE抑制肽的純化分子量0 3000的堿性蛋白酶水解液的凍干粉溶解在IOmM Tris-HCl (pH 7. 0) 中，經(jīng) Superdex Peptide HR 10/30 柱過濾分離，采用 IOmM Tris-HCl(pH 7.0，包含 150mM NaCl)洗脫，在215nm波長(zhǎng)處進(jìn)行檢測(cè)并收集，然后檢測(cè)ACE抑制活性，活性最高的收集液迅 速進(jìn)行冷凍干燥(附圖1)。具有最高活性的收集液凍干粉溶解于流動(dòng)相A中，經(jīng)C0SM0SIL MS-II C18柱進(jìn) 行反相高效液相色譜純化，色譜柱用100%的流動(dòng)相A平衡2CV，逐漸升高流動(dòng)相B的濃度 進(jìn)行梯度分離純化(0-50%，12CV ；50-100%,3CV)，分離及ACE抑制活性檢測(cè)結(jié)果見附圖 2。抑制率最高的收集液再次反相高效液相色譜純化(梯度條件0-15%，lCV;15-20%， 15CV ；20-100 %,2CV)，出現(xiàn)單峰，分離譜圖見附圖3，其ACE抑制活性IC50值經(jīng)檢測(cè)為 0. 0021 + 0. OOOlmg/mLo流動(dòng)相A 0. 1 %三氟乙酸(TFA)溶解于1 %乙腈(ACN) /水(ν/ν)；流動(dòng)相B 0. 1% TFA 溶解于 90% ACN/ffater (ν/ν)。
3.螺旋藻源ACE抑制肽的生物物理化學(xué)分析純化后的多肽經(jīng)基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(KRAT0S ANALYTICALSHIMADZU, Japan)分析(附圖 4)及氨基酸測(cè)序(PPSQ-31A/33A, SHIMADZU, Japan)，鑒定其氨基酸序列為異亮氨酸-谷氨酰胺-脯氨酸(Ile-Gln-Pro，IQP)，IC50值按 其分子量換算為5. 77士0.09 μ mol/L。經(jīng)酶促動(dòng)力學(xué)分析，IQP為ACE酶的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制 劑，Ki 值為 7. 61 士0. 16 μ mol/L。通過胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶分別單獨(dú)消化IQP，以及先經(jīng)胃蛋白酶、再 經(jīng)胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶消化IQP，進(jìn)行體外穩(wěn)定性試驗(yàn)。反應(yīng)停止后的混合液分別使用 10000MWC0超濾膜在4°C下以6000g離心去除酶，取0. 2mL進(jìn)樣RP-HPLC系統(tǒng)以比較消化前 后的差異。色譜柱為Hydrosphere C18柱(YMC Co.，日本京都)，先用流動(dòng)相A平衡15min， 再用流動(dòng)相B對(duì)流動(dòng)相A 0 100%梯度洗脫30min。經(jīng)不同酶處理的多肽液IC5tl值和液 相色譜譜圖特征值如表2所示，前后變化不大，說明此種肽經(jīng)消化酶消化是穩(wěn)定的。表2IQP在主要胃腸蛋白酶消化下的穩(wěn)定性 4. IQP的動(dòng)物體內(nèi)降壓作用按10mg/kg將IQP溶解于0.9%生理鹽水中，通過胃管每日上午11 00灌服8周齡 雄性原發(fā)性高血壓大鼠(SHR，Charles River, Japan)，每只大鼠灌服量為ImL時(shí)間持續(xù)一 周。每日灌服前及第一日灌服后2、4、6、8、24小時(shí)的尾部動(dòng)脈收縮壓、舒張壓、心率采用尾 部套管法(BP-98A-L，Softron, Japan)檢測(cè)。如附圖5所示，首日灌服后4、6、8小時(shí)的加權(quán)收縮壓和舒張壓顯著低于負(fù)對(duì)照組 (灌服等量的0. 9%生理鹽水)，和正對(duì)照組(灌服降血壓藥物Captoporil，10mg/kg)結(jié)果 相近，說明本發(fā)明的降血壓肽具有顯著的體內(nèi)急性降血壓效果。另外，從第三日起，灌服IQP 的處理組大鼠的加權(quán)收縮壓和舒張壓顯著地低于負(fù)對(duì)照組(附圖6)，說明本發(fā)明的降血壓 肽具有中期降血壓的效果。
權(quán)利要求
一種具有高體內(nèi)活性的降血壓肽，所述降血壓肽的序列為異亮氨酸 谷氨酰胺 脯氨酸(Ile Gln Pro，IQP)。
2.一種制備含有如權(quán)利要求1所述序列降血壓肽的螺旋藻低聚肽的方法，其特征在于 所述方法包括以下步驟1)將螺旋藻粉懸浮水中(料液比1 5 1 10)，懸浮液用液氮-水浴25 30°C法 凍融2 5次。采用超聲波破碎3 5min，以4000g 8000g的速率離心20 40min，得 到螺旋藻蛋白質(zhì)溶液。2)采用Alcalase2. 4L酶水解所述螺旋藻蛋白質(zhì)溶液，酶解pH值7 9，酶與底物的 比例為0. 02 0. 05 (ν/ν)，混合均勻后，酶解溫度40°C 60°C，酶解時(shí)間6 10小時(shí)。酶 解結(jié)束后混合液在沸水浴中加熱8 15min滅酶，然后調(diào)節(jié)pH值至7. 0。3)采用截留分子量為10000D、5000D和3000D的超濾膜對(duì)所述酶解后混合液進(jìn)行過濾， 經(jīng)噴霧干燥或真空冷凍干燥，從而得到不同分子量范圍的螺旋藻低聚肽粉。
3.一種制備如權(quán)利要求1所述序列降血壓肽的純化方法，其特征在于所述方法包括以 下步驟1)檢測(cè)如權(quán)利要求2所述不同分子量范圍的螺旋藻低聚肽的ACE抑制活性，活性最高 的螺旋藻低聚肽經(jīng)Superdex Peptide HR 10/30柱過濾分離，采用IOmM Tris-HCl(pH 7.0， 包含150mM NaCl)洗脫，收集并檢測(cè)ACE抑制活性。2)具有最高活性的所述收集液相繼經(jīng)反相高效液相色譜進(jìn)行2次不同梯度的純化，其 中流動(dòng)相A :0. 三氟乙酸(TFA)溶解于乙腈(ACN)/水(ν/ν)；流動(dòng)相B :0. TFA溶 解于 90% ACN/ffater (ν/ν)。
4.如權(quán)利要求1所述序列降血壓肽的制備方法，其特征在于所述降血壓肽可以從其他 蛋白來源酶解制備，或利用肽自動(dòng)合成儀通過合成方法人工合成。
5.如權(quán)利要求1所述序列降血壓肽作為產(chǎn)品或添加成分在具有降血壓作用的保健功 能性食品或藥劑中的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求2所述螺旋藻低聚肽作為產(chǎn)品或添加成分在具有降血壓作用的保健功 能性食品或藥劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開一種口服有效的螺旋藻源新型降血壓肽及其制備方法，所述降血壓肽為一種三肽，序列為異亮氨酸-谷氨酰胺-脯氨酸(Ile-Gln-Pro，IQP)。本發(fā)明采用堿性蛋白酶對(duì)鈍頂螺旋藻進(jìn)行酶解，通過超濾、凝膠過濾色譜和二次反相高效液相色譜純化，獲得一種血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制肽。試驗(yàn)表明IQP為ACE的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，在主要胃腸蛋白酶的消化下能保持良好的ACE抑制活性。IQP對(duì)原發(fā)性高血壓大鼠(SHR)具有良好的降壓作用，在高血壓防治藥物和功能食品中具有巨大的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61P9/12GK101906135SQ20101023779
公開日2010年12月8日 申請(qǐng)日期2010年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月27日
發(fā)明者任迪峰, 王建中, 田之倉(cāng)優(yōu), 魯軍 申請(qǐng)人:魯軍