專利名稱：一種抗凝血抗菌生物醫(yī)用材料及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域，具體涉及一種抗凝血抗菌生物醫(yī)用材料及其制備 方法。
背景技術(shù)：
隨著人口老齡化進(jìn)程的發(fā)展，心血管疾病患者在我國呈逐年增加的趨勢，因此對 人工血管材料以及抗凝血的醫(yī)用材料需求日益增大。無論是用于血管代替材料還是血管內(nèi) 部支架材料，其血液相容性都是決定是否具備臨床應(yīng)用價(jià)值的先決條件。因此提高和改善 材料的血液相容性是血管修復(fù)材料領(lǐng)域研究重要方向之一。目前，制備抗凝血材料的方法 有很多，比如肝素固定化、提高材料的含水率以及形成微相不均勻結(jié)合等，其中肝素固定化 是研究最為活躍、應(yīng)用最為廣泛的一個(gè)領(lǐng)域。在材料進(jìn)行肝素化(heparization)時(shí)，關(guān)鍵要從肝素化材料的牢固程度、肝素化 材料的生物活性以及材料表面的濃度等幾個(gè)方面綜合考慮。一般來說，分為物理吸附和化 學(xué)結(jié)合兩大類。前者方法簡便，但肝素量化難以控制，且抗凝血持續(xù)時(shí)間不長，易隨血液溶 解而流失；后者則可以兼顧肝素化材料的利用率和穩(wěn)定性，且可以大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。目前用于血管組織工程的基底材料主要包括兩大類，一類是天然生物材料，如膠 原、絲素、纖維素、海藻酸鈉、透明質(zhì)酸及硫酸軟骨素等。這類材料本身來源于生物機(jī)體，具 有良好的細(xì)胞親和力，能為細(xì)胞生長、增殖及分化提供三維支架空間，其功能十分類似于體 內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)(ExtracellularMatrix，ECM)0另一類是人工合成材料，聚乳酸、聚氨酯及聚 己內(nèi)酯等。這類材料具有良好的生物惰性，優(yōu)異的機(jī)械性能，形態(tài)及降解的可控性以及生產(chǎn) 的可重復(fù)性。天然生物材料生物相容性良好，降解產(chǎn)物無毒，但來源有限。人工合成材料的 優(yōu)點(diǎn)是其強(qiáng)度、降解速度、微結(jié)構(gòu)均可進(jìn)行可控制備，但生物相容性不及天然材料。臨床實(shí)際應(yīng)用時(shí)發(fā)現(xiàn)，含有肝素化的抗凝血材料其抗凝性能表現(xiàn)較佳，但極容易 發(fā)生感染。其主要原因是肝素能夠刺激體內(nèi)金黃色葡萄球菌增殖，產(chǎn)生菌落薄膜，進(jìn)而引起 血流感染。因此，在制備抗凝血材料的同時(shí)需要兼顧考慮材料的抗菌性能。殼聚糖(chitosan)作為一種天然有機(jī)抗菌材料，其抗菌機(jī)理是殼聚糖分子表面含 有很強(qiáng)的正電荷，而許多微生物(細(xì)菌、真菌等)的細(xì)胞膜表面則帶負(fù)電荷，殼聚糖通過這種 靜電效應(yīng)破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)而殺死微生物。隨著這一機(jī)理的發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已在殼聚糖 材料的基礎(chǔ)上開發(fā)了一系列正電荷性能更強(qiáng)的新型抗菌材料一殼聚糖衍生物，如季銨化殼 聚糖、胍基化殼聚糖等。但是，目前并沒有關(guān)于肝素化抗凝血材料與抗菌材料材料結(jié)合運(yùn)用 的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是提出了一種抗凝血抗菌生物醫(yī)學(xué)材料及其制備方法， 它克服了現(xiàn)有的肝素化抗凝血材料僅僅具備抗凝血功能，而缺乏抗菌功能，在實(shí)際臨床應(yīng)用中這類材料易引起金黃色葡萄球菌感染而失效。本發(fā)明中提出的一種抗凝血抗菌生物醫(yī)用材料，其特征在于，它是基于對含 有氨基的天然生物材料(H2N-R)通過化學(xué)共價(jià)接枝的方法進(jìn)行肝素化，得到表達(dá)式為 C26H41N2O36S5-HN-R的肝素化抗凝血材料，然后將肝素化抗凝血材料與以殼聚糖為基材的 抗菌材料殼聚糖及其衍射物進(jìn)行混合，得到的抗凝血抗菌生物醫(yī)用材料。所述表達(dá)式中 C26H42N2O37S5為肝素的分子式，而H2N-R則用來代表含有氨基的天然生物材料。優(yōu)選的，所述含有氨基的天然生物材料主要包括膠原蛋白、絲素蛋白、海藻酸鈉、 透明質(zhì)酸中的任何一種。優(yōu)選的，所述的以殼聚糖為基材的抗菌材料主要包括殼聚糖、季氨化殼聚糖、胍基 化殼聚糖中的任何一種。優(yōu)選的，所述的化學(xué)共價(jià)接枝方法主要包括碳酰二亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺 (EDC/NHS)的縮肽交聯(lián)法將肝素接枝到上述含有氨基的天然生物材料分子上。本發(fā)明中提出的上述抗凝血抗菌生物醫(yī)學(xué)材料的制備方法，其特征在于，該方法 包括以下步驟
步驟1、通過碳酰二亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺(EDC/NHS)的縮肽交聯(lián)法將肝素接枝到上 述含有氨基的天然生物材料分子上，制備所述肝素化抗凝血材料；
步驟2、準(zhǔn)備以殼聚糖為基材的抗菌材料，包括殼聚糖、季銨化殼聚糖、胍基化殼聚糖中 的任何一種；
步驟3、將所述肝素化抗凝血材料與抗菌材料按質(zhì)量比為(1 士0. 5) (1 士0. 5)混合制 成抗凝血抗菌復(fù)合材料。優(yōu)選的，上述方法包括步驟4 將所述抗凝血抗菌復(fù)合材料進(jìn)行冷凍干燥，保存?zhèn)溆谩?yōu)選的，所述步驟1包括將肝素的羧基Ofep-COOH)在2- (N-嗎啉代)乙磺酸 (MES)緩沖液中通過所述EDC/NHS激活，在肝素的羧基被激活5—30分鐘后，與含有氨基的 天然生物材料中的氨基發(fā)生縮肽反應(yīng)，其中EDC:NHS:H印-C00H=2:1:1，MES緩沖液的pH值 ；^； 5. 5 6. 5 ο本發(fā)明首次描述了一種抗凝血抗菌生物醫(yī)用材料及其制備方法，該發(fā)明填補(bǔ)了目 前抗凝血材料在抗菌方面的空白。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這種新型的抗凝血抗菌生物醫(yī)用材料不 僅具有良好的血液相容性，而且還對金黃色葡萄球菌具有較強(qiáng)的抑制效果。這種同時(shí)具備 抗凝血抗菌的雙功能生物醫(yī)用材料具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。


下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步具體說明。圖1天然生物材料通過EDC/NHS肝素化的流程圖。圖2實(shí)施例1肝素化的絲素蛋白與殼聚糖復(fù)合的抗凝血抗菌材料的SEM圖。圖3實(shí)施例5肝素化膠原蛋白與胍基殼聚糖復(fù)合的抗凝血抗菌材料的抗凝鑒定。圖4實(shí)施例9肝素化透明質(zhì)酸與劑銨化殼聚糖復(fù)合的抗凝血抗菌材料的抗金黃色 葡萄球菌鑒定。
具體實(shí)施例方式如圖1所示的天然生物材料通過EDC/NHS肝素化的流程圖。肝素的羧基 (Hep-COOH)在EDC/NHS催化下形成激發(fā)態(tài)的活化酯與含有氨基的天然生物材料分子上的 氨基進(jìn)行縮肽反應(yīng)，將肝素共價(jià)接枝在天然生物材料分子上。由于肝素分子中的抗凝血活 性基團(tuán)磺酸基依然保留下來，因此這種化學(xué)共價(jià)接枝的方法不會(huì)影響肝素的抗凝活性。實(shí)施例1
1)取 0. 5g 的絲素蛋白(silkfibroin, SF)溶于 50ml 的 0. 05M、pH=5. 5—6. 5 的 MES 緩 沖溶液中，均勻攪拌lh。2)取 0. 5g 的肝素(h印arin，Hep)溶于 0· 05M、ρΗ=5· 5—6. 5 的 50ml 的 MES 緩沖 溶液中，均勻攪拌30min后，按照EDC:NHS:Hep-C00H=2:l:l的比例加入EDC和NHS,反應(yīng) 5-30min用于激活肝素。3)將上述絲素蛋白溶液加入到激活的肝素溶液中，攪拌5h，讓其充分反應(yīng)后，得到 肝素化絲素材料(ifep-SF)。4)取0. 5g殼聚糖(chitoSan，CS)溶于IOml的0. 5%醋酸溶液中，然后用MES緩沖 液稀釋至100ml。5)將上述肝素化絲素(!fep-SF)溶液逐步滴加到殼聚糖溶液中，混合反應(yīng)2h后，形 成乳白色粘稠懸濁液。6)將懸濁液放入截留分子量3500的透析袋中，在純水介質(zhì)中透析2天，主要去除 其中的醋酸和鹽離子(MES，EDC，NHS)。然后在聚乙二醇20000的介質(zhì)中脫水4h，目的是濃
縮樣品。7)將濃縮后的樣品吸出，倒入12孔板中塑形，隨后凍干樣品。8)將凍干后的樣品放入到60% (ν/ν)甲醇溶液中進(jìn)行誘導(dǎo)，目的是使絲素蛋白材 料由無規(guī)則卷曲構(gòu)象向折疊轉(zhuǎn)變，增加力學(xué)強(qiáng)度。9)將在甲醇中誘導(dǎo)的材料用純水清洗3次后，依次放入0. IM的Na2HPO4溶液中浸 泡12h，換液3次，4M的NaCl溶液浸沒12h，換液3次，純水中浸泡12h，換液3次。10)將清洗后的樣品進(jìn)行凍干，即獲得抗凝血抗菌復(fù)合材料肝素化絲素蛋白_殼 聚糖(H印-SF/CS)。將獲得的肝素化絲素蛋白-殼聚糖(!fep-SF/CS)復(fù)合材料進(jìn)行抗凝血實(shí)驗(yàn)評價(jià)， 結(jié)果表明，凝血酶原時(shí)間(PT)和活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)分別超過60秒(凝血儀的最大標(biāo)本檢查時(shí)間為60秒)。因此，該新型復(fù)合材料具有良好的抗凝作用。將獲得的肝素化絲素蛋白-殼聚糖(ifep-SF/CS)復(fù)合材料進(jìn)行溶血實(shí)驗(yàn)評價(jià)。結(jié) 果表明，陰性對照中，血細(xì)胞不溶解、不脹破，溶液為無色，低速離心后，大量血細(xì)胞聚集在 離心管底部。陽性對照中，血細(xì)胞大量溶解、脹破，溶液為深紅色，低速離心后，無血細(xì)胞聚 集在離心管底部。實(shí)驗(yàn)組中，血細(xì)胞極少量溶解，溶液略顯淺紅色，低速離心后，大量血細(xì)胞 聚集在離心管底部。因此，該新型復(fù)合材料具有良好的抑制溶血功能。將獲得的肝素化絲素蛋白-殼聚糖(!fep-SF/CS)復(fù)合材料進(jìn)行抗菌實(shí)驗(yàn)評價(jià)， 結(jié)果表明，肝素化絲素蛋白(Hep-SF)材料的菌落數(shù)顯著高于空白對照組，肝素化絲素蛋 白-殼聚糖(ifep-SF/CS)復(fù)合材料的顯著小于空白對照組。因此，該新型復(fù)合材料具有良 好的抗金黃色葡萄球菌功能。
圖2是肝素化絲素蛋白與殼聚糖復(fù)合的抗凝血抗菌材料的環(huán)境掃描電鏡(SEM) 圖。圖中顯示絲狀分子為肝素化絲素(SF)，片層狀分子為殼聚糖(CS)，結(jié)果表明二者復(fù)合 完好。實(shí)施例2
1)取 0. 5g 的絲素蛋白(silkfibroin, SF)溶于 50ml 的 0. 05M、pH=5. 5—6. 5 的 MES 緩 沖溶液中，均勻攪拌lh。2)取 0. 5g 的肝素(h印arin，Hep)溶于 0· 05M、ρΗ=5· 5—6. 5 的 50ml 的 MES 緩沖 溶液中，均勻攪拌30min后，按照EDC:NHS:Hep-C00H=2:l:l的比例加入EDC和NHS,反應(yīng) 5-30min用于激活肝素。3)將上述絲素蛋白溶液加入到激活的肝素溶液中，攪拌5h，讓其充分反應(yīng)后，得到 肝素化絲素材料(ifep-SF)。4)取Ig殼聚糖(chitosan，CS)溶解于20ml0. 5%的醋酸溶液中，然后用MES緩沖 液稀釋至100ml。5)取0. 5g精氨酸(arginine，Arg)溶于IOOml的MES緩沖溶液中，然后按照比例 EDC:NHS:Arg-C00H=2:l:l的比例加入EDC和NHS，反應(yīng)15min用于激活精氨酸的羧基，再 將殼聚糖溶液與活化的精氨酸反應(yīng)，制備帶正電荷胍基的抗菌材料(guanidine-chitosan， Gua-CS)ο6)將上述肝素化絲素(Ifep-SF)溶液逐步滴加到胍基化殼聚糖(Gua-CS)溶液中， 混合反應(yīng)2h后，形成乳白色粘稠懸濁液。7)將懸濁液放入截留分子量為3500的透析袋中，在純水介質(zhì)中透析2天，主要去 除其中的醋酸和鹽離子(MES，EDC，NHS)。然后在聚乙二醇20000的介質(zhì)中脫水4h，目的是 濃縮樣品。8)將濃縮后的樣品吸出，倒入12孔板中塑形，隨后凍干樣品。9)將凍干后的樣品放入到60% (ν/ν)甲醇溶液中進(jìn)行誘導(dǎo)，目的是使絲素蛋白材 料由無規(guī)則卷曲構(gòu)象向折疊轉(zhuǎn)變，增加力學(xué)強(qiáng)度。10)將在甲醇中誘導(dǎo)的材料用純水清洗3次后，依次放入0. IM的Na2HPO4溶液中 浸泡12h，換液3次，4M的NaCl溶液浸沒12h，換液3次，純水中浸泡12h，換液3次。11)將清洗后的樣品進(jìn)行凍干，即獲得抗凝血抗菌復(fù)合材料肝素化絲素蛋白_胍 基殼聚糖(H印-SF/Gua-CS )。將獲得的肝素化絲素蛋白-胍基殼聚糖(!fep-SF/Gua-CS)復(fù)合材料進(jìn)行抗凝血實(shí) 驗(yàn)評價(jià)，結(jié)果表明，凝血酶原時(shí)間(PT)和活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)均超過60秒(凝血 儀的最大標(biāo)本檢查時(shí)間為60秒)。因此，該新型復(fù)合材料具有良好的抗凝作用。將獲得的肝素化絲素蛋白-胍基殼聚糖(!fep-SF/Gua-CS)復(fù)合材料進(jìn)行溶血實(shí)驗(yàn) 評價(jià)。結(jié)果表明，陰性對照中，血細(xì)胞不溶解、不脹破，溶液為無色，低速離心后，大量血細(xì)胞 聚集在離心管底部。陽性對照中，血細(xì)胞大量溶解、脹破，溶液為深紅色，低速離心后，無血 細(xì)胞聚集在離心管底部。實(shí)驗(yàn)組中，血細(xì)胞極少量溶解，溶液略顯淺紅色，低速離心后，大量 血細(xì)胞聚集在離心管底部。因此，該新型復(fù)合材料具有良好的抑制溶血功能。將獲得的肝素化絲素蛋白-胍基殼聚糖(!fep-SF/Gua-CS)復(fù)合材料進(jìn)行抗菌實(shí)驗(yàn) 評價(jià)，結(jié)果表明，肝素化絲素蛋白(ifep-SF)材料的菌落數(shù)顯著高于空白對照組，肝素化絲素蛋白-胍基殼聚糖(ifep-SF/Gua-CS)復(fù)合材料的極顯著小于空白對照組。因此，該新型復(fù) 合材料具有良好的抗金黃色葡萄球菌功能。實(shí)施例3
1)取 0. 5g 的絲素蛋白(silkfibroin, SF)溶于 50ml 的 0. 05M、pH=5. 5—6. 5 的 MES 緩 沖溶液中，均勻攪拌lh。2)取 0. 5g 的肝素(h印arin，H印)溶于 0. 05M、ρΗ=5· 5—6. 5 的 50ml 的 MES 緩沖 溶液中，均勻攪拌30min后，按照EDC:NHS:Hep-C00H=2:l:l的比例加入EDC和NHS，反應(yīng) 5-30min用于激活肝素。3)將上述絲素蛋白溶液加入到激活的肝素溶液中，攪拌5h，讓其充分反應(yīng)后，得到 肝素化絲素材料(H印arin-silkfibroin，Hep-SF)04)取Ig殼聚糖(chitosan，CS)和Ig碘化鈉(NaI)在60mlN_甲基吡咯烷酮(NMP) 催化下60°C反應(yīng)2h，然后加入5ml，10%Na0H和5ml碘甲烷，仍在60°C反應(yīng)2h。5)將得到的樣品依次在乙醇溶液中洗滌3次，純水中洗滌3次，最后將樣品凍干， 得到季銨化殼聚糖(quaternaryammonium-chitosan，QA-CS)抗菌材料。6)將上述肝素化絲素(Ifep-SF)溶液逐步滴加到季銨化殼聚糖(QA-CS)溶液中，混 合反應(yīng)2h后，形成乳白色粘稠懸濁液。7)將懸濁液放入截留分子量為3500的透析袋中，在純水介質(zhì)中透析2天，主要去 除其中的醋酸和鹽離子(MES，EDC，NHS)。然后在聚乙二醇20000的介質(zhì)中脫水4h，目的是 濃縮樣品。8)將濃縮后的樣品吸出，倒入12孔板中塑形，隨后凍干樣品。9)將凍干后的樣品放入到60% (ν/ν)甲醇溶液中進(jìn)行誘導(dǎo)，目的是使絲素蛋白材 料由無規(guī)則卷曲構(gòu)象向折疊轉(zhuǎn)變，增加力學(xué)強(qiáng)度。10)將在甲醇中誘導(dǎo)的材料用純水清洗3次后，依次放入0. IM的Na2HPO4溶液中 浸泡12h，換液3次，4M的NaCl溶液浸沒12h，換液3次，純水中浸泡12h，換液3次。11)將清洗后的樣品進(jìn)行凍干，即獲得抗凝血抗菌復(fù)合材料肝素化絲素蛋白_季 銨化殼聚糖(H印-SF/QA-CS )。將獲得的肝素化絲素蛋白-季銨化殼聚糖(!fep-SF/QA-CS)復(fù)合材料進(jìn)行抗凝血 實(shí)驗(yàn)評價(jià)，結(jié)果表明，凝血酶原時(shí)間(PT)和活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)分別超過60秒 (凝血儀的最大標(biāo)本檢查時(shí)間為60秒)。因此，該新型復(fù)合材料具有良好的抗凝作用。將獲得的肝素化絲素蛋白-季銨化殼聚糖(!fep-SF/QA-CS)復(fù)合材料進(jìn)行溶血實(shí) 驗(yàn)評價(jià)。結(jié)果表明，陰性對照中，血細(xì)胞不溶解、不脹破，溶液為無色，低速離心后，大量血細(xì) 胞聚集在離心管底部。陽性對照中，血細(xì)胞大量溶解、脹破，溶液為深紅色，低速離心后，無 血細(xì)胞聚集在離心管底部。實(shí)驗(yàn)組中，血細(xì)胞極少量溶解，溶液略顯淺紅色，低速離心后，大 量血細(xì)胞聚集在離心管底部。因此，該新型復(fù)合材料具有良好的抑制溶血功能。將獲得的肝素化絲素蛋白-季銨化殼聚糖(!fep-SF/QA-CS)復(fù)合材料進(jìn)行抗菌實(shí) 驗(yàn)評價(jià)，結(jié)果表明，肝素化絲素蛋白(Ifep-SF)材料的菌落數(shù)顯著高于空白對照組，肝素化絲 素蛋白-季銨化殼聚糖(ifep-SF/QA-CS)復(fù)合材料的極顯著小于空白對照組。因此，該新型 復(fù)合材料具有良好的抗金黃色葡萄球菌功能。實(shí)施例41)取0. 5g的膠原蛋白(collagen，COL)溶于20ml的0. 5%醋酸溶液中，再用0. 05M、 pH=5. 5—6. 5的MES緩沖溶液稀釋至50ml，均勻攪拌lh。2)取 0. 5g 的肝素(h印arin，Hep)溶于 0· 05M、ρΗ=5· 5—6. 5 的 50ml 的 MES 緩沖 溶液中，均勻攪拌30min后，按照EDC:NHS:Hep-C00H=2:l:l的比例加入EDC和NHS，反應(yīng) 5-30min用于激活肝素。3)將上述膠原蛋白溶液加入到激活的肝素溶液中，攪拌5h，讓其充分反應(yīng)后，得到 肝素化膠原材料(Ifep-COL )。4)取0. 5g殼聚糖(chitosan, CS)溶于醋酸(0. 5%，IOml)溶液中，然后用MES緩沖 液稀釋至100ml。5)將上述肝素化膠原(!fep-COL)溶液逐步滴加到殼聚糖溶液中，混合反應(yīng)2h后， 形成乳白色粘稠懸濁液。6)將懸濁液放入截留分子量為3500的透析袋中，在純水介質(zhì)中透析2天，主要去 除其中的醋酸和鹽離子(MES，EDC，NHS)。然后在聚乙二醇20000的介質(zhì)中脫水4h，目的是 濃縮樣品。
7)將濃縮后的樣品吸出，倒入12孔板中塑形，隨后凍干樣品。8)將凍干后的樣品依次放入0. IM的Na2HPO4溶液中浸泡12h，換液3次，4M的NaCl 溶液浸沒12h，換液3次，純水中浸泡12h，換液3次。9)將洗滌后的樣品進(jìn)行凍干，即獲得抗凝血抗菌復(fù)合材料肝素化膠原蛋白_殼聚 糖(H印-C0L/CS)。將獲得的肝素化膠原蛋白-殼聚糖(ifep-COL/CS)復(fù)合材料進(jìn)行抗凝血實(shí)驗(yàn)評價(jià)， 結(jié)果表明，凝血酶原時(shí)間(PT)和活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)分別超過60秒(凝血儀的最 大標(biāo)本檢查時(shí)間為60秒)。因此，該新型復(fù)合材料具有良好的抗凝作用。將獲得的肝素化膠原蛋白-殼聚糖(!fep-C0L/CS)復(fù)合材料進(jìn)行溶血實(shí)驗(yàn)評價(jià)。結(jié) 果表明，陰性對照中，血細(xì)胞不溶解、不脹破，溶液為無色，低速離心后，大量血細(xì)胞聚集在 離心管底部。陽性對照中，血細(xì)胞大量溶解、脹破，溶液為深紅色，低速離心后，無血細(xì)胞聚 集在離心管底部。實(shí)驗(yàn)組中，血細(xì)胞極少量溶解，溶液略顯淺紅色，低速離心后，大量血細(xì)胞 聚集在離心管底部。因此，該新型復(fù)合材料具有良好的抑制溶血功能。將獲得的肝素化膠原蛋白_殼聚糖(!fep-C0L/CS)復(fù)合材料進(jìn)行抗菌實(shí)驗(yàn)評價(jià)， 結(jié)果表明，肝素化膠原蛋白(Hep-COL)材料的菌落數(shù)顯著高于空白對照組，肝素化膠原蛋 白-殼聚糖(ifep-COL/CS)復(fù)合材料的顯著小于空白對照組。因此，該新型復(fù)合材料具有良 好的抗金黃色葡萄球菌功能。實(shí)施例5
1)取0. 5g的膠原蛋白(collagen，C0L)溶于20ml的0. 5%醋酸溶液中，再用0. 05M、 pH=5. 5—6. 5的MES緩沖溶液稀釋至50ml，均勻攪拌lh。2)取 0. 5g 的肝素(h印arin，H印)溶于 0. 05Μ、ρΗ=5· 5—6. 5 的 50ml 的 MES 緩沖溶 液中，均勻攪拌30min后，按照EDC NHS Hep-C00H=2 1 1的比例加入EDC和NHS，反應(yīng)15min
用于激活肝素。3)將上述膠原蛋白溶液加入到激活的肝素溶液中，攪拌5h，讓其充分反應(yīng)后，得到 肝素化膠原材料(Ifep-COL )。
4)取Ig殼聚糖(chitoSan，CS)溶解于20ml的0. 5%醋酸溶液中，然后用MES緩沖液稀釋至100ml。5)取0. 5g精氨酸(arginine，Arg)溶于IOOml的MES緩沖溶液中，然后按 照比例EDC:NHS:Arg-C00H=2:l 1的比例加入EDC和NHS，反應(yīng)5—30min用于激活 精氨酸的羧基，再將殼聚糖溶液與活化的精氨酸反應(yīng)，制備帶正電荷胍基的抗菌材料 (guanidine-chitosan，Gua_CS)。6)將上述肝素化膠原(!fep-COL)溶液逐步滴加到胍基化殼聚糖(Gua-CS)溶液中， 混合反應(yīng)2h后，形成乳白色粘稠懸濁液。7)將懸濁液放入透析袋(截留分子量3500)中，在純水介質(zhì)中透析2天，主要去除 其中的醋酸和鹽離子(MES，EDC，NHS)。然后在聚乙二醇20000的介質(zhì)中脫水4h，目的是濃
縮樣品。8)將濃縮后的樣品吸出，倒入12孔板中塑形，隨后凍干樣品。9 )將凍干后的樣品依次放入0. IM的Na2HPO4溶液中浸泡12h，換液3次，4M的NaCl 溶液浸沒12h，換液3次，純水中浸泡12h，換液3次。10)將洗滌后的樣品進(jìn)行凍干，即獲得抗凝血抗菌復(fù)合材料肝素化膠原蛋白_胍 基殼聚糖(H印-COL/Gua-CS )。將獲得的肝素化膠原蛋白-胍基殼聚糖(!fep-COL/Gua-CS)復(fù)合材料進(jìn)行抗凝血 實(shí)驗(yàn)評價(jià)，結(jié)果表明，凝血酶原時(shí)間(PT)和活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)分別超過60秒 (凝血儀的最大標(biāo)本檢查時(shí)間為60秒)。因此，該新型復(fù)合材料具有良好的抗凝作用。圖3為肝素化膠原蛋白與胍基殼聚糖復(fù)合的抗凝血抗菌材料的溶血鑒定圖片。圖 中1 與2 樣品為陰性對照組，4#和5#為陽性對照組，3#是實(shí)驗(yàn)組，陰性對照組是以生理鹽 水為溶劑稀釋血漿，陽性對照組是以三蒸水為溶劑稀釋血漿，實(shí)驗(yàn)組是以材料的浸提液為 溶劑稀釋血漿。結(jié)果表明，陰性對照組無血細(xì)胞溶解、脹破現(xiàn)象，溶液呈無色，離心后管底有 大量血細(xì)胞聚集；陽性對照組血細(xì)胞大量溶解和脹破，溶液呈深紅色，離心后管底無血細(xì)胞 聚集；實(shí)驗(yàn)組僅有少量血細(xì)胞溶解，溶液略呈淺紅色，離心后管底有大量血細(xì)胞聚集。因此， 該新型復(fù)合材料具有良好的抑制溶血功能。將獲得的肝素化膠原蛋白-胍基殼聚糖(!fep-COL/Gua-CS)復(fù)合材料進(jìn)行抗菌實(shí) 驗(yàn)評價(jià)，結(jié)果表明，肝素化膠原蛋白(Hep-COL)材料的菌落數(shù)顯著高于空白對照組，肝素化 膠原蛋白-胍基殼聚糖(ifep-COL/Gua-CS)復(fù)合材料的顯著小于空白對照組。因此，該新型 復(fù)合材料具有良好的抗金黃色葡萄球菌功能。實(shí)施例6
1)取0. 5g的膠原蛋白(collagen，C0L)溶于20ml的0. 5%醋酸溶液中，再用0. 05M、 pH=5. 5—6. 5的MES緩沖溶液稀釋至50ml，均勻攪拌lh。2)取 0. 5g 的肝素(h印arin，Hep)溶于 0· 05M、ρΗ=5· 5—6. 5 的 50ml 的 MES 緩沖 溶液中，均勻攪拌30min后，按照EDC:NHS:Hep-C00H=2:l:l的比例加入EDC和NHS，反應(yīng) 5-30min用于激活肝素。3)將上述膠原蛋白溶液加入到激活的肝素溶液中，攪拌5h，讓其充分反應(yīng)后，得到 肝素化膠原材料(Ifep-COL )。4)取Ig殼聚糖(chitosan，CS)和Ig碘化鈉(NaI)在60mlN_甲基吡咯烷酮(NMP)催化下60°C反應(yīng)2h，然后加入5ml，10%Na0H和5ml碘甲烷，仍在60°C反應(yīng)2h。5)將得到的樣品依次在乙醇溶液中洗滌3次，純水中洗滌3次，最后將樣品凍干， 得到季銨化殼聚糖(quaternaryammonium-chitosan，QA-CS)抗菌材料。6)將上述肝素化絲素(Ifep-COL)溶液逐步滴加到季銨化殼聚糖(QA-CS)溶液中， 混合反應(yīng)2h后，形成乳白色粘稠懸濁液。7)將懸濁液放入透析袋(截留分子量3500)中，在純水介質(zhì)中透析2天，主要去除 其中的醋酸和鹽離子(MES，EDC，NHS)。然后在聚乙二醇20000的介質(zhì)中脫水4h，目的是濃
縮樣品。8)將濃縮后的樣品吸出，倒入12孔板中塑形，隨后凍干樣品。9)將凍干后的樣品依次放入0. IM的Na2HPO4溶液中浸泡12h，換液3次，4M的NaCl 溶液浸沒12h，換液3次，純水中浸泡12h，換液3次。10)將洗滌后的樣品進(jìn)行凍干，即獲得抗凝血抗菌復(fù)合材料肝素化膠原蛋白_季 銨化殼聚糖(H印-C0L/QA-CS )。將獲得的肝素化膠原蛋白-季銨化殼聚糖(!fep-C0L/QA-CS)復(fù)合材料進(jìn)行抗凝血 實(shí)驗(yàn)評價(jià)，結(jié)果表明，凝血酶原時(shí)間(PT)和活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)分別超過60秒 (凝血儀的最大標(biāo)本檢查時(shí)間為60秒)。因此，該新型復(fù)合材料具有良好的抗凝作用。將獲得的肝素化膠原蛋白-季銨化殼聚糖(!fep-C0L/QA-CS)復(fù)合材料進(jìn)行溶血實(shí) 驗(yàn)評價(jià)。結(jié)果表明，陰性對照中，血細(xì)胞不溶解、不脹破，溶液為無色，低速離心后，大量血細(xì) 胞聚集在離心管底部。陽性對照中，血細(xì)胞大量溶解、脹破，溶液為深紅色，低速離心后，無 血細(xì)胞聚集在離心管底部。實(shí)驗(yàn)組中，血細(xì)胞極少量溶解，溶液略顯淺紅色，低速離心后，大 量血細(xì)胞聚集在離心管底部。因此，該新型復(fù)合材料具有良好的抑制溶血功能。將獲得的肝素化膠原蛋白-季銨化殼聚糖(ifep-COL/QA-CS)復(fù)合材料進(jìn)行抗菌實(shí) 驗(yàn)評價(jià)，結(jié)果表明，肝素化膠原蛋白(Hep-COL)材料的菌落數(shù)顯著高于空白對照組，肝素化 膠原蛋白-季銨化殼聚糖(ifep-COL/QA-CS)復(fù)合材料的極顯著小于空白對照組。因此，該 新型復(fù)合材料具有良好的抗金黃色葡萄球菌功能。實(shí)施例7
1)取 0. 5g 的透明質(zhì)酸(hyaluronicacid，HA)溶于 0. 05Μ、ρΗ=5· 5—6. 5 的 50ml 的 MES 緩沖溶液，均勻攪拌lh，充分溶解。2)取 0. 5g 的肝素(h印arin，Hep)溶于 0. 05M、pH=5. 5—6. 5 的 50ml 的 MES 緩沖 溶液中，均勻攪拌30min后，按照EDC:NHS:Hep-C00H=2:l:l的比例加入EDC和NHS，反應(yīng) 5-30min用于激活肝素。3)將上述透明質(zhì)酸溶液加入到激活的肝素溶液中，攪拌5h，讓其充分反應(yīng)后，得到 肝素化透明質(zhì)酸材料(Hep-HA )。4)取0. 5g殼聚糖(chitosan, CS)溶于醋酸(0. 5%，IOml)溶液中，然后用MES緩沖 液稀釋至100ml。5)將上述肝素化透明質(zhì)酸(Ifep-HA)溶液逐步滴加到殼聚糖溶液中，混合反應(yīng)2h 后，形成乳白色粘稠懸濁液。6)將懸濁液放入透析袋(截留分子量3500)中，在純水介質(zhì)中透析2天，主要去除 其中的醋酸和鹽離子(MES，EDC，NHS)。然后在聚乙二醇20000的介質(zhì)中脫水4h，目的是濃縮樣品。7)將濃縮后的樣品吸出，倒入12孔板中塑形，隨后凍干樣品。8)將凍干后的樣品依次放入0. IM的Na2HPO4溶液中浸泡12h，換液3次，4M的NaCl 溶液浸沒12h，換液3次，純水中浸泡12h，換液3次。9)將洗滌后的樣品進(jìn)行凍干，即獲得抗凝血抗菌復(fù)合材料肝素化透明質(zhì)酸_殼聚 糖(H印-HA/CS)。將獲得的肝素化透明質(zhì)酸-殼聚糖(ifep-HA/CS)復(fù)合材料進(jìn)行抗凝血實(shí)驗(yàn)評價(jià)， 結(jié)果表明，凝血酶原時(shí)間(PT)和活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)分別超過60秒(凝血儀的最 大標(biāo)本檢查時(shí)間為60秒)。因此，該新型復(fù)合材料具有良好的抗凝作用。將獲得的肝素化透明質(zhì)酸-殼聚糖(ifep-HA/CS)復(fù)合材料進(jìn)行溶血實(shí)驗(yàn)評價(jià)。結(jié) 果表明，陰性對照中，血細(xì)胞不溶解、不脹破，溶液為無色，低速離心后，大量血細(xì)胞聚集在 離心管底部。陽性對照中，血細(xì)胞大量溶解、脹破，溶液為深紅色，低速離心后，無血細(xì)胞聚 集在離心管底部。實(shí)驗(yàn)組中，血細(xì)胞極少量溶解，溶液略顯淺紅色，低速離心后，大量血細(xì)胞 聚集在離心管底部。因此，該新型復(fù)合材料具有良好的抑制溶血功能。將獲得的肝素化透明質(zhì)酸-殼聚糖(!fep-HA/CS)復(fù)合材料進(jìn)行抗菌實(shí)驗(yàn)評價(jià)， 結(jié)果表明，肝素化透明質(zhì)酸(Ifep-HA)材料的菌落數(shù)顯著高于空白對照組，肝素化透明質(zhì) 酸-殼聚糖(ifep-HA/CS)復(fù)合材料的顯著小于空白對照組。因此，該新型復(fù)合材料具有良 好的抗金黃色葡萄球菌功能。實(shí)施例8
1)取 0. 5g 的透明質(zhì)酸(hyaluronicacid，HA)溶于 0. 05Μ、ρΗ=5· 5—6. 5 的 50ml 的 MES 緩沖溶液，均勻攪拌lh，充分溶解。2)取 0. 5g 的肝素(h印arin，H印)溶于 0. 05M、pH=5. 5—6. 5 的 50ml 的 MES 緩沖 溶液中，均勻攪拌30min后，按照EDC NHS H印_C00H=2 1 1的比例加Λ EDC和NHS，反應(yīng) 5-30min用于激活肝素。3)將上述透明質(zhì)酸溶液加入到激活的肝素溶液中，攪拌5h，讓其充分反應(yīng)后，得到 肝素化透明質(zhì)酸材料(Hep-HA )。4)取Ig殼聚糖(chitoSan，CS)溶解于醋酸(0. 5%，20ml)溶液中，然后用MES緩沖 液稀釋至100ml。5)取0. 5g精氨酸(arginine，Arg)溶于IOOml的MES緩沖溶液中，然后按照比例 EDC:NHS:Arg-C00H=2:l:l的比例加入EDC和NHS，反應(yīng)15min用于激活精氨酸的羧基，再 將殼聚糖溶液與活化的精氨酸反應(yīng)，制備帶正電荷胍基的抗菌材料(guanidine-chitosan， Gua-CS)ο6)將上述肝素化透明質(zhì)酸(!fep-HA)溶液逐步滴加到胍基化殼聚糖(Gua-CS)溶液 中，混合反應(yīng)2h后，形成乳白色粘稠懸濁液。7)將懸濁液放入透析袋(截留分子量3500)中，在純水介質(zhì)中透析2天，主要去除其中的醋酸和鹽離子(MES，EDC，NHS)。然后在聚乙二醇20000的介質(zhì)中脫水4h，目的是濃
縮樣品。8)將濃縮后的樣品吸出，倒入12孔板中塑形，隨后凍干樣品。9)將凍干后的樣品依次放入0. IM的Na2HPO4溶液中浸泡12h，換液3次，4M的NaCl溶液浸沒12h，換液3次，純水中浸泡12h，換液3次。10)將洗滌后的樣品進(jìn)行凍干，即獲得抗凝血抗菌復(fù)合材料肝素化透明質(zhì)酸_胍基殼聚糖(Hep-HA/Gua-CS )。將獲得的肝素化透明質(zhì)酸-胍基殼聚糖(!fep-HA/Gua-CS)復(fù)合材料進(jìn)行抗凝血實(shí) 驗(yàn)評價(jià)，結(jié)果表明，凝血酶原時(shí)間(PT)和活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)分別超過60秒(凝 血儀的最大標(biāo)本檢查時(shí)間為60秒)。因此，該新型復(fù)合材料具有良好的抗凝作用。將獲得的肝素化透明質(zhì)酸_胍基殼聚糖(ifep-HA/Gua-CS)復(fù)合材料進(jìn)行溶血實(shí)驗(yàn) 評價(jià)。結(jié)果表明，陰性對照中，血細(xì)胞不溶解、不脹破，溶液為無色，低速離心后，大量血細(xì)胞 聚集在離心管底部。陽性對照中，血細(xì)胞大量溶解、脹破，溶液為深紅色，低速離心后，無血 細(xì)胞聚集在離心管底部。實(shí)驗(yàn)組中，血細(xì)胞極少量溶解，溶液略顯淺紅色，低速離心后，大量 血細(xì)胞聚集在離心管底部。因此，該新型復(fù)合材料具有良好的抑制溶血功能。將獲得的肝素化透明質(zhì)酸-胍基殼聚糖(Hep-HA/Gua-CS)復(fù)合材料進(jìn)行抗菌實(shí)驗(yàn) 評價(jià)，結(jié)果表明，肝素化透明質(zhì)酸(ifep-HA)材料的菌落數(shù)顯著高于空白對照組，肝素化透明 質(zhì)酸-胍基殼聚糖(ifep-HA/Gua-CS)復(fù)合材料的極顯著小于空白對照組。因此，該新型復(fù) 合材料具有良好的抗金黃色葡萄球菌功能。實(shí)施例9
1)取 0. 5g 的透明質(zhì)酸(hyaluronicacid，HA)溶于 0. 05Μ、ρΗ=5· 5—6. 5 的 50ml 的 MES 緩沖溶液，均勻攪拌lh，充分溶解。2)取 0. 5g 的肝素(h印arin，Hep)溶于 0. 05M、pH=5. 5—6. 5 的 50ml 的 MES 緩沖 溶液中，均勻攪拌30min后，按照EDC:NHS:Hep-C00H=2:l:l的比例加入EDC和NHS，反應(yīng) 5-30min用于激活肝素。3)將上述透明質(zhì)酸溶液加入到激活的肝素溶液中，攪拌5h，讓其充分反應(yīng)后，得到 肝素化透明質(zhì)酸材料(Hep-HA )。4)取Ig殼聚糖(chitosan，CS)和Ig碘化鈉(NaI)在60mlN_甲基吡咯烷酮(NMP) 催化下60°C反應(yīng)2h，然后加入5ml，10%Na0H和5ml碘甲烷，仍在60°C反應(yīng)2h。5)將得到的樣品依次在乙醇溶液中洗滌3次，純水中洗滌3次，最后將樣品凍干， 得到季銨化殼聚糖(quaternaryammonium-chitosan，QA-CS)抗菌材料。6)將上述肝素化透明質(zhì)酸(Ifep-HA)溶液逐步滴加到季銨化殼聚糖(QA-CS)溶液 中，混合反應(yīng)2h后，形成乳白色粘稠懸濁液。7)將懸濁液放入透析袋(截留分子量3500)中，在純水介質(zhì)中透析2天，主要去除 其中的醋酸和鹽離子(MES，EDC，NHS)。然后在聚乙二醇20000的介質(zhì)中脫水4h，目的是濃
縮樣品。8)將濃縮后的樣品吸出，倒入12孔板中塑形，隨后凍干樣品。9)將凍干后的樣品依次放入0. IM的Na2HPO4溶液中浸泡12h，換液3次，4M的NaCl 溶液浸沒12h，換液3次，純水中浸泡12h，換液3次。10)將洗滌后的樣品進(jìn)行凍干，即獲得抗凝血抗菌復(fù)合材料肝素化透明質(zhì)酸_季 銨化殼聚糖(H印-HA/QA-CS )。將獲得的肝素化透明質(zhì)酸-季銨化殼聚糖(!fep-HA/QA-CS)復(fù)合材料進(jìn)行抗凝血 實(shí)驗(yàn)評價(jià)，結(jié)果表明，凝血酶原時(shí)間(PT)和活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)分別超過60秒(凝血儀的最大標(biāo)本檢查時(shí)間為60秒)。因此，該新型復(fù)合材料具有良好的抗凝作用。將獲得的肝素化透明質(zhì)酸-季銨化殼聚糖(Ifep-HA/QA-CS)復(fù)合材料進(jìn)行溶血實(shí) 驗(yàn)評價(jià)。結(jié)果表明，陰性對照中，血細(xì)胞不溶解、不脹破，溶液為無色，低速離心后，大量血細(xì) 胞聚集在離心管底部。陽性對照中，血細(xì)胞大量溶解、脹破，溶液為深紅色，低速離心后，無 血細(xì)胞聚集在離心管底部。實(shí)驗(yàn)組中，血細(xì)胞極少量溶解，溶液略顯淺紅色，低速離心后，大 量血細(xì)胞聚集在離心管底部。因此，該新型復(fù)合材料具有良好的抑制溶血功能。圖4為肝素化透明質(zhì)酸與季銨化殼聚糖復(fù)合的抗凝血抗菌材料的抗金黃色葡萄 球菌鑒定圖片。圖中A組是空白對照(基礎(chǔ)培養(yǎng)基+MES)，B組是陽性對照(肝素化透明質(zhì)酸 材料+MES+基礎(chǔ)培養(yǎng)基)，C組是實(shí)驗(yàn)組(肝素化透明質(zhì)酸與季銨化殼聚糖+MES+基礎(chǔ)培養(yǎng) 基)，B組材料支持金黃色葡萄球菌的增殖，其菌落數(shù)顯著高于對照組A，C組材料則對金黃 色葡萄球菌具有明顯的抑制效應(yīng)，其菌落數(shù)極顯著低于對照組A。因此，該新型復(fù)合材料具 有良好的抗金黃色葡萄球菌功能。實(shí)施例10
1)取 0. 5g 的海藻酸(alginicacid，AA)的鈉鹽溶于 0. 05M、pH=5. 5—6. 5 的 50ml 的 MES 緩沖溶液，均勻攪拌lh，充分溶解。2)取 0. 5g 的肝素(h印arin，H印)溶于 0. 05M、pH=5. 5—6. 5 的 50ml 的 MES 緩沖 溶液中，均勻攪拌30min后，按照EDC:NHS:Hep-C00H=2:l:l的比例加入EDC和NHS，反應(yīng) 5-30min用于激活肝素。3)將上述海藻酸鈉溶液加入到激活的肝素溶液中，攪拌5h，讓其充分反應(yīng)后，得到 肝素化海藻酸材料(Ifep-AA)。4)取0. 5g殼聚糖(chitosan, CS)溶于醋酸(0. 5%，10ml)溶液中，然后用MES緩沖 液稀釋至100ml。5)將上述肝素化海藻酸(Ifep-AA)溶液逐步滴加到殼聚糖溶液中，混合反應(yīng)2h后， 形成乳白色粘稠懸濁液。6)將懸濁液放入透析袋(截留分子量3500)中，在純水介質(zhì)中透析2天，主要去除 其中的醋酸和鹽離子(MES，EDC，NHS)。然后在聚乙二醇20000的介質(zhì)中脫水4h，目的是濃
縮樣品。7)將濃縮后的樣品吸出，倒入12孔板中塑形，隨后凍干樣品。8)將凍干后的樣品依次放入0. 1M的Na2HP04溶液中浸泡12h，換液3次，4M的NaCl 溶液浸沒12h，換液3次，純水中浸泡12h，換液3次。9)將洗滌后的樣品進(jìn)行凍干，即獲得抗凝血抗菌復(fù)合材料肝素化海藻酸_殼聚糖 (Ifep-AA/CS)。將獲得的肝素化海藻酸-殼聚糖(Hep-AA/CS)復(fù)合材料進(jìn)行抗凝血實(shí)驗(yàn)評價(jià)，結(jié) 果表明，凝血酶原時(shí)間(PT)和活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)分別超過60秒(凝血儀的最大 標(biāo)本檢查時(shí)間為60秒)。因此，該新型復(fù)合材料具有良好的抗凝作用。將獲得的肝素化海藻酸-殼聚糖(Hep-AA/CS)復(fù)合材料進(jìn)行溶血實(shí)驗(yàn)評價(jià)。結(jié)果 表明，陰性對照中，血細(xì)胞不溶解、不脹破，溶液為無色，低速離心后，大量血細(xì)胞聚集在離 心管底部。陽性對照中，血細(xì)胞大量溶解、脹破，溶液為深紅色，低速離心后，無血細(xì)胞聚集 在離心管底部。實(shí)驗(yàn)組中，血細(xì)胞極少量溶解，溶液略顯淺紅色，低速離心后，大量血細(xì)胞聚集在離心管底部。因此，該新型復(fù)合材料具有良好的抑制溶血功能。將獲得的肝素化海藻酸_殼聚糖(Hep-AA/CS)復(fù)合材料進(jìn)行抗菌實(shí)驗(yàn)評價(jià)，結(jié)果 表明，肝素化海藻酸(Hep-AA)材料的菌落數(shù)顯著高于空白對照組，肝素化海藻酸-殼聚糖 (Ifep-AA/CS)復(fù)合材料的顯著小于空白對照組。因此，該新型復(fù)合材料具有良好的抗金黃色 葡萄球菌功能。實(shí)施例11
1)取 0. 5g 的海藻酸(alginicacid，AA)的鈉鹽溶于 0. 05M、pH=5. 5—6. 5 的 50ml 的 MES 緩沖溶液，均勻攪拌lh，充分溶解。2)取 0. 5g 的肝素(h印arin，Hep)溶于 0. 05M、pH=5. 5—6. 5 的 50ml 的 MES 緩沖 溶液中，均勻攪拌30min后，按照EDC:NHS:Hep-C00H=2:l:l的比例加入EDC和NHS，反應(yīng) 5-30min用于激活肝素。3)將上述海藻酸鈉溶液加入到激活的肝素溶液中，攪拌5h，讓其充分反應(yīng)后，得到 肝素化海藻酸材料(Ifep-AA)。4)取lg殼聚糖(chitoSan，CS)溶解于醋酸(0. 5%，20ml)溶液中，然后用MES緩沖 液稀釋至100ml。5)取0. 5g精氨酸(arginine，Arg)溶于100ml的MES緩沖溶液中，然后按照比例 EDC:NHS:Arg-C00H=2:l:l的比例加入EDC和NHS，反應(yīng)15min用于激活精氨酸的羧基，再 將殼聚糖溶液與活化的精氨酸反應(yīng)，制備帶正電荷胍基的抗菌材料(guanidine-chitosan， Gua_CS)06)將上述肝素化海藻酸(Ifep-AA)溶液逐步滴加到胍基化殼聚糖(Gua-CS)溶液 中，混合反應(yīng)2h后，形成乳白色粘稠懸濁液。7)將懸濁液放入透析袋(截留分子量3500)中，在純水介質(zhì)中透析2天，主要去除 其中的醋酸和鹽離子(MES，EDC，NHS)。然后在聚乙二醇20000的介質(zhì)中脫水4h，目的是濃
縮樣品。8)將濃縮后的樣品吸出，倒入12孔板中塑形，隨后凍干樣品。9)將凍干后的樣品依次放入0. 1M的Na2HP04溶液中浸泡12h，換液3次，4M的NaCl 溶液浸沒12h，換液3次，純水中浸泡12h，換液3次。10)將洗滌后的樣品進(jìn)行凍干，即獲得抗凝血抗菌復(fù)合材料肝素化海藻酸_胍基 殼聚糖(Hep-AA/Gua-CS )。將獲得的肝素化海藻酸-胍基殼聚糖(Hep-AA/Gua-CS)復(fù)合材料進(jìn)行抗凝血實(shí)驗(yàn) 評價(jià)，結(jié)果表明，凝血酶原時(shí)間(PT)和活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)分別超過60秒(凝血 儀的最大標(biāo)本檢查時(shí)間為60秒)。因此，該新型復(fù)合材料具有良好的抗凝作用。將獲得的肝素化海藻酸-胍基殼聚糖(Hep-AA/Gua-CS)復(fù)合材料進(jìn)行溶血實(shí)驗(yàn)評 價(jià)。結(jié)果表明，陰性對照中，血細(xì)胞不溶解、不脹破，溶液為無色，低速離心后，大量血細(xì)胞聚 集在離心管底部。陽性對照中，血細(xì)胞大量溶解、脹破，溶液為深紅色，低速離心后，無血細(xì) 胞聚集在離心管底部。實(shí)驗(yàn)組中，血細(xì)胞極少量溶解，溶液略顯淺紅色，低速離心后，大量血 細(xì)胞聚集在離心管底部。因此，該新型復(fù)合材料具有良好的抑制溶血功能。將獲得的肝素化海藻酸-胍基殼聚糖(Hep-AA/Gua-CS)復(fù)合材料進(jìn)行抗菌實(shí)驗(yàn) 評價(jià)，結(jié)果表明，肝素化海藻酸(H印-AA)材料的菌落數(shù)顯著高于空白對照組，肝素化海藻酸-胍基殼聚糖(Ifep-AA/Gua-CS)復(fù)合材料的極顯著小于空白對照組。因此，該新型復(fù)合 材料具有良好的抗金黃色葡萄球菌功能。實(shí)施例12
1)取 0. 5g 的海藻酸(alginicacid，AA)的鈉鹽溶于 0. 05M、pH=5. 5—6. 5 的 50ml 的 MES 緩沖溶液，均勻攪拌lh，充分溶解。2)取 0. 5g 的肝素(h印arin，Hep)溶于 0. 05M、pH=5. 5—6. 5 的 50ml 的 MES 緩沖 溶液中，均勻攪拌30min后，按照EDC:NHS:Hep-C00H=2:l:l的比例加入EDC和NHS，反應(yīng) 5-30min用于激活肝素。3)將上述海藻酸鈉溶液加入到激活的肝素溶液中，攪拌5h，讓其充分反應(yīng)后，得到 肝素化海藻酸材料(Ifep-AA)。4)取lg殼聚糖(chitosan，CS)和lg碘化鈉(Nal)在60mlN_甲基吡咯烷酮(NMP) 催化下60°C反應(yīng)2h，然后加入5ml，10%Na0H和5ml碘甲烷，仍在60°C反應(yīng)2h。5)將得到的樣品依次在乙醇溶液中洗滌3次，純水中洗滌3次，最后將樣品凍干， 得到季銨化殼聚糖(quaternaryammonium-chitosan，QA-CS)抗菌材料。6)將上述肝素化海藻酸(Ifep-AA)溶液逐步滴加到季銨化殼聚糖(QA-CS)溶液中， 混合反應(yīng)2h后，形成乳白色粘稠懸濁液。7)將懸濁液放入透析袋(截留分子量3500)中，在純水介質(zhì)中透析2天，主要去除其中 的醋酸和鹽離子(MES，EDC, NHS)。然后在聚乙二醇20000的介質(zhì)中脫水4h，目的是濃縮樣品。8)將濃縮后的樣品吸出，倒入12孔板中塑形，隨后凍干樣品。9)將凍干后的樣品依次放入0. 1M的Na2HP04溶液中浸泡12h，換液3次，4M的NaCl 溶液浸沒12h，換液3次，純水中浸泡12h，換液3次。10)將洗滌后的樣品進(jìn)行凍干，即獲得抗凝血抗菌復(fù)合材料肝素化海藻酸_季銨 化殼聚糖(H印-AA/QA-CS )。將獲得的肝素化海藻酸_季銨化殼聚糖(Hep-AA/QA-CS)復(fù)合材料進(jìn)行抗凝血實(shí) 驗(yàn)評價(jià)，結(jié)果表明，凝血酶原時(shí)間(PT)和活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)分別超過60秒(凝 血儀的最大標(biāo)本檢查時(shí)間為60秒)。因此，該新型復(fù)合材料具有良好的抗凝作用。將獲得的肝素化海藻酸-季銨化殼聚糖(Hep-AA/QA-CS)復(fù)合材料進(jìn)行溶血實(shí)驗(yàn) 評價(jià)。結(jié)果表明，陰性對照中，血細(xì)胞不溶解、不脹破，溶液為無色，低速離心后，大量血細(xì)胞 聚集在離心管底部。陽性對照中，血細(xì)胞大量溶解、脹破，溶液為深紅色，低速離心后，無血 細(xì)胞聚集在離心管底部。實(shí)驗(yàn)組中，血細(xì)胞極少量溶解，溶液略顯淺紅色，低速離心后，大量 血細(xì)胞聚集在離心管底部。因此，該新型復(fù)合材料具有良好的抑制溶血功能。將獲得的肝素化海藻酸-季銨化殼聚糖(Hep-AA/QA-CS)復(fù)合材料進(jìn)行抗菌實(shí)驗(yàn) 評價(jià)，結(jié)果表明，肝素化海藻酸(H印-AA)材料的菌落數(shù)顯著高于空白對照組，肝素化海藻 酸-季銨化殼聚糖(H印-AA/QA-CS)復(fù)合材料的顯著小于空白對照組。因此，該新型復(fù)合材 料具有良好的抗金黃色葡萄球菌功能。最后所應(yīng)說明的是，以上具體實(shí)施方式
僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制， 盡管參照較佳實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對 本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均 應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。
權(quán)利要求
一種抗凝血抗菌生物醫(yī)用材料，其特征在于，它是對含有氨基的天然生物材料(H2N-R)通過化學(xué)共價(jià)接枝方法進(jìn)行肝素化，得到表達(dá)式為C26H41N2O36S5-HN-R的肝素化抗凝血材料與以殼聚糖為基材的抗菌材料混合制備的復(fù)合材料。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗凝血抗菌生物醫(yī)用材料，其特征在于，所述含有氨基的天 然生物材料為絲素蛋白、膠原蛋白、透明質(zhì)酸、海藻酸中的任何一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗凝血抗菌生物醫(yī)用材料，其特征在于，所述以殼聚糖為基 材的抗菌材料為殼聚糖、胍季化殼聚糖、季銨化殼聚糖中的任何一種。
4.一種制備如權(quán)利要求1所述的抗凝血抗菌生物醫(yī)用材料的方法，其特征在于，該方 法包括以下步驟步驟1、通過碳酰二亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺(EDC/NHS)的縮肽交聯(lián)法將肝素接枝到上 述含有氨基的天然生物材料分子上，制備所述肝素化抗凝血材料；步驟2、準(zhǔn)備以殼聚糖為基材的抗菌材料，包括殼聚糖、季銨化殼聚糖、胍基化殼聚糖中 的任何一種；步驟3、將所述肝素化抗凝血材料與抗菌材料按質(zhì)量比為(1 士0. 5) (1 士0. 5)混合制 成抗凝血抗菌復(fù)合材料。
5.一種制備如權(quán)利要求4所述的抗凝血抗菌生物醫(yī)用材料的方法，其特征在于，該方 法包括步驟4、將抗凝血抗菌復(fù)合材料進(jìn)行冷凍干燥，保存?zhèn)溆谩?br> 6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗凝血抗菌生物醫(yī)用材料的方法，其特征在于包括以下步 驟將肝素的羧基Ofep-COOH)在2- (N-嗎啉代)乙磺酸(MES)緩沖液中通過所述EDC/NHS 激活，在肝素的羧基被激活5-30分鐘后，與所述含有氨基的天然生物材料中的氨基發(fā)生 縮肽反應(yīng)，其中 EDC:NHS:!fep-C00H=2:l 1，MES 緩沖液的 pH 值是 5. 5—6. 5。
全文摘要
本發(fā)明具體涉及一種抗凝血抗菌生物醫(yī)用材料及其制備方法，該抗凝血抗菌材料是對含有氨基的天然生物材料通過化學(xué)共價(jià)接枝方法進(jìn)行肝素化，得到肝素化抗凝血材料與以殼聚糖為底材的抗菌材料混合制備的復(fù)合材料。本發(fā)明的抗凝血抗菌雙功能材料不僅具有良好的血液相容性，還具有很好的抗金黃色葡萄球菌的功能，該新型材料首次兼顧抗凝血與抗菌雙重功能，在臨床血管修復(fù)中具有廣泛應(yīng)用前景。
文檔編號A61L33/10GK101837149SQ20101020258
公開日2010年9月22日 申請日期2010年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月18日
發(fā)明者劉群, 張勝民, 王江林 申請人:華中科技大學(xué)