專利名稱：黃臘果皂苷類成分及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種藥物原料的提取制備方法及其應(yīng)用，具體涉 及黃臘果皂苷類成分的制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
黃臘果(Stauntonia brachyanthera Hand-Mazz)為木通科野木瓜屬植物，在我國 貴州、廣西等省(區(qū))有分布，為常綠木質(zhì)藤本，其莖在民間主要作木通藥用，具有清熱利 尿、通經(jīng)活絡(luò)、鎮(zhèn)痛排膿、通乳等功效，與木通功效相同；果實(shí)形態(tài)與預(yù)知子基本相同，不同 點(diǎn)在于預(yù)知子成熟后開裂，故又名八月扎、羊開口，黃臘果成熟后不開裂，色黃，民間也把其 當(dāng)作預(yù)知子藥用；果皮含有眾多石細(xì)胞，民間用于結(jié)石。葉在民間亦入藥，用于外感風(fēng)寒，頭 痛胸悶，吐瀉腹脹，黃臘果整個(gè)植物都具有一定的藥用價(jià)值。(謝宗萬、余友芩.全國中草藥 名鑒(上冊(cè))[M].北京人民衛(wèi)生出版社，1996:176.)有關(guān)黃臘果的開發(fā)與利用近年來越來越受到人們的重視。因?yàn)樗粌H具有很好的 藥用價(jià)值，而且其果實(shí)也是一種有高營養(yǎng)價(jià)值的美味水果。目前以有報(bào)道將其果實(shí)開發(fā)成 黃臘果醋，其莖作為木通入藥(汪冶，陳超，梅樹模。侗藥豬腰子(黃臘果)藤莖的生藥學(xué) 鑒定。)但迄今為止，其在化學(xué)研究領(lǐng)域仍是一片空白，本專利將是首次對(duì)該植物進(jìn)行化學(xué) 成分分離，分析和研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一系列以齊墩果烷型、降甲基齊墩果烷型和羽扇豆烷型為母 核的三萜苷元及其糖苷類化合物，其母核結(jié)構(gòu)如下
齊墩果烷型降甲基齊墩果烷型羽扇豆烷型本發(fā)明的另一個(gè)目的在于應(yīng)用簡(jiǎn)便、安全、價(jià)廉和實(shí)用的方法制備黃臘果皂苷類 成分，并說明其應(yīng)用，該方法能制備純度較高的一系列以齊墩果烷型和降甲基齊墩果烷型 為母核的三萜類化合物。本發(fā)明目的的實(shí)現(xiàn)方式如下(1)黃臘果原料粗粉1千克，用12倍，10倍和8倍的20% 95%的乙醇溶液80°C 下溫浸提取三次(第一次3小時(shí)，第二次2小時(shí)，第三次2小時(shí))或超聲提取，過濾，合并濾 液，濃縮至1升總提取液。(2)將總提取液采用下述a)或b)方法之一對(duì)有效部位進(jìn)行富集
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a將上述總提取液按大孔吸附樹脂藥材為1 1的比例上已處理好的非極性或 弱極性大孔吸附樹脂柱層析分離，采用梯度洗脫法，依次用水、40%、70%、90%的含水乙醇 或甲醇洗脫，每個(gè)梯度洗脫4 10個(gè)柱床體積，合并洗脫液，過濾，濃縮至1升，得黃臘果乙 醇洗脫液。b.將上述總提取液按藥材正丁醇為1 1的比例，用0. 5-3倍體積的水飽和正
丁醇萃取3-8次，合并正丁醇，得黃臘果正丁醇萃取液。(3)將上述乙醇洗脫液或正丁醇萃取液經(jīng)氧化鎂脫色，按每升80克加入氧化鎂回 流脫色1小時(shí)，過濾，濾液經(jīng)減壓濃縮、真空干燥得黃臘果總皂苷。(4)將上述黃臘果總皂苷經(jīng)正相硅膠柱色譜法、反相柱色譜法、制備高效液相色 譜法中的一種方法或多種方法聯(lián)合使用，可除去雜質(zhì)，純化，得到所需的三萜類單體化合物 及其純度更高的總皂苷混合物。一般以不同比列的氯仿-甲醇或丙酮-甲醇作為洗脫劑 洗脫，可得到部分三萜單體及三萜混合物，如將黃臘果總皂苷提取液經(jīng)正丁醇萃取、氧化 鎂脫色后，用硅膠柱色譜法以二氯甲烷和甲醇為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，在二氯甲烷甲醇 =100 5得到一新天然產(chǎn)物3-0- α -L-吡喃阿拉伯糖_3_0去甲齊墩果-12 20 (29) - 二 稀-28-羧酸，在二氯甲烷甲醇=100 8得到一單體化合物胡蘿卜苷。(5)將從黃臘果中分離得到的皂苷類單體或混合物單獨(dú)或與其它藥物組合作為原 料藥應(yīng)用于抗腫瘤、抗炎、利尿和相關(guān)疾病治療的藥劑中。上述濃縮操作可采用常規(guī)濃縮和減壓濃縮，干燥可采用50°C下常規(guī)干燥、真空干 燥、噴霧干燥或冷凍干燥。步驟⑵中的大孔吸附樹脂選用非極性樹脂(XAD-4，Diaion HP-20，D101、D102、 D401，Dl、D2、D3、D4，HPD-100，X-5)、弱極性樹脂(D-201，HPD-300，AB-8)和中等極性 (XAD-6、XAD-7、XAD-8 等)的吸附樹脂。步驟(4)中正相硅膠色譜柱所使用的流動(dòng)相可以是氯仿或二氯甲烷和甲醇，采用 氯仿或二氯甲烷甲醇=50 1 1 1的比例梯度洗脫；反相色譜柱的填料可為RP-18， RP-8或RP-2.；所述的高效液相制備方法所使用的流動(dòng)相為5% 95%的含水甲醇；高效 液相色譜柱的填料為八烷基硅烷鍵合硅膠或十八烷基硅烷鍵合硅膠。本方法為首次對(duì)黃臘果植物中的化學(xué)成分進(jìn)行分離、純化和醫(yī)藥用途等方面的研 究，應(yīng)用本方法得到的黃臘果總皂苷提取物的收率為23%以上，總皂苷的含量大于35%， 含量測(cè)定方法可采用香草醛_硫酸法。本發(fā)明采用水或是含水乙醇提取、經(jīng)大孔樹脂或正丁醇富集、純化和氧化鎂脫色 這樣一套完整的工藝方法實(shí)現(xiàn)黃臘果總皂苷提取物的制備，同時(shí)，還可使用正相硅膠柱色 譜法、0DS、和制備高效液相色譜法中的一種或幾種，對(duì)其總皂苷進(jìn)一步分離和純化，以提高 皂苷純度，進(jìn)一步得到一系列以齊墩果烷型、降甲基齊墩果烷型和羽扇豆烷型為母核的三 萜苷元單體及其糖苷類的皂苷類混合物以及單體化合物。提取物可以單獨(dú)或與其它藥物組 合作為原料藥應(yīng)用于抗腫瘤、抗炎、利尿和相關(guān)疾病治療的藥劑中。另外，本發(fā)明步驟(2)中有兩種不同的方法從黃臘果中提取黃臘果總皂苷，每種 方法都有各自的特點(diǎn)和適用情況，提取時(shí)可根據(jù)已有的設(shè)備條件和提取量的多少盡量選擇 價(jià)廉，安全，適合的提取方法。本發(fā)明黃臘果皂苷類成分制備方法的提取分離效率高，黃臘果總皂苷含量高，還可進(jìn)一步得到單體化合物并保持高的生理活性，方法簡(jiǎn)單易行、可操作性強(qiáng)，易于實(shí)現(xiàn)工業(yè) 化大生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式下面的實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明予以進(jìn)一步的說明，但并不因此而限制本發(fā)明。實(shí)施例一黃臘果根粗粉1公斤，用12倍，10倍和8倍的70%醇80°C下溫浸提取三次，(第 一次3小時(shí)，第二次2小時(shí)，第三次2小時(shí))過濾，合并濾液，回收溶劑或蒸干至濃縮至1升， 根據(jù)大孔吸附樹脂與藥材量按1 1的比例上大孔吸附樹脂(HPD100)柱層析分離，采用梯 度洗脫法，依次用水、40%的含水醇、70%的含水醇、90%的含水乙醇洗脫，每個(gè)梯度洗8個(gè) 保留體積，合并乙醇洗脫液，用氧化鎂脫色，按每升80克加入氧化鎂回流脫色1小時(shí)，過濾， 濾液經(jīng)減壓濃縮、干燥得黃臘果總皂苷170g(收率17% )，將上述富集的黃臘果總皂苷采用 正相硅膠柱色譜法進(jìn)一步分離和純化，以不同比列的氯仿_甲醇或丙酮_甲醇作為洗脫劑 洗脫，可得到部分三萜單體及三萜混合物。如以氯仿一甲醇進(jìn)行梯度洗脫，在氯仿甲醇= 5 1處得到一單體化合物，為一已知化合物，白色粉末，易溶于甲醇，紫外燈下無熒光也無 暗斑，硫酸顯色后為紫紅色，在1H-NMR的高場(chǎng)區(qū)出現(xiàn)五個(gè)單峰甲基信號(hào)δ 0. 85，0. 93，1. 07， 1. 14，1. 19 (5 X CH3) ,13C-NMR中，出現(xiàn)29個(gè)碳信號(hào)，其中含有降齊墩果烷型特征的兩組雙鍵 碳信號(hào)以及一個(gè)羰基信號(hào)，經(jīng)1H-NMR和13C-NMR鑒定為3_0_ α -L-吡喃阿拉伯糖_30_去甲 齊墩果-12 20 (29)-二稀-28-羧酸-28-0-β-D-吡喃葡萄糖(1_6) - β-D-吡喃葡萄糖酯。 將上述三萜混合物進(jìn)一步采用反向色譜柱(以RP-IS(ODS)，RP-8或RP-2. RP為填料)或高 效液相制備柱(以RP-18或RP-8為填料)以含水甲醇為流動(dòng)相進(jìn)一步進(jìn)行分離和純化，以 得到具有活性的一系列以齊墩果烷型和降甲基齊墩果烷型為母核的三萜類化合物。將黃臘 果皂苷類單體成分或其化合物單獨(dú)或與其它藥物組合作為原料藥應(yīng)用于抗腫瘤、抗炎、利 尿和相關(guān)疾病治療的藥劑中。實(shí)施例二黃臘果莖粗粉1公斤，用10倍，8倍和6倍的60%醇60°C下溫浸提取三次，(第一 次3小時(shí)，第二次2小時(shí)，第三次2小時(shí))過濾，合并濾液，回收溶劑或蒸干至濃縮至1升， 將上述總提取液按藥材正丁醇為1 1的比例，用0.5-3倍體積的水飽和正丁醇萃取3-8 次，合并正丁醇，得黃臘果正丁醇萃取液。用氧化鎂脫色，按每升80克加入氧化鎂回流脫 色1小時(shí)，過濾，濾液經(jīng)減壓濃縮、干燥得黃臘果總皂苷182g(收率18. 2% )，將上述富集 的黃臘果總皂苷采用正相硅膠柱色譜法進(jìn)一步分離和純化，以不同比列的氯仿_甲醇或丙 酮-甲醇作為洗脫劑洗脫，可得到部分三萜單體及三萜混合物。如將黃臘果總皂苷提取液 經(jīng)正丁醇萃取、氧化鎂脫色后，用硅膠柱色譜法以二氯甲烷_甲醇為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫， 在二氯甲烷甲醇=100 5得到一新化合物，白色粉末，溶于氯仿和甲醇的混合液，紫外 燈下無熒光也無暗斑，硫酸顯色后為紫紅色，在1H-NMR中出現(xiàn)五個(gè)單峰甲基信號(hào)δ 0. 90， 0. 97，1. 10，1. 22，1. 28 (5 X CH3)，13C-NMR中，出現(xiàn)29個(gè)碳信號(hào)，其中含有降齊墩果烷型特征 的兩組雙鍵碳信號(hào)以及一個(gè)羰基信號(hào)，經(jīng)1H-NMR和13C-NMR鑒定為3_0_ α -L-吡喃阿拉伯 糖-3-0去甲齊墩果-12,20(29)-二稀-28-羧酸，在二氯甲烷甲醇=100 8得到一單體 化合物，白色粉末，Molish反應(yīng)陽性，Liebermann-Burchard反應(yīng)呈陽性，經(jīng)與已知化合物對(duì)照比較為胡蘿卜苷，將二氯甲烷甲醇=100 5的一個(gè)流分再次用硅膠柱色譜法以石 油醚-丙酮為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，在石油醚丙酮=100 5處得到一單體化合物，為一 已知化合物，白色針狀結(jié)晶(CHC13)，mp. 252 253°C，Liebermann-Burchard反應(yīng)呈陽性， 1H-NMR (400MHz, CDCl3) d 4. 68 (1H, s，H_29)，4· 58 (1H, s，H_29)，3· 18，(1H, dd, J = 11. 5Hz, H-3)，3. 81 (1H, ABdd, J = 10. 8Hz, H-28)，3. 33 (1H, ABdd, J = 10. 8Hz, H-28)，2. 38 (1H, m, H-19), 1. 68 (3H, s，30_Me)，0. 75，0. 82，0. 98，0. 99，1. 02 (3HX 5，s，23，24，25，26，27_Me)； 13C-NMR(75MHz, DMS0_d6)譜中，共給出 30 個(gè)碳信號(hào)，其中 79. 0 (C-3) 60. 5 (C-28)，δ 150. 5, 109. 8為一對(duì)雙鍵碳信號(hào)，綜合以上理化性質(zhì)和波譜數(shù)據(jù)分析，鑒定為白樺脂醇。在石油 醚丙酮=100 6處得到一單體化合物，為一已知化合物，褐色無定形粉末。硫酸顯 色后為紫紅色，。ESI-MS給出準(zhǔn)分子離子峰m/z456 ([M]+, 5) 1H-NMR (500MHz，C5D5N) d 譜 中給出 5. 45 (1H, m, H-12)，3· 47(1，t, J = 7. 8Hz, Η-3), 3. 30 (1Η, dd, J = 4· 5，13. 9Hz, Η-18)，1. 30 (3Η, s, Me-27) ,0. 86，0· 97，1. 02，1. 04，1. 20(3ΗΧ6, s，23，24，25，26，29， 30Me) 13C-WR (125MHz，C5D5N) d 30個(gè)碳信號(hào)，包括8個(gè)季碳信號(hào)、9個(gè)CH碳信號(hào)、12個(gè)CH碳 信號(hào)、6個(gè)CH3碳信號(hào)。δ 180. 1為連氧羰基碳信號(hào)。δ144.8、122.6構(gòu)成烯鍵。結(jié)合結(jié)核 碳譜、氫譜化學(xué)位移，綜合分析其核磁數(shù)據(jù)鑒定為齊墩果酸。將上述三萜混合物采用反向色 譜柱(以RP-18 (ODS)，RP-8或RP-2. RP為填料)或高效液相制備柱(以RP-18或RP-8為 填料)以含水甲醇為流動(dòng)相進(jìn)一步進(jìn)行分離和純化，以得到具有活性的一系列以齊墩果烷 型和降甲基齊墩果烷型為母核的三萜類化合物。將黃臘果皂苷類單體成分或其化合物單獨(dú) 或與其它藥物組合作為原料藥應(yīng)用于抗腫瘤、抗炎、利尿和相關(guān)疾病治療的藥劑中。實(shí)施例三黃臘果葉粗粉1公斤，用8倍，6倍和6倍的65%醇80°C下溫浸提取三次，(第一次 3小時(shí)，第二次2小時(shí)，第三次2小時(shí))過濾，合并濾液，回收溶劑或蒸干至濃縮至1升，根據(jù) 大孔吸附樹脂與藥材量按1 1的比例上大孔吸附樹脂(HPDlOO)柱層析分離，采用梯度洗 脫法，依次用水、40%的含水醇、70%的含水醇、90%的含水乙醇洗脫，每個(gè)梯度洗9個(gè)保留 體積，合并乙醇洗脫液，用氧化鎂脫色，按每升80克加入氧化鎂回流脫色1小時(shí)，過濾，濾液 經(jīng)減壓濃縮、干燥得黃臘果總皂苷120g(收率12% )，將上述富集的黃臘果總皂苷采用正相 硅膠柱色譜法進(jìn)一步分離和純化，以不同比列的氯仿-甲醇或丙酮-甲醇作為洗脫劑洗脫， 可得到部分三萜單體及三萜混合物。將上述三萜混合物采用反向色譜柱(以RP-IS(ODS)， RP-8或RP-2. RP為填料)或高效液相制備柱(以RP-18或RP-8為填料)以含水甲醇為流 動(dòng)相進(jìn)一步進(jìn)行分離和純化，以得到具有活性的一系列以齊墩果烷型和降甲基齊墩果烷型 為母核的三萜類化合物。將黃臘果皂苷類單體成分或其化合物單獨(dú)或與其它藥物組合作為 原料藥應(yīng)用于抗腫瘤、抗炎、利尿和相關(guān)疾病治療的藥劑中。實(shí)施例四黃臘果果皮粗粉1公斤，用12倍，10倍和6倍的70%醇60°C下溫浸提取三次， (第一次3小時(shí)，第二次2小時(shí)，第三次2小時(shí))過濾，合并濾液，回收溶劑或蒸干至濃縮至 1升，根據(jù)大孔吸附樹脂與藥材量按1 1的比例上大孔吸附樹脂(HPD100)柱層析分離，采 用梯度洗脫法，依次用水、40%的含水醇、70%的含水醇、90%的含水乙醇洗脫，每個(gè)梯度洗 9個(gè)保留體積，合并乙醇洗脫液，用氧化鎂脫色，按每升80克加入氧化鎂回流脫色1小時(shí)，過 濾，濾液經(jīng)減壓濃縮、干燥得黃臘果總皂苷143g(收率14. 3% )，將上述富集的黃臘果總皂
7苷采用正相硅膠柱色譜法進(jìn)一步分離和純化，以不同比列的氯仿_甲醇或丙酮_甲醇作為 洗脫劑洗脫，可得到部分三萜單體及三萜混合物。將上述三萜混合物采用反向色譜柱(以 RP-18 (ODS)，RP-8或RP-2. RP為填料)或高效液相制備柱(以RP-18或RP-8為填料)以 含水甲醇為流動(dòng)相進(jìn)一步進(jìn)行分離和純化，以得到具有活性的一系列以齊墩果烷型和降甲 基齊墩果烷型為母核的三萜類化合物。將黃臘果皂苷類單體成分或其化合物單獨(dú)或與其它 藥物組合作為原料藥應(yīng)用于抗腫瘤、抗炎、利尿和相關(guān)疾病治療的藥劑中。實(shí)施例五黃臘果果肉粗粉1公斤，用12倍，10倍和6倍的70%醇60°C下溫浸提取三次， (第一次3小時(shí)，第二次2小時(shí)，第三次2小時(shí))過濾，合并濾液，回收溶劑或蒸干至濃縮至 1升，根據(jù)大孔吸附樹脂與藥材量按1 1的比例上大孔吸附樹脂(HPD100)柱層析分離，采 用梯度洗脫法，依次用水、40%的含水醇、70%的含水醇、90%的含水乙醇洗脫，每個(gè)梯度洗 9個(gè)保留體積，合并乙醇洗脫液，用氧化鎂脫色，按每升80克加入氧化鎂回流脫色1小時(shí)，過 濾，濾液經(jīng)減壓濃縮、干燥得黃臘果總皂苷150g(收率15% )，將上述富集的黃臘果總皂苷 采用正相硅膠柱色譜法進(jìn)一步分離和純化，以不同比列的氯仿_甲醇或丙酮_甲醇作為洗 脫劑洗脫，可得到部分三萜單體及三萜混合物。將上述三萜混合物采用反向色譜柱(一般 以RP-18 (ODS)，RP-8或RP_2. RP為填料)或高效液相制備柱(一般以RP-18或RP-8為填 料)以含水甲醇為流動(dòng)相進(jìn)一步進(jìn)行分離和純化，以得到具有活性的一系列以齊墩果烷型 和降甲基齊墩果烷型為母核的三萜類化合物。將黃臘果皂苷類單體成分或其化合物單獨(dú)或 與其它藥物組合作為原料藥應(yīng)用于抗腫瘤、抗炎、利尿和相關(guān)疾病治療的藥劑中。實(shí)施例六黃臘果種子中皂苷類成分、制備方法及其應(yīng)用黃臘果種子1公斤，用12倍，10倍和8倍的70%醇80°C下溫浸提取三次，(第一 次3小時(shí)，第二次2小時(shí)，第三次2小時(shí))過濾，合并濾液，回收溶劑或蒸干至濃縮至1升， 用正丁醇萃取，按藥材量與正丁醇用量比例為1 1的比例萃取5次，黃臘果總皂苷主要富 集于正丁醇層，合并正丁醇萃取液，用氧化鎂脫色，按每升80克加入氧化鎂回流脫色1小 時(shí)，過濾，濾液經(jīng)減壓濃縮、干燥得黃臘果總皂苷80g(收率8% )將上述富集的黃臘果總皂 苷采用正相硅膠柱色譜法進(jìn)一步分離和純化，以不同比列的氯仿_甲醇或丙酮_甲醇作為 洗脫劑洗脫，可得到部分三萜單體及三萜混合物。將上述三萜混合物采用反向色譜柱(以 RP-18 (ODS)，RP-8或RP-2. RP為填料)或高效液相制備柱(以RP-18或RP-8為填料)以 含水甲醇為流動(dòng)相進(jìn)一步進(jìn)行分離和純化，以得到具有活性的一系列以齊墩果烷型和降甲 基齊墩果烷型為母核的三萜類化合物。將黃臘果皂苷類單體成分或其化合物單獨(dú)或與其它 藥物組合作為原料藥應(yīng)用于抗腫瘤、抗炎、利尿和相關(guān)疾病治療的藥劑中。實(shí)施例七黃臘果粗粉1公斤，用10倍，8倍和8倍量的水40°C下溫浸，75%的醇提取三次，每 次2小時(shí)，過濾，合并濾液，靜止12小時(shí)，濾取上清液，濃縮至1升，上大孔吸附樹脂AB8柱， 依次用水、30 %的含水醇、60 %的含水醇、90 %的含水乙醇洗脫，每個(gè)梯度洗8個(gè)保留體積， 合并乙醇洗脫液，用氧化鎂脫色，按每升80克加入氧化鎂回流脫色1小時(shí)，過濾，濾液經(jīng)減 壓濃縮、干燥得黃臘果總皂苷180g(收率18% )，將上述富集的黃臘果總皂苷采用正相硅膠 柱色譜法進(jìn)一步分離和純化，一般以不同比列的氯仿-甲醇或丙酮-甲醇作為洗脫劑洗脫， 可的到部分三萜單體及三萜混合物。將上述三萜混合物采用反向色譜柱(以RP-IS(ODS)，RP-8或RP-2. RP為填料)或高效液相制備柱(以RP-18或RP-8為填料)以含水甲醇為流 動(dòng)相進(jìn)一步進(jìn)行分離和純化，以得到具有活性的一系列以齊墩果烷型和降甲基齊墩果烷型 為母核的三萜類化合物。將黃臘果皂苷類單體成分或其化合物單獨(dú)或與其它藥物組合作為 原料藥應(yīng)用于抗腫瘤、抗炎、利尿和相關(guān)疾病治療的藥劑中。實(shí)施例八黃臘果粗粉1公斤，用12倍，10倍和8倍的70%乙醇80°C下溫浸提取三次，(第一 次3小時(shí)，第二次2小時(shí)，第三次2小時(shí))過濾，合并濾液，回收溶劑或蒸干至濃縮至1升，用 正丁醇萃取，按藥材量與正丁醇用量比例為1 1的比例萃取4次，黃臘果總皂苷主要富集 于正丁醇層，合并正丁醇萃取液，用氧化鎂脫色，按每升80克加入氧化鎂回流脫色1小時(shí)， 過濾，濾液經(jīng)減壓濃縮、干燥得黃臘果總皂苷165g(收率16. 5% )將上述富集的黃臘果總 皂苷采用正相硅膠柱色譜法進(jìn)一步分離和純化，一般以不同比列的氯仿_甲醇或丙酮_甲 醇作為洗脫劑洗脫，可的到部分三萜單體及三萜混合物。將上述三萜混合物采用反向色譜 柱(以RP-18 (ODS)，RP-8或RP_2. RP為填料)或高效液相制備柱(以RP-18或RP-8為填 料)以含水甲醇為流動(dòng)相進(jìn)一步進(jìn)行分離和純化，以一系列以齊墩果烷型和降甲基齊墩果 烷型為母核的三萜類化合物。將黃臘果皂苷類單體成分或其化合物單獨(dú)或與其它藥物組合 作為原料藥應(yīng)用于抗腫瘤、抗炎、利尿和相關(guān)疾病治療的藥劑中。實(shí)施例九從黃臘果中分離的總皂苷及部分三萜類化合物的體外抗腫瘤活性的測(cè) 定取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的六種人體腫瘤細(xì)胞(人急性髓性白血病細(xì)胞株(HL-60)、人前列 腺癌細(xì)胞株(PC-3MIE8)、人胃癌細(xì)胞株(BGC-823)、人乳腺癌細(xì)胞株(MDA-MB-435)、人肝癌 細(xì)胞株(Bel-7402)、人宮頸癌細(xì)胞株(HeLa))，以內(nèi)含10% (ν/ν)胎牛血清(fetal bovine serum)的RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋為5 X IO4個(gè)/L的細(xì)胞懸浮液，接種于96孔板中，100 μ L/ 孔，置于37°C、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。樣品用DMSO溶解后，用含10% (ν/ν) 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋。將上述含藥培養(yǎng)液加入96孔板中，放置于與細(xì)胞培養(yǎng) 相同條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。MTT法操作流程如下接種細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)(24h)，藥物處理(48h)，加MTT染色(4h)， 離心除去上清液，加DMSO溶解，酶標(biāo)儀570nm下測(cè)定OD值。數(shù)據(jù)分析按照以下方法計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=[1-給藥組OD值/對(duì)照組OD 值]X100%。采用LOGIT法計(jì)算藥物半數(shù)抑制濃度(IC5tl)。試驗(yàn)結(jié)果如表1中所示。表 1
9 備注樣品為不同純度的總皂苷。包括大孔吸附樹脂不同洗脫部位和柱層析不同 洗脫部位的皂苷(齊墩果烷型、降甲基齊墩果烷型和羽扇豆烷型)。實(shí)施例十從黃臘果中分離的總皂苷及部分三萜類化合物的體外抗炎活性的測(cè)定小鼠腹腔注射15mg/ml玉米淀粉鹽水溶液1. 5ml/只，3天后取腹腔巨嗜細(xì)胞，以內(nèi) 含10% (ν/ν)胎牛血清(FCS)的RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋為IX IO6個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，接種 于96孔平底培養(yǎng)板中，100μ Ι/well，置于37°C、飽和濕度、0.050)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2h細(xì)胞 貼壁后，去除未貼壁的細(xì)胞，加入20 μ 1/ml脂多糖(LPS)IOy 1/well，然后再加入不同濃度 的待測(cè)藥物0. lml/well，每濃度3個(gè)復(fù)孔，以及空白對(duì)照組(LPS)。之后置于37°C、飽和濕 度、0. 05C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，取上清液，待測(cè)。(1)對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞NO合成與釋放的抑制作用取待測(cè)上清夜接種于96孔平底培養(yǎng)板中，100 μ 1/well ；ΙΟΟμΜ的NaNO2等倍稀 釋于96孔平底培養(yǎng)板中為標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照(陽性對(duì)照)；以含10% (ν/ν)胎牛血清(FCS)的 RPMI-1640培養(yǎng)液為陰性對(duì)照。均設(shè)兩個(gè)復(fù)孔。0.2%的N-I-萘基乙二胺雙氯化物溶液 (NED)與0. 2%的磺胺溶液(SA)等體積混合配成Gress試劑，每孔中加入0. ImlGress試劑， 混合均勻，IOmin后于550nm波長(zhǎng)下測(cè)OD值。試驗(yàn)結(jié)果按下面公式計(jì)算抑制率(IR)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。Inhibition rate (IR) %= (0DLPS-0Dsample) / (0DLPS-0Dnegative control) X 100% ；表 2
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備注樣品為不同純度的總皂苷。包括大孔吸附樹脂不同洗脫部位和柱層析不同 洗脫部位的皂苷(齊墩果烷型、降甲基齊墩果烷型和羽扇豆烷型)。(2)對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TNF-α合成與釋放的抑制作用取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L929細(xì)胞，用0. 1 %胰蛋白酶及0. 02% EDTA混合液消化。用含 10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至2 X IO5個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，接種于96孔 平底培養(yǎng)板中，100 μ 1/well，置于37°C、飽和濕度、0. 05C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，吸去上清 液，每孔分別加入0. Iml倍比稀釋后的各濃度TNF標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)上清夜，各設(shè)3個(gè)復(fù)孔，陰 性對(duì)照組為1640培養(yǎng)液，空白對(duì)照組為磷酸鹽緩沖液(PBS)，同時(shí)向各孔加入0. 05ml的放 線菌素D(0. 5-1 μ g/ml)，37°C、飽和濕度、0. 05C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后離心棄上清 液，潤(rùn)洗、MTT染色，570nm下測(cè)OD值。試驗(yàn)結(jié)果按下面公式計(jì)算抑制率(IR)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。Inhibition rate (IR) % = (0DLPS_0Dsample) / (0DLPS_。Dnegative control) X 100 %表 3 備注樣品為不同純度的總皂苷。包括大孔吸附樹脂不同洗脫部位和柱層析不同 洗脫部位的皂苷(齊墩果烷型、降甲基齊墩果烷型和羽扇豆烷型)。實(shí)施例十一從黃臘果中分離的總皂苷體內(nèi)抗炎活性
(1)黃臘果總皂苷對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的抑制作用昆明種小鼠60只，18-22g，雌雄各半，隨機(jī)分為5組，每組12只，分別為空白對(duì)照 組、總皂苷、吲哚美辛組；實(shí)驗(yàn)各組給藥劑量見Table 4. 9，分別ig給藥，連續(xù)7天，第7天 給藥后lh，于小鼠右耳兩面涂二甲苯25 μ 1，左耳不涂為正常耳，2h后，脫頸椎處死，用直徑 Srarn打孔器打下左耳和右耳同一部位的圓片，于扭力天平上稱重，計(jì)算耳腫脹率及抑制率。 結(jié)果見表 4Edema Rate (ER) (%) = [Right Ear (mg) -Left ear (mg) ] /Left Ear (mg) X100% Inhibitory Rate(IR) (% ) = (ERcontrol-ERsamples) /ERcontrol X 100%表4 *P < 0. 05，**P < 0. 01 vs control, Duncan test(2)黃臘果總皂苷對(duì)小鼠棉球肉芽腫增生的抑制作用昆明種小鼠60只，18-22g，雌雄各半，隨機(jī)分為5組，每組12只，分組及給藥劑量 見Table 4. 10 ；實(shí)驗(yàn)各組分別ig給藥，連續(xù)7天，在給藥第一日手術(shù)植入IOmg滅菌棉球 (每個(gè)棉球含1000U青霉素和1000U鏈霉素)，第8天脫頸椎處死小鼠，剝離肉芽組織，并于 60°C烘箱中烘12h，稱重，計(jì)算肉芽腫重。試驗(yàn)結(jié)果見表5表 5 **P < 0. 01, ***P < 0. 001 vs control, Duncan test(3)黃臘果總皂苷對(duì)增高小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的作用昆明種小鼠60只，18_22g，雌雄各半，隨機(jī)分為5組，每組12只，按Table4. 11 分組和給藥；實(shí)驗(yàn)各組分別ig給藥，連續(xù)7天，第7天給藥后lh，iv伊文思蘭NS溶液 0. lml/10g(2 % )，立即ipO. 6 %醋酸0. 2ml/只，20min后，脫頸椎處死小鼠，剪開腹腔，用 5mlNS溶液沖洗腹腔數(shù)次，收集洗滌液，定容為10ml，離心IOOOrpmX 5min，在721分光光度 計(jì)590nm處測(cè)定吸光度值。試驗(yàn)結(jié)果見表6表6
**P < 0. 01，***P < 0. 001 vs control, Duncan test實(shí)施例十二從黃蠟果中分離的總皂苷利尿活性取180 200g雄性大鼠，預(yù)試，選取經(jīng)水灌胃(2. 5mL/100g)后2h內(nèi)排尿量達(dá)到 灌胃量40%以上的大鼠40只，隨機(jī)分為生理鹽水組、藥物高、中、低劑量組，將各組大鼠分 別放入代謝籠中，每籠2只，體重相近。實(shí)驗(yàn)前禁食24h，生理鹽水組和各個(gè)給藥組的灌胃水 負(fù)荷量均為2. 5mL/100g體重。給藥后在代謝籠下放置量筒，連續(xù)收集6h尿量，記錄尿量體 積(mL)，結(jié)果見表7。 表7黃臘果總皂苷大鼠的利尿作用(η = 10，χ士s)
P < 0. 0權(quán)利要求
一類黃臘果皂苷類成分，其特征在于該成分是一系列以齊墩果烷型、降甲基齊墩果烷型和羽扇豆烷型為母核的三萜苷元及其糖苷類化合物，其母核結(jié)構(gòu)如下FSA00000136474700011.tif
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一類黃臘果皂苷類成分，其特征在于若母核為齊墩果 燒型時(shí)，R1 是 α -OH, β -OH, α -OAC 或 β -OAC, R2 是-CH3, -CHO, -CH2OH,或 _C00H，R3 是-CH3, -C00H, -CH2OH, R4是-H或α / β -OH ； 11、12位形成環(huán)氧結(jié)構(gòu)；13位與28位形成內(nèi)酯結(jié)構(gòu)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一類黃臘果皂苷類成分，其特征在于若母核為降甲基齊 墩果烷型時(shí)，R1 是 α -0Η, β -OH, α -OAC 或 β -OAC, R2 是-CH3, -CHO, -CH2OH,或-C00H，R3 是-CH3, -COOH,或-CH2OH。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一類黃臘果皂苷類成分，其特征在于若母核為羽扇豆烷型 時(shí)，R1 是 α -0Η, β -OH, α -OAC, β -OAC,或在 3 位形成酮羰基，R2 是 _CH3，-CHO, -CH2OH, 或-C00H，R3 是-CH3, -COOH,或 _CH20H。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或3或4所述的一類黃臘果皂苷類成分，其特征在于在C-3，C-23， C-24，C-28位連接糖片段成苷，糖的數(shù)目為1-7個(gè)，糖的種類為呋糖，葡萄糖醛酸，葡萄糖， 阿拉伯糖，半乳糖，木糖，鼠李糖，甘露糖，阿洛糖，來蘇糖，核糖，果糖，糖的類型是呋喃糖或 吡喃糖，糖之間的連接方式有1-2位連接，1-4位連接，1-3位連接和1-6位連接的一種或多 種；呋糖上可有一個(gè)或二個(gè)酰基取代，?；〈愋椭饕獮橐阴；?或當(dāng)歸?；?或惕 恪?；?。
6.一種如權(quán)利要求1所述的黃臘果皂苷類成分的制備方法，其特征在于所述的黃臘 果總皂苷的制備方法如下(1)將新鮮或干燥的黃臘果原料，粉碎成粗粉，用10%-95%的含水乙醇溶液熱提取或 乙醇溶液超聲提取，過濾、濃縮、得總提取液。(2)將總提取液采用下述a)或b)方法之一對(duì)有效部位進(jìn)行富集a.將上述總提取液過以處理好的非極性或弱極性大孔吸附樹脂，依次用水和不同濃度 的含水乙醇溶液或含水甲醇溶液梯度洗脫，每個(gè)梯度洗脫4-10個(gè)柱床體積，合并洗脫液， 濃縮，得乙醇洗脫液；b.將上述總提取液用0.5-3倍體積的水飽和正丁醇萃取3-8次，合并正丁醇，得正丁醇 萃取液；(3)將上述乙醇洗脫液或正丁醇萃取液經(jīng)氧化鎂脫色，過濾，濾液經(jīng)減壓濃縮、真空干 燥得黃臘果總皂苷；(4)將上述黃臘果總皂苷經(jīng)正相硅膠柱色譜法、反相柱色譜法、制備高效液相色譜法中 的一種方法或多種方法聯(lián)合使用，可除去雜質(zhì)，純化，得到所需的三萜類單體化合物及其混合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的黃臘果皂苷類成分的制備方法，其特征在于黃臘果原料包括 黃蠟果的根、莖、葉、果實(shí)和種子。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的黃臘果皂苷類成分的制備方法，其特征在于步驟(1)所用 的有機(jī)溶劑包括甲醇、乙醇、含水甲醇、含水乙醇或含水丙酮中的一種或多種。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述黃臘果皂苷類成分的制備方法，其特征在于步驟(1)所用的 提取方法有加熱提取和超聲提取。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的黃臘果皂苷類成分的制備方法及其應(yīng)用，其特征在于步驟 (2)大孔吸附樹脂選自 XAD-4, Diaion HP-20，DlOl、D102、D401, Dl、D2、D3、D4, HPD-100, X-5、D-201, HPD-300, AB-8XAD-6、XAD-7、XAD-8、HPD400、HPD 600 中的一種。
11.根據(jù)權(quán)利要求6所述的黃臘果皂苷類成分的制備方法，其特征在于步驟(3)中所 選用的氧化鎂為輕質(zhì)氧化鎂。
12.根據(jù)權(quán)利要求6所述的黃臘果皂苷類成分的制備方法，其特征在于步驟(4)中正 相硅膠色譜柱所使用的流動(dòng)相可以是氯仿或二氯甲烷和甲醇，采用氯仿或二氯甲烷甲醇 =50 1 1 1的比例梯度洗脫。
13.根據(jù)權(quán)利要求2所述的黃臘果皂苷類成分的制備方法，其特征在于步驟(4)中反 相色譜柱的填料可為RP-18，RP-8或RP-2.
14.根據(jù)權(quán)利要求2所述的黃臘果皂苷類成分的制備方法，其特征在于步驟(4)中所 述的高效液相制備方法所使用的流動(dòng)相為5% 95%的含水甲醇。
15.根據(jù)權(quán)利要求2所述的黃臘果皂苷類成分的制備方法，其特征在于步驟(4)中高 效液相色譜柱的填料為八烷基硅烷鍵合硅膠或十八烷基硅烷鍵合硅膠。
16.根據(jù)權(quán)利要求6所述的黃臘果皂苷類成分的制備方法，其特征在于濃縮可采用常 規(guī)濃縮和減壓濃縮，干燥可采用50°C下常規(guī)干燥、真空干燥、噴霧干燥或冷凍干燥。
17.權(quán)利要求1所述的黃臘果皂苷類成分在制備抗腫瘤、抗炎、利尿和相關(guān)疾病治療的 藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及黃臘果皂苷類成分、制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明所述的方法是指通過用水或不同濃度的有機(jī)溶劑對(duì)黃臘果進(jìn)行提取，過濾，回收溶劑得濃縮液，濃縮液經(jīng)大孔吸附樹脂，用水和有機(jī)溶劑進(jìn)行洗脫，回收溶劑得總皂苷，或采用萃取的方法從正丁醇層中到總皂苷，再進(jìn)一步使用正相硅膠柱、反相柱和制備高效液相系統(tǒng)對(duì)總皂苷進(jìn)行分離和純化，最終得到具有顯著活性的單體或化合物。應(yīng)用本發(fā)明所制備的黃臘果皂苷類成分可以單獨(dú)或與其它藥物組合作為原料藥應(yīng)用于抗腫瘤、抗炎、利尿及其相關(guān)疾病治療的藥劑中。本方法所制備的皂苷類成分純度高，藥理作用顯著，方法簡(jiǎn)便、實(shí)用、廉價(jià)、安全、適合工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A61P29/00GK101880306SQ20101019651
公開日2010年11月10日 申請(qǐng)日期2010年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月10日
發(fā)明者孟大力, 李寧, 李銑, 耿劍亮, 陳超 申請(qǐng)人:沈陽藥科大學(xué)