專利名稱：人纖溶酶原Kringle 5短肽、其藥物組合物、用途和編碼該種短肽的多核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種人纖溶酶原Kringle來源的小分子多肽、其藥物組合物、用途和編碼該種短肽的多核苷酸。
背景技術(shù)：
在健康人體中，血管生成(vasculogenesis)主要發(fā)生在胚胎早期，成年機(jī)體的血管新生不如胚胎時(shí)期旺盛和普遍，血管新生的速度在生理狀態(tài)下也遠(yuǎn)比病理狀態(tài)下緩慢，這與體內(nèi)存在血管新生抑制因子有關(guān)，這些抑制因子主要包括血管新生抑制素 (angiostatin)，內(nèi)皮生成抑素(endostatin)，組織金屬蛋白酶抑制物(tissue inhibitor ofmetalloproteinase, T IMP), II .^ S S (thrombospondin, TSP) >Bl HC (Plasminogen)和血小板因子 4(platelet factor-4, PF-4)等。新生血管異常增生是許多重大疾病的病因和/或重要病理特征，由其引起的全身組織及器官的損害是目前最為棘手的醫(yī)學(xué)難題之一，包括角膜新生血管增生，糖尿病性視網(wǎng)膜病變甚至失明，腫瘤的新生血管異常增生，以及銀屑病的啟動(dòng)因素真皮乳頭微血管異常增生等，具體說明如下角膜新生血管增生角膜新生血管依然是目前最常見的致盲原因之一。正常角膜組織透明，無血管，周圍血管終止于角膜緣，形成血管網(wǎng)，營養(yǎng)成分由此擴(kuò)散入角膜。無血管是角膜的主要特征，也是維持角膜透明的重要條件。在病理狀態(tài)下，新生毛細(xì)血管由角膜緣處侵入角膜內(nèi)，稱為角膜新生血管，主要與角膜水腫、促血管生成因子增加、抑制血管生成因子減少、炎癥反應(yīng)、缺氧以及角膜神經(jīng)損傷等有關(guān)。糖尿病性視網(wǎng)膜病變糖尿病是一種內(nèi)分泌代謝病，白內(nèi)障、視網(wǎng)膜病變、暫時(shí)性屈光不正、眼外肌麻痹等病變是糖尿病晚期嚴(yán)重并發(fā)癥。據(jù)報(bào)道，病程在5年以下者眼底改變?yōu)?8% 39%，病程5 10年者發(fā)病率為50% 56. 7 %，10年以上者發(fā)病率增至 69% 90%。糖尿病可導(dǎo)致視網(wǎng)膜上出現(xiàn)廣泛的新生血管，新增血管可以生長在視網(wǎng)膜表層或視神經(jīng)上。這些未成長的血管比正常血管脆弱，容易破裂使血液流入玻璃體中視網(wǎng)膜反復(fù)出血，棉絮狀滲出增多，嚴(yán)重?fù)p害視力。晚期或嚴(yán)重病例，可反復(fù)發(fā)生大量的玻璃體出血，引起視網(wǎng)膜脫離，最后導(dǎo)致失明。腫瘤的新生血管異常增生腫瘤的發(fā)生是多種原因作用的結(jié)果，而新生血管異常增生則大大促進(jìn)了腫瘤的增殖速度及惡化程度。大體上，腫瘤生長的階段可以分為以下兩種第一種是無血管期的腫瘤，主要依靠周圍組織的彌散作用來獲取營養(yǎng)物質(zhì)和排泄代謝產(chǎn)物，所以明顯限制了其生長速度；腫瘤直徑不超過1 2mm，甚至?xí)L時(shí)間地潛伏在組織中而無明顯進(jìn)展。第二種是血管期腫瘤，瘤內(nèi)出現(xiàn)新生毛細(xì)血管并獲得進(jìn)一步生長的能力， 腫瘤從而迅速生長并發(fā)生轉(zhuǎn)移。纖溶酶原由5個(gè)Kringle組成，在血液中每一個(gè)Kringle都具有較強(qiáng)的抑制新生血管生成活性，這其中，人纖溶酶原Kringle5 (Human Plasminogen Kringle 5，K5)作為引人注目的抑制血管生成蛋白，是目前發(fā)現(xiàn)的抑制新生血管活性最強(qiáng)的纖溶酶原 (Plasminogen)片段，其具有生物活性強(qiáng)、高度的細(xì)胞特異性、分子量小、性質(zhì)比較穩(wěn)定等諸多的顯著優(yōu)點(diǎn)(1 3)，現(xiàn)已證實(shí)，K5在新生血管性疾病如實(shí)體瘤0，5)、糖尿病性視網(wǎng)膜增生(6)等疾病治療中具有潛在的應(yīng)用前景，另，根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)報(bào)道，K5的多肽序列PRKLYDY 可能是K5蛋白與其受體GRP-78相互作用位點(diǎn)，提示其潛在的抗血管生成活性(7)。但是傳統(tǒng)的K5存在酵母系統(tǒng)生產(chǎn)工藝復(fù)雜、生產(chǎn)成本昂貴、應(yīng)用劑量大，伴隨潛在的毒副作用等缺陷，嚴(yán)重制約著K5在臨床中的應(yīng)用。參考文獻(xiàn)1. Cao. Y, Chen. A. An, S. S. Ji, R. W, Davidson. D and Llinas. Μ. Kringle 5 of plasminogenis a novel inhibitor of endothelial cell growth. J Biol Chem, 272(36) 22924-22928，1997.2. W. R. Ji, L. G. Barrientos, M. Llinas, H. Gray, X. Villarreal, M. E. DeFord, F.J.Castellino, R. A. Kramer and P.A.Trail.Selective inhibition by kringle 5 of human plasminogen onendothelial cell migration, an important process in angiogenesis. Biochem Biophys ResCommun,247(2) :414-419,1998.3. Soff, G. A. Angiostatin and angios tat in-related proteins. Cancer Metastasis Rev,19(1-2) :97-107,2000.4.Davidson DJ, Haskell C, Majest S,et al. Kringle 5 of human plasminogen inducesapoptosis of endothelial and tumor cells through surface-expressed glucose-regulated protein 78. Cancer Res, 65 :4663-72,2005.5. Perri SR, Nalbantoglu J, Annabi B, et al. Plasminogen kringle 5-engineered glioma cellsblock migration of tumor-associated macrophages and suppress tumor vascularization andprogression. Cancer Res, 65 :8359-65,2005.6. Zhihong Zhang, Jian-xing Ma, Guoquan Gao, Chaoyang Li, Lihui Luo, MeiZhang, Wenzhao Yang, Aihua Jiang, Wenhui Kuang, Liying Xu, Jiaqi Chen, and Zuguo Liu.Plasminogen Kringle 5 Inhibits Alkali-Burn-Induced Corneal Neovascularization. InvestOphthalmol Vis Sci. 46 :4062-4071,2005.7.Davidson DJ,Haskell C,Maj est S,Kherzai A,Egan DA,Walter KA,Schneider A, Gubbins EF, Solomon L, Chen Z, Lesniewski R, Henkin J. Kringle 5 of Human Plasminogeninduces Apoptosis of Endothelial and Tumor Cells through Surface-Ex pressedGlucose-Regulated Protein 78. Cancer Res. 2005 Jun 1 ；65(11) :4663-72.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種人纖溶酶原Kringle 5短肽，以解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題。本發(fā)明使用小片段多肽合成來代替繁瑣的K5蛋白表達(dá)純化工藝，并獲得了一種高活性、經(jīng)濟(jì)的新型多肽類藥物。本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下一種人纖溶酶原Kringle 5短肽，其特征在于它包含如SEQ ID NO :1所示氨基酸序列的多肽。
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我們通過生物信息學(xué)的方法，研究纖溶酶原(Plasminogen)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，了解多肽中哪些氨基酸系列是活性所必需的，申請(qǐng)人通過查詢NCBI數(shù)據(jù)庫，找出人類(Homosapiens)，小鼠(Mus musculus)，普通牛(Bos taurus)，褐家鼠(Rattus norvegicus)， M (Macaca mulatta)，H H H (Pan troglodytes), 3 ^ H (Danio rerio)，原雞(Gallusgallus)，家犬(Canis familiar is)等八種種屬的纖溶酶原 (Plasminogen)的全長序列，并分別比較八種種屬間五個(gè)kringle的同源性，發(fā)現(xiàn)各種種屬間都分別具有保守的Asn-Tyr-Cys-Arg-Asn-Pro-Asp (即NYCRNPD)序列，具體如圖1中所示。另外，申請(qǐng)人還通過比較人纖溶酶原(Plasminogen)的五種kringle之間同源性，發(fā)現(xiàn)氨基酸序列NYCRNPD在人的五個(gè)kringle環(huán)中也是高度保守，具體如圖2中所示。另外，此段序列位于kringle環(huán)二級(jí)結(jié)構(gòu)的中心位置，對(duì)纖溶酶原蛋白維持活性構(gòu)象的形式起著重要作用。NYCRNPD序列的結(jié)構(gòu)式如圖3中所示。上述人纖溶酶原Kringle 5短肽NYCRNPD可利用美國PTZ儀器總公司的多肽合成儀(PS3)合成，其脫保護(hù)劑為哌啶與DMF的混合液，活化劑為0. 4當(dāng)量的NMM的DMF溶液； 裂解液為TFA、苯甲硫醚、水等的混合溶液。合成的多肽用乙醚反復(fù)沖洗沉淀。合成后的短肽NYCRNPD采用以下的步驟對(duì)其進(jìn)行氨基酸序列分析首先使用苯異硫氰酸酯(PITC)在pH9. O的堿性條件下對(duì)蛋白質(zhì)或多肽進(jìn)行處理，PITC與肽鏈的N-端的氨基酸殘基反應(yīng)，形成PTC-肽。然后PTC-肽用三氟乙酸處理，N-端氨基酸殘基肽鍵被有選擇地切斷，釋放出該氨基酸殘基的噻唑啉酮苯胺衍生物。接下來將該衍生物用有機(jī)溶劑從反應(yīng)液中萃取出來，而去掉了一個(gè)N-端氨基酸殘基的肽仍留在溶液中。萃取出來的噻唑啉酮苯胺衍生物經(jīng)酸作用，再進(jìn)一步環(huán)化，形成一個(gè)穩(wěn)定的PTH-氨基酸。留在溶液中的減少了一個(gè)氨基酸殘基的肽再重復(fù)進(jìn)行上述反應(yīng)過程，整個(gè)測序過程都是通過測序儀自動(dòng)進(jìn)行。我們測定了短肽NYCRNPD序列的HMNR、HPLC、MS圖譜，具體如圖4、5和6中所示。本發(fā)明的另一目的是提供一種多核苷酸，該多核苷酸包含編碼如SEQ ID NO 1所示氨基酸序列的多核苷酸。本發(fā)明的又一目的是提供一種藥物組合物，該藥物組合物含有治療或預(yù)防有效量的如SEQ ID NO :1所示氨基酸序列的多肽和含有至少一種的藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明的再一目的是提供上述人纖溶酶原Kringle 5短肽在用于制備抗新生血管生成藥物中的用途。涉及上述人纖溶酶原Kringle 5短肽在應(yīng)用于制備治療角膜新生血管增生、視網(wǎng)膜新生血管及腫瘤等血管生成性疾病藥物中的用途。除非特別指明，這里所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語的含義與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域一般技術(shù)人員通常所理解的含義相同。同樣，所有在此提及的出版物、專利申請(qǐng)、專利及其他參考資料均引入本發(fā)明作為參考。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下的特點(diǎn)1)本發(fā)明使用小片段多肽合成來代替繁瑣的K5蛋白表達(dá)純化工藝，并獲得了一種高活性、經(jīng)濟(jì)的新型多肽類藥物；2)本發(fā)明通過生物信息學(xué)方法模擬纖溶酶原Kringle中保守的氨基酸序列，合成短肽NH3-NYCRNPD-C00H，并通過人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)增殖實(shí)驗(yàn)證明，NYCRNPD多肽可以有效抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖(見圖7)，并通過HUVEC細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)證明，NYCRNPD多肽可以有效抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移(見圖8)，此外，還通過雞胚尿囊膜(CAM)實(shí)驗(yàn)證明，NYCRNPD多肽可以明顯抑制尿囊膜新生血管生成(見圖9)。與人纖溶酶原Kringle 5比較，發(fā)現(xiàn)其具有更強(qiáng)的內(nèi)皮細(xì)胞遷移及新生血管生成抑制作用，具有合成簡便、經(jīng)濟(jì)等顯著優(yōu)點(diǎn)。


圖1. DNAMAN對(duì)纖溶酶原八種種屬間五個(gè)kringle環(huán)的同源性分析；圖2. DNAMAN對(duì)人纖溶酶原中五個(gè)kringle序列的同源性分析；圖3為NYCRNPD序列的結(jié)構(gòu)式；圖4為NYCRNPD序列的HMNR圖譜；圖5為NYCRNPD序列的HPLC圖譜；圖6為NYCRNPD序列的MS圖譜；圖7顯示了采用MTT法檢測K5短肽對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖影響；圖8顯示了采用遷移水平檢測K5短肽對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的影響；圖9顯示了采用CAM assay法檢測0. 5nmolK5短肽對(duì)雞胚尿囊膜血管生成的影響。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述，但不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的任何限制。實(shí)施例通過體外實(shí)驗(yàn)檢測K5短肽NYCRNPD的抗血管生成活性，實(shí)驗(yàn)中又加入了已報(bào)道的另一段多肽PRKLYDY做為陽性對(duì)照。(I)HUVEC增殖試驗(yàn)原代培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，接種在96孔板中(5000個(gè)/孔)，于37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h，待其貼壁后，分別向培養(yǎng)基中加入500nM K5、 NYCRNPD及PRKLYDY，PBS為陰性對(duì)照，培養(yǎng)箱孵育48h，用MTT標(biāo)準(zhǔn)方法檢測存活的內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果如圖7，與對(duì)照組相比，K5及其多肽均具有顯著的抑制HUVEC細(xì)胞增殖作用， 抑制率分別為65. 3%、43. 0%和46. 8%，和對(duì)照組相比，三種蛋白均具有顯著性差異(*P < 0. 05)，各蛋白之間活性相似，無顯著性差異。(2)內(nèi)皮細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)遷移實(shí)驗(yàn)所用的材料為美國millpore公司生產(chǎn)的 transwell，上室加無血清培養(yǎng)基，下室加完全培養(yǎng)基。原代培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，接種在transwell上室中(2. 0萬個(gè)/孔)，分別向上室中加入K5、NYCRNPD及 PRKLYDY,終濃度為250nM，PBS為陰性對(duì)照，于37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)Mh。以棉花輕輕擦去上室中殘留的未遷移細(xì)胞，結(jié)晶紫染色30min，顯微鏡下計(jì)數(shù)遷移至下層的HUVEC細(xì)胞數(shù)。結(jié)果如圖8，與對(duì)照相比，K5、NYCRNPD及PRKLYDY均顯著抑制HUVEC細(xì)胞遷移，抑制率分別為 72.0%,77.4%,82.9%,和對(duì)照組相比，三種蛋白均具有顯著性差異(*P < 0. 05)，各蛋白之間活性相似，無顯著性差異。(3)雞胚尿囊膜試驗(yàn)種蛋尖端消毒，打開并吸出1. 0 1. 5ml蛋清，膠帶封口，在 37°C培養(yǎng)箱(保持一定的濕度)蛋架上孵育7天，雞蛋每天旋轉(zhuǎn)三次。孵育第7天，在種蛋鈍端消毒后用無菌的眼科剪開一 1. 5X1. 5cm窗口，剝除殼膜后暴露雞胚尿囊膜，將6mm直徑大小的滅菌濾紙片放置于血管部位，用微量加樣器將10 μ 1 0. 05ηΜ的Κ5及其短肽NYCRNPD及PRKLYDY滴入滅菌濾紙片中，陰性對(duì)照組用等體積無菌PBS緩沖液。用無菌透明膠帶封窗后放入孵化箱，37°C繼續(xù)孵化48小時(shí)。去除膠帶，打開鈍端蛋殼，加入aiil甲醇和丙酮等體積混合液，室溫放置15min，剪下雞胚尿囊膜拍照，分析給藥區(qū)血管形成情況。結(jié)果如圖9 中所示，與對(duì)照組相比，K5及多肽NYCRNPD及PRKLYDY對(duì)新生血管均有顯著的抑制作用。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。序列表<110> 金光輝<120>人纖溶酶原Kringle 5短肽、其藥物組合物、用途和編碼該種短肽的多核苷酸<160>1<210>1<211>7bp<212>PRT<213>人工合成<400>1Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp權(quán)利要求
1.一種人纖溶酶原Kringle 5短肽，其特征在于它包含如SEQ ID NO 1所示氨基酸序列的多肽。
2.一種多核苷酸，該多核苷酸包含編碼如SEQ ID NO :1所示氨基酸序列的多核苷酸。
3.—種藥物組合物，該藥物組合物含有治療或預(yù)防有效量的如SEQ ID NO :1所示氨基酸序列的多肽和含有至少一種的藥學(xué)上可接受的載體。
4.權(quán)利要求1中的人纖溶酶原Kringle5短肽在用于制備抗新生血管生成藥物中的用途。
5.權(quán)利要求1中的人纖溶酶原Kringle5短肽在用于制備治療角膜新生血管增生、視網(wǎng)膜新生血管及腫瘤等血管生成性疾病藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人纖溶酶原Kringle 5短肽、其藥物組合物、用途和編碼該種短肽的多核苷酸，該種短肽為包含如SEQ ID NO1所示氨基酸序列的多肽，其與人纖溶酶原Kringle 5相比較，具有更強(qiáng)的內(nèi)皮細(xì)胞遷移及新生血管生成抑制作用，并具有合成簡便、經(jīng)濟(jì)等顯著優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61P27/02GK102250210SQ20101017992
公開日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2010年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月21日
發(fā)明者劉祖國, 張秀麗, 朱鉉, 鄭紅花, 金光輝 申請(qǐng)人:金光輝