專利名稱：：以海豹油為液相基質(zhì)的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及海豹油制備的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體體系的應(yīng)用，主要涉及納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體在加強藥物穩(wěn)定性，緩釋效果及改變藥物體內(nèi)藥代動力學(xué)過程中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體(Nanostructuredlipidcarriers，NLC)是由固體脂質(zhì)納米粒發(fā)展而來。固體脂質(zhì)納米粒(Solidlipidnanoparticles,SLN)，是以固態(tài)的天然或合成的類脂如卵磷脂、三脂肪酰甘油等為載體，將藥物包裹于類脂核中，經(jīng)不同方法制成的粒徑在50IOOOnm之間的納米給藥體系。與一些傳統(tǒng)的載體系統(tǒng)脂質(zhì)體和微乳相比，藥物由于被包封于生理相容性好的固體骨架中而實現(xiàn)了更好的控釋和緩釋效果，同時由于其使用生物相容的類脂作為載體基質(zhì)，因此大大減少了產(chǎn)生急、慢性毒性的危險。盡管如此，SLN仍然有它的局限性如載藥量低、突釋效應(yīng)以及物理穩(wěn)定性差。由于單一固體脂質(zhì)基質(zhì)會形成脂質(zhì)晶體，限制了它的載藥能力，并且會逐漸向完美晶體轉(zhuǎn)變，從而導(dǎo)致貯存過程中藥物被排擠出晶格，這些缺點導(dǎo)致了納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體(NanostructuredLipidCarrier,NLC)的出現(xiàn)。NLC與SLN的不同之處在于NLC是由幾種不同結(jié)構(gòu)，互不混溶(熔點不同)的固液脂質(zhì)混合物制備而成的一種具有特殊結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)填充體系。液體脂質(zhì)的加入，可擾亂固體脂質(zhì)規(guī)則的晶格結(jié)構(gòu)，增加納米粒結(jié)構(gòu)中不規(guī)則晶型的比例，使包封藥物的空間容量增加，進而提高載體的載藥能力，并防止藥物泄漏。NLC也繼承了SLN的一些優(yōu)點，如生理相容性好、保護藥物不受化學(xué)降解(包括作為防曬劑)、可大規(guī)模制備、成本低廉，并可將其制成片齊U、丸劑、膠囊以及粉劑以滿足各種需要。通過控制液體脂質(zhì)比例，還可使NLC在體溫下保持固體骨架結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)NLC藥物的控制釋放。海豹油是近些年來備受人們關(guān)注的富含ω-3不飽和脂肪酸的動物油，被用于人體保健與免疫調(diào)節(jié)。其富含高比例的ω-3不飽和脂肪酸，EPA、DPA和DHA，低含量的維生素K及低比例的氧化和反式脂肪酸?；诤１鸵陨咸攸c，我們考慮選用海豹油作為制備納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的液相基質(zhì)，以期得到具有良好效果的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體。全反式維甲酸(ATRA)，是維生素A在體內(nèi)代謝誕生的衍生物，最早由ArensJF和VanDorp于1946年在體外成功合成。維甲酸具有很強的誘導(dǎo)分化腫瘤細(xì)胞作用，備受國際國內(nèi)醫(yī)藥界的關(guān)注，是目前治療急性早幼粒細(xì)胞白血病、骨髓異常增生(白血病前期)的臨床首選藥物。維甲酸具有支持生長，促進上皮分化，抑制細(xì)胞增殖等作用，并能對多種腫瘤細(xì)胞的生長及分化產(chǎn)生作用，是一種比較理想的抗細(xì)胞增殖藥物。同時臨床用于治療痤瘡、扁平苔蘚、白斑、多發(fā)性尋常疣及其它角化性皮膚病也有顯著療效。維甲酸為黃色或淡橙色的結(jié)晶性粉末，在水中幾乎不溶，同時在光照、熱和一些氧化條件下很不穩(wěn)定，影響了藥物的臨床使用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的一提供一種具有光穩(wěn)定性的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體。本發(fā)明的目的二提供載有維甲酸的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備方法。本發(fā)明的目的三以海豹油作為液相基質(zhì)的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體。本發(fā)明的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體，由固相基質(zhì)和液相基質(zhì)組成，其中固相基質(zhì)為卵磷脂和飽和脂肪酸，液相基質(zhì)為海洋生物脂肪。其中所述飽和脂肪酸為已知結(jié)構(gòu)的分子式為=CH3(CH2)nCH2COOH的物質(zhì)，其中η為5、7、9、11、13或15，優(yōu)選正癸酸或月桂酸，其中所述海洋生物脂肪為海豹油。其中固相基質(zhì)占0.02-32%(w/V)，液相基質(zhì)占0.02-32%(w/V)，貯存30天之內(nèi)粒徑在100-500nm,多分散性指數(shù)P.I.在0.15-0.30，Zeta電位在-25—50mV。優(yōu)選的，所述載體材料中含固相基質(zhì)20-80%(W/W)，含液相基質(zhì)20-80%(W/W)。更加優(yōu)選的所述載體材料中含固相基質(zhì)40-60%(W/W)，含液相基質(zhì)40-60%(W/W)。本發(fā)明的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備方法包括如下步驟稱量固相基質(zhì)和液相基質(zhì)，混合均勻，加入含有吐溫80的PBS，攪拌至形成預(yù)乳化液，定容后經(jīng)高壓乳勻形成納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體。具體步驟如下按照處方量稱取一定量的固相基質(zhì)與液相基質(zhì)于茄瓶中，并加入適量藥物，恒溫振蕩混合均勻成為油相。稱量適量吐溫80攪拌分散于PBS緩沖液形成水相，室溫下不斷攪拌將水相加入油相，攪拌至形成均勻預(yù)乳化液，定容于50ml。采用高壓勻質(zhì)機常溫900-1500bar壓力下乳勻循環(huán)5次，即形成NLC的水分散體系。其脂質(zhì)材料由卵磷脂、脂肪酸和液態(tài)脂質(zhì)海豹油組成，本發(fā)明還包括用所述的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體制備的藥物緩釋系統(tǒng)，其特征在于，各組分的配比為藥物0.01-20%(W/V)，納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體為0.1-40%(W/V)，其余為pH74的等滲PBS，所述緩釋系統(tǒng)，其粒徑為100-500nm，Zeta電位在-25—50mV之間。其中所述藥物選自脂溶性藥物如全反式維甲酸、尼莫地平、紫杉醇或多西紫杉醇。優(yōu)選的藥物選自全反式維甲酸。本發(fā)明優(yōu)選的藥物緩釋系統(tǒng)，各組分的配比為全反式維甲酸0.01-20%(W/V),納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體為0.1-40%(W/V)，其余為pH7.4的等滲PBS。本發(fā)明的脂溶性藥物緩釋系統(tǒng)的制備方法包括如下步驟稱量固相基質(zhì)和液相基質(zhì)和脂溶性藥物，用乙醇溶解，混合均勻后，加入含有吐溫80的PBS，攪拌至形成預(yù)乳化液，定容后經(jīng)高壓乳勻。用本發(fā)明的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體改善了現(xiàn)有技術(shù)中一些脂溶性藥物由于溶解性差、光不穩(wěn)定性和藥代動力學(xué)過程造成的應(yīng)用限制。本發(fā)明的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體及其凍干品可增強對光不穩(wěn)定性藥物的保護作用和改善脂溶性藥物體內(nèi)藥代動力學(xué)過程的用途。本發(fā)明還包括，用本發(fā)明的新型納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體及其凍干品在醫(yī)學(xué)，生物學(xué)、農(nóng)藥及化妝品等領(lǐng)域中的用途。以下通過試驗數(shù)據(jù)說明本發(fā)明的有益效果1、全反式維甲酸納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的物理穩(wěn)定性制劑的物理穩(wěn)定性是指物理性能發(fā)生變化，如制劑中的藥物溶出，發(fā)生聚集結(jié)塊，結(jié)晶生長，油水分層等。研究藥物制劑穩(wěn)定性的任務(wù)是提高產(chǎn)品的內(nèi)在質(zhì)量。為達到這一目的，首先要考察環(huán)境因素對藥物穩(wěn)定性的影響。本發(fā)明中納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的物理穩(wěn)定性通過監(jiān)測避光條件，25°C下的粒徑、Zeta電位及載藥納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)體的包封率來評定。結(jié)果參見附圖3，4，說明制備的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體穩(wěn)定性較好，且低溫貯存更有利。2、納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體中全反式維甲酸的化學(xué)穩(wěn)定性藥物制劑的化學(xué)穩(wěn)定性是指藥物由于水解、氧化等化學(xué)降解反應(yīng)，使藥物含量或效價、色澤等產(chǎn)生改變，從而影響藥效。由于全反式維甲酸在光照下極不穩(wěn)定，因此通過監(jiān)測不同照度(4500士5001x、2000士5001x)下全反式維甲酸的含量變化，來評定用海豹油制成的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體對于藥物的光保護作用。室溫下分別將對照組全反式維甲酸的甲醇液，正癸酸-海豹油ATRA-NLC和月桂酸-海豹油ATRA-NLC置于澄明度光照箱中，每小時取樣lOOul，加入5ml甲醇液稀釋破壞后，渦旋15s至完全溶解，0.45μm濾膜過濾，用HPLC測定ATRA含量。結(jié)果見附圖5，附圖6。由圖可以看出，全反式維甲酸在甲醇溶液中衰減很快，制備成NLC劑型對ATRA有明顯的光保護作用。從定量結(jié)果來看，將4500士5001x和2000士5001x的兩個照度下的結(jié)果以一級動力學(xué)方程擬合，其半衰期與全反式維甲酸甲醇液相比，均有P<0.01即有極顯著性差異。4500士5001x照度時，NLC半衰期最大為對照組的為2.2倍；2000士5001x照度下NLC半衰期最大為對照組的2.9倍，證明此種納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體對全反式維甲酸有明顯的光保護作用。3、全反式維甲酸納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的體外釋放載有全反式維甲酸的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的藥物體外釋放，通過以下方式實現(xiàn)制備含ATRA200mg/L的正癸酸-海豹油NLC劑型，精密吸取3mL于處理好的透析袋中，兩端用透析夾加緊，置于含有50mL透析介質(zhì)的廣口瓶中。將廣口瓶放入37°C空氣恒溫震蕩器中，90次/分振蕩，于lh，3h，5h，8h，16h，24h，32h，40h取樣并更換50mL新鮮透析介質(zhì)(PBS+40%乙醇溶液)。取出的介質(zhì)用0.45μm微孔濾膜過濾后，取濾液進樣，HPLC分析ATRA的濃度。同時以游離藥物的釋放作對比。結(jié)果參見附圖7。4、全反式維甲酸納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的體內(nèi)藥物動力學(xué)藥物動力學(xué)是藥物制劑評價的一個重要方面。通過以下方式實現(xiàn)實驗動物采用雄性Wistar大鼠，體重280-330g，給藥方式尾靜脈推注，給藥劑量6mg/kg。取血方式眼眶取血。實驗分組本實驗采用自身對照與交叉給藥相結(jié)合的方式。A組游離ATRA，少量吐溫80助溶的ATRA的PBS混懸液。B組正癸酸-海豹油的ATRA-NLC。實驗大鼠隨機分為2組，每組3只。實驗第一周按照AB順序給藥，實驗后經(jīng)過一周休藥期，第二次實驗兩組依次按照BA順序給藥。于給藥后0.0167,0.083，0.167，0.333，0.5，1，2，4，6，8，12h取血0.6ml左右于經(jīng)肝素處理的尖底試管中，3000rpm離心lOmin，取上層血清置于_20°C冰箱中冷藏待測。血漿樣品處理精密吸取血漿樣品0.2ml于1.5ml具塞尖底塑料試管中，加入甲醇0.8ml沉淀蛋白，渦旋15s，離心3000rpmIOmin0取上清真空干燥后加入200μ1色譜甲醇濃縮，過0.45μm微孔濾膜過濾后進樣HPLC分析。將峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算各時間點樣品中藥物濃度，結(jié)果見附圖8。實驗結(jié)果用3P87藥動學(xué)軟件對大鼠體內(nèi)藥時數(shù)據(jù)進行處理計算，用二室模型進行模擬，得到大鼠體內(nèi)藥動學(xué)參數(shù)，見表1。可以看到全反式維甲酸從周邊室向中央室轉(zhuǎn)運的一級速率常數(shù)(k21)，從中央室向周邊室轉(zhuǎn)運的一級速率常數(shù)(k12)及藥物從中央室消除的一級速率常數(shù)(k1(l)與空白組相比均有顯著性差異(P<0.05)。這說明藥物在體內(nèi)的分布、轉(zhuǎn)運及消除速率增加，有利于藥物在體內(nèi)更快地發(fā)揮作用并消除。這可能與納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體與組織和器官有較高的親合性有關(guān)。ATRA在水中溶解度差是其吸收不佳，生物利用度差的主要原因之一，藥物在納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體中溶解良好，吸收快，AUC增加明顯，從而提高了生物利用度。藥時曲線下面積(AUC)和清除率(CL)與空白組ATRA相比均有極顯著性差異(P<0.01)。因此納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體不僅提高了ATRA的血藥峰濃度，同時也大大增加了ATRA在大鼠體內(nèi)的體存量，可以維持較長時間的治療有效濃度。表1.ATRA及ATRA-NLC大鼠體內(nèi)藥動學(xué)參數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>*表示對比空白組(ATRA)有顯著性差異P<0.05**表示對比空白組(ATRA)有極顯著性差異P<0.0圖1描繪了納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的透射電鏡圖。圖2描繪了納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的掃描電鏡圖。圖3描繪了室溫25度貯存時由正癸酸_海豹油和月桂酸_海豹油制備的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的粒徑與Zeta電位變化。圖4描繪了貯存時載有全反式維甲酸的正癸酸-海豹油和月桂酸-海豹油制備的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的包封率變化。圖5描繪了光照強度為4500士5001x時全反式維甲酸甲醇液及納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體中的全反式維甲酸含量變化。圖6描繪了光照強度為2000士5001x時全反式維甲酸甲醇液及納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體中的全反式維甲酸含量變化。圖7描繪了全反式維甲酸及納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體中全反式維甲酸的藥物體外釋放曲線。圖8描繪了ATRA及ATRA-NLC大鼠體內(nèi)血藥濃度變化。具體實施例方式為了進一步闡述本發(fā)明，下面給出一系列實施例。這些實施例完全是例證性的，它們僅用來對本發(fā)明進行具體描述，不應(yīng)當(dāng)理解為對本發(fā)明的限制。實施例1:以海豹油為液相基質(zhì)的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備(空白NLC制備)稱量0.5g海豹油，0.375g卵磷脂和0.125g正癸酸或月桂酸于茄瓶中，恒溫振蕩混合均勻。在20mlPBS中加入0.6g吐溫80，作為水相邊攪拌邊加入之前的油相中，攪拌至形成預(yù)乳化液，定容于50ml，900-1500bar壓力下高壓乳勻循環(huán)5次即形成載藥納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體。實施例2全反式維甲酸納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備稱量0.5g海豹油，0.375g卵磷脂和0.125g正癸酸或月桂酸和一定量的全反式維甲酸于茄瓶中，恒溫振蕩混合均勻。在20mlPBS中加入0.6g吐溫80，作為水相邊攪拌邊加入之前的油相中，攪拌至形成預(yù)乳化液，定容于50ml，900-1500bar壓力下高壓乳勻循環(huán)5次即形成載藥納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體。實施例3納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的微觀形態(tài)觀察取NLC樣品溶液，分別用蒸餾水稀釋，取IOul置于銅網(wǎng)表面，下襯濾紙，自然揮干后，準(zhǔn)備透射電鏡觀察。固定電鏡電子束電壓為80kV，移動坐標(biāo)，調(diào)節(jié)放大倍數(shù)，尋找觀察粒子并拍照。見附圖1。同時將稀釋的樣品滴20ul于蓋玻片上，自然揮干后，噴金，進行掃描電鏡觀察。見附圖2。本發(fā)明通過透射電鏡可以看出，單個納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體為球形粒子，大小比較均一，且分布比較均勻；掃描電鏡視野中也印證了上述結(jié)果，放大后可看到納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體為表面有褶皺和凹陷，類似于囊泡的結(jié)構(gòu)。實施例4尼莫地平納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備稱量0.5g海豹油，0.375g卵磷脂和0.125g正癸酸或月桂酸和一定量的尼莫地平于茄瓶中，恒溫振蕩混合均勻。在20mlPBS中加入0.6g吐溫80，作為水相邊攪拌邊加入之前的油相中，攪拌至形成預(yù)乳化液，定容于50ml，900-1500bar壓力下高壓乳勻循環(huán)5次即形成載藥納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體。實施例5多西紫杉醇納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備稱量0.5g海豹油，0.375g卵磷脂和0.125g正癸酸或月桂酸和一定量的多西紫杉醇于茄瓶中，恒溫振蕩混合均勻。在20mlPBS中加入0.6g吐溫80，作為水相邊攪拌邊加入之前的油相中，攪拌至形成預(yù)乳化液，定容于50ml，900-1500bar壓力下高壓乳勻循環(huán)5次即形成載藥納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體。實施例6紫杉醇納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備稱量0.5g海豹油，0.375g卵磷脂和0.125g正癸酸或月桂酸和一定量的紫杉醇于茄瓶中，恒溫振蕩混合均勻。在20mlPBS中加入0.6g吐溫80，作為水相邊攪拌邊加入之前的油相中，攪拌至形成預(yù)乳化液，定容于50ml，900-1500bar壓力下高壓乳勻循環(huán)5次即形成載藥納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體。權(quán)利要求一種納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體，其特征在于，由固相基質(zhì)和液相基質(zhì)組成，其中固相基質(zhì)為卵磷脂和飽和脂肪酸，液相基質(zhì)為海豹油；其中所述飽和脂肪酸分子式為CH3(CH2)nCH2COOH，n為5、7、9、11、13或15。2.權(quán)利要求1的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體，其特征在于，所述載體材料中含固相基質(zhì)20-80%(W/W)，含液相基質(zhì)20-80%(W/W)。3.權(quán)利要求1的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體，其特征在于，所述載體材料中含固相基質(zhì)40-60%(W/W)，含液相基質(zhì)40-60%(W/W)。4.權(quán)利要求1的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備方法其特征在于，包括如下步驟稱量固相基質(zhì)和液相基質(zhì)，混合均勻，加入含有吐溫80的PBS，攪拌至形成預(yù)乳化液，定容后經(jīng)高壓乳勻形成納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體。5.權(quán)利要求4的制備方法其特征在于，包括如下步驟稱量0.5g海豹油，0.375g卵磷脂和0.125g正癸酸或月桂酸于茄瓶中，恒溫振蕩混合均勻。在20mlPBS中加入0.6g吐溫80，作為水相邊攪拌邊加入之前的油相中，攪拌至形成預(yù)乳化液，定容于50ml，900-1500bar壓力下高壓乳勻循環(huán)5次即形成載藥納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體。6.用權(quán)利要求1所述的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體制備的藥物緩釋系統(tǒng)，其特征在于，各組分的配比為藥物0.01-20%(W/V)，納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體為0.1-40%(W/V)，其余為pH7.4的等滲PBS，所述緩釋系統(tǒng)，其粒徑為100-500nm，Zeta電位在-25—50mV之間。7.權(quán)利要求6的藥物緩釋系統(tǒng)，其特征在于，所述藥物選自全反式維甲酸、尼莫地平、紫杉醇或多西紫杉醇。8.權(quán)利要求7的脂溶性藥物緩釋系統(tǒng)，其特征在于，其中藥物選自全反式維甲酸，所述系統(tǒng)，各組分的配比為全反式維甲酸0.01-20%(W/V)，納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體為0.1-40%(W/V)，其余為PH7.4的等滲PBS。9.權(quán)利要求6的脂溶性藥物緩釋系統(tǒng)的制備方法其特征在于，包括如下步驟稱量固相基質(zhì)和液相基質(zhì)和脂溶性藥物，混合均勻后，加入含有吐溫80的PBS，攪拌至形成預(yù)乳化液，定容后經(jīng)高壓乳勻。10.權(quán)利要求9的制備方法其特征在于，包括如下步驟稱量0.5g海豹油，0.375g卵磷脂和0.125g正癸酸或月桂酸和一定量的全反式維甲酸于茄瓶中，恒溫振蕩混合均勻。在20mlPBS中加入0.6g吐溫80，作為水相邊攪拌邊加入之前的油相中，攪拌至形成預(yù)乳化液，定容于50ml，900-1500bar壓力下高壓乳勻循環(huán)5次即形成載藥納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體。全文摘要本發(fā)明涉及以海豹油為液相基質(zhì)的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備及應(yīng)用，其中納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體，由固相基質(zhì)和液相基質(zhì)組成，其中固相基質(zhì)為卵磷脂和飽和脂肪酸，液相基質(zhì)為海洋生物脂肪。文檔編號A61K31/4422GK101822839SQ201010168929公開日2010年9月8日申請日期2010年5月12日優(yōu)先權(quán)日2010年3月31日發(fā)明者崔國輝,崔純瑩,李曦萌申請人:首都醫(yī)科大學(xué)