專利名稱：基于巰嘌呤類藥物的新型兩親性大分子前藥及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種基于巰嘌呤類藥物的新型兩親性大分子前藥及其制備方法。
背景技術(shù)：
巰嘌呤及其衍生物是由Ellion和Hitching于20世紀50年代發(fā)現(xiàn)并獲得諾貝爾 獎，其廣泛應(yīng)用于人類白血病以及其他疾病的治療，如急性腸炎、全身性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕 關(guān)節(jié)炎等。巰嘌呤及其衍生物的發(fā)現(xiàn)在白血病的治療上是一個新的突破。它們是一種細胞 周期特異性藥物，通過負反饋作用抑制酰胺轉(zhuǎn)移酶，干擾了嘌呤核苷酸合成的起始階段；同 時抑制復(fù)雜的嘌呤間的相互轉(zhuǎn)變、抑制輔酶I (NAD+)的合成，并減少了生物合成DNA所必需 的脫氧三磷酸腺苷(dATP)及脫氧三磷酸鳥苷(dGTP)，因而腫瘤細胞不能增殖。臨床主要 通過注射用藥用于絨毛膜上皮癌、惡性葡萄胎、急性淋巴細胞白血病及急性非淋巴細胞白 血病、慢性粒細胞白血病急變期的治療。然而，該類藥物制劑水溶性差，半衰期短，血漿清除 速率高，大大減弱了它的治療效應(yīng)；同時該類藥物細胞選擇性差、毒副作用大、不良反應(yīng)嚴 重，易引起急性肝膽損害，重者可致肝硬化，而且在免疫刺激之后給藥會增加對免疫的抑制 作用。前藥即前體藥物(prodrug orpro-agent)，是將原藥與無毒載體通過化學(xué)鍵連 接，形成暫時的化學(xué)結(jié)合物或覆蓋物，在體內(nèi)水解酶解生成原藥而發(fā)揮其藥效作用的一類 藥物。原藥通過載體修飾，不僅可以改變其理化性質(zhì)，而且可改善其體內(nèi)的吸收與分布， 從而可達到提高其藥效的目的。經(jīng)過對現(xiàn)有技術(shù)的檢索發(fā)現(xiàn)，巰嘌呤前藥可分為小分子 前藥和大分子前藥兩類。Christa E.等制備了一系列由巰嘌呤通過二硫鍵連接長鏈烷 烴的高脂溶性小分子前藥，實現(xiàn)了病變細胞中巰嘌呤的有效釋放(Christa E. Miiller, Peter T. Daniel, Joachim Holzschuh andHermann J. Roth, International Journal of Pharmaceutics, 57 (1989)，41-47) ；Τ. Miron 等制得了大蒜素-巰嘌呤小分子前 藥(SA-6MP)，實驗證明這種前藥在提高抗癌療效的同時也可實現(xiàn)可控釋藥(T.Miron， F. Arditti, L. Konstantinovski, A. Rabinkov, D. Mirelman, A. Berrebi, Μ. Wilchek, European Journal of Medicinal Chemistry，44 (2009)，541-550)。由于這兩種前藥均為 脂溶性小分子前藥，在體內(nèi)生物相容性低，腎濾過率和血漿清除速率高，易排泄，指定時間 內(nèi)藥物難以達到治療作用。由于小分子前藥大都存在上述共性問題，關(guān)于巰嘌呤的大分子 前藥開始引起人們的關(guān)注。目前巰嘌呤大分子前藥的報道比較少見，Marina等通過巰嘌呤 與兩端氯代的聚乙二醇2000反應(yīng)，以化學(xué)鍵方式載于生物相容性良好的聚乙二醇載體上 獲得PEG-巰嘌呤前藥，這種前藥不僅能改善巰嘌呤的水溶性并延長其作用時間，而且能降 低其細胞毒苜 1J作用(Marina Zacchigna,Francesca Cateni,Gabriella Di Luca and Sara Drioli, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 17 (2007)，6607-6609)。但這種前 藥不能充分保證在通過體內(nèi)循環(huán)過程轉(zhuǎn)運至病灶細胞之前不釋放藥物，致使到達病灶細胞 的藥物不能達到有效劑量而降低藥物療效；而且該前藥在轉(zhuǎn)入病灶細胞之后也不能響應(yīng)細胞內(nèi)環(huán)境釋藥。另外，聚乙二醇作為前藥載體有明顯的缺點，其降解過程中產(chǎn)生的乙二醇和 二甘醇具有一定的生物毒性(中國專利200710024888. 2)。藥物載體的選擇是大分子前藥制備的關(guān)鍵，羧甲基殼聚糖(Carboxymethyl Chitosan，簡稱CMC)是天然高分子殼聚糖的羧甲基化產(chǎn)物，是分子鏈上含有陽離子(-NH+3) 和陰離子(-coo—)的兩性聚電解質(zhì)；用作疏水小分子及生物活性大分子(多肽、蛋白和基 因)藥物的前藥載體時，它可與生物組織形成非共價鍵合的氫鍵，從而產(chǎn)生粘附作用，延長 在吸收部位的滯留時間，增進藥物的吸收；同時其分子鏈上質(zhì)子化的氨基可作用于細胞膜 表面的類脂_蛋白質(zhì)復(fù)合物，增進藥物的透膜性能。以CMC為載體的前藥研究已有文獻報 道，如謝永美等制備了一種以羧甲基殼聚糖為載體的阿霉素前藥(謝永美，唐小海.N，0-羧 甲基殼聚糖_阿霉素偶聯(lián)物的合成及其淋巴靶向特性.高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報，2006)，中國專利200710024888. 2則公開了一種以羧甲基殼聚糖為載體的燈盞乙素前藥。目前將羧甲基 殼聚糖作為載體，用于設(shè)計巰嘌呤類前藥尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對上述技術(shù)存在的不足，提供一種羧甲基殼聚 糖為載體的巰嘌呤類藥物的新型兩親性大分子前藥，以巰基乙酸等為連接臂，使載體羧甲 基殼聚糖和抗癌藥物巰嘌呤等以二硫鍵連接。該前藥能在血液循環(huán)過程中穩(wěn)定存在，在病 灶細胞里能響應(yīng)谷胱甘肽的濃度變化釋藥；同時該兩親性大分子可用于載體材料，自組裝 成納米給藥系統(tǒng)，通過該系統(tǒng)表面部分羧基的靶分子或靶基團修飾，有望實現(xiàn)藥物靶向到 達病灶細胞的目的。本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題是提供一種容易實施的基于巰嘌呤類藥物的 新型兩親性大分子前藥的制備方法。本發(fā)明解決其技術(shù)問題采用以下的技術(shù)方案本發(fā)明提供的基于巰嘌呤類藥物的新型兩親性大分子前藥(CMC-6MP)，具體是 兩親性大分子的親水段為羧甲基殼聚糖，疏水段為一種巰嘌呤類藥物；巰嘌呤類藥物先與 連接臂巰基乙酸類化合物以二硫鍵連接為其修飾物，連接臂另一端羧基與親水段的氨基以 酰胺鍵連接；在所述前藥的整體結(jié)構(gòu)中包含以下亞結(jié)構(gòu)
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其中m為大于等于1的整數(shù)，η為大于等于1的整數(shù)。
所述的羧甲基殼聚糖為O-羧甲基殼聚糖、N-羧甲基殼聚糖或N，0-羧甲基殼聚糖， 它們的取代度均為大于等于0. 5且小于等于1. 5的任意數(shù)。所述的巰嘌呤類藥物包括巰嘌呤及其衍生物硫鳥嘌呤等，它們的取代度均為大于 0且小于等于1的任意數(shù)。所述的巰基乙酸類化合物為巰基乙酸、巰基丙酸或巰基丁酸。本發(fā)明提供了制備上述基于巰嘌呤類藥物的新型兩親性大分子前藥(簡稱兩親 性大分子前藥)的方法，該方法采用包括以下步驟的方法步驟1是雙-(6-嘌呤)二硫化物的制備，巰嘌呤經(jīng)碘氧化反應(yīng)得到其二硫化物；步驟2是6-巰基嘌呤磺酸鈉的制備，由雙-(6-嘌呤)二硫化物與亞硫酸鈉反應(yīng) 制得；步驟3是2-[(9H_嘌呤-6-基)二巰基]乙酸的合成，由6_巰基嘌呤磺酸鈉與巰 基乙酸反應(yīng)得到；步驟4是2_[ (9H-嘌呤-6-基)二巰基]乙酸活性酯的制備；步驟5是羧甲基殼聚糖為載體的兩親性大分子前藥的合成，用2-[(9H_嘌 呤-6-基)二巰基]乙酸活性酯與羧甲基殼聚糖反應(yīng)；經(jīng)過上述步驟，制得所述的基于巰嘌呤類藥物的新型兩親性大分子前藥。上述步驟1中，可以將巰嘌呤溶解于熱的磷酸緩沖溶液，過濾溶液，濾液冷至 30°C 40°C，加入碘化鈉和碘重量比2 1的水溶液，過濾出生成的沉淀物，用水和乙 醚-乙醇洗滌，真空干燥，得到產(chǎn)物。上述步驟2中，可以將磨細的雙-(6-嘌呤)二硫化物加到亞硫酸鈉的水溶液中， 攪拌2h后，過濾除去析出的6-MP，濾液以活性炭脫色后，減壓濃縮，所得白色漿狀物中加乙 醇析出結(jié)晶，過濾，干燥，得6-巰基嘌呤磺酸鈉粗品；經(jīng)重結(jié)晶得到類白色鱗片狀晶體，即 為6-巰基嘌呤磺酸鈉。上述步驟3中，可以將6-巰基嘌呤磺酸鈉溶于緩沖溶液中，通氮除氧，降溫至 0-10°C，向溶液中逐滴加入巰基乙酸反應(yīng)24h，反應(yīng)液過濾，所得沉淀用蒸餾水和乙醇洗滌， 真空干燥即得2-[(9H-嘌呤-6-基)二巰基]乙酸。上述步驟4中，可以將2- [ (9H-嘌呤_6_基)二巰基]乙酸溶于DMF，降溫至0_5°C， 首先按2-[ (9H-嘌呤-6-基)二巰基]乙酸N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)為1 1. 1 2. 0 的摩爾投放NHS，然后按2-[(9H-嘌呤-6-基)二巰基]乙酸1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙 基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC · HCl)為1 1. 1 2. 0的摩爾投放EDC · HCl，室溫反應(yīng)24h，反 應(yīng)液過濾，濾液即為2-[ (9H-嘌呤-6-基)二巰基]乙酸活性酯溶液。上述步驟5中，可以將羧甲基殼聚糖溶于蒸餾水中，加入制備的所述活性酯和 0. 3mL四甲基二乙胺，室溫反應(yīng)72h，經(jīng)透析、冷凍干燥得到兩親性大分子前藥。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下的主要優(yōu)點(1)本兩親性大分子前藥將疏水巰嘌呤藥物連接于大分子載體羧甲基殼聚糖上，該兩親性大分子可用于載體材料，自組裝成納米給藥系統(tǒng)，通過該系統(tǒng)表面部分羧基的靶 分子或靶基團修飾，有望實現(xiàn)藥物靶向到達病灶細胞的目的。(2)本兩親性大分子前藥在較低濃度(微摩爾級)的谷胱甘肽溶液中，由于二硫鍵的穩(wěn)定存在，藥物幾乎不被釋放，從而使得兩親性大分子前藥在人體血液循環(huán)中不釋放藥物，降低巰嘌呤類藥物對正常細胞的毒副作用。(3)本兩親性大分子前藥在較低濃度(毫摩爾級)的谷胱甘肽溶液中，由于連接藥 物的二硫鍵會被由外向內(nèi)逐漸打開，二硫鍵被還原成巰基，巰嘌呤藥物因此被逐漸釋放出 來，從而使得大分子前藥在人體病灶細胞里具有智能可控釋藥性能。


圖1為實施例1中羧甲基殼聚糖為載體的巰嘌呤類藥物的大分子前藥合成路線 圖。圖2為實施例1中巰嘌呤與巰嘌呤磺酸鈉的紫外吸收圖。圖3為實施例1中2-[ (9H-嘌呤_6_基)二巰基]乙酸的1HNMR譜圖。圖4為實施例1中制備的大分子前藥CMC-6MP在不同濃度谷胱甘肽中響應(yīng)釋藥曲 線圖。
具體實施例方式以下結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細描述。本實施例在以本發(fā)明前藥結(jié)構(gòu)和技術(shù)方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施 方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。本發(fā)明的合成路線如圖1所示將巰嘌呤或巰嘌呤衍生物先通過碘氧化變成 雙_ (6-嘌呤)二硫化物，再與亞硫酸鈉反應(yīng)后得到6-巰基嘌呤磺酸鈉，把6-巰基嘌呤磺酸 鈉與巰基乙酸等反應(yīng)制得2-[(9H-嘌呤-6-基)二巰基]乙酸，最后將2-[(9H-嘌呤-6-基) 二巰基]乙酸經(jīng)活化后與羧甲基殼聚糖反應(yīng)可制得絮狀的巰嘌呤前藥。實施例1 (采用取代度為0. 74的N，0_羧甲基殼聚糖為載體，巰基乙酸為連接臂， 巰嘌呤為治療藥物)(1)雙-(6-嘌呤)二硫化物的制備稱取(1. Og, 0. 0066mol)巰嘌呤溶解于IL熱的磷酸緩沖溶液(pH7. 6)，過濾溶液， 冷至33°C。同時按重量比2 1稱取碘化鈉和碘配成6mL(0.0033mol)的溶液。往巰嘌呤 溶液中邊攪拌邊在5min內(nèi)分批加入所配置的碘溶液，立即過濾出生成的白色沉淀物，用水 洗滌除去表面殘留的磷酸緩沖溶液，用乙醚-乙醇將其洗至完全粉末狀，用80%乙醇重結(jié) 晶，最后將該粉末在45°C下真空干燥，得到產(chǎn)物。(2) 6-巰基嘌呤磺酸鈉的制備將磨細的雙-(6-嘌呤)二硫化物3. 025g(0. Olmol)加到亞硫酸鈉 1.263g(0. Olmol)的水(IOmL)溶液中，經(jīng)攪拌下，固體逐漸溶解，同時析出6-MP，此時反應(yīng) 液變稠，顏色從淡黃色變?yōu)槿榘咨?。攪?小時后，濾去6-MP，濾液以活性炭脫色后，減壓蒸去水(水浴溫度應(yīng)不超過50°C，否則易生成嘌呤-6-磺酸鈉之副產(chǎn)物)。殘物加乙醇括 擦，過濾，干燥，得1.85g6-巰基嘌呤磺酸鈉粗品，將粗品(1份)溶于水(4份)中，脫色，過 濾，濾液中加入無水乙醇(24份)，放過夜，生成類白色鱗片狀晶體。測定該化合物和巰嘌呤 的紫外吸收，如圖2。溶液配制方法均依照藥典中的相關(guān)規(guī)定，實驗結(jié)果符合藥典中規(guī)定的 "287nm有最大吸收，238nm處有最小吸收”。(3) 2_[ (9H-嘌呤_6_基)二巰基]乙酸的合成
將6-巰基嘌呤磺酸鈉0. 94g(0. 003mol)溶于20mLpH7. 4緩沖溶液中，抽真空后 向系統(tǒng)中充滿氮氣，冰浴中降溫至5-10°C，向溶液中逐滴加入286 μ L巰基乙酸。5-10°C 反應(yīng)24h，反應(yīng)液過濾，得到的白色沉淀用蒸餾水和乙醇洗數(shù)次，真空干燥即得2-[(9H-嘌 呤-6-基)二巰基]乙酸，其IHNMR表征如圖3所示。
(4)羧甲基殼聚糖_巰嘌呤兩親性大分子前藥的制備2- [ (9H-嘌呤-6-基)二巰基]乙酸0. 0501g溶于3mLDMF中，溶解后降溫 至0-5°C，按以下摩爾比投料羧基1-(3_ 二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽 (EDOHCl) N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) = 1 1. 1 1. 1，先加入0. 0269gNHS，再滴入已配 置好的0. 0436g EDC .HClz^mLDMF溶液，室溫條件下攪拌反應(yīng)12h，反應(yīng)液過濾。將0. 0510g 羧甲基殼聚糖溶于5mL蒸餾水配成濃度水溶液，將之前制備的活性酯溶液滴入到該溶 液中，并加入0. 3mL四甲基二乙胺，反應(yīng)72h，先用DMF透析兩天，再用蒸餾水透析三周，冷凍 干燥得到兩親性大分子前藥。實施例2 (采用取代度為0. 60的0-羧甲基殼聚糖為載體，巰基乙酸為連接臂，巰 嘌呤為治療藥物)(1)雙-(6-嘌呤)二硫化物的制備同實施例1。(2) 6-巰基嘌呤磺酸鈉的制備同實施例1。(3) 2_[ (9H-嘌呤-6-基)二巰基]乙酸的合成同實施例1。(4)羧甲基殼聚糖_巰嘌呤兩親性大分子前藥的制備2- [ (9H-嘌呤-6-基)二巰基]乙酸0. 0501g溶于3mLDMF中，溶解后降溫 至0-5°C，按以下摩爾比投料羧基1-(3_ 二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽 (EDOHCl) N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) = 1 1. 1 1. 1，先加入0. 0269gNHS，再滴入已配 置好的0. 0436g EDC -HCl/3mLDMF溶液，室溫條件下攪拌反應(yīng)12h，反應(yīng)液過濾。將0. 0468g 羧甲基殼聚糖溶于5mL蒸餾水配成濃度0. 94%水溶液，將之前制備的活性酯溶液滴入到該 溶液中，并加入0. 3mL四甲基二乙胺，反應(yīng)72h，先用DMF透析兩天，再用蒸餾水透析三周，冷 凍干燥得到兩親性大分子前藥。實施例3 (采用取代度為0. 50的N-羧甲基殼聚糖為載體，巰基乙酸為連接臂，巰 嘌呤為治療藥物)(1)雙-(6-嘌呤)二硫化物的制備同實施例1。(2) 6-巰基嘌呤磺酸鈉的制備同實施例2。(3) 2_[ (9H-嘌呤-6-基)二巰基]乙酸的合成同實施例1。(4)羧甲基殼聚糖_巰嘌呤兩親性大分子前藥的制備2- [ (9H-嘌呤-6-基)二巰基]乙酸0. 0501g溶于3mLDMF中，溶解后降溫 至0-5°C，按以下摩爾比投料羧基1-(3_ 二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDOHCl) N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) = 1 1. 1 1. 1，先加入0. 0269gNHS，再滴入已配置好的0. 0436g EDC -HCl/3mLDMF溶液，室溫條件下攪拌反應(yīng)12h，反應(yīng)液過濾。將0. 0936g 羧甲基殼聚糖溶于5mL蒸餾水配成濃度1.9%水溶液，將之前制備的活性酯溶液滴入到該 溶液中，并加入0. 3mL四甲基二乙胺，反應(yīng)72h，先用DMF透析兩天，再用蒸餾水透析三周，冷 凍干燥得到兩親性大分子前藥。實施例4 (采用取代度為0. 74的N，0_羧甲基殼聚糖為載體，巰基丙酸為連接臂， 巰嘌呤為治療藥物)(1)雙-(6-嘌呤)二硫化物的制備同實施例1。(2) 6-巰基嘌呤磺酸鈉的制備同實施例2。(3) 3_[ (9H-嘌呤_6_基)二巰基]丙酸的合成將6-巰基嘌呤磺酸鈉0. 94g溶于20mLpH7. 4緩沖溶液中，抽真空后向系統(tǒng)中充滿 氮氣，冰浴中降溫至5-10°C，向溶液中逐滴加入265 μ L巰基丙酸。5-10°C反應(yīng)24h，反應(yīng)液 過濾，得到的白色沉淀用蒸餾水和乙醇洗數(shù)次，真空干燥即得3-[ (9H-嘌呤-6-基)二巰
基]丙酸。(4)羧甲基殼聚糖-巰嘌呤兩親性大分子前藥的制備3- [ (9H-嘌呤-6-基)二巰基]丙酸0. 0514g溶于3mLDMF中，溶解后降溫 至0-5°C，按以下摩爾比投料羧基1-(3_ 二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽 (EDOHCl) N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) = 1 1. 5 1. 5，先加入0. 0356NHS，再滴入已配 置好的0. 0593g EDC -HCl/3mLDMF溶液，室溫條件下攪拌反應(yīng)12h，反應(yīng)液過濾。將0. 0522g 羧甲基殼聚糖溶于5mL蒸餾水配成濃度水溶液，將之前制備的活性酯溶液滴入到該溶 液中，并加入0. 3mL四甲基二乙胺，反應(yīng)72h，先用DMF透析兩天，再用蒸餾水透析三周，冷凍 干燥得到兩親性大分子前藥。實施例5 (采用取代度為0. 74的N，0_羧甲基殼聚糖為載體，巰基乙酸為連接臂， 硫鳥嘌呤為治療藥物)(1)雙-(9H-嘌呤-2-胺-6-基)二硫化物的制備將lLpH7. 6磷酸緩沖溶液和0. 75L水混合，并加熱至65 °C，稱取(1. Og, 0.0060mol)硫鳥嘌呤溶解于其中，過濾溶液，冷至38°C。同時按重量比2 1稱取碘化鈉 和碘配成5. 7mL(0. 0030mol)的溶液。往硫鳥嘌呤溶液中邊攪拌邊逐滴加入所配置的碘溶 液，碘溶液剛加入，溶液中立即有白色固體生成，隨著碘溶液繼續(xù)加入，固體由白色變黃色， 用水洗滌除去表面殘留的磷酸緩沖溶液，用乙醚_乙醇將其洗至完全粉末狀，最后將該粉 末在45°C下真空干燥，得到產(chǎn)物。(2) 2-氨基-6-(巰基磺酸鈉)-9-鈉代嘌呤的制備將“雙-(6-嘌呤)二硫化物3. 025g”換為“雙-(9H-嘌呤_2_胺_6_基)二硫化 物3. 325g”，其它同實施例1。(3) 2_[ (9H-嘌呤_2_胺_6_基)二巰基]乙酸的合成將“6-巰基嘌呤磺酸鈉0. 94g”換為“2-氨基_6_(巰基磺酸鈉)_9_鈉代嘌呤 0. 99g”，其它同實施例1。
(4)羧甲基殼聚糖_硫鳥嘌呤兩親性大分子前藥的制備將“2-[(9H-嘌呤-6-基)二巰基]乙酸 0.0501g” 換為 “2-[(9H_ 嘌 呤-2-胺-6-基)二巰基]乙酸0. 0514g”，其它同實施例1。實施例6將上述實施例1得到的兩親性大分子前藥進行體外模擬釋放實驗，據(jù)文獻已知人體血液里谷胱甘肽的濃度較低(微摩爾級)，病灶細胞后由于谷胱甘肽濃度相對較高(毫摩 爾級)。具體操作是谷胱甘肽(ImM)的配制，稱取15. 366mg的谷胱甘肽溶于50mL的PBS 緩沖溶液急得；谷胱甘肽(10 μ Μ)的配制，精確稱取谷胱甘肽3. 0732mg溶解于IOOOmlPBS 緩沖溶液中即得。稱取羧甲基殼聚糖-巰嘌呤兩親性大分子前藥Ig溶于10mLpH7. 4的PBS緩沖溶 液。將該溶液平均分為2份裝于兩個透析袋中，分別置于30ml谷胱甘肽(10μΜ))、30πι1谷 胱甘肽(ImM)的試管中。將試管放置于37°C，90r/min的恒溫搖床中振蕩處理，間隔一段時 間取出3ml，補充相應(yīng)的釋放介質(zhì)3ml，利用紫外分光光度計在325nm處測定吸收度，計算累 積釋放率，結(jié)果如圖4，a為置于30ml谷胱甘肽(ImM)中釋藥曲線，b為置于30ml谷胱甘肽 (10 μ M))中釋藥曲線。結(jié)果顯示，該兩親性大分子前藥在谷胱甘肽(10 μ Μ)溶液中二硫鍵穩(wěn)定，只有很 微量釋藥；而在谷胱甘肽(ImM)溶液中二硫鍵斷裂，藥物巰嘌呤逐漸被釋放出來，在3h時巰 嘌呤釋放約80%，在4h時檢測到得累積釋放率減小，是因為巰嘌呤在釋放過程中容易被空 氣氧化為二硫化物。這一結(jié)果表明，該兩親性大分子前藥能響應(yīng)人體中不同部位谷胱甘肽 濃度的刺激釋藥，從而在人體血液中穩(wěn)定存在，不釋放藥物，而在病灶部位智能釋放。
權(quán)利要求
一種基于巰嘌呤類藥物的新型兩親性大分子前藥，其特征在于兩親性大分子的親水段為羧甲基殼聚糖，疏水段為一種巰嘌呤類藥物；巰嘌呤類藥物先與連接臂巰基乙酸類化合物以二硫鍵連接為其修飾物，連接臂另一端羧基與羧甲基殼聚糖的氨基以酰胺鍵連接；在所述前藥的整體結(jié)構(gòu)中包含如下亞結(jié)構(gòu)其中m為大于等于1的整數(shù)，n為大于等于1的整數(shù)。FSA00000105070100011.tif
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型兩親性大分子前藥，其特征在于羧甲基殼聚糖為0-羧甲 基殼聚糖、N-羧甲基殼聚糖或N，0-羧甲基殼聚糖，它們的取代度為大于等于0. 5且小于等 于1. 5的任意數(shù)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型兩親性大分子前藥，其特征在于巰嘌呤類藥物包括巰嘌 呤及其衍生物硫鳥嘌呤，它們的取代度均為大于0且小于等于1的任意數(shù)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型兩親性大分子前藥，其特征在于巰基乙酸類化合物為巰 基乙酸、巰基丙酸或巰基丁酸。
5.一種基于巰嘌呤類藥物的新型兩親性大分子前藥的制備方法，其特征在于該方法采 用包括以下步驟的方法步驟1是雙_(6_嘌呤)二硫化物的制備，巰嘌呤經(jīng)碘氧化反應(yīng)得到其二硫化物；步驟2是6-巰基嘌呤磺酸鈉的制備，由雙-(6-嘌呤)二硫化物與亞硫酸鈉反應(yīng)制得；步驟3是2-[ (9H-嘌呤-6-基)二巰基]乙酸的合成，由6-巰基嘌呤磺酸鈉與巰基乙 酸反應(yīng)得到；步驟4是2-[ (9H-嘌呤-6-基)二巰基]乙酸活性酯的制備；步驟5是羧甲基殼聚糖為載體的兩親性大分子前藥的合成，用2-[ (9H-嘌呤-6-基) 二巰基]乙酸活性酯與羧甲基殼聚糖反應(yīng)；經(jīng)過上述步驟，制得權(quán)利要求1至4中任一權(quán)利要求所述的前藥。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于步驟1是將巰嘌呤溶解于熱的磷酸 緩沖溶液，過濾溶液，濾液冷至30°C 40°C，加入碘化鈉和碘重量比2 1的水溶液，過濾 出生成的沉淀物，用水和乙醚-乙醇洗滌，真空干燥，得到產(chǎn)物。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于步驟2是將磨細的雙_(6_嘌呤)二 硫化物加到亞硫酸鈉的水溶液中，攪拌2h后，過濾除去析出的巰嘌呤，濾液以活性炭脫色 后，減壓濃縮，所得白色漿狀物中加乙醇析出結(jié)晶，過濾，干燥，得6-巰基嘌呤磺酸鈉粗品； 經(jīng)重結(jié)晶得到類白色鱗片狀晶體，即為6-巰基嘌呤磺酸鈉。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于步驟3是將6-巰基嘌呤磺酸鈉溶于 緩沖溶液中，通氮除氧，降溫至0-10°C，向溶液中逐滴加入巰基乙酸反應(yīng)24h，反應(yīng)液過濾， 所得沉淀用蒸餾水和乙醇洗滌，真空干燥即得2-[(9H-嘌呤-6-基)二巰基]乙酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于步驟4是將2-[(9H-嘌呤-6-基)二 巰基]乙酸溶于DMF，降溫至0-5°C，首先按2-[(9H-嘌呤-6-基)二巰基]乙酸N_羥基琥 珀酰亞胺(NHS)為1 1.1 2.0的摩爾投放NHS，然后按2-[(9H-嘌呤-6-基)二巰基] 乙酸1_(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDO HC1)為1 1.1 2.0的摩 爾投放EDC HC1，室溫反應(yīng)24h，反應(yīng)液過濾，濾液即為2-[ (9H-嘌呤-6-基)二巰基]乙 酸活性酯溶液。
10.根據(jù)權(quán)利要求5或9所述的制備方法，其特征在于步驟5是將羧甲基殼聚糖溶于 蒸餾水中，加入制備的所述活性酯和0. 3mL四甲基二乙胺，室溫反應(yīng)72h，經(jīng)透析、冷凍干燥 得到兩親性大分子前藥。
全文摘要
本發(fā)明涉及基于巰嘌呤類藥物的新型兩親性大分子前藥及其制備方法。所述前藥的結(jié)構(gòu)是兩親性大分子的親水段為羧甲基殼聚糖，疏水段為一種巰嘌呤類藥物；巰嘌呤類藥物先與連接臂巰基乙酸類化合物以二硫鍵連接為其修飾物，連接臂另一端羧基與羧甲基殼聚糖的氨基以酰胺鍵連接。所述前藥的制備方法步驟包括雙-(6-嘌呤)二硫化物的制備、6-巰嘌呤磺酸鈉的制備、2-[(9H-嘌呤-6-基)二巰基]乙酸的合成、2-[(9H-嘌呤-6-基)二巰基]乙酸活性酯的制備和所述前藥的合成。所述前藥在血液循環(huán)中不釋放原藥，在進入病灶細胞后能響應(yīng)谷胱甘肽濃度變化釋；該兩親性大分子可用于載體材料，自組裝成納米給藥系統(tǒng)。
文檔編號A61K47/48GK101829338SQ20101016019
公開日2010年9月15日 申請日期2010年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月23日
發(fā)明者殷以華, 舒凱凱, 鄭化, 饒艷 申請人:武漢理工大學(xué)