專利名稱：一種含釓納米粒子的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學領(lǐng)域，特別是涉及一種含釓納米粒子的制備方法。
背景技術(shù)：
根據(jù)2004-2010年《中國癌癥預(yù)防與控制規(guī)劃綱要》，肺癌、肝癌、胃癌等8種癌癥 死亡約占中國癌癥總死亡人數(shù)的80%以上。我國是肝癌的高發(fā)地區(qū)，原發(fā)性肝癌發(fā)病率占 全球的45% ，死亡率在惡性腫瘤中居第二位，5年存活率僅有5% 。肝癌的總病程大約2年半 時間，其中2年時間都是在沒有癥狀的早期階段，一旦出現(xiàn)癥狀多數(shù)患者就只有半年的存 活時間。如果能在早期及時發(fā)現(xiàn)微小病灶，及時手術(shù)切除，5年生存率可達60%-70%。在 對肝臟的影像診斷中，核磁共振成像技術(shù)(MRI，magnetic resonance imaging)與CT、ECT、 B超等其他技術(shù)相比具有更好的準確性。MRI是利用生物體不同組織在外磁場影響下產(chǎn)生 不同共振信號來成像的，信號強弱取決于組織內(nèi)水的含量和水分子中的質(zhì)子弛豫時間。MRI 可有效檢測組織壞死、局部缺血和各種惡性病變(如腫瘤)，并能進行早期病變診斷和循環(huán) 系統(tǒng)代謝的監(jiān)測，還能對器官移植等進行監(jiān)測[l]。為確保臨床診斷的準確性，30%以上的 MRI檢查使用了對比劑來提高圖像的對比度，因此對比劑成為MRI技術(shù)的重要組成部分，研 究十分活躍。 20世紀80年代中期，基于肝臟的諸多功能和特殊組成成份，研究人員開始尋找能 在肝組織內(nèi)滯留時間更長、以肝臟組織細胞為特殊靶器官、同時又不被肝臟生物攝取的肝 臟特異性對比劑。國內(nèi)武漢大學、蘭州大學、南方醫(yī)科大學、華東師范大學、華中科技大學等 單位在這方面做了很多不錯的工作，主要集中在Gd水溶性聚合物的合成和超順磁性氧化 鐵(SPIO， superparamagnetic iron oxide)被動耙向納米粒子表面包覆層的制備。
目前臨床應(yīng)用最廣泛的MRI對比劑是含Gd順磁性對比劑(Gd-DTPA)。但在2006 年1月，研究發(fā)現(xiàn)含釓磁共振成像對比劑與一種罕見的致命性疾病一腎源性纖維化皮膚 病腎源性系統(tǒng)纖維化(NFD， nephrogenic fib-rosing dermopathy)/(NSF， n印hr-ogenic systemicfibrosis)有關(guān)，NSF患者組織中存在嚴重的釓沉積。多種目前被廣泛使用的Gd 對比劑都可以誘發(fā)這種疾病。Gd-DTPA早期主要用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的磁共振成像，為了改善 Gd-DTPA對肝臟的造影效果，研究人員借助于多糖、多肽、生物大分子、脂質(zhì)體特性對其功能 化來實現(xiàn)靶向作用。G. Wkabalka等在脂質(zhì)體雙分子層包入金屬螯合物脂溶性衍生物，打破 了 Gd-DTPA僅用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的局限。卓仁禧教授課題組在含釓肝靶向?qū)Ρ葎┑难芯糠?面做了大量出色的工作。有研究表明采用離子交聯(lián)或乳化的方法制備的Gd納米粒子，通過 改變粒子表面電荷和粒度可以實現(xiàn)較好的肝被動靶向作用。 殼聚糖無毒價廉，具有良好的生物相容性和可降解性。有研究表明，用殼聚糖及其 衍生物包覆SPI0粒子或與Gd3+配位制備MRI對比劑，可顯著降低其毒副作用，但對肝臟的 造影效果改善不大。甘草次酸(glycyrrhetinic acid，GA)存在于甘草的根、莖部，無毒、廉 價。1991年，Negishi證實了大鼠肝細胞膜上含有大量的甘草次酸結(jié)合位點和少量的甘草 酸結(jié)合位點，隨后國內(nèi)外一些學者紛紛報道了以甘草次酸修飾的脂質(zhì)體或血清蛋白可在肝臟富集。 隨著人們對肝臟早期病變診斷要求的提高和對現(xiàn)在使用的MRI對比劑毒副作用
的深入了解，MRI對比劑在動物體內(nèi)的分布規(guī)律和肝特異性識別研究顯得尤為重要和迫切。 從改變肝臟對比劑的靶向作用機制和降低劑量出發(fā)，采用受體介導設(shè)計，將具有
很高肝靶向性的小分子物質(zhì)如甘草次酸、膽酸和葉酸等引入可降解并具有良好生物相容性
的高分子載體上(如殼聚糖、聚氨基酸等)，通過聚電介質(zhì)的靜電相互作用，制備含有Gd磁
性納米粒子，目前尚無文獻報道。 本發(fā)明的目的是為了解決以上技術(shù)問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種含Gd納米粒子的制備方法。 采用的技術(shù)路線是利用肝靶向化合物和含氨基的聚合物制備含有肝靶向基團的
聚合物，并與釓鹽水溶液發(fā)生離子交聯(lián)反應(yīng)來制備含釓納米粒子。 所述聚合物為殼聚糖、聚賴氨酸中的任意一種； 所述殼聚糖的分子量為2000 4乂105，脫乙酰度為30% 100% ; 所述聚賴氨酸的分子量為3000 6X 104 ; 所述肝靶向化合物為甘草次酸、膽酸、葉酸中的任意一種或其混合物；
所述釓鹽為為氯化釓、硫酸釓、磷酸釓中的任意一種；
含釓納米粒子的制備方法，包括下述步驟
1肝靶向基團修飾的聚合物的制備
1. 1羧基修飾的肝靶向化合物的合成 將肝靶向化合物溶于N， N-二甲基亞砜中，冷卻，加入二異丙基碳二亞胺，攪拌后 加入N-羥基琥珀酰亞胺，在室溫下攪拌反應(yīng)，將反應(yīng)混合物傾入無水乙醇中，收集到白色 固體，用無水乙醇洗滌，再用無水乙醚洗滌，真空干燥，得活性酯； 將活性酯的N， N-二甲基亞砜溶液滴加到二元胺的溶液中，在40-8(TC下反應(yīng) 14-24h，將膽酸或甘草次酸的衍生物傾入水中，葉酸的衍生物傾入四氫呋喃中，在3t:下放 置。將沉淀過濾，用少量乙醇、乙醚洗滌，干燥，然后將所得沉淀在N， N-二甲基甲酰胺中溶 解，用乙醚沉淀，真空干燥，得到胺基修飾的肝靶向化合物； 將胺基修飾的肝靶向化合物溶解在丙酮中，在攪拌下滴入二元酸酐，反應(yīng)3h后， 加入乙醚沉淀，將所得沉淀在N， N- 二甲基甲酰胺中溶解，再用乙醚沉淀，真空干燥，得到羧 基修飾的肝靶向化合物； 所述羧基修飾的肝靶向化合物的合成步驟中的物料配比為 肝靶向化合物二異丙基碳二亞胺N-羥基琥珀酰亞胺為i : i.o
1. 5 : 1. 0 1. 5， mol/mo1 ; 活性酯二元胺為1 : 30 100， mol/mo1 ; 二元胺是二乙烯三胺、丁二胺的任意一種，二乙烯三胺用N， N-二甲基甲酰胺做溶 劑，丁二胺用N， N-二甲基亞砜做溶劑； 二元酸酐胺基修飾的肝耙向化合物為10 100 : l， mol/mo1 ;
二元酸酐是丙二酸酐、丁二酸酐、順丁烯二酸酐中的任意一種。
1. 2肝靶向基團修飾的聚合物的合成 在2 10%的殼聚糖或聚賴氨酸的水溶液中，加入羧基化的肝靶向化合物和1-乙 基-3-(3-二甲氨基異丙基)碳二亞胺的鹽酸鹽的N，N-二甲基甲酰胺的溶液，在60 10(TC 反應(yīng)4 6小時，冷卻后，濃縮反應(yīng)液，將濃縮液傾入乙醇中沉淀，過濾，將沉淀干燥，得到含 有肝靶向基團的聚合物。 所述含肝靶向基團修飾聚合物的合成步驟中的物料配比為 殼聚糖或聚賴氨酸羧基化的肝靶向化合物i-乙基_3-(3- 二甲氨基異丙基) 碳二亞胺的鹽酸鹽為1 : 0.05 0.4 : 0.05 0.4，mol/mol。
2含釓納米粒子的制備 將含有肝靶向基團修飾的聚合物的水溶液滴加到含釓鹽的pH值為7. 4的磷酸緩
沖液中，超聲振蕩，得到分散均勻的含釓納米粒子。 所述含釓納米粒子的制備步驟中的物料配比為 含有肝靶向基團修飾的聚合物的水溶液的濃度為0. 05% _8%，肝靶向基團的聚 合物:釓鹽為100 : 0. 5 10， m/m。 本發(fā)明的效果用于MRI核磁共振造影，可以顯著提高弛豫效能，改善造影效果。
具體實施例方式
為了進一步了解本發(fā)明的內(nèi)容、特點，詳細說明如下
實施例l含有甘草次酸基團的殼聚糖的制備
1. 1羧基修飾的甘草次酸衍生物的合成 將4.70g甘草次酸溶于30ml N， N-二甲基亞砜中，冷卻，加入二異丙基碳二亞胺 1. 26g，攪拌后加入N-羥基琥珀酰亞胺1. 15g，在室溫下攪拌反應(yīng)，將反應(yīng)混合物傾入100ml 無水乙醇中，收集白色固體，用20ml無水乙醇洗滌，再用10ml無水乙醚洗滌，真空干燥，得 甘草次酸的活性酯； 將甘草次酸活性酯的N， N- 二甲基亞砜溶液滴加到含有28g 丁二胺的200ml N， N-二甲基亞砜溶液中，在7(TC下反應(yīng)15h，將將反應(yīng)液傾入1000ml水中，在3t:放置。將沉 淀過濾，用20ml乙醇、100ml乙醚洗滌，干燥，將所得沉淀在N， N-二甲基甲酰胺中溶解，用 乙醚沉淀，真空干燥，得到胺基修飾的甘草次酸衍生物； 將胺基修飾的甘草次酸衍生物溶解在30ml丙酮中，在攪拌下滴入含20. 04g 丁二 酸酐的150ml丙酮溶液，反應(yīng)3h后，加入250ml乙醚沉淀，將所得沉淀在40ml N，N-二甲基 甲酰胺中溶解，再用80ml乙醚沉淀，真空干燥，得到羧基修飾的甘草次酸衍生物5. 82g。
1. 2含有甘草次酸基團的殼聚糖的合成 在100ml 8%的殼聚糖的水溶液中，加入3. 74g羧基修飾的甘草次酸衍生物和
1.25g l-乙基-3-(3-二甲氨基異丙基)碳二亞胺的鹽酸鹽的20mlN，N-二甲基甲酰胺的溶
液，在8(TC反應(yīng)5小時，冷卻后，濃縮反應(yīng)液，將濃縮液傾入乙醇中沉淀，過濾，將沉淀干燥，
得到含有甘草次酸基團的殼聚糖10. 45g。 實施例2含有膽酸基團的殼聚糖的制備 2. 1羧基修飾的膽酸衍生物的合成 將4.08g膽酸溶于30ml N，N-二甲基亞砜中，冷卻，加入二異丙基碳二亞胺1. 51g，攪拌后加入N-羥基琥珀酰亞胺1. 38g，在室溫下攪拌反應(yīng)，將反應(yīng)混合物傾入140ml無水乙 醇中，收集白色固體，用30ml無水乙醇洗滌，再用20ml無水乙醚洗滌，真空干燥，得膽酸的 活性酯； 將膽酸活性酯的N， N- 二甲基亞砜溶液滴加到含有30g 丁二胺的200ml N， N_ 二甲 基亞砜溶液中，，在7(TC下反應(yīng)15h，將將反應(yīng)液傾入lOOOml水中，在3t:放置。將沉淀過 濾，用25ml乙醇、100ml乙醚洗滌，干燥，將所得沉淀在N， N_ 二甲基甲酰胺中溶解，用乙醚 沉淀，真空干燥，得到胺基修飾的膽酸衍生物； 將胺基修飾的膽酸衍生物溶解在30ml丙酮中，在攪拌下滴入含22g 丁二酸酐的 150ml丙酮溶液，反應(yīng)3h后，加入250ml乙醚沉淀，將所得沉淀在40ml N，N- 二甲基甲酰胺 中溶解，再用80ml乙醚沉淀，真空干燥，得到羧基修飾的膽酸衍生物5. 45g。
2. 2含有膽酸基團的聚合物的合成在200ml 4X的殼聚糖的水溶液中，加入含有3.45g羧基修飾的膽酸衍生物和
0.92g l-乙基-3-(3-二甲氨基異丙基)碳二亞胺的鹽酸鹽的20ml N，N-二甲基甲酰胺的
溶液，在8(TC反應(yīng)5小時，冷卻后，濃縮反應(yīng)液，將濃縮液傾入乙醇中沉淀，過濾，將沉淀干
燥，得到含有膽酸基團的殼聚糖10. 02g。 實施例3含有葉酸基團的聚賴氨酸的制備 3. 1羧基修飾的葉酸衍生物的合成 將4.41g葉酸溶于30ml N，N-二甲基亞砜中，冷卻，加入二異丙基碳二亞胺1. 62g， 攪拌后加入N-羥基琥珀酰亞胺1. 42g，在室溫下攪拌反應(yīng)，將反應(yīng)混合物傾入140ml無水乙 醇中，收集白色固體，用30ml無水乙醇洗滌，再用20ml無水乙醚洗滌，真空干燥，得葉酸的 活性酯； 將葉酸活性酯的N， N- 二甲基亞砜溶液滴加到含有34g 丁二胺的200ml N， N- 二甲 基亞砜溶液中，，在7(TC下反應(yīng)15h，將將反應(yīng)液傾入1000ml水中，在3t:放置。將沉淀過 濾，用25ml乙醇、100ml乙醚洗滌，干燥，將所得沉淀在N， N-二甲基甲酰胺中溶解，用乙醚 沉淀，真空干燥，得到胺基修飾的葉酸衍生物； 將胺基修飾的葉酸衍生物溶解在30ml丙酮中，在攪拌下滴入含22g 丁二酸酐的 150ml丙酮溶液，反應(yīng)3h后，加入250ml乙醚沉淀，將所得沉淀在40ml N，N- 二甲基甲酰胺 中溶解，再用80ml乙醚沉淀，真空干燥，得到羧基修飾的葉酸衍生物5. 75g。
3. 2含有葉酸基團的聚賴氨酸的合成 在300ml 2. 29%的聚賴氨酸的水溶液中，加入含有2. 78g羧基修飾的葉酸衍生物 和1.06gl-乙基-3-(3-二甲氨基異丙基)碳二亞胺的鹽酸鹽的20ml N， N-二甲基甲酰胺 的溶液，在8(TC反應(yīng)5小時，冷卻后，濃縮反應(yīng)液，將濃縮液傾入乙醇中沉淀，過濾，將沉淀 干燥，得到含有葉酸基團的殼聚糖9. 74g。
實施例4含釓納米粒子的制備 將100ml含有3. Og膽酸基團修飾的殼聚糖的水溶液緩慢滴加到40ml含0. 15g氯 化釓的pH值為7.4的磷酸緩沖液中，超聲振蕩，得到分散均勻的含釓納米粒子。動態(tài)光散 射測定其粒徑為84nm，分散指數(shù)為0. 18，透射電鏡觀測粒子為規(guī)則的圓球形。
實施例5含釓納米粒子的制備 將100ml含有2. 5g葉酸基團修飾的聚賴氨酸的水溶液緩慢滴加到40ml含0. 18g氯化釓的pH值為7. 4的磷酸緩沖液中，超聲振蕩，得到分散均勻的含釓納米粒子。動態(tài)光 散射測定其粒徑為64nm，分散指數(shù)為0. 22，透射電鏡觀測粒子為規(guī)則的圓球形。
實施例6含釓納米粒子的制備 將100ml含有2. 7g甘草次酸基團修飾的殼聚糖的水溶液緩慢滴加到40ml含 0. 14g氯化釓的pH值為7. 4的磷酸緩沖液中，超聲振蕩，得到分散均勻的含釓納米粒子。動 態(tài)光散射測定其粒徑為75nm，分散指數(shù)為0. 15，透射電鏡觀測粒子為規(guī)則的圓球形。
實施例7含釓納米粒子弛豫效能的測定 分別稱取含釓納米粒子及Gd-DTPA，于25ml的容量瓶中用二次蒸餾水配成一定 濃度(mmol/L)的溶液(pH= 7)，在Bruker BI0SPEC 47/30型磁共振成像儀(4. 7T)上 分別測定純水的弛豫時間Tl(d)和樣品溶液中弛豫時間Tjobsd)，方法為反轉(zhuǎn)恢復法 (InversionRecovery， IR)，并計算弛豫效能&。具體測試結(jié)果如下Gd-DTPA， 1. 25mmo1/ L， VGd = 4. 97L ,1—1 s—1 ;含甘草次酸的殼聚糖納米粒子，1. 25mmol/L， ms R/Gd = 8. 53L .mmo1—1 *s—1 ;含膽酸的殼聚糖納米粒子，1. 25mmol/L，ms R/Gd = 11. 78L .mmo1—1 *s—1 ; 含葉酸的殼聚糖納米粒子，1. 25,1/L， ms VGd = 9. 21L mmol—1 s—、含釓納米粒子的 弛豫效能顯著高于Gd-DTPA。
權(quán)利要求
一種含釓納米粒子的制備方法，其特征在于使用肝靶向化合物和含氨基的聚合物制備含有肝靶向基團的聚合物，并與釓鹽水溶液發(fā)生離子交聯(lián)反應(yīng)來制備含釓納米粒子；所述肝靶向化合物為甘草次酸、膽酸、葉酸中的任意一種或其混合物；所述含氨基的聚合物為殼聚糖、聚賴氨酸中的任意一種；所述殼聚糖的分子量為2000～4×105，脫乙酰度為30％～100％；所述聚賴氨酸的分子量為3000～6×104；所述釓鹽為為氯化釓、硫酸釓、磷酸釓中的任意一種。
2. 按照權(quán)利要求1所述的含釓納米粒子的制備方法，其特征在于含有肝靶向基團的聚 合物的合成，包括下述制備步驟2. 1羧基修飾的肝靶向化合物的合成將肝靶向化合物溶于N， N-二甲基亞砜中，冷卻，加入二異丙基碳二亞胺，攪拌后加入 N-羥基琥珀酰亞胺，在室溫下攪拌反應(yīng)，將反應(yīng)混合物傾入無水乙醇中，收集到白色固體， 用無水乙醇洗滌，再用無水乙醚洗滌，真空干燥，得活性酯；將活性酯的N， N- 二甲基亞砜溶液滴加到二元胺的溶液中，在40-8(TC下反應(yīng)14-24h， 將膽酸或甘草次酸的衍生物傾入水中，葉酸的衍生物傾入四氫呋喃中，在3t:下放置。將沉 淀過濾，用少量乙醇、乙醚洗滌，干燥，然后將所得沉淀在N， N- 二甲基甲酰胺中溶解，用乙 醚沉淀，真空干燥，得到胺基修飾的肝靶向化合物；將胺基修飾的肝靶向化合物溶解在丙酮中，在攪拌下滴入二元酸酐，反應(yīng)3h后，加入 乙醚沉淀，將所得沉淀在N， N- 二甲基甲酰胺中溶解，再用乙醚沉淀，真空干燥，得到羧基修 飾的肝靶向化合物；2. 2從羧基修飾的肝靶向化合物合成肝靶向基團修飾的聚合物在2% 10%的殼聚糖或聚賴氨酸的水溶液中，加入羧基化的肝靶向化合物和1-乙 基-3-(3-二甲氨基異丙基)碳二亞胺的鹽酸鹽的N，N-二甲基甲酰胺的溶液，在60 10(TC 反應(yīng)4 6小時，冷卻后，濃縮反應(yīng)液，將濃縮液傾入乙醇中沉淀，過濾，將沉淀干燥，得到含 有肝靶向基團的聚合物。
3. 按照權(quán)利要求2所述的含有肝靶向基團的聚合物的合成，其特征在于物料配比為 在2. l所述的羧基修飾的肝靶向化合物的合成中，肝靶向化合物二異丙基碳二亞胺N-羥基琥珀酰亞胺為1 : 1. 0 1. 5 : l. 0 l. 5， mol/mo1 ; 活性酯二元胺為1 : 30 100， mol/mol ;二元胺是二乙烯三胺、丁二胺的任意一種，二乙烯三胺用N， N-二甲基甲酰胺做溶劑， 丁二胺用N， N- 二甲基亞砜做溶劑；二元酸酐胺基修飾的肝靶向化合物為10 100 : 1， mol/mol ; 二元酸酐是丙二酸酐、丁二酸酐、順丁烯二酸酐中的任意一種；在2. 2所述的從羧基修飾的肝靶向化合物合成肝靶向基團修飾的聚合物中，殼聚糖或 聚賴氨酸羧基化的肝靶向化合物i-乙基-3-(3-二甲氨基異丙基)碳二亞胺的鹽酸鹽 為l : 0. 05 0. 4 : 0. 05 0. 4， mol/mol 。
4 照權(quán)利要求1所述的含釓納米粒子的制備方法，其特征在于含有肝靶向基團的聚 合物與釓鹽水溶液發(fā)生離子交聯(lián)反應(yīng)來制備含釓納米粒子，包括下述制備步驟將含有肝靶向基團修飾的聚合物的水溶液滴加到含釓鹽的PH值為7. 4的磷酸緩沖液中，超聲振蕩，得到分散均勻的含釓納米粒子。
5.按照權(quán)利要求4所述的含釓納米粒子的制備方法，其特征在于物料配比為 含有肝靶向基團修飾的聚合物的水溶液的濃度為0.05% 8% ;肝靶向基團的聚合物釓鹽為ioo : o. 5 io， g/g。
全文摘要
一種含釓納米粒子的制備方法，發(fā)明屬于生物醫(yī)學領(lǐng)域。使用肝靶向化合物和含氨基的聚合物制備含有肝靶向基團的聚合物，并與釓鹽水溶液發(fā)生離子交聯(lián)反應(yīng)來制備含釓納米粒子。這種含釓納米粒子用于MRI核磁共振造影，可以顯著提高弛豫效能，改善造影效果。
文檔編號A61K49/12GK101757642SQ20101011659
公開日2010年6月30日 申請日期2010年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月3日
發(fā)明者張旖倩, 查瑞濤, 王立軍 申請人:天津科技大學