專利名稱：一種具有抑菌活性的抗脂多糖因子的制備及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及中華絨螯蟹抗脂多糖因子(EsALF-2)基因 編碼區(qū)的體外重組表達(dá)技術(shù)，活性重組蛋白的分離純化，以及重組蛋白對(duì)枯草芽孢桿菌、鰻 弧菌和畢赤酵母的抑菌作用研究；還涉及到該重組蛋白作為一種新型抑菌藥物，免疫增強(qiáng) 劑和飼料添加劑生產(chǎn)中的應(yīng)用價(jià)值。
背景技術(shù)：
中華絨螯蟹是東南亞重要的水產(chǎn)品養(yǎng)殖品種之一。然而，隨著中華絨螯蟹養(yǎng)殖面 積的不斷擴(kuò)大，由細(xì)菌，真菌和病毒引起的多種疾病在蟹的養(yǎng)殖群體中不斷爆發(fā)，造成了巨 大的經(jīng)濟(jì)損失。先前的研究已經(jīng)表明，生物體死亡率的增加與其對(duì)外界病原微生物免疫防 御能力低下有密不可分的關(guān)系。因此，對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物開展免疫防御系統(tǒng)的相關(guān)研究將有助于 人類對(duì)其病害進(jìn)行有效防控和治療。中華絨螯蟹是一種無脊椎動(dòng)物，缺乏適應(yīng)性免疫防御系統(tǒng)，只依賴固有免疫系統(tǒng) 實(shí)現(xiàn)對(duì)外界病原微生物的免疫防御。固有免疫系統(tǒng)包括由血細(xì)胞引起的細(xì)胞免疫及由抗菌 肽等組成的體液免疫來執(zhí)行對(duì)外界病原微生物的免疫防御。在水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖過程中，抗生 素的濫用不僅造成水體污染，而且因此帶來抗藥性微生物的產(chǎn)生。這個(gè)問題激發(fā)了我們對(duì) 于生物體本身抗菌分子的研究，以期將其作為模板設(shè)計(jì)免疫防治的藥物。并且，對(duì)于生物體 內(nèi)抗菌分子進(jìn)行研究，將使我們進(jìn)一步了解中華絨螯蟹免疫防御機(jī)制，從而更好地制定免 疫防治的對(duì)策?？怪嗵且蜃?ALF)是一種可以結(jié)合脂多糖(LPS)的小蛋白，它可以調(diào)節(jié)細(xì)胞 的脫顆粒作用，并引起細(xì)胞內(nèi)的一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)。ALF最先在鱟中被發(fā)現(xiàn)，它分子量為 11. 8kDa，對(duì)于R-型革蘭氏陰性菌有明顯的抑制生長(zhǎng)的效果。從晶體結(jié)構(gòu)上看，鱟的ALF的 結(jié)構(gòu)中有兩個(gè)高度保守的半胱氨酸結(jié)構(gòu)，他們所限制的結(jié)構(gòu)域?yàn)長(zhǎng)PS結(jié)合域。體外合成鱟 的ALF的LPS結(jié)合域，證明其確實(shí)可以與LPS結(jié)合。隨后，從對(duì)蝦，蟹，螯蝦等甲殼動(dòng)物中也 純化或克隆獲得了 一些抗脂多糖因子。本發(fā)明中的中華絨螯蟹抗脂多糖因子，其重組產(chǎn)物對(duì)枯草芽孢桿菌、鰻弧菌和畢 赤酵母的生長(zhǎng)都具有抑制的功能。目前，抗脂多糖因子的結(jié)構(gòu)和功能在蝦中已得到一定程 度的研究，但在中華絨螯蟹的研究還很少。ALFs在中華絨螯蟹中的研究，有利于更好的揭示 固有免疫作用的途徑及其機(jī)制，并且對(duì)開發(fā)廣譜抗菌藥物和篩選免疫增強(qiáng)劑提供指導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
中華絨螯蟹作為甲殼動(dòng)物的代表，在進(jìn)化上比較原始，研究其效應(yīng)分子的作用在 理論和實(shí)際中都具有重要的意義。本發(fā)明對(duì)中華絨螯蟹抗脂多糖因子(EsALF-2)基因編碼 區(qū)進(jìn)行原核重組，旨在確認(rèn)其蛋白功能，以深入研究EsALF-2的抑菌活性，為抗菌藥物和免 疫增強(qiáng)劑的篩選提供指導(dǎo)。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是在EsALF-2基因編碼區(qū)(信號(hào)肽除
3外)的兩端分別設(shè)計(jì)含有限制性酶切位點(diǎn)的引物，通過PCR技術(shù)，擴(kuò)增編碼區(qū)基因并將其克 隆到pET-32a表達(dá)載體中，隨后轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞BL21(DE3)plysS中實(shí)現(xiàn)原核體外重組表達(dá)。 重組產(chǎn)物經(jīng)鎳瓊脂糖凝膠柱純化，并且透析復(fù)性后，表現(xiàn)出以下活性1、EsALF-2重組蛋白對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌枯草芽孢桿菌、革蘭氏陰性菌鰻弧菌和真菌 畢赤酵母有抑制生長(zhǎng)作用。當(dāng)EsALF-2重組蛋白為最大濃度(600yg ml/1)時(shí)，該蛋白與枯 草芽孢桿菌37°C孵育3小時(shí)后，再加LB培養(yǎng)基孵育過夜，0. D. 600值為0. 18 士 0. 019 (平均 值士標(biāo)準(zhǔn)誤)，顯著低于對(duì)照組(Tris-HCl)的0. D. 600值(0. 38士0. 013)；該蛋白與鰻弧菌 28°C孵育3小時(shí)后，再加2216E培養(yǎng)基孵育過夜，0. D. 600值為0. 06士0. 002，顯著低于對(duì)照 組(Tris-HCl)的0.D.600值(0. 16士0.012)；該蛋白與畢赤酵母30°C孵育3小時(shí)后，再加 YPD培養(yǎng)基孵育過夜，0. D. 560值為0. 90 士0. 006，顯著低于對(duì)照組(Tris-HCl)的0. D. 600 值(0. 97 士 0. 043)。2、EsALF-2重組蛋白對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌枯草芽孢桿菌、革蘭氏陰性菌鰻弧菌和真菌 畢赤酵母的最小抑制濃度分別為150 μ g mL—1，75 μ g mL—1和18. 75 μ g mL—1。


圖1 中華絨螯蟹重組蛋白EsALF-2對(duì)枯草芽孢桿菌、鰻弧菌和畢赤酵母生長(zhǎng)的影 響圖2 不同濃度梯度的中華絨螯蟹重組蛋白EsALF-2對(duì)枯草芽孢桿菌、鰻弧菌和畢 赤酵母生長(zhǎng)的影響
具體實(shí)施例方式下面的實(shí)驗(yàn)例中將對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述，但本發(fā)明不限于此。實(shí)施實(shí)驗(yàn)1:本發(fā)明的中華絨螯蟹重組蛋白EsALF-2基因編碼區(qū)(信號(hào)肽除外)體外原核重組 表達(dá)，包括下列步驟1、重組載體的構(gòu)建通過PCR技術(shù)，使用5’末端分別添加了 BamH I和Xho I特定酶切位點(diǎn)的基因特 異性引物 Pl (5，-GGATCCAACATTTTTGACGATATTTTCG-3，)和 P2(5，-CTCGAGTCAAGCATTCAGCAA AGGGTC-3’)擴(kuò)增中華絨螯蟹重組蛋白EsALF-2的編碼區(qū)片段。反應(yīng)條件為首先94°C預(yù)變 性5分鐘，然后進(jìn)入下列循環(huán)94°C變性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸30秒，共進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘。將擴(kuò)增片段純化回收，與PMD18-T載體連接。轉(zhuǎn)化后篩選 陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒；使用BamH I和Xho I兩個(gè)酶酶切質(zhì)粒，用膠回收純化試劑盒(大連寶 生物工程有限公司)對(duì)酶切產(chǎn)生的目的片段純化回收；回收目的片段與經(jīng)BamH I和Xho I 兩個(gè)酶酶切的表達(dá)載體pET-32a連接，完成載體的構(gòu)建。上述實(shí)驗(yàn)操作的具體方法請(qǐng)參照 《分子克隆第三版》。2、重組蛋白EsALF-2的表達(dá)將構(gòu)建好的重組載體轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21(DE3)-plysS中，并篩選陽(yáng)性克隆，測(cè) 序確認(rèn)表達(dá)框的正確性。挑取單克隆，接種于200mL的LB液體培養(yǎng)基中，220rpm，37°C培養(yǎng) 至0. D. 600 = 0. 5-0. 7。加入IPTG，使終濃度達(dá)到Immol Γ1，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。4°C，5000rpm，
4離心10分鐘，收集菌體，于_20°C凍存?zhèn)溆?。取ImL菌液離心，棄去上清后，加入80 μ L水和 20 μ L的5倍的蛋白上樣緩沖液，100°C煮沸2分鐘，稍離心，SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物。3、重組蛋白EsALF-2的純化與復(fù)性本發(fā)明中重組蛋白采用北京韋氏博慧色譜科技有限公司的鎳瓊脂糖凝膠柱純 化。變性狀態(tài)下的具體操作步驟如下首先用緩沖液I (50mmol L—1磷酸緩沖液，pH = 7. 4， 0. Smoir1氯化鈉，8mol L—1尿素)平衡鎳瓊脂糖凝膠柱2_5個(gè)柱床體積，流速為2mL mirT1。 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)胞，用緩沖液I重懸，150瓦超聲破碎30分鐘，12000轉(zhuǎn)，離心30分 鐘，上清液用0.45 μ m濾膜過濾后，過柱，流速為ImL mirT1。再次用緩沖液I再洗2_5個(gè)柱 床體積，流速為2mL mirT1，然后用有50mmol Γ1咪唑的緩沖液I再洗2_5個(gè)柱床體積，流速 為2mL mirT1。最后，用400mmol L—1咪唑的緩沖液I洗脫目的蛋白，收集。重組蛋白的復(fù)性采用尿素逐級(jí)稀釋的方法，通過透析除去尿素，使蛋白重新正 確折疊，恢復(fù)正確構(gòu)象。本發(fā)明中采用的復(fù)性透析液為50mmol I^1Tris-HCl，pH 7.4， SOmmolL—1氯化鈉，2mmol L—1還原型谷胱苷肽，0. 2mmol L—1氧化型谷胱苷肽，10%甘油，1 % 甘氨酸，lmmol L-1EDTAj-Omol L—1逐級(jí)稀釋的尿素。最后，重組蛋白的透析緩沖液為50mmol L-1 Tris-HCl, ρΗ 7. 4。實(shí)施實(shí)驗(yàn)2 本發(fā)明的中華絨螯蟹重組蛋白EsALF-2的抑菌活性檢測(cè)具體步驟如下1、微生物的培養(yǎng)及制備枯草芽孢桿菌用LB培養(yǎng)基37 °C，鰻弧菌用2216E培養(yǎng)基28 °C，畢赤酵母 用YPD培養(yǎng)基30°C，同時(shí)用搖床每分鐘220轉(zhuǎn)數(shù)培養(yǎng)到菌濃度達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，用 Tris-HCl (50mmol ρΗ = 8. 0)稀釋菌體，使其每毫升菌液中的菌落數(shù)約為IX 103。2、重組蛋白EsALF-2抑菌活性測(cè)定重組蛋白EsALF-2成倍稀釋，分別加50 μ L的EsALF-2在無菌的96孔板中， 50 μ LTris-HCl (50mmol Γ1, ρΗ = 8. 0)設(shè)為對(duì)照，然后再加入50 μ L的稀釋好的菌液，并 且混勻。只加入50yL菌液的孔為空白孔。96孔板在菌液的培養(yǎng)溫度下孵育3小時(shí)后，加 入相應(yīng)培養(yǎng)基150 μ L，空白孔加入培養(yǎng)基200 μ L，孵育過夜。加枯草芽孢桿菌和鰻弧菌的 96孔板在波長(zhǎng)為600nm的可見光下讀數(shù)，加畢赤酵母的96孔板在波長(zhǎng)為560nm的可見光 下讀數(shù)。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組進(jìn)行顯著分析，正如圖1所示，實(shí)驗(yàn)組重組蛋白EsALF-2(600y g mL-1)對(duì)鰻弧菌，枯草芽孢桿菌和畢赤酵母生長(zhǎng)與對(duì)照組Tris-HCl組相比均具有明顯的抑 制效果(星號(hào)* 差異顯著；兩個(gè)星號(hào)** 差異極顯著)。以重組蛋白EsALF-2最小濃度抑 制菌生長(zhǎng)的濃度定義為此菌的最小抑制濃度，正如圖2所示，隨著重組蛋白EsALF-2濃度的 降低，抑菌活性逐漸減弱，重組蛋白EsALF-2對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌枯草芽孢桿菌、革蘭氏陰性菌 鰻弧菌和真菌畢赤酵母有抑制生長(zhǎng)作用，且最小抑制濃度分別為150yg ml^JSygmL—1* 18. 75 μ g mlA序列表<110>中國(guó)科學(xué)院海洋研究所<120> 一種具有抑菌活性的抗脂多糖因子的制備及應(yīng)用<140><160>1
5
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>120
<212>PRT
<213>中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)
<220>
<400>1
Met Ala ArgLeuSerLeuPheLeuValAlaValAlaValAlaValPhe
151015
Thr Pro AsnlieArgGlnCysGluAlaAsnliePheAspAspliePhe
202530
Gly Lys ValThrGluThrLeuValAspPheGlyThrThrAsplieAla
354045
Gly Asn ProCysAsnTyrArgLeuSerProArgLeulieLysPheGlu
505560
Leu Tyr PheValGlyLeuValTrpCysProGlyTrpThrThrlieGln
65707580
Gly Glu SerLeuThrArgSerArgThrArgValValAsnLysAlaVal
859095
Glu Asp PheAlaLysLysAlaValAlaAlaGlylieMetThrGlnGlu
100105110
Asp Ala AspProLeuLeuAsnAla
115120
權(quán)利要求
一種中華絨螯蟹抗脂多糖因子EsALF 2基因編碼蛋白，其特征在于含有序列表SEQ ID NO.1中氨基酸序列。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的中華絨螯蟹抗脂多糖因子EsALF-2的制備方法，其特征 在于(1)利用帶有限制性酶切位點(diǎn)的引物Pl和P2擴(kuò)增中華絨螯蟹EsALF-2基因編碼區(qū) 片段；(2)將pET32a載體與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)BamH I和Xho I雙酶切，連接后轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株 BL21(DE3)plysS;(3)測(cè)序鑒定重組子并進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，超聲波破碎處理菌體收獲重組蛋 白，經(jīng)鎳柱純化、復(fù)性后得到具有活性的抗脂多糖因子EsALF-2。
3.—種權(quán)利要求1所述的中華絨螯蟹抗脂多糖因子EsALF-2的應(yīng)用。其特征在于中 華絨螯蟹抗脂多糖因子EsALF-2可作為廣譜抗菌類藥物治療細(xì)菌、真菌感染，或用于免疫 增強(qiáng)劑、保健品、飼料添加劑的生產(chǎn)。
全文摘要
本發(fā)明涉及中華絨螯蟹抗脂多糖因子(EsALF-2)基因的體外重組表達(dá)技術(shù)及其功能鑒定。中華絨螯蟹抗脂多糖因子具有序列SEQ ID NO.1中氨基酸序列。本發(fā)明利用體外重組表達(dá)技術(shù)獲得了中華絨螯蟹抗脂多糖因子(EsALF-2)，該重組蛋白具有廣譜性的抑菌效果，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、革蘭氏陰性菌鰻弧菌(Listonella anguillarum)和真菌畢赤酵母(Pichia pastoris)的生長(zhǎng)都具有明顯的抑制效果，對(duì)它們起抑制作用的最小蛋白濃度分別為150μg mL-1，75μg mL-1和18.75μg mL-1。
文檔編號(hào)A61P37/04GK101914149SQ20101001149
公開日2010年12月15日 申請(qǐng)日期2010年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月16日
發(fā)明者宋林生, 張瑩, 王玲玲, 邱麗梅 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所