專利名稱：用于癌癥光動力學(xué)治療的靶向納米光藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及癌癥治療以及用于癌癥治療的治療制劑。特別是，本發(fā)明涉及用于癌癥光動力學(xué)治療的納米藥物、以及制備所述納米藥物的方法。
背景技術(shù)：
光動力學(xué)治療(Wiotodynami c Therapy, PDT)是用于治療許多類型癌癥和各種非惡性疾病的新興治療方式。在光動力學(xué)治療中，光敏藥物的光活化可產(chǎn)生活性氧簇 (Reactive Oxygen Species, R0S)，諸如單線態(tài)氧(1O2)、氧自由基或過氧化物，這些活性氧簇可以氧化破壞包括血漿、線粒體、溶酶體和細(xì)胞核膜在內(nèi)的細(xì)胞區(qū)室，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的不可逆損傷。在適當(dāng)?shù)臈l件下，光動力學(xué)治療的優(yōu)點(diǎn)是它是一種有效地、選擇性地破壞病體組織而不損害相鄰健康組織的方法。然而，盡管與目前的治療方法(例如手術(shù)、放射療法、和化學(xué)療法)相比光動力學(xué)治療具有其優(yōu)點(diǎn)，但其作為癌癥主流治療手段的一般臨床接受度仍然很低。這是因?yàn)槟壳肮鈩恿W(xué)治療技術(shù)存在一些重要的限制因素，諸如由于光敏(Photosensitive，PS)藥物的非特異性生物分布所造成的身體的過長光敏感性、藥物對組織穿透較好的光譜范圍的光吸收性低、光敏藥物的疏水性導(dǎo)致的在血液循環(huán)中不可控的聚集和給藥困難、親水性藥物的快速光漂白、非特異性的藥物分布導(dǎo)致的在靶部位達(dá)不到藥物的最佳濃度?？紤]到傳統(tǒng)方法缺乏有效的靶向性，因而目前技術(shù)水平的光動力學(xué)治療必須繼續(xù)開發(fā)用于靶向光動力學(xué)治療的結(jié)合物(該結(jié)合物將光敏劑與靶向配體，例如單克隆抗體、 肽、葉酸等，結(jié)合到一起)。重要的是，注意到這些方法與靶向光學(xué)診斷結(jié)合物的開發(fā)緊密相關(guān)；靶向光學(xué)診斷結(jié)合物組合了小熒光分子，該小熒光分子與靶向光動力學(xué)治療所用的相同的靶向配體相結(jié)合。然而，靶向光動力學(xué)治療目前的技術(shù)水平具有一些重大挑戰(zhàn)。(1) 大部分有效的光敏劑本質(zhì)上是疏水性的，具有固有的低水溶性，并且對脂類環(huán)境具有高親和性。這會導(dǎo)致兩種結(jié)果第一，當(dāng)在生理?xiàng)l件下注射光敏劑結(jié)合物時(shí)，光敏劑結(jié)合物形成與血漿蛋白結(jié)合的聚集體，并被細(xì)胞內(nèi)網(wǎng)系統(tǒng)從宿主中清除。這限制了結(jié)合物在任何靶組織中可以達(dá)到的有效濃度。第二，當(dāng)光敏劑結(jié)合物與靶細(xì)胞發(fā)生相互作用時(shí)，光敏劑的高親脂性促進(jìn)非特異性細(xì)胞攝取。此過程與活性靶向受體競爭，導(dǎo)致結(jié)合物在不表達(dá)靶受體的正常細(xì)胞中聚集。(2)單個(gè)光敏劑分子連接在單個(gè)靶向配體上的事實(shí)，意味著并入具有有限數(shù)量受體的細(xì)胞中的光敏劑的量是有限的。雖然將多個(gè)光敏劑分子(或它們的前體)與單個(gè)靶向配體相連接已經(jīng)做出很多的努力，但這仍然是個(gè)顯著的問題。此外，自由光敏劑的一個(gè)重要特性是產(chǎn)生活性氧簇的同時(shí)其自身被破壞，在光敏劑-配體結(jié)合物中存在相似的作用。此作用限制了傳送給組織的活性氧的總劑量。因此，在每個(gè)受體中達(dá)到光敏劑的高濃度是很重要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一方面提供了一種制備含光敏劑的納米顆粒的方法，所述納米顆粒適用于光動力學(xué)治療，該方法包括提供納米顆粒前體分子；將光敏劑偶聯(lián)到所述納米顆粒前體分子，從而產(chǎn)生結(jié)合光敏劑的納米顆粒前體； 并且利用所述納米顆粒前體的溶液沉淀或者自組裝，由所述結(jié)合光敏劑的納米顆粒前體形成納米顆粒。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種制備含光敏劑的納米顆粒的方法，所述納米顆粒適用于分子成像輔助靶向光動力學(xué)治療，該方法包括提供納米顆粒前體分子；將光敏劑與所述納米顆粒前體分子偶聯(lián)，從而提供結(jié)合光敏劑的納米顆粒前體；將磁和/或光對比劑加入到光敏劑納米顆粒前體結(jié)合物中；并且利用溶液沉淀或者分子自組裝，由含磁和/或光對比劑的所述光敏劑-納米顆粒前體混合物形成納米顆粒。在所述方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述納米顆粒是由選自由金屬硫酸鹽、 金屬磷酸鹽、金屬氧化物、殼聚糖、羧甲基殼聚糖(Carboxymethyl Chitosan, CMC)、 聚乙烯醇(Polyvinyl Alcohol, PVA)、聚苯乙烯(Polystyrene, PS)、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpyrrolidone, PVP)、聚乳酸(Polylactic Acid, PLA)、聚乙烯亞胺 (Polyethylenimine, PEI)、乳酸-羥基乙酸共聚物(Poly (Lactic-co-Glycolic Acid), PLGA)、聚己內(nèi)酉旨(Polycaprolactone，PCL)、聚乙二醇(Polyethelene Glycole，PEG)、以及其組合所組成的組的材料形成。在所述方法的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述金屬氧化物是二氧化硅，所述前體分子是正硅酸酯，所述納米顆粒的形成是通過用溶膠-凝膠法形成硅酸鹽粉末，使硅酸鹽粉末在堿性PH值以及超聲條件下的水解和縮合過程而形成膠體二氧化硅納米顆粒。在所述方法的又一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述光敏劑選自二氫卟吩A(Ce6)、 間-四(3-羥基苯基)二氫卟吩(m-THPC)、苯并卟啉衍生物單酸環(huán)A(BPD或者維替泊芬 (vert印orfin))、卟吩姆鈉(photofrin)、替莫泊芬(temoporfin) (Foscan )、玫瑰紅、金屬酞菁、以及其組合。本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種含光敏劑的納米顆粒，所述含光敏劑的納米顆?？赏ㄟ^如上所述的根據(jù)本發(fā)明的方法獲得。本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種含光敏劑的納米顆粒；所述納米顆粒包含光敏劑，該光敏劑通過至少一部分所述納米顆粒共價(jià)鍵合到納米顆粒基質(zhì)材料上并以單體分子與聚集體分子混合物的形式并入納米基質(zhì)材料中，其中，所述納米顆粒的Q帶吸收與索雷氏帶(Soret band)吸收的比值在0. 05和1. O之間。在本發(fā)明各方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述納米顆粒是由選自金屬硫酸鹽、金屬磷酸鹽、金屬氧化物、殼聚糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乳酸(PLA)、聚乙烯亞胺(PEI)^L 酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)、以及其組合所組成的組的材料形成。在本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例中，所述納米顆粒是由金屬氧化物構(gòu)成，優(yōu)選地，所述金屬氧化物是二氧化硅。在根據(jù)本發(fā)明的納米顆粒的又一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述光敏劑選自二氫卟吩%(&6)、間-四(3-羥基苯基)二氫卟吩(m-THPC)、苯并卟啉衍生物單酸環(huán)A(BPD或者維替泊芬)、卟吩姆鈉、替莫泊芬O7Oscan )、玫瑰紅、金屬酞菁、以及其組合。在根據(jù)本發(fā)明的納米顆粒的又一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述納米顆粒用光對比劑和/ 或磁對比功能劑摻雜。在又一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，光對比劑是用MruCu-Al或Cu-鹵素?fù)诫s的ZnS的發(fā)光量
點(diǎn)ο在又一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，磁對比功能劑是通過用Gd3+Je3+或Mn2+摻雜納米光藥物而得到。在又一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述納米顆粒包含經(jīng)共價(jià)鍵連接到最外層表面的癌癥靶向配體。優(yōu)選地，癌癥-靶向配體是奧曲肽(octreotide)。本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種可注射組合物或者用于口服的組合物，所述組合物包含如上所述根據(jù)本發(fā)明的納米顆粒和藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種利用光動力學(xué)治療法殺死癌細(xì)胞的方法，該方法包括使所述癌細(xì)胞與如上所述根據(jù)本發(fā)明的納米顆粒接觸，并用治療有效量的光照射所述納米顆粒，從而誘發(fā)所述納米顆粒釋放出單線態(tài)氧。本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種利用成像輔助光動力學(xué)治療法殺死癌細(xì)胞的方法；該方法包括使所述癌細(xì)胞與如上所述根據(jù)本發(fā)明的納米顆粒接觸，并且用治療有效量的光照射所述納米顆粒，從而誘發(fā)所述納米顆粒釋放出單線態(tài)氧；其中所述納米顆粒用光對比劑和/或磁對比劑摻雜，所述照射的方向用成像技術(shù)來引導(dǎo)，其中所述光對比劑或磁對比劑被用作標(biāo)記物，以指示癌細(xì)胞的位置、大小和擴(kuò)散范圍。


圖1示出了實(shí)施例1中所述實(shí)驗(yàn)的結(jié)果基于二氧化硅的、大小為90-100nm的納米光藥物的透射電子顯微照片；圖2示出了實(shí)施例1 3中所述實(shí)驗(yàn)的結(jié)果基于二氫卟吩e6@ 二氧化硅的納米光藥物的熒光激發(fā)光譜，表明與自由的光藥物相比，由于特定的處理?xiàng)l件，NPM-U NPM-2和 NPM-3在654nm處的吸收系統(tǒng)地增加；圖3示出了實(shí)施例4中所述實(shí)驗(yàn)的結(jié)果基于mTHPC 二氧化硅的納米光藥物的光致發(fā)光激發(fā)光譜，表明激發(fā)光譜完全改變，導(dǎo)致與自由mTHPC相比，基于mTHPC 二氧化硅的納米光藥物在紅色吸收帶的吸收增加約6倍；圖4示出了實(shí)施例5中所述實(shí)驗(yàn)的結(jié)果將納米光藥物的光降解性質(zhì)與具有幾乎相同的初始熒光強(qiáng)度的自由二氫卟吩％進(jìn)行比較。由于光敏作用期間產(chǎn)生的單線態(tài)氧，自由Ce56顯示出非?？焖俚墓馄仔再|(zhì)，而NPM即使在IOJ的照射后仍顯示出完全不同的非線性漂白特征，從而導(dǎo)致藥物的光穩(wěn)定性延長；圖5示出了實(shí)施例6中所述實(shí)驗(yàn)的結(jié)果在激光照射G05nm，30秒，左圖)下，自由二氫卟吩％在癌細(xì)胞內(nèi)快速光漂白的共聚焦顯微圖像，而在納米光藥物處理的細(xì)胞中， 即使在延長照射(360秒，右圖)后仍然顯示藥物的光活性；圖6示出了實(shí)施例7中所述實(shí)驗(yàn)的結(jié)果(a)X_射線衍射，(b)光致發(fā)光 (Photoluminescence,PL)光譜，和(c)照片，表明SiS = Mn摻雜的量子點(diǎn)的納米光藥物的熒光發(fā)射；圖7示出了實(shí)施例10中所述實(shí)驗(yàn)的結(jié)果振動樣品磁強(qiáng)計(jì)數(shù)據(jù)，表明Gd3+摻雜的納米光藥物的順磁性，與自由光藥物(Ce6)的抗磁性相比，Gd3+摻雜的納米光藥物適合于磁共振成像；圖8示出了實(shí)施例10中所述實(shí)驗(yàn)的結(jié)果參照水和自由Ce6,不同濃度的納米光藥物(Nanophotomedicine，NPM)的磁共振虛擬圖像；圖9示出了實(shí)施例11中所述實(shí)驗(yàn)的結(jié)果共聚焦顯微圖像，表明sst2受體+ve癌細(xì)胞(K562)對肽結(jié)合的納米光藥物的高效的細(xì)胞內(nèi)攝取；圖10示出了實(shí)施例11中所述實(shí)驗(yàn)的結(jié)果癌細(xì)胞的光動力學(xué)治療數(shù)據(jù)，表明與相同濃度的自由二氫卟吩％和對照納米顆粒相比，用納米光藥物處理K562細(xì)胞中細(xì)胞死亡增加(低細(xì)胞存活率)。圖10表明基于在654nm處的吸收，NPM的光動力學(xué)治療效果更好。
具體實(shí)施例方式本文中所用的術(shù)語“納米顆?！笔侵复笮榧s20 500歷、優(yōu)選地50 200nm、最優(yōu)選地為約IOOnm的微晶或者原始顆粒。該納米顆?？梢允怯袡C(jī)或無機(jī)的納米顆粒，包括高分子納米顆粒。該顆粒可制成干粉或液體分散體的形式。一般而言，具有較高附加值產(chǎn)品形式的納米顆粒，需要進(jìn)一步處理以形成漿體、薄膜或者器件。在本發(fā)明中，用作器件是可預(yù)見的。納米顆?？梢允菍?shí)心的或者多孔的，并且可以包括被一個(gè)或多個(gè)連續(xù)或準(zhǔn)連續(xù)的殼所包圍的內(nèi)核，或者可以包括單個(gè)整體的顆粒。核和殼都可以是有機(jī)、無機(jī)或者高分子的。合適的用于制備納米顆粒的納米微粒材料是簡單的金屬氧化物，諸如氧化硅(SiO2)、氧化鈦(TiO2)、氧化鋁(Al2O3)、氧化鐵(狗304、!^e2O3)、氧化鋅(ZnO)、氧化鈰(CeO2)和氧化鋯 (ZrO2)?；旌涎趸镆彩呛线m的，諸如氧化銦錫Gn2O3-SnO2或者ITOandium-Tin Oxide)) 和氧化銻錫(Antimony-TinOxide，ΑΤΟ)、硅酸鹽(硅酸鋁和硅酸鋯)、以及鈦酸鹽(鈦酸鋇 (BaTiO3))。其它類型的納米顆粒，包括各種復(fù)合氧化物、半導(dǎo)體、非氧化物陶瓷(例如，碳化鎢)，以及金屬也適用于某些實(shí)施例中。除半導(dǎo)電的氧化物之外，諸如TW2和ιτο，半導(dǎo)體納米晶(經(jīng)常稱為“量子點(diǎn)”)。用于制備納米顆粒的其它技術(shù)包括樹枝狀大分子(高度支化的合成聚合物)或者其他聚合物的使用。通常將光敏劑聯(lián)接到樹枝狀大分子的表面或者置于樹枝狀大分子內(nèi)部的空隙中，從而實(shí)現(xiàn)靶位定向和可控傳輸、或者靶向與檢測的組合。該納米顆?？珊线m地利用膠體合成法合成，并且可采用膠晶的形式。合適的納米顆粒前體包括可聚合的單體，優(yōu)選地，該單體具有2個(gè)，優(yōu)選地大于2個(gè)，如3、4或5個(gè)用于分子間鍵合的位置，以便形成互相連接的網(wǎng)狀前體，該網(wǎng)狀前體聚集形成納米顆粒。本文中所用的術(shù)語“納米載體器件”是指所發(fā)明的納米顆粒形式的組合物，其中所述顆粒起到諸如光敏劑、以及可選擇的成像劑和靶向配體等化合物載體的作用。 本文中所用的術(shù)語“光敏劑”是指如二氫卟吩％ (Ce6)、m-THPC等化合物。本文中所用的術(shù)語“納米光藥物”是指與納米顆粒復(fù)合的光敏劑。本文中所用的術(shù)語“摻雜的納米光藥物”是指用磁共振對比劑和/或光對比劑摻雜的納米光藥物。本文中所用的術(shù)語“摻雜的”表示有意地將少量(大約1-15% )的另一種物質(zhì)(在這里，指光對比劑和/或磁對比劑)加入納米顆粒晶體中。本文中所用的術(shù)語“納米光藥物結(jié)合物”是指與靶向配體結(jié)合的納米光藥物。本文中所用的術(shù)語“摻雜的納米光藥物結(jié)合物”是指與靶向配體結(jié)合并用磁共振 (MR)對比劑和/或光對比劑摻雜的摻雜納米光藥物。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)了一種提高光動力學(xué)治療效果的納米光藥物制劑。所發(fā)明的納米光藥物制劑包括基于金屬硫酸鹽、金屬磷酸鹽、金屬氧化物的納晶的納米顆粒，或者基于殼聚糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乳酸(PLA)、聚乙烯亞胺(PEI)、乳酸-羥基乙酸共聚物 (PLGA)、或其它合適的聚合物、以及其組合的納米顆粒；例如具有金屬氧化物核和聚合物殼的顆粒、或者具有金屬氧化物殼的聚合物核、或者上述的任意其它組合，包括陶瓷構(gòu)造的核或殼，其中，所述納米顆粒，或者其殼或核，是用光敏劑分子摻雜，并且其中，所述光敏劑分子以準(zhǔn)聚集狀態(tài)分散于所述納米顆粒材料中。本文中所用的術(shù)語“準(zhǔn)聚集狀態(tài)”表示光敏劑存在于納米載體(納米顆粒)中的聚集程度不同，亦即，既有聚集體的形式也有自由光敏劑(單體單元)的形式。在本發(fā)明中，納米顆粒內(nèi)的光敏劑的獨(dú)特狀態(tài)是半(準(zhǔn))聚集狀態(tài)。這種狀態(tài)可以定義為，與光敏劑在紫外-可見光譜的Soret帶中的吸收相比，光敏劑在Q帶區(qū)域的吸收增加。更具體地，(穩(wěn)定的)半聚集狀態(tài)的Q帶吸收與Soret帶吸收的比值(Q/幻優(yōu)選地為彡0. 05至1。Soret帶是任何光敏劑以單體形式存在時(shí)的主要吸收，但是Soret帶處于藍(lán)色區(qū)域內(nèi)，藍(lán)色區(qū)域?qū)M織的穿透性低。Q帶是紅色-近紅外區(qū)域(具有更好的組織穿透性)的伴隨帶，但是光敏劑在該區(qū)域的吸收性較低。通常，各單體的Q/S值約為0. 05。在本發(fā)明中，通過控制光敏劑分子與納米顆?；|(zhì)的胺化程度(連接程度)獲得了較高的Q帶吸收。例如，正如下面實(shí)施例中更詳細(xì)的說明，NPM-I的胺化程度低于 NPM-2,而NPM-2的胺化程度低于NPM-3。如這些具體的NPM的實(shí)例中所示，根據(jù)氨基丙基三乙氧基硅燒(Aminopropyl Triethoxysilane, APTS)和正硅酸四乙酯 CTetraethyl Orthosilicate, TE0S)的濃度以及其它反應(yīng)參數(shù)，可以通過控制Ce6中羧基胺化的程度獲得NPM在Q-帶654nm處不同的吸收水平(參見圖2，NPM1_2和3是指在654nm處不同程度的吸收)。例如，NPM-I的Q/S值約為0. 3的，NPM-2的Q/S值約為0. 5，NPM-3的Q/S值約為0. 7，NPM-4的Q/S值約為1 (最大值，其中Q帶吸收被最大化)。因此，本發(fā)明涉及包含光敏藥物的金屬硫酸鹽、金屬磷酸鹽或(優(yōu)選地)金屬氧化物或者高分子納米顆粒的納米顆粒，所述納米顆粒的Q/S值至少為0. 05、更優(yōu)選地至少為 0. 1、更優(yōu)選地至少為0. 3。這個(gè)值與譜峰最大值無關(guān)to帶的最大值是在大約600-900nm之間的某處，S帶的最大值是在350-500nm之間的某處)。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，與別的納米粒子相比，這種納米顆粒提供高度改善的光穩(wěn)定性。在優(yōu)選實(shí)施例中，所述納米晶體是無毒性的，并且可適當(dāng)?shù)匕l(fā)光。這為將針對癌癥的靶向配體優(yōu)選地連接到此復(fù)合結(jié)構(gòu)的外表面作好了準(zhǔn)備。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，此光敏劑-納米顆粒-靶向配體結(jié)合物尤其克服了現(xiàn)有技術(shù)中的如下問題(1)光敏劑的聚集/親脂性；(2)每個(gè)靶向配體的光敏劑濃度低； (3)光敏劑在可見光譜紅色區(qū)域內(nèi)的吸收性低；(4)光敏劑的非特異性累積、(5)光敏劑分子在血液循環(huán)中的不可控聚集；(6)難以利用光敏劑自身的熒光性質(zhì)測量劑量；以及(7)缺乏非侵入式分子成像引導(dǎo)的劑量測量和藥物代謝動力學(xué)估計(jì)。納米顆粒結(jié)合物的表面化學(xué)是這樣的避免在生理環(huán)境中的聚集、結(jié)合物不被細(xì)胞內(nèi)網(wǎng)系統(tǒng)隔離、以及對正常細(xì)胞的非特異性靶向最小化。也發(fā)現(xiàn)，可以將(非常)高濃度的光敏劑裝載入納米顆粒中而形成準(zhǔn)聚集狀態(tài)。納米顆粒內(nèi)的光敏劑的量是合適的。不同于聚集狀態(tài)的自由光敏劑，處于準(zhǔn)聚集狀態(tài)的光敏劑分子高效率地吸收光， 從而高效率地產(chǎn)生活性氧簇。此結(jié)果是出乎意料的，可以用光敏劑在納米顆粒內(nèi)的特定構(gòu)像來解釋。不希望受到理論的約束，認(rèn)為納米顆粒內(nèi)的光敏作用的過程導(dǎo)致藥物的可控原位單體化，由此在延長的時(shí)段內(nèi)可控地釋放出單線態(tài)氧。除納米顆粒結(jié)合物的光動力學(xué)組分以外，本發(fā)明的組合物還可以額外地將光對比劑加入納米顆粒(的核或殼)中。合適的光對比劑包括發(fā)光標(biāo)記物，例如aiS:Mn2+ 量子點(diǎn)；熒光標(biāo)記物，例如吲哚菁綠andocyanine Green, ICG)；及光學(xué)染料，例如亞甲藍(lán) (Methylene Blue，MB)。這些標(biāo)記物使光學(xué)圖像引導(dǎo)的局部藥物傳輸成為可能，光學(xué)圖像引導(dǎo)的局部藥物傳輸可顯著提高對某些形式癌癥的療效?；趽诫s納米顆粒的總重量，納米顆粒中合適的光對比劑含量為約0. 0001 15wt%、優(yōu)選為0. 0005 5wt%。除了納米顆粒結(jié)合物的光動力學(xué)成分以外，本發(fā)明組合物還可以額外地將磁對比劑加入納米顆粒(的核或殼)中。這使得磁共振成像成為可能。在臨床應(yīng)用中，用磁共振成像來確定結(jié)合物的系統(tǒng)藥物代謝動力學(xué)參數(shù)具有明顯的優(yōu)勢，光的穿透性決定了不能用光來測定。基于摻雜納米顆粒的總重量，合適的磁對比劑含量約0. 0001 15wt%、優(yōu)選為 0. 0005 5wt%。如上所述，本發(fā)明顯著改善了光敏藥物和光動力學(xué)治療當(dāng)前的諸多局限。這些改善是由于所述納米光藥物制劑的特定性質(zhì)所致。與常規(guī)的自由藥物相比，這種新納米制劑的主要優(yōu)點(diǎn)之一是，光敏分子以準(zhǔn)聚集方式(一種介于單體分子和聚集體分子之間的狀態(tài)，即其中單體分子和聚集體分子共存)與載體器件復(fù)合。一般而言，在溶液或粉末的形式下，由于范德華力之類的分子間吸引力，使得單個(gè)(單體)光敏染料分子易于發(fā)生聚集。這種聚集是有效應(yīng)用光動力學(xué)治療的一個(gè)關(guān)鍵障礙，因?yàn)樵诜肿拥木奂癄顟B(tài)下，該藥物的熒光效力和單線態(tài)氧的產(chǎn)率顯著降低。光敏藥物的聚集是由分子間相互作用的程度所決定的，因此光敏藥物的聚集是分子在溶劑介質(zhì)中的濃度的函數(shù)。光動力學(xué)治療中所使用的大部分光藥物本質(zhì)上是疏水性的，因此在生理?xiàng)l件下易于發(fā)生聚集。因此，當(dāng)使用自由藥物時(shí)，為維持光分子在循環(huán)中的單體狀態(tài)，通常只能用非常低的濃度。另一方面，藥物完全的單體形式還具有對穿透組織的紅色光的吸收性低的缺點(diǎn)。此外，單體單元經(jīng)歷快速的光漂白，由于光分子濃度下降至低于有效水平，導(dǎo)致治療的提前結(jié)束。現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)，可以實(shí)現(xiàn)完全單體化和聚集之間的折中，由此改善并延長光動力學(xué)治療的應(yīng)用。因此，本發(fā)明提供了使光藥物分子向納米載體器件基質(zhì)(納米顆?；|(zhì))的可控復(fù)合?？煽貜?fù)合通過以下方式實(shí)現(xiàn)提供具有官能團(tuán)的納米載體器件，所述納米載體器件可以共價(jià)連接作為單體單元的單個(gè)光藥物分子和準(zhǔn)聚集簇，使得單體單元和被納米顆?；|(zhì)中的官能團(tuán)所分離的聚集簇共存。實(shí)現(xiàn)此目的一個(gè)合適方式是由結(jié)合光敏劑的納米顆粒前體制備納米顆粒。如此方法得到的結(jié)構(gòu)中，單體單元在激光照射時(shí)開始釋放單線態(tài)氧簇， 部分單線態(tài)氧活潑地分解光藥物分子的準(zhǔn)聚集聚合體，從而增加新的單體單元。因此，將為長時(shí)間的激光治療連續(xù)地提供光活性的單體單元。最重要地，本發(fā)明的納米顆粒制劑在固體狀態(tài)(粉末形式)下或者在水性/生物化學(xué)介質(zhì)中生理化學(xué)穩(wěn)定，因此在生理?xiàng)l件下光物理性質(zhì)基本上保持不變。這具有如下優(yōu)點(diǎn)不存在藥物在血液中聚集和與之相關(guān)的藥物的藥物代謝動力學(xué)問題。本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是納米光藥物的獨(dú)特構(gòu)造和光藥物的復(fù)合可顯著提高光藥物在可見光譜的紅色和近紅外區(qū)(在此區(qū)域光輻射的組織穿透性更高)的光吸收。此性質(zhì)對于提高光治療的療效非常重要，因?yàn)榕c電磁光譜的紫外區(qū)域或藍(lán)色區(qū)域(Soret譜帶)相比，大部分的自由光藥物分子在紅色區(qū)域(即，Q帶)吸收最小。這限制了自由光藥物的使用，因?yàn)樾枰镁哂懈呓M織穿透性的光輻射(如紅色光)對整個(gè)腫瘤內(nèi)部區(qū)域的藥物進(jìn)行光敏化。因此，需要改善光藥物在紅色區(qū)域(即Q-帶)的吸收性質(zhì)。因此，本發(fā)明提供了一種在Q帶的光吸收顯著較高的，是在Soret譜帶吸收的許多倍的光藥物納米制劑。這種吸收性質(zhì)的改善是所述納米制劑所特有的，吸收性質(zhì)的改善是通過準(zhǔn)聚集藥物分子與納米載體器件的可控超分子相互作用而實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明的又一個(gè)重要特征涉及納米載體器件內(nèi)的光藥物的較高穩(wěn)定性，光藥物的較高穩(wěn)定性可延長細(xì)胞毒性單線態(tài)氧的釋放。一般而言，單體自由光藥物，特別是親水性分子(如二氫卟吩％)，由于受分子自身所產(chǎn)生的單線態(tài)氧的攻擊而發(fā)生快速光漂白。這使得在病體部位難以獲得充分濃度的光藥物，因而限制了在破壞癌癥中的藥物療效。為使分子對光漂白穩(wěn)定而對分子進(jìn)行的直接修飾，會影響單線態(tài)氧產(chǎn)生的量子產(chǎn)率，是不可取的。因此，重要的是制備保持單線態(tài)氧的產(chǎn)率同時(shí)發(fā)生較少光漂白的光藥物制劑。因此，本發(fā)明提供了一種納米光藥物制劑，其中藥物的單體單元沒有暴露在全激光的漂白作用下。相反，作為單體單元與準(zhǔn)聚集單元的穩(wěn)定的混合物，光藥物與納米載體基質(zhì)復(fù)合到一起，如此，在激光照射時(shí)，由單體產(chǎn)生的單線態(tài)氧使準(zhǔn)聚集單元解聚集，以致連續(xù)地提供毒性濃度的單線態(tài)氧，即使是在長時(shí)間照射和/或高光劑量下。本發(fā)明某些實(shí)施例的又一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是在實(shí)施光治療之前或?qū)嵤┕庵委熎陂g，納米光藥物能夠提供病體部位的磁和光對比成像。成像引導(dǎo)的放射治療是臨床實(shí)踐中的新興領(lǐng)域，其中對癌癥的精確位置、大小和擴(kuò)散范圍(血管生成/轉(zhuǎn)移)進(jìn)行檢測并用來指導(dǎo)放射治療。這是通過，在治療前和治療期間，使藥物在體內(nèi)的實(shí)際成像坐標(biāo)(通過計(jì)算機(jī)斷層掃描或磁共振成像顯示出)與照射治療計(jì)劃一致而實(shí)現(xiàn)。這種成像輔助光治療在有效控制癌癥方面具有很大優(yōu)勢。因此，能夠提供具有熒光標(biāo)記物和/或磁對比劑的本發(fā)明的納米光藥物，并且使用由此摻雜的納米光藥物連同治療劑是本發(fā)明的一個(gè)重要方面。在本發(fā)明各方面的又一個(gè)實(shí)施例中，給納米光藥物結(jié)構(gòu)提供特異性地靶向病體部位(如癌癥)的性質(zhì)。這可以通過給納米光藥物表面提供靶向部分(如受體-配體)而實(shí)現(xiàn)。這有助于實(shí)現(xiàn)癌癥的靶向光動力學(xué)治療。基于納米顆粒的總重量，靶向配體合適的含量為大約0. 00001 lwt%。為了證明這個(gè)概念，本發(fā)明人已制備了包含光敏劑、納米顆粒和靶向配體的納米光藥物。選擇間-四羥基苯基二氫卟吩(m-THPC/R)SCan)和二氫卟吩A(Ce6)作為光敏藥物，選擇納米微粒的二氧化硅作為納米顆粒，選擇奧曲肽作為靶向配體。奧曲肽是合成的生長抑素類似物。許多神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤和(活化的)免疫細(xì)胞都表達(dá)高密度的生長抑素受體 (sst)。本領(lǐng)域技術(shù)人員明白可以改變對光敏劑、納米顆粒和靶向配體的選擇。為證實(shí)該方法的有效性，在實(shí)驗(yàn)室階段，本發(fā)明人已將用如此方法制備的靶向納米光藥物應(yīng)用于各種水性介質(zhì)和體外SSt陽性(K562細(xì)胞，人類骨髓細(xì)胞系)以及野生型細(xì)胞中。以下實(shí)施例中所述的，結(jié)合物的體外吸收和激發(fā)光譜、單線態(tài)氧量子產(chǎn)率數(shù)據(jù)和細(xì)胞增殖測定證實(shí)了這些納米光藥物表現(xiàn)出所期望的療效。重要的是注意到本發(fā)明人設(shè)想可以采用相似的方法來靶向其它受體，并且對光敏劑和納米顆粒的選擇并不挑剔。本發(fā)明提供了一種新型的納米光藥物，該藥物能夠在體內(nèi)靶向癌細(xì)胞、利用雙模熒光和磁共振成像來增強(qiáng)腫瘤對比度、以及在可見光照射下通過可控傳輸?shù)幕钚匝醮貋砥茐陌┘?xì)胞。本發(fā)明的一個(gè)特征是將光敏劑以期望的準(zhǔn)聚集方式與納米顆粒結(jié)合，以及發(fā)現(xiàn)這改變了光敏劑的物理化學(xué)性質(zhì)，使得光敏劑適用于有效的靶向光動力學(xué)治療。此結(jié)合可產(chǎn)生準(zhǔn)聚集狀態(tài)的光敏劑。與自由非結(jié)合藥物相比，該準(zhǔn)聚集狀態(tài)的光敏劑能更好地吸收穿透組織波長的光，以及在光照射時(shí)，容許可控地釋放活性氧簇，這個(gè)發(fā)現(xiàn)是出乎預(yù)料的。本發(fā)明的治療組合物可以與靶向配體和磁對比功能劑相結(jié)合，這樣可以支持成像輔助光動力學(xué)治療的應(yīng)用，這是本發(fā)明的一個(gè)特殊的優(yōu)勢。制備本發(fā)明納米光藥物的方法根據(jù)納米顆粒的類型、以及光敏劑和納米顆?；|(zhì)(用于制備納米顆粒的材料) 的化學(xué)性質(zhì)，本發(fā)明的納米光藥物可以采用許多不同方式來制備。至關(guān)重要的是，光敏劑以準(zhǔn)聚集狀態(tài)與納米顆粒相結(jié)合。正如本文中所示，可以通過在低溫(例如20-80°C )下使前體材料從溶液中沉淀成為納晶或者通過高溫(熱)處理而獲得合適的納米顆粒。優(yōu)選地，通過從溶液或者膠體中沉淀獲得納米顆粒。在合適的條件下發(fā)生沉淀形成納米顆粒的合適的前體材料包括但不限于金屬硫化物、金屬磷酸鹽和金屬氧化物、以及其組合，諸如硅酸鹽和磷酸鈣。一種特別優(yōu)選的方法是本領(lǐng)域已知的用于制備膠體二氧化硅顆粒的方法。顆粒可以是無定形結(jié)晶或者完全晶化。金屬硫化物、金屬磷酸鹽和/或金屬氧化物顆?？梢詥渭兊厥褂没蛘吒采w或結(jié)合高分子材料形成陶瓷使用。本發(fā)明的納米顆粒摻雜有光敏劑、發(fā)光材料和磁性材料，優(yōu)選地是在形成顆粒期間包含進(jìn)去。優(yōu)選地，光敏劑以共價(jià)鍵與納米顆粒相結(jié)合。因此，制備二氧化硅納米顆粒的話， 適當(dāng)?shù)?并且優(yōu)選地)制備硅酸鹽反應(yīng)性的光敏劑。硅烷偶聯(lián)劑非常適于用作光敏劑與硅酸鹽之間的交聯(lián)劑。氨基丙基三乙氧基硅烷(APTS)非常適于用作與硅酸鹽反應(yīng)的化合物， 以產(chǎn)生具有胺官能團(tuán)的硅酸鹽。在納米顆粒是硅酸鹽的一個(gè)實(shí)施例中，制備本發(fā)明納米光藥物的方法中的一個(gè)步驟是提供氨反應(yīng)性光敏劑。為了達(dá)到此目的，通常在溶劑DMSO中，使光敏劑與摩爾數(shù)過量的碳二亞胺(如EDC (EDAC))反應(yīng)，優(yōu)選在丁二酰亞胺(如磺基NHS)存在下，適當(dāng)?shù)鼗罨然墓饷魟?每個(gè)Ce6分子具有三個(gè)羧基)。在此反應(yīng)中，使光敏劑上的羧基活化，生成氨反應(yīng)性中間體，如氨反應(yīng)性磺基-NHS酯類。合適地，活化反應(yīng)容許進(jìn)行約為1 10小時(shí)， 通常約為4小時(shí)，而產(chǎn)生氨反應(yīng)性光敏劑。可選地，利用凝膠過濾法對該產(chǎn)物進(jìn)行純化。在這種實(shí)施例中制備的第二步驟合適地是使氨反應(yīng)性光敏劑與氨基丙基三乙氧基硅烷(APTS)反應(yīng)而產(chǎn)生硅酸鹽反應(yīng)性光敏劑(官能化的光敏劑)。合適地，此偶聯(lián)反應(yīng)在暗處、室溫下進(jìn)行3 4小時(shí)。由此步驟所形成的化合物的一個(gè)例子是Ce6-APTS。在下一個(gè)步驟中，使硅酸鹽反應(yīng)性光敏劑，例如Ce6-APTS,與用于利用溶膠-凝膠法合成納米結(jié)構(gòu)二氧化硅粉末的正硅酸酯前體物，諸如正硅酸四乙酯(四乙氧基硅烷， TE0S)和正硅酸四甲酯(Tetramethyl Orthosilicate, TM0S)(四甲氧基硅烷)反應(yīng)，而產(chǎn)生結(jié)合光敏劑的正硅酸酯(例如Ce6-TEOS或者Ce6-TMOS)。適合地，此結(jié)合反應(yīng)在99 %乙醇中進(jìn)行2 3小時(shí)。結(jié)合光敏劑的正硅酸酯形成納米顆粒器件的前體，其中埋入硅烷偶聯(lián)的準(zhǔn)聚集光敏劑，而形成本發(fā)明的納米光藥物。通過在溶膠-凝膠反應(yīng)中使用這些結(jié)合光敏劑的正硅酸酯前體而獲得本發(fā)明的納米顆粒。溶膠-凝膠反應(yīng)中的初始階段涉及正硅酸酯前體的專一性水解，以及水解產(chǎn)物的縮合而形成小(3 4個(gè)硅)顆粒，該小顆粒聚集而形成較大的膠體氧化硅顆粒，較大膠體氧化硅顆?？勺罱K縮合而形成硅膠。然而，優(yōu)選地這后一階段不是本發(fā)明方法的一部分。該顆粒具有大約90 IOOnm的最終尺寸，并且在缺酸的條件下通常不縮合形成凝膠。結(jié)合光敏劑的正硅酸酯前體(例如結(jié)合Ce6-的TEOS和/或TMOS前體)的水解和縮合產(chǎn)生納米大小的氧化硅粉末，其中光敏劑共價(jià)鍵合在氧化硅基質(zhì)上。 通過向乙醇介質(zhì)中加入少量的水和強(qiáng)堿，如NH4O4或其它胺源或者NaOH，可實(shí)現(xiàn)結(jié)合的TEOS和/或TMOS前體在水溶液中的水解。接著，對此水溶液進(jìn)行超聲波處理，例如以2分鐘為間隔進(jìn)行10分鐘的超聲波處理，超聲波處理導(dǎo)致與氧化硅基質(zhì)復(fù)合的準(zhǔn)聚集光敏劑的納米顆粒沉淀。然后，可通過離心將如此沉淀出的納米光藥物顆粒從水性介質(zhì) (通常是乙醇/水/胺的混合物)中分離出來，并且可選地，用水清洗并再分散于PBS或水中。盡管在上述實(shí)施例中，原則上APTS改性的硅酸鹽前體可以與氨反應(yīng)性光敏劑發(fā)生反應(yīng)，但優(yōu)選的是使偶聯(lián)APTS的光敏劑與硅酸鹽前體反應(yīng)，因?yàn)檫@導(dǎo)致光敏劑以更有利的準(zhǔn)聚集的狀態(tài)并入生長中的納米顆粒中。因此，優(yōu)選地，給光敏劑提供與納米顆粒前體共價(jià)連接的官能團(tuán)，從而產(chǎn)生官能化的光敏劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員對于使分子(如光敏劑)與納米顆粒前體結(jié)合的可能性是熟知的。這些技術(shù)一般包括將氨基_、硅烷_、巰基_、羥基-和/或環(huán)氧基官能團(tuán)引入光敏劑，以及隨后將光敏劑與納米顆粒前體結(jié)合，可選地使用交聯(lián)劑。當(dāng)更一般地提及光敏劑的氨基烷基硅烷化的這種實(shí)施例時(shí)，制備與根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的納米顆粒前體共價(jià)結(jié)合的官能化光敏劑的方法，也可描述成使用起連接劑作用的雙官能單體，將光敏劑與納米顆粒前體物相連接。非常合適地，雙官能單體可具有兩種不同的化學(xué)官能團(tuán)，以便一種官能團(tuán)能夠與納米顆粒前體反應(yīng)，而另一種官能團(tuán)能夠與光敏劑的官能化基團(tuán)反應(yīng)。在如下條件下，將官能化的光敏劑與納米顆粒前體混合在溶液或懸浮液中(i) 容許光敏劑以共價(jià)鍵與納米顆粒前體共價(jià)連接從而形成結(jié)合光敏劑的納米顆粒前體，以及 (ii)能夠經(jīng)由所述納米顆粒前體的分子間連接形成納米顆粒前體復(fù)合物，所述納米顆粒前體復(fù)合物聚集并通過隨后的縮合和聚集步驟而形成納米顆粒。優(yōu)選地，步驟(i)可在步驟 (ii)之前發(fā)生。這導(dǎo)致光敏劑以準(zhǔn)聚集狀態(tài)與納米顆粒結(jié)合。另外，在制備結(jié)合光敏劑的納米顆粒期間或之后，可用發(fā)光標(biāo)記物和/或磁對比標(biāo)記物摻雜結(jié)合光敏劑的納米顆粒。優(yōu)選地以如下所述方式實(shí)施該結(jié)合步驟。
發(fā)光量子點(diǎn)-摻雜的納米光藥物用發(fā)光材料摻雜納米顆粒的方法通常是按如下方式實(shí)施。首先，以如上所述方法制備結(jié)合光敏劑的納米顆粒前體。在此前體的水解和縮合期間，通過將標(biāo)記物添加至水解和縮合溶液中，而將發(fā)光標(biāo)記物摻雜入納米基質(zhì)中。然后，施加條件以通過所述納米顆粒前體的分子間縮合形成納米顆粒前體復(fù)合物，且所述納米顆粒前體復(fù)合物聚集以形成納米顆粒。在正硅酸酯前體的情況下，這些包括提供例如1 5%的NH4O415適當(dāng)量的發(fā)光標(biāo)記物是例如在沉淀溶液中的0. 01 μ M ZnS:Mn2+0 10分鐘的超聲波處理導(dǎo)致與準(zhǔn)聚集的( 和 SiS = Mn2+量子點(diǎn)(仍然埋在納米顆?；|(zhì)內(nèi))復(fù)合的二氧化硅納米顆粒發(fā)生沉淀。通過離心將沉淀出的摻雜納米光藥物從介質(zhì)中分離出來，并且優(yōu)選地清洗并儲存在PBS中。就本發(fā)明納米光藥物的給藥而言，優(yōu)選將該器件懸浮于PBS中。摻雜磁對比劑的納米光藥物用磁對比劑摻雜納米顆粒的方法與上述發(fā)光標(biāo)記物的方法基本相同。首先，以如上所述方法制備結(jié)合光敏劑的納米顆粒前體。將磁對比劑的前體例如0.001 10% Gd3+ (GdNO3)或 0. 001 ~ 10% (Mn2+)MnCl2 或 0. 001 ~ 10% Fe3+ (FeCl3)加入至形成納米顆粒的水解和縮合溶液中。例如，在適當(dāng)?shù)臈l件下，使用硝酸釓導(dǎo)致與準(zhǔn)聚集光敏劑結(jié)合并摻雜有Gd3+(仍然埋在納米顆粒基質(zhì)非晶相內(nèi))的納米顆粒的沉淀。通過離心將沉淀出的納米顆粒從介質(zhì)中分離出，并且優(yōu)選地在使用前對納米顆粒進(jìn)行清洗。本發(fā)明的應(yīng)用靶向治療是藥物的中心目的，對靶向治療部位周圍正常組織的損傷最小化是非常重要的。實(shí)際上，光動力學(xué)治療可以應(yīng)用于體內(nèi)的任何部位。雖然，光照后，光動力學(xué)治療會引起系統(tǒng)免疫反應(yīng)，但活性氧簇的作用半徑遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于單個(gè)細(xì)胞的半徑。實(shí)際上，光敏劑結(jié)合物沒有暗毒性，因此局部選擇性(在光照范圍內(nèi))提供顯著的機(jī)會。沒有細(xì)胞或組織對高濃度活性氧簇有抵抗力或者是已經(jīng)表現(xiàn)出形成抵抗力。本發(fā)明可以克服現(xiàn)有技術(shù)靶向光動力學(xué)治療的許多顯著缺點(diǎn)?，F(xiàn)有技術(shù)中的缺點(diǎn)是光敏劑結(jié)合物具有有限的生物藥效率、非特異性攝取、以及每個(gè)靶向配體產(chǎn)生活性氧簇的能力有限。如本文中所述，利用sst2 表達(dá)細(xì)胞來證明本發(fā)明方法的原理。本發(fā)明可以用來靶向其他受體并且可以用于其他光敏齊U。癌癥的分子靶體是分布廣泛的并且對不同腫瘤類型具有特異性。有明顯的理由應(yīng)對乳腺、前列腺、肺、大腦腫瘤以及消化道癌癥的靶向光動力學(xué)治療受體進(jìn)行研究。也可以對其他非惡性疾病進(jìn)行靶向。例如，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的患病關(guān)節(jié)中的免疫細(xì)胞活化后會表達(dá)高密度的生長抑素(Somatostatin，SS)受體(sst)。靶向光動力學(xué)治療可以是治療此疾病 (類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎)的理想候選方法?，F(xiàn)在，將通過以下非限制性實(shí)施例來更詳細(xì)地說明本發(fā)明。 實(shí)施例以下各實(shí)施例描述了制備納米光藥物(NPM)的方法，將兩個(gè)獨(dú)立的具有代表性的光敏劑(即二氫卟吩A(Ce6)或mTHPC)以適當(dāng)?shù)臏?zhǔn)聚集狀態(tài)共價(jià)地埋入納米尺寸(50 150nm)的二氧化硅或殼聚糖的載體器件內(nèi)，最終結(jié)構(gòu)具有期望的在Q-帶(紅色_近紅外) 區(qū)域(在該光譜范圍內(nèi)，光的組織穿透性較好)的光吸收性質(zhì)。在各實(shí)施例中描述了 用適用于光成像的第二成分熒光量子點(diǎn)以及適用于磁共振對比成像的第三成分順磁離子摻雜這些納米光藥物從而形成摻雜的納米光藥物和/或與活性癌癥靶向肽配體結(jié)合從而形成 (摻雜的)納米光藥物結(jié)合物、新型光漂白特征、到癌細(xì)胞的傳輸、以及使用所述納米光藥物的光動力學(xué)治療。用于制備納米光藥物的試劑包括正硅酸四乙酯(TEOS，Sigma 98% )或正硅酸四甲酯(TMOS)、氨基丙基三乙氧基硅烷(APTS，Sigma 98% )、氨水(25%溶液，Sigma Aldrich)，1-乙基-3-[3- 二甲氨基丙基]碳二亞胺鹽酸鹽(EDAC或EDC)、N-羥基磺基丁二酰亞胺(磺基-NHS)、N，N' - 二丁二酰亞胺基碳酸酯(DSC，Sigma, 98% 乙醇(99%， Sigma)、2-(N-嗎啉基)乙磺酸(MES)緩沖液(Sigma)、磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)、二氫卟吩 e6、間-四羥基苯基二氫卟吩(mTHPC) ,ZnSiMn量子點(diǎn)(QD)、硝酸釓(Gd3+) (99%, Sigma)、和二甲基亞砜(DMSO，Sigma)，所有試劑都是分析純級，使用時(shí)沒有進(jìn)一步純化。在該合成方法中，不同于現(xiàn)有技術(shù)(美國第7364754號專利)，我們使用了無表面活性劑的非膠束介質(zhì)，該介質(zhì)含有簡單、低成本的乙醇或DMSO與水均相混溶的溶劑體系。^MM 1 用CeJ乍為光敏劑制各納米光藥物NPM-I在此實(shí)施例中介紹了基于光敏劑二氫卟吩A(Ce6)的納米光藥物(即，NPM_1)的制備，該納米光藥物的最終結(jié)構(gòu)在Q帶(6Mnm)區(qū)域的光吸收度是自由C^6的大約3倍。在5ml 的 99% DMSO 中，1 μ M濃度的 Ce6 (市售，購自例如 Porphyrin Products (洛根，猶他州))與10 15倍摩爾過量的EDAC和10 15摩爾過量的磺基-NHS反應(yīng)。反應(yīng)4小時(shí)后，利用凝膠過濾法對結(jié)合產(chǎn)物進(jìn)行純化，得到氨反應(yīng)性光敏劑，該氨反應(yīng)性光敏劑進(jìn)一步與200 μ L的硅烷偶聯(lián)劑APTS反應(yīng)。偶聯(lián)反應(yīng)在暗處、室溫下進(jìn)行3 4小時(shí)，得到化合物Ce6-APTS。在下一步驟中，在IOml的99%乙醇介質(zhì)中，Ce6-APTS與600 μ L (大約 600mg)的TEOS或TMOS反應(yīng)2 3小時(shí)，形成硅烷偶聯(lián)的準(zhǔn)聚集光敏劑的前體。加入:3ml 的水和600μ L NH4O4，以2分鐘為間隔，進(jìn)行10分鐘超聲波處理，對此前體進(jìn)行水解，產(chǎn)生與氧化硅基質(zhì)復(fù)合的準(zhǔn)聚集G6的納米顆粒的沉淀。通過離心(6000rpm，5分鐘)將沉淀出的NPM-I從溶劑介質(zhì)中分離出，用蒸餾水清洗后，再分散入PBS。透射電子顯微鏡照片(圖1)顯示形成了大小為90 IOOnm的均勻球狀納米顆粒。 NPM-I的熒光激發(fā)光譜(圖2a)顯示在654nm處的光吸收對應(yīng)于導(dǎo)致單線態(tài)氧產(chǎn)生的三重態(tài)電子躍遷，和/或該結(jié)構(gòu)的熒光強(qiáng)度是自由光敏劑熒光強(qiáng)度的大約3倍。這表明，納米光藥物結(jié)構(gòu)內(nèi)的光敏劑不再是自由形式，而是利用由氨基丙基硅烷基所提供酰胺鍵而共價(jià)連接的復(fù)合統(tǒng)一體。實(shí)施例2 具有作為光敏劑的納米光藥物NPM-2的特征在此實(shí)施例中，說明了 Q帶光吸收比自由G6增加大約4倍的納米光藥物(NPM-2) 的工藝。在5ml的99%乙醇中，1 μ M濃度的&6與10 15倍摩爾過量的EDAC和10 15 摩爾過量的磺基-NHS反應(yīng)。在反應(yīng)約4小時(shí)后，利用凝膠過濾法對結(jié)合物進(jìn)行純化，得到氨反應(yīng)性光敏劑，該光敏劑與300 μ L的硅烷偶聯(lián)劑APTS反應(yīng)。偶聯(lián)反應(yīng)在暗處、室溫下進(jìn)行 3 4小時(shí)，得到化合物Ce6-APTS。在下一個(gè)步驟中，在IOml的99%乙醇介質(zhì)中，Ce6-APTS 與800 μ L的TEOS或TMOS反應(yīng)3小時(shí)，生成ΝΡΜ-2的前體。加入3ml的水和600 μ L的 NH4O4，以2分鐘為間隔，進(jìn)行15分鐘超聲波處理，對此前體進(jìn)行水解，從而產(chǎn)生ΝΡΜ-2納米光藥物的沉淀，其中Ce56以較高的水平準(zhǔn)聚集并且仍然通過酰胺鍵以共價(jià)鍵埋入于納米顆?；|(zhì)內(nèi)。通過離心將沉淀出的NPM-2顆粒從乙醇介質(zhì)中分離出，并用蒸餾水清洗后再分散入PBS中。圖2中所示NPM-2的熒光激發(fā)光譜顯示，在654nm處的Q帶吸收與自由藥物相比增加了約4倍。Soret帶區(qū)域內(nèi)的吸收大體上保持不變。與自由光敏劑的情況相比，Q 帶的吸收增加可以導(dǎo)致在更深的組織深度處產(chǎn)生單線態(tài)氧。_仿丨丨麵恪賊錢奪勿NPM-3在又一個(gè)實(shí)施例中，說明了 Q帶區(qū)域的吸收比自由Ce56增加大約7倍的納米光藥物(NPM-3)的制備。在5ml的99%乙醇中，1 μ M濃度的&6與10 15倍摩爾過量的EDAC和10 15 摩爾過量的磺基-NHS反應(yīng)。反應(yīng)4小時(shí)后，利用凝膠過濾法對該結(jié)合產(chǎn)物進(jìn)行純化，得到氨反應(yīng)性Ce6,氨反應(yīng)性( 與600 μ L硅烷偶聯(lián)劑APTS反應(yīng)。偶聯(lián)反應(yīng)在暗處、室溫下進(jìn)行 3 4小時(shí)，得到化合物Ce6-APTS。在下一個(gè)步驟中，在IOml的99%乙醇介質(zhì)中，Ce6-APTS 與1000 μ L的TEOS或TMOS反應(yīng)2 3小時(shí)，從而形成硅烷偶聯(lián)的準(zhǔn)聚集光藥物的前體。加入3ml的水和800 μ L NH4O4，以2分鐘為間隔，進(jìn)行20分鐘超聲波處理，對此前體進(jìn)行水解， 導(dǎo)致與進(jìn)一步準(zhǔn)聚集的Ce6(仍然埋在納米顆粒基質(zhì)內(nèi))復(fù)合的ΝΡΜ-3納米顆粒發(fā)生沉淀。 通過離心將沉淀出的ΝΡΜ-3顆粒從乙醇介質(zhì)中分離出來，用蒸餾水清洗后再分散入PBS待用。ΝΡΜ-3的熒光激發(fā)光譜(圖2)顯示在654nm區(qū)域處更高的光吸收，比自由藥物的光吸收高將近7倍，且大約是相同結(jié)構(gòu)的Soret帶吸收的75%。本發(fā)明的重要成就是利用化學(xué)修飾的程度來可控地增加納米光藥物的Q帶吸收、以及最重要的使納米載體器件內(nèi)納米光藥物穩(wěn)定。所述納米載體器件保護(hù)光敏劑分子在水中、或PBS中、或者由于血液中蛋白質(zhì)的影響、或者在病體部位積聚后，不再進(jìn)行任何進(jìn)一步的不可控的聚集。因此，本發(fā)明克服了一個(gè)最大難題從自由光敏劑中所觀察到的光敏劑不可控聚集和光敏性的喪失。實(shí)施例4 用mTHPC作為光敏劑制備納米光藥物NPM-4在此實(shí)施例中，說明了用另一種重要的光敏劑mTHPC制備納米光藥物(NPM-4)。該產(chǎn)品顯示光吸收性質(zhì)從Soret帶100%轉(zhuǎn)移至在652nm處的Q帶，同時(shí)保持其高熒光和光敏劑活性。1 μ M濃度的氨反應(yīng)性mTHPC與600 μ L硅烷偶聯(lián)劑APTS在暗處反應(yīng)M小時(shí)。M 小時(shí)后，在IOml的99%乙醇介質(zhì)中，mTHPC-APTS結(jié)合物與1000 μ L的TEOS或TMOS反應(yīng)6 小時(shí)，形成硅烷偶聯(lián)的準(zhǔn)聚集納米光藥物的前體(mTHPC)。加入6ml的水和800 μ L NaOH, 以2分鐘為間隔，進(jìn)行20分鐘超聲波處理，對此前體進(jìn)行水解，從而產(chǎn)生與準(zhǔn)聚集mTHPC復(fù)合的NPM-4納米顆粒的沉淀。如圖3中所示，此產(chǎn)物顯示與自由m-HPC完全不同的吸收/激發(fā)特征。發(fā)現(xiàn)在大約 400nm處的Soret帶吸收完全消失，而光治療所需重要的在Q帶的吸收增加了 70 80%。 Q帶吸收與自由光敏劑的Soret帶吸收同樣高，這導(dǎo)致光動力學(xué)治療期間療效的顯著增加。 此結(jié)構(gòu)克服了自由光敏劑的主要缺點(diǎn)之一，亦即在光譜紅色區(qū)域內(nèi)的低吸收。實(shí)施例5 納米光藥物NPM-3的離體光物理性質(zhì)在此實(shí)施例中，說明了在實(shí)施例3中所制備納米光藥物(NPM-3)的光物理性質(zhì)。顯示了，在光動力學(xué)治療中，與自由藥物相比該產(chǎn)物具有顯著的改善。
藥物的光穩(wěn)定性對于疾病(如癌癥)的長時(shí)間治療是非常重要的。然而，光藥物， 特別是水溶性藥物(如Ce6)，經(jīng)歷非?？焖俚墓饨到猓?yàn)楣馑幬锸艿剿幬镒陨懋a(chǎn)生的單線態(tài)氧的降解。由于藥物在病體部位濃度不足，導(dǎo)致治療提前結(jié)束。在此實(shí)施例中，顯示納米光藥物如何克服此問題。利用熒光光譜儀，對具有幾乎相同的初始熒光強(qiáng)度(與藥物濃度相關(guān))的自由Ce6 與納米光藥物(NPM-3)的光漂白特征進(jìn)行了比較。兩個(gè)產(chǎn)物的樣品，在相同條件下(lOJ/cm2 的總劑量)，進(jìn)行激光照射。圖4示出了兩個(gè)樣品的熒光發(fā)射特征的變化。自由Ce56顯示典型的快速漂白，從而導(dǎo)致在2. 5J/cm2的較低光照強(qiáng)度下藥物的失活，而NPM-3結(jié)構(gòu)顯示獨(dú)特的非線性特征，以及埋入藥物的光穩(wěn)定性，即使在接受lOJ/cm2的光劑量照射后。NPM-3 的光漂白曲線顯示包括藥物熒光發(fā)射的增加和減少的多種狀態(tài)。這揭示了埋入藥物與光發(fā)生相互作用時(shí)空間多樣化的本質(zhì)(準(zhǔn)聚集的)，并且表明該藥物的原位單體化以及之后的漂白重復(fù)發(fā)生。實(shí)際上，這導(dǎo)致藥物結(jié)構(gòu)內(nèi)的長期穩(wěn)定性，即使在延長治療的時(shí)間后。實(shí)施例6納米光藥物NPM-3的體內(nèi)光物理件質(zhì)在此實(shí)施例中，對納米光藥物在癌細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)光穩(wěn)定性進(jìn)行了測試，并且與自由光敏劑的光穩(wěn)定性進(jìn)行了比較。將白血病細(xì)胞K562以800. 000個(gè)細(xì)胞/孔接種于12孔組織培養(yǎng)板中，并且用相同濃度的光敏劑制備的自由Ce6(IyM)和納米光藥物(NPM-3)進(jìn)行處理。在利用共聚焦顯微鏡進(jìn)行成像之前，將細(xì)胞在37°C下培養(yǎng)3小時(shí)。通過利用405nm激光激發(fā)被細(xì)胞攝入的光敏劑或納米光藥物，進(jìn)行熒光成像。為了記錄癌細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)區(qū)域中的光漂白(與治療效果具有顯著相關(guān)性)，在規(guī)定的激光照射周期(1 360秒)后進(jìn)行成像。圖fe示出了用自由處理的細(xì)胞的共聚焦顯微圖像，其中發(fā)現(xiàn)該藥物在激光照射30秒后的區(qū)域中被完全漂白，而在圖恥中用納米光藥物處理的細(xì)胞顯示甚至高達(dá)360 秒的穩(wěn)定的熒光性。這就證實(shí)了如實(shí)施例5中所述觀察到的光譜特征在生物細(xì)胞內(nèi)(即在體內(nèi))也是存在的。納米光藥物的這種獨(dú)特特征對于延長癌癥光治療時(shí)間是關(guān)鍵的，因?yàn)楸３炙幬锏臒晒饣钚詫τ诠庵委煼浅Ｖ匾?。^mm 7 發(fā)光^■子點(diǎn)-mmm^mmm^在此實(shí)施例中，說明了用SiS = Mn2+的發(fā)光量子點(diǎn)摻雜的納米光藥物NPM-5的制備， 從而形成摻雜的納米光藥物。發(fā)光量子點(diǎn)對包括癌癥在內(nèi)的疾病的體內(nèi)成像是有前途的候選者。然而，通常所使用的發(fā)光量子點(diǎn)組成中(CdS、CdSe、CdTe等)含有毒重金屬鎘。這就限制了該量子點(diǎn)以及用該量子點(diǎn)摻雜的納米器件在人臨床應(yīng)用中的使用。相反，本發(fā)明使用完全無毒的、基于金屬(Cu或Al)或過渡金屬(Mn)所摻雜的ZnS的、用于并入納米光藥物的量子點(diǎn)，該量子點(diǎn)可用于NPM的體內(nèi)光學(xué)成像而不影響埋入的光敏劑的熒光和產(chǎn)生單線態(tài)氧的性質(zhì)。因此，在一個(gè)典型的制備中，在5ml的99%乙醇中，ΙμΜ ( 與10 15倍摩爾過量的EDAC和10 15摩爾過量的磺基-NHS反應(yīng)。反應(yīng)2 4小時(shí)后，利用凝膠過濾法對結(jié)合的產(chǎn)物進(jìn)行純化，得到氨反應(yīng)性“活化的”光敏劑，該光敏劑與600 μ L的硅烷偶聯(lián)劑APTS 反應(yīng)。在暗處、室溫下反應(yīng)3 4小時(shí)，得到化合物Ce6-APTS-I。3 4小時(shí)后，在IOml的 99%乙醇介質(zhì)中，Ce6-APTS-I與1000 μ L的TEOS或TMOS反應(yīng)2 3小時(shí)，從而形成硅烷偶聯(lián)的準(zhǔn)聚集的光敏劑的前體。量子點(diǎn)在此前體的水解和縮合期間摻雜進(jìn)納米基質(zhì)中。加入3ml含0. 01 μ M ZnSiMn2+量子點(diǎn)的水以及800 μ L NH4O4，進(jìn)行10分鐘超聲波處理，對此前體進(jìn)行水解和縮合，導(dǎo)致與準(zhǔn)聚集的( 和SiS = Mn2+量子點(diǎn)(仍然埋入納米顆?；|(zhì)中)復(fù)合的二氧化硅的納米顆粒的沉淀。通過離心將沉淀出的摻雜的納米光藥物從乙醇介質(zhì)中分離出，用蒸餾水清洗后再分散于PBS中待用。圖6a示出了埋入納米光藥物內(nèi)的ZnS量子點(diǎn)的X射線衍射圖案，圖6b和圖6c示出了在600nm處的熒光發(fā)射光譜以及水分散樣品的照片，水分散樣品中，埋入的aiS:Mn發(fā)射出橙色，從而證實(shí)了量子點(diǎn)成功摻雜入摻雜的納米光藥物內(nèi)。在摻雜的納米光藥物定位于靶組織之后，可利用光纖激發(fā)和發(fā)射器件而將來自量子點(diǎn)的熒光發(fā)射用于體內(nèi)的癌癥成像。這有助于改善光動力學(xué)劑量測量的現(xiàn)有方法，現(xiàn)有方法依賴于自由光敏劑的熒光性質(zhì)。將量子點(diǎn)用于癌癥檢測和劑量測量，有助于在不使光敏劑發(fā)生光漂白(破壞)的情況下達(dá)到這些目的。實(shí)施例8 釓(Gd3+)摻雜的納米光藥物的制備在此實(shí)施例中，描述了用磁對比劑釓(Gd3+)摻雜的NPM-5的制備，從而形成摻雜的納米光藥物。在5ml的99%乙醇中，1 μ M濃度的&6與10 15倍摩爾過量的EDAC和10 15 摩爾過量的磺基-NHS反應(yīng)。反應(yīng)2 4小時(shí)后，利用凝膠過濾法對結(jié)合的產(chǎn)物進(jìn)行純化， 得到氨反應(yīng)性“活化的”光藥物，該光藥物與600 μ L的硅烷偶聯(lián)劑APTS反應(yīng)。反應(yīng)在暗處、 室溫下進(jìn)行3 4小時(shí)，得到化合物Ce6-APTS-1。3 4小時(shí)后，在IOml的99%乙醇介質(zhì)中，使Ce6-APTS-I與1000 μ L的TEOS或TMOS反應(yīng)2 3小時(shí)，從而形成硅烷偶聯(lián)的準(zhǔn)聚集的納米光藥物的前體。磁對比劑在此前體水解和縮合期間摻雜入納米基質(zhì)中。加入:3ml 含0. OlM硝酸釓的水，接著加入800 μ L NH4O4，進(jìn)行10分鐘超聲波處理，使此前體水解和縮合，從而產(chǎn)生與準(zhǔn)聚集Ce56復(fù)合且用Gd3+ (仍然埋在納米顆?；|(zhì)的非晶相中)摻雜的二氧化硅納米顆粒的沉淀。通過離心將沉淀出的納米顆粒從乙醇介質(zhì)中分離出，用蒸餾水清洗后再分散入PBS。使用振動樣品磁強(qiáng)計(jì)進(jìn)行的磁研究顯示了與自由C^6的抗磁反應(yīng)相比，Gd3+摻雜的納米光藥物具有順磁性質(zhì)(圖7)。此外，用1. 5Τ臨床磁共振，對在M孔板中用摻雜的納米光藥物處理過的一批大約80. 000個(gè)癌細(xì)胞進(jìn)行成像，顯示此體系在磁共振成像中的適用性。圖8示出了用不同濃度的摻雜的納米光藥物處理過的細(xì)胞、以及對照細(xì)胞(未經(jīng)處理的細(xì)胞)、和用自由處理過的細(xì)胞的Tl加權(quán)對比成像?？梢钥闯?，隨著納米光藥物濃度的增加對比度增加，從而證實(shí)本發(fā)明中所述的摻雜的納米光藥物可以用于基于磁共振成像的診斷以及光動力學(xué)治療。這對預(yù)治療計(jì)劃、利用完全非侵入技術(shù)進(jìn)行施用藥物的藥代動力學(xué)探究和治療后的療效分析具有重要意義。實(shí)施例9 錳(Μη2+)_摻雜的納米光藥物的制備在此實(shí)施例中，描述了用磁對比劑錳(Mn2+)摻雜的ΝΡΜ-6的制備，從而形成摻雜的納米光藥物。在5ml的99%乙醇中，1 μ M濃度的&6與10 15倍摩爾過量的EDAC和10 15 摩爾過量的磺基-NHS反應(yīng)。反應(yīng)2 4小時(shí)后，利用凝膠過濾法對結(jié)合的產(chǎn)物進(jìn)行純化， 得到氨反應(yīng)性“活化的”光藥物，該藥物與600 μ L硅烷偶聯(lián)劑APTS反應(yīng)。反應(yīng)在暗處、室溫下進(jìn)行3 4小時(shí)，得到化合物Ce6-APTS-I。3 4小時(shí)后，在IOml的99%乙醇介質(zhì)中，使Ce6-APTS-I與1000 μ L的TEOS或TMOS反應(yīng)2 3小時(shí)，從而形成硅烷偶聯(lián)的準(zhǔn)聚集納米光藥物的前體。磁對比劑在此前體的水解和縮合期間摻雜入納米基質(zhì)中。加入3ml含 0. OlM硫酸錳的水，接著加入800 μ L的NH4O4，進(jìn)行10分鐘超聲處理，使此前體水解和縮合， 從而導(dǎo)致與準(zhǔn)聚集的C^6復(fù)合且用Μη2+(仍然埋在納米顆?；|(zhì)的非晶相內(nèi))摻雜的二氧化硅納米顆粒的沉淀。通過離心將沉淀出的納米顆粒從乙醇介質(zhì)中分離出，用蒸餾水清洗后再分散入PBS。實(shí)施例10 鐵(Fe3+)摻雜的納米光藥物的制備在此實(shí)施例中，描述了用磁對比劑鐵(Fe3+)摻雜的NPM-5的制備，從而形成摻雜的納米光藥物。在5ml的99%乙醇中，1 μ M濃度的&6與10 15倍摩爾過量的EDAC和10 15 摩爾過量的磺基-NHS反應(yīng)。反應(yīng)2 4小時(shí)后，利用凝膠過濾法對結(jié)合的產(chǎn)物進(jìn)行純化， 得到氨反應(yīng)性“活化的”光藥物，該光藥物與600 μ L的硅烷偶聯(lián)劑APTS反應(yīng)。反應(yīng)在暗處、 室溫下進(jìn)行3 4小時(shí)，得到化合物Ce6-APTS-1。3 4小時(shí)后，在IOml的99%乙醇介質(zhì)中，使Ce6-APTS-I與1000 μ L的TEOS或TMOS反應(yīng)2_3小時(shí)，從而形成硅烷偶聯(lián)的準(zhǔn)聚集納米光藥物的前體。磁對比劑在此前體的水解和縮合期間摻雜入納米基質(zhì)中。加入3ml含 0. OlM三氯化鐵(FeC13)的水，接著加入800 μ L的NH4O4，進(jìn)行10分鐘的超聲處理，使此前體水解和縮合，從而導(dǎo)致與準(zhǔn)聚集Ce56復(fù)合且用狗3+(仍然埋在納米顆?；|(zhì)的非晶相內(nèi)) 摻雜的二氧化硅的納米顆粒的沉淀。通過離心將沉淀出的納米顆粒從乙醇介質(zhì)中分離出， 用蒸餾水清洗后再分散入PBS。使用振動樣品磁強(qiáng)計(jì)進(jìn)行的磁研究顯示了與自由C^6的抗磁反應(yīng)相比，Gd3+摻雜的納米光藥物具有順磁性(圖7)。此外，通過使用1. 5Τ臨床磁共振成像對在M孔板中用摻雜的納米光藥物處理的一批大約80. 000個(gè)癌細(xì)胞進(jìn)行成像，而顯示此體系在磁共振成像中的適用性。圖8示出了用不同濃度的摻雜的納米光藥物處理過的細(xì)胞、以及對照細(xì)胞 (未經(jīng)處理的細(xì)胞)和用自由( 處理過的細(xì)胞的Tl加權(quán)對比成像。可以看出，隨著納米光藥物濃度的增加對比度增加，從而證實(shí)本發(fā)明中所述的摻雜的納米光藥物可以用于基于磁共振成像的診斷以及光動力學(xué)治療。這對預(yù)治療計(jì)劃、利用完全非侵入式技術(shù)進(jìn)行施用藥物的藥物代謝動力學(xué)探究和治療后的療效分析具有重要意義。實(shí)施例11在此實(shí)施例中，描述了將肽結(jié)合的納米光藥物傳輸?shù)桨┘?xì)胞、以及用紅色激光 (發(fā)射波長為652nm)使結(jié)合的納米光藥物敏化的光動力學(xué)治療。將白血病細(xì)胞K562以800. 000個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔微量滴定板中，并用自由 Ce6(1 μ Μ)、具有與自由光敏劑相等濃度的光敏劑的納米光藥物(NPM-3)0. 05mg/ml、和作為對照的裸露的二氧化硅納米顆粒0. 05mg/ml進(jìn)行處理。在37°C下將細(xì)胞在5% CO2中培養(yǎng) 3小時(shí)。接著，將未結(jié)合的自由光敏劑、納米光藥物和二氧化硅納米顆粒從孔板中除去，并用新鮮介質(zhì)清洗2次。使用測試樣品來研究肽結(jié)合的納米光藥物的細(xì)胞攝取。圖9示出了癌細(xì)胞對結(jié)合的納米光藥物的明顯的亞細(xì)胞攝取，從而證實(shí)了成功的藥物傳輸。隨后，利用固態(tài)激光器進(jìn)行光動力學(xué)治療，該固體激光器發(fā)射652nm的相干光，該光通過光纖照射器耦合，固體激光器將均勻的激光功率傳輸給96孔板的所有孔上。用激光功率計(jì)測得的所施用的總光劑量是20J/cm2。在4000秒的時(shí)段內(nèi)輸送5mW量的激光功率， 而獲得20J/cm2的總劑量。在光動力學(xué)治療后，將細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)72天，利用標(biāo)準(zhǔn)測定(羅氏細(xì)胞增殖試劑 WST-1，羅氏診斷有限公司，曼海姆，德國(Roche Cell Proliferation Reagent WST-I, Roche Diagnostics GmbH,Mannheim, Germany))來評價(jià)處理過的細(xì)胞的細(xì)胞存活率和增殖能力，其中應(yīng)用了甲臜晶體的光吸收(光密度)G80nm)，甲臜晶體是由于這些細(xì)胞的代謝作用而在活細(xì)胞的線粒體內(nèi)形成。因此，此試驗(yàn)提供了關(guān)于由于光動力學(xué)治療法所造成細(xì)胞死亡/存活的直接信息。圖10示出了 WST測定的結(jié)果。這些數(shù)據(jù)清楚地表明與自由光敏劑相比，所有三種納米光藥物結(jié)構(gòu)都顯示具有較高的治療效果(殺死癌細(xì)胞)。這證實(shí)了所述結(jié)構(gòu)在光動力學(xué)治療中的有利性質(zhì)。
權(quán)利要求
1.一種含光敏劑的納米顆粒的制備方法，其特征在于，所述納米顆粒適用于分子成像輔助靶向光動力學(xué)治療，所述方法包括(a)提供納米顆粒前體分子；(b)將光敏劑偶聯(lián)到所述納米顆粒前體分子，從而產(chǎn)生結(jié)合光敏劑的納米顆粒前體；(c)將磁和/或光對比劑加入所述光敏劑-納米顆粒前體結(jié)合物中，從而產(chǎn)生光敏劑-納米顆粒前體混合物；以及(d)通過溶液沉淀或者分子自組裝，由步驟(c)中所產(chǎn)生的所述光敏劑-納米顆粒前體混合物形成納米顆粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述納米顆粒是由選自由金屬硫酸鹽、金屬磷酸鹽、金屬氧化物、殼聚糖、羧甲基殼聚糖(CMC)、聚乙烯醇(PVA)、聚苯乙烯(PS)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乳酸(PLA)、聚乙烯亞胺(PEI)、乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)、聚己內(nèi)酯(PCL)、聚乙二醇(PEG)、以及其組合所組成的組的材料形成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述金屬氧化物是二氧化硅，所述前體分子是正硅酸酯，并且所述納米顆粒的形成是通過正硅酸酯前體在堿性PH值以及超聲條件下的水解和縮合過程而形成膠體二氧化硅納米顆粒。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述光敏劑選自二氫卟吩e6(Ce6)、 間-四(3-羥基苯基)二氫卟吩(m-THPC)、苯并卟啉衍生物單酸環(huán)A(BPD或維替泊芬)、卟吩姆鈉、替莫泊芬O^oscan )、玫瑰紅、金屬酞菁、以及其組合。
5.一種含光敏劑的納米顆粒，其特征在于，所述納米顆粒通過根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法獲得。
6.一種含光敏劑的納米顆粒，其特征在于，所述納米顆粒包括光敏劑，所述光敏劑通過至少一部分所述納米顆粒共價(jià)鍵合到納米顆?；|(zhì)材料上并以單體分子與聚集體分子混合物的形式并入所述納米顆?；|(zhì)材料中，其中，所述納米顆粒的Q帶吸收與索雷氏帶吸收的比值在0. 05和1. 0之間。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的納米顆粒，其特征在于，所述納米顆粒是由選自由金屬硫酸鹽、金屬磷酸鹽、金屬氧化物、羧甲基殼聚糖(CMC)、聚乙烯醇(PVA)、聚苯乙烯(PS)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乳酸(PLA)、聚乙烯亞胺(PEI)、乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)、聚己內(nèi)酯(PCL)、聚乙二醇(PEG)、以及其組合所組成的組的材料形成。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的納米顆粒，其特征在于，所述金屬氧化物是二氧化硅。
9.根據(jù)權(quán)利要求5至8中任一項(xiàng)所述的納米顆粒，其特征在于，所述光敏劑選自二氫卟吩4(( )、間-四(3-羥基苯基)二氫卟吩(m-THPC)、苯并卟啉衍生物單酸環(huán)A(BPD或者維替泊芬)、卟吩姆鈉、替莫泊芬O7Oscan )、玫瑰紅、金屬酞菁、以及其組合。
10.根據(jù)權(quán)利要求5至9中任一項(xiàng)所述的納米顆粒，其特征在于，所述納米顆粒用光對比劑和/或磁對比功能劑摻雜。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的納米顆粒，其特征在于，所述光對比劑是用Mn2+、Cu+-Al3+或 Cu+-鹵素或其組合摻雜的SiS的發(fā)光量子點(diǎn)。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的納米顆粒，其特征在于，所述磁對比功能劑是通過用Gd3+、 Fe3+或Mn2+摻雜納米光藥物而得到。
13.根據(jù)權(quán)利要求5至12中任一項(xiàng)所述的納米顆粒，其特征在于，所述納米顆粒包含經(jīng)共價(jià)鍵連接到最外層表面的癌癥-靶向配體。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的納米顆粒，其特征在于，所述癌癥-靶向配體是奧曲肽或奧曲肽酸或者它們的羧酸酯衍生物，諸如靶向于生長抑素2型受體的DTPA-Tyrf-奧曲肽、 DOTA-Tyr3-奧曲肽、DTPA-Tyr3-奧曲肽酸或者DOTA-Tyr3-奧曲肽酸。
15.一種可注射組合物或者用于口服的組合物，其特征在于，所述組合物包含根據(jù)權(quán)利要求5至14中任一項(xiàng)所述的納米顆粒以及藥學(xué)上可接受的載體。
16.一種利用光動力學(xué)治療法殺死癌細(xì)胞的方法，其特征在于，所述方法包括使所述癌細(xì)胞與根據(jù)權(quán)利要求5至14中任一項(xiàng)所述的納米顆粒接觸，并用治療有效量的光照射所述納米顆粒，從而誘發(fā)所述納米顆粒釋放出單線態(tài)氧。
17.一種利用成像輔助光動力學(xué)治療法殺死癌細(xì)胞的方法，其特征在于，所述方法包括使所述癌細(xì)胞與根據(jù)權(quán)利要求5至14中任一項(xiàng)所述的納米顆粒接觸，并且用治療有效量的光照射所述納米顆粒，從而誘發(fā)所述納米顆粒釋放出單線態(tài)氧，其中所述納米顆粒用光對比劑和/或磁對比劑摻雜，所述照射的方向用成像技術(shù)來引導(dǎo)，其中所述光或磁對比劑被用作標(biāo)記物，以指示癌細(xì)胞的位置、大小和擴(kuò)散范圍。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種含光敏劑的納米顆粒，所述納米顆粒包括一種光敏劑，所述光敏劑通過至少一部分所述納米顆粒共價(jià)鍵合到納米顆?；|(zhì)材料上并以準(zhǔn)聚集狀態(tài)并入所述納米顆?；|(zhì)中。本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種制備本發(fā)明納米顆粒的方法、以及使用所述納米顆粒進(jìn)行光動力學(xué)治療殺死癌細(xì)胞的方法。
文檔編號A61K41/00GK102573910SQ200980160922
公開日2012年7月11日 申請日期2009年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月12日
發(fā)明者M·科亞庫蒂, S·卡斯卡科瓦, 亨利克斯·約翰尼斯·科尼利厄斯·瑪麗亞·斯提倫伯格, 多米尼克·詹姆斯·羅賓遜, 珊提庫瑪爾·奈爾 申請人:愛麗達(dá)維紗瓦偉德雅佩大學(xué), 鹿特丹伊拉斯謨大學(xué)醫(yī)療中心