專利名稱：利用動物組織粉末制造多孔立體支架的方法及其多孔立體支架的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制造多孔立體支架的方法及通過該方法制成的多孔立體支架，尤指一種利用來自動物衍生組織的粉末來制造多孔立體支架的方法及通過該方法制成的多孔立體支架，其中利用顆粒過濾法將來自動物衍生組織的粉末制成因應(yīng)其目的與治療用途的具有多種尺寸、孔隙率、形狀及結(jié)構(gòu)的多孔立體支架。
背景技術(shù)：
關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞為只存在于軟骨的中層衍生細(xì)胞。軟骨為一種無血管組織，其由生成自軟骨細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)所組成。其不會造成發(fā)炎反應(yīng)，也不會在受損時自行再生。一旦軟骨受損，其自行再生的能力相當(dāng)有限，并最后將導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎，而骨關(guān)節(jié)炎將讓病人的生活質(zhì)量受到很大的影響。目前，典型處置受損軟骨的方法包含例如磨削關(guān)節(jié)成形術(shù)及微骨折術(shù)的骨髓刺激法；通過移植骨骼及/或軟骨組織到受損區(qū)域的軟骨鑲嵌成形術(shù)；通過培養(yǎng)并移植自體軟骨細(xì)胞到受損區(qū)域的自體軟骨細(xì)胞移植(ACI)等。由于骨髓刺激法以關(guān)節(jié)內(nèi)窺鏡進(jìn)行侵入式治療只需很短的時間，使其成為現(xiàn)今廣泛使用的方式。此方法的優(yōu)點在于其操作流程簡單且所需操作時間短。然而，卻很難保存治療軟骨及形成血液及干細(xì)胞所必需的血塊(包含干細(xì)胞)。此外，血塊物理上并不穩(wěn)定且很難產(chǎn)生正常的軟骨。更明確的說，衍生自骨髓的血塊無法在手術(shù)程序中予以保存使得重建的軟骨極可能變成纖維狀軟骨而非正常的軟骨。因此，很難預(yù)期通過該骨髓刺激能夠成功治愈。此外，該軟骨鑲嵌成形術(shù)主要在將軟骨組織分離自重量負(fù)擔(dān)輕及少摩擦力的區(qū)域后，將軟骨組織填滿到損壞區(qū)域。此技術(shù)對于治愈損壞的區(qū)域效果相當(dāng)不錯，但問題在于很難避免造成二次傷害。近年來，自體軟骨細(xì)胞移植(ACI)主要通過培養(yǎng)并移植自體軟骨細(xì)胞到受損區(qū)域以治療受損的軟骨。該自體軟骨細(xì)胞移植ACI是臨床認(rèn)可的細(xì)胞移植治療術(shù)(Brittberg M.等人，新英格蘭醫(yī)學(xué)期刊，331 :889，1994)。然而，有一個缺點，即軟骨的流失區(qū)域必須在分離骨膜后緊密的縫合以覆蓋之。此外，既然該骨膜可允許軟骨細(xì)胞被增生，導(dǎo)致受損區(qū)域在手術(shù)后疼痛。要進(jìn)行包括兩個步驟的手術(shù)過程也很麻煩；以關(guān)節(jié)內(nèi)窺鏡手術(shù)將軟骨細(xì)胞分離并在體外培養(yǎng)一長段時間，再將細(xì)胞懸浮液植入受損區(qū)域。因此，自體軟骨細(xì)胞移植的缺點在于須在手術(shù)前分離軟骨并以長時間培養(yǎng)軟骨細(xì)胞。本案發(fā)明人發(fā)現(xiàn)假若立體支架在分離動物組織，尤其，動物軟骨之后，再藉由軟骨細(xì)胞植入，并通過“軟骨制成粉末過程”及“顆粒過濾法”制成，則立體支架可在不受限于其物理特性、孔隙率、形狀、結(jié)構(gòu)及尺寸下，有效再生透明軟骨組織。近來，直接從動物取得的同種或異種組織或器官在去細(xì)胞化后，可應(yīng)用于各種支架或薄膜的制造中。
至今，小腸黏膜下組織(SIS)、膀胱黏膜下組織(UBM)、皮膚、人類羊膜(HAM)等已充分商品化或研究。舉例來說，“Alloderm”通過將捐贈者的皮膚去細(xì)胞化來取得， “OASIS”通過將小腸黏膜下組織(SIQ去細(xì)胞化來取得，其用作傷口的修飾劑，及UBM通過將豬膀胱組織去細(xì)胞化來取得。此外，研發(fā)出由第I型及第III型膠原蛋白所組成的 "Chondro-gide"(商標(biāo))(雙層膠原膜)以再生軟骨并積極被軟骨再生領(lǐng)域所研究。詳細(xì)的說，軟骨組織依其生化組成包括組織液、大分子及其它物質(zhì)。65-80%的組織液是由水所組成，并進(jìn)一步包含蛋白質(zhì)、無機鹽、氣體及各種代謝物。組織液一般在高濃度下帶有正電以與帶有負(fù)電的蛋白多糖平衡。約60%的大分子是由膠原蛋白所組成。藉由與蛋白多糖鍵結(jié)在一起以形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)并賦予軟骨張力與彈性，大分子允許軟骨保有其形狀。大多數(shù)的軟骨，即90-95%是由第II型膠原蛋白所組成，該第II型膠原蛋白是由三條α型鏈組合成螺旋結(jié)構(gòu)以形成纖維狀。蛋白多糖是個蛋白復(fù)合物，其藉由與糖胺多糖(GAG)鍵結(jié)來形成，糖胺多糖(GAG)包含 4-硫酸軟骨素、6-硫酸軟骨素、硫酸角質(zhì)素及之類。大多數(shù)的蛋白多糖，即80-90%聚集在軟骨以形成一個大分子，簡稱為聚蛋白多糖。其他基質(zhì)包含非膠原蛋白、糖蛋白等類，其占有軟骨凈重的10-15%。這些基質(zhì)主要可穩(wěn)定大分子結(jié)構(gòu)及協(xié)助形成器官組織。不幸地，部分細(xì)胞抗原會在異體同種組織植入至主體時，因遭主體辨識而造成發(fā)炎反應(yīng)或免疫排斥。然而，細(xì)胞外基質(zhì)的組成物一般對于那些同種異體接受者有抵抗作用。 因此，包含于心血管系統(tǒng)、血管、皮膚、神經(jīng)、骨骼肌、肌腱、膀胱、肝臟等的組織中的各種細(xì)胞外基質(zhì)已被積極研究，并應(yīng)用于組織工程及醫(yī)療重建中。將細(xì)胞外基質(zhì)去細(xì)胞化的主要目的在于減少對細(xì)胞外基質(zhì)的細(xì)胞組成物的排斥反應(yīng)并通過有效去除細(xì)胞、細(xì)胞核等方式來增加細(xì)胞外基質(zhì)的機械強度。有效及常用的去細(xì)胞化方法包含物理方法及化學(xué)方法。物理方法包括攪拌、超音波、機械施壓、及冷凍/解凍程序。物理方法可破壞細(xì)胞膜并讓細(xì)胞組成物外露。接下來， 利用沖洗程序來將細(xì)胞從細(xì)胞外基質(zhì)移除。然而，一般物理方法被視為無法完全去細(xì)胞化。 因此，物理方法應(yīng)搭配化學(xué)方法的使用。使用胰蛋白酵素的酵素消化法或使用離子溶液的化學(xué)處置法皆可破壞細(xì)胞膜并打斷細(xì)胞內(nèi)部及外部之間的連結(jié)。在去細(xì)胞化的過程中，細(xì)胞外基質(zhì)會被破壞但卻仍保有其基礎(chǔ)骨干。去細(xì)胞化過程可以去除微孔材料及來自組織的殘骸并將所有的細(xì)胞充份暴露于促溶液中。去細(xì)胞化的目的主要在于保有組織完整的物理特性或生物特性的同時并降低對其的破壞。關(guān)于上述目的，傳統(tǒng)技術(shù)已揭露通過使用來自天然組織的細(xì)胞外基質(zhì)來制造多孔支架的方法。更明確的說，美國專利公開第2007/0Μ8638Α1號便揭露例如軟骨細(xì)胞的天然組織細(xì)胞可通過同時以氧化劑與去污劑處置并冷凍干燥來去細(xì)胞化以形成多孔支架。美國專利公開第2008/0124374Α1號揭露一種將來自脊椎動物骨髓細(xì)胞中的細(xì)胞外基質(zhì)去細(xì)胞化的方法及其治療裝置。上述已知技術(shù)皆通過將自然軟骨細(xì)胞或骨髓細(xì)胞所組成的組織去細(xì)胞化來取得異種細(xì)胞外基質(zhì)以形成多孔立體支架。由于已知技術(shù)是通過將天然組織去細(xì)胞化以制造多孔立體支架，故可減少可能的免疫排斥反應(yīng)，然而，這有個缺點由于其使用本身的天然組織，故其支架的尺寸、孔隙率、形狀及結(jié)構(gòu)易受限。因此，已知技術(shù)很難應(yīng)用于商業(yè)目的及醫(yī)療使用。因此，最好能夠隨著受損部位、受損范圍及病人特性來改變治療所使用多孔立體支架的尺寸、形狀或結(jié)構(gòu)。然而，由于已知技術(shù)采用單純將天然軟骨組織去細(xì)胞化的方式， 阻礙了治療的多元性，故無法滿足上述需求。此外，美國專利第7，201，917號揭露一種通過將細(xì)胞外基質(zhì)置于液體中以形成泥漿再將泥漿冷凍干燥來制成多孔支架的方法，但這只能取得來自天然組織細(xì)胞外基質(zhì)的液態(tài)泥漿。此外，美國專利第4，656，137號揭露一種制造動物軟骨粉末的方法，包括搜集來自動物的軟骨；通過酵素劑將附著于軟骨上的各種蛋白質(zhì)及脂質(zhì)組織移除；將其粉碎成約 4-8mm大??；透過低壓凍干法將水份移除；及將其制成40-70 μ m大小的粉末。然而，上述方法有一個問題由于所使用的細(xì)胞外基質(zhì)是通過將天然組織本身去細(xì)胞化來取得，故其支架的尺寸、孔隙率、形狀及結(jié)構(gòu)易受限。因此，很難將上述方法應(yīng)用于商業(yè)目的及醫(yī)療使用。美國專利第4，656，137號僅揭露一種以軟骨粉末處置傷口的方法， 卻完全沒有揭示如何以軟骨粉末制成具有各種尺寸、形狀及結(jié)構(gòu)的立體支架。因此，目前亟需延發(fā)一種可以再生透明軟骨組織且又不受限于其物理特性、孔隙率、形狀、結(jié)構(gòu)及尺寸的立體支架的技術(shù)。為了解決上述傳統(tǒng)方法的問題，我們研發(fā)出一種在分離動物組織，舉例來說，動物軟骨之后，通過“軟骨制成粉末過程”及“顆粒過濾法”來制備可不受限于物理特性、孔隙率、 形狀、結(jié)構(gòu)及尺寸的多孔立體支架。顆粒過濾法一般在組織工程領(lǐng)域中是用來將例如PLA、PGA、PLGA等的合成聚合物制成立體支架。在顆粒過濾法中，具有所欲孔洞尺寸的立體支架可由下列步驟制造添加具有所欲孔洞尺寸的造孔劑(鹽、有機糖、石蠟、冰顆粒及之類)到一特定容量的聚合物溶液中；將其混合；將其塑造成所欲形狀；將其澆鑄或凍干以完全移除有機溶劑；及將造孔劑以水、適當(dāng)溶劑等溶解，或通過干燥的方式移除造孔劑。本案發(fā)明人結(jié)合上述顆粒過濾法的基本理論，并在不將動物衍生組織粉末溶解于有機溶劑或任何其他溶劑下，將該動物衍生組織粉末與造孔劑混合在一起，并使用交聯(lián)劑 (例如EDC)將粉末聚集在一起。此外，以例如軟骨粉末的動物組織粉末所組成的多孔立體支架，經(jīng)證實，假若制造該多孔立體支架時，在將動物組織制成粉末之前或之后，或在制成粉末的同時，將其去細(xì)胞化，則該多孔立體支架將具有良好的生物兼容性及臨床實用性，且其在植入時，也不會造成任何發(fā)炎現(xiàn)象。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種多孔立體支架及其制造方法，其中用以制成該多孔立體支架的粉末是來自動物組織，舉例來說，利用顆粒過濾法將動物軟骨制成根據(jù)其目的與治療用途的具有多種尺寸、孔隙率、形狀及結(jié)構(gòu)的多孔立體支架。更明確的說，本發(fā)明的目的在于提供一種制造多孔立體支架的方法及通過該方法制成的多孔立體支架，其在分離動物組織，舉例來說，動物軟骨之后，通過“軟骨制成粉末過程”及“顆粒過濾法”，可在不受限于透明軟骨組織的物理特性、孔隙率、形狀、結(jié)構(gòu)及尺寸下，增進(jìn)其再生的效果。
再者，本發(fā)明的目的在于提供一種制造多孔立體支架的方法及通過該方法制成的多孔立體支架，其中假若在分離例如動物軟骨的動物組織后，通過物理及/或化學(xué)的方式， 在將動物組織制成粉末之前或之后，或在制成粉末的同時，將其去細(xì)胞化，以制造該多孔立體支架，則該多孔立體支架將具有良好的生物兼容性及臨床實用性，且其在植入時，也不會造成任何發(fā)炎現(xiàn)象。此外，本發(fā)明的目的在于提供一種細(xì)胞治療劑，其包括由軟骨細(xì)胞、骨骼細(xì)胞、干細(xì)胞等類的細(xì)胞所灌輸?shù)牧Ⅲw支架。為了達(dá)成上述目的，本發(fā)明提供一種利用動物組織粉末制造多孔立體支架的方法，其包括下列步驟將動物衍生組織制成粉末；在將該動物衍生組織制成粉末之前或之后，或在制成粉末的同時，將其去細(xì)胞化；及通過顆粒過濾法將該去細(xì)胞化的動物衍生組織粉末制成多孔立體支架。依據(jù)本發(fā)明一實施例，該顆粒過濾法包含在不溶解于有機溶劑或任何其他溶劑下將該去細(xì)胞化的動物衍生組織粉末與造孔劑混合在一起，并使用交聯(lián)劑將該去細(xì)胞化的動物衍生組織粉末聚集在一起。依據(jù)本發(fā)明一實施例，該顆粒過濾法使用的造孔劑選自例如氯化鈉的鹽顆粒、有機糖顆粒、葡萄聚糖顆粒、蔗糖顆粒、冰顆?；蚴烆w粒其中至少一種或幾種的混合物。依據(jù)本發(fā)明一實施例，通過將該去細(xì)胞化的動物衍生組織粉末與該顆粒過濾法所使用的造孔劑顆粒混合在一起，再將其倒入鑄模中，根據(jù)其用途及治療部位的不同，以壓力將該去細(xì)胞動物衍生組織粉末鑄造成具有多種形狀與尺寸的多孔立體支架。依據(jù)本發(fā)明一實施例，該方法進(jìn)一步包括通過選自由UV、EDC、NHS、脫水加熱法、及戊二醛至少一種方式來交聯(lián)該多孔立體支架。依據(jù)本發(fā)明一較佳實施例，該方法進(jìn)一步包括將至少一個生長因子加入到該動物衍生組織粉末中并將其冷凍干燥。依據(jù)本發(fā)明一更較佳實施例，該方法進(jìn)一步包括將軟骨細(xì)胞灌輸?shù)酵ㄟ^該顆粒過濾法所形成的多孔立體支架之上或之中，再將多孔立體支架之上或之中的軟骨細(xì)胞再培養(yǎng)，取得組織工程軟骨組織。依據(jù)本發(fā)明一較佳實施例，該動物衍生組織可衍生自例如豬、牛、羊、馬、狗或貓的脊椎動物的軟骨。更明確的說，該動物衍生組織粉末可為豬軟骨粉末。依據(jù)本發(fā)明一較佳實施例，將該動物衍生組織制成粉末的步驟包括將軟骨從動物衍生軟骨組織分離出來，通過粉碎機將該軟骨粉碎，并通過冷凍磨粉機將該粉碎的軟骨磨成粉末。依據(jù)本發(fā)明一較佳實施例，該動物衍生組織可衍生自例如豬、牛、羊、馬、狗或貓的脊椎動物的羊膜、皮膚、小腸黏膜下組織(SIQ、筋膜或脊髓膜。依據(jù)本發(fā)明一較佳實施例，該去細(xì)胞化是通過物理去細(xì)胞化、化學(xué)去細(xì)胞化、或該物理去細(xì)胞化及該化學(xué)去細(xì)胞化的組合來達(dá)成。該物理去細(xì)胞化可利用冷凍-解凍、超音波或物理震動的方式來進(jìn)行，而該化學(xué)去細(xì)胞化是通過將該動物衍生組織粉末以低滲溶液、負(fù)離子去污劑、非離子去污劑、陽離子去污劑、脫氧核糖核酸酶、核糖核酸酶或胰蛋白酵素處置來達(dá)成。此外，該去細(xì)胞化在大約 0到50C的溫度下進(jìn)行。
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在該化學(xué)去細(xì)胞化過程中，使用的低滲溶液為Tris HCl (pH 8.0)溶液，使用的負(fù)離子去污劑為十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)、脫氧膽酸鈉 (sodium deoxycholate)或 Triton X-200，使用的非離子去污劑為 Trrion X-100，而使用的陽離子去污劑為CHAPS、磺基甜菜堿-10 (Sulfobetaine-10, SB-10)、磺基甜菜堿-16(Sulfobetaine-16，SB-16)或磷酸三正丁酯(tri-n-butyl 磷酸鹽)。一種依據(jù)本發(fā)明的方法所制造的多孔立體支架可用來再生軟骨。此外，本發(fā)明的多孔立體支架亦可用來構(gòu)成間盤組織、骨骼組織及關(guān)節(jié)軟骨組織。本發(fā)明較佳多孔立體支架可進(jìn)一步包括至少一個生長因子。本發(fā)明更較佳多孔立體支架可通過將軟骨細(xì)胞灌輸?shù)蕉嗫琢Ⅲw支架之上或之中， 再將該多孔立體支架之上或之中的軟骨細(xì)胞再培養(yǎng)，并形成組織工程軟骨組織來取得。本發(fā)明通過例如動物軟骨粉末的動物組織所制造的多孔立體支架，因其具有多種尺寸、孔隙率、形狀及結(jié)構(gòu)以因應(yīng)其目的與治療用途，其可有效應(yīng)用于臨床治療。本發(fā)明的多孔立體支架在不受限于其物理特性、孔隙率、形狀、結(jié)構(gòu)及尺寸下，可有效增進(jìn)透明軟骨組織的再生。此外，既然本發(fā)明在分離例如動物軟骨的動物組織后，通過物理及/或化學(xué)的方式，在將動物組織制成粉末之前或之后，或在制成粉末的同時，將之去細(xì)胞化，使得其所制造出來的多孔立體支架具有良好的生物兼容性及臨床實用性，且其在植入時，也不會造成任何發(fā)炎現(xiàn)象。再者，相較于由膠原蛋白或其他合成聚合物所組成的支架，本發(fā)明的多孔立體支架對于軟骨再生的功效更為顯著。除此之外，通過例如動物軟骨粉末的動物組織所制造的多孔立體支架，由于其立體結(jié)構(gòu)，其可提供一個適合細(xì)胞移動、細(xì)胞生長及細(xì)胞分化的環(huán)境。另外，該多孔立體支架可包括生長因子及適用于軟骨再生的適當(dāng)要素。由于本發(fā)明的多孔立體支架的高生物兼容性、生物可降解性及立體結(jié)構(gòu)，使得其可有效應(yīng)用于制備治療軟骨損耗的組織工程支架中。


圖1(a)為由豬軟骨分離出來的豬軟骨切片的照片，圖1(b)為經(jīng)冷凍粉碎后再去細(xì)胞化的豬軟骨粉末的照片，及圖1(c)為去細(xì)胞化豬軟骨粉末的SEM照片；圖2為天然豬軟骨(去細(xì)胞化之前的PC)、去細(xì)胞化豬軟骨切片(去細(xì)胞化PC)、 及去細(xì)胞化豬軟骨粉末(去細(xì)胞化PCP)的DNA殘余含量表；圖3為依據(jù)本發(fā)明利用軟骨粉末制造多孔立體支架的流程示意圖；圖4為依據(jù)本發(fā)明一實施例，通過軟骨粉末所制造的多孔立體支架的照片；圖5為依據(jù)本發(fā)明一實施例，通過軟骨粉末所制造的多孔立體支架的SEM照片；圖 5(a)為其表面的20倍放大照片，圖5(b)為其表面的50倍放大照片，圖5(c)為其側(cè)面的 20倍放大照片，及圖5(d)為其側(cè)面的50倍放大照片；圖6為依據(jù)本發(fā)明一實施例，通過軟骨粉末所制造的多孔立體支架的孔隙率分布曲線圖；圖7為依據(jù)本發(fā)明一實施例，通過軟骨粉末所制造的多孔立體支架的親水性實驗資料的照片；圖8為膠原蛋白海棉及本發(fā)明豬軟骨粉末支架的代表照片，其為評估兩者細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下的功效之前所拍攝；圖8(a)為膠原蛋白海棉的正視圖的照片，圖8(b)為膠原蛋白海棉的側(cè)視圖的照片，圖8(c)為本發(fā)明豬軟骨粉末支架的正視圖的照片，及圖8(d) 為本發(fā)明豬軟骨粉末支架的側(cè)視圖的照片；圖9為對照組的膠原蛋白海棉及本發(fā)明豬軟骨粉末支架在灌輸細(xì)胞到其之上或之中后的細(xì)胞種植率的分析結(jié)果；圖10為對照組的膠原蛋白海棉及本發(fā)明豬軟骨粉末支架，在體外培養(yǎng)1星期之后的生長的照片；圖10(a)為膠原蛋白海棉的正視圖，圖10(b)為膠原蛋白海棉的側(cè)視圖，圖 10(c)為本發(fā)明豬軟骨粉末支架的正視圖，及圖10(d)為本發(fā)明豬軟骨粉末支架的側(cè)視圖；圖11為對照組的膠原蛋白海棉及本發(fā)明豬軟骨粉末支架，在體外培養(yǎng)1星期之后，以藏紅-O(Safranin-O)染色的照片；圖11(a)為膠原蛋白海棉的20倍放大照片，圖 1Kb)為膠原蛋白海棉的100倍放大照片，圖11(c)為本發(fā)明豬軟骨粉末支架的20倍放大照片，及圖11(d)為本發(fā)明豬軟骨粉末支架的100倍放大照片；圖12為對照組的膠原蛋白海棉及本發(fā)明豬軟骨粉末支架，在體外培養(yǎng)2星期之后的生長的照片；圖12(a)為膠原蛋白海棉的正視圖，圖12(b)為膠原蛋白海棉的側(cè)視圖，圖 12(c)為本發(fā)明豬軟骨粉末支架的正視圖，及圖12(d)為本發(fā)明豬軟骨粉末支架的側(cè)視圖；圖13為對照組的膠原蛋白海棉及本發(fā)明豬軟骨粉末支架，在體外培養(yǎng)2星期之后，以藏紅-O(Safranin-O)染色的照片；圖13(a)為膠原蛋白海棉的20倍放大照片，圖 13(b)為膠原蛋白海棉的100倍放大照片，圖13(c)為本發(fā)明豬軟骨粉末支架的20倍放大照片，及圖13(d)為本發(fā)明豬軟骨粉末支架的100倍放大照片。
具體實施例方式以下通過實施例對本發(fā)明進(jìn)行具體的說明。值得注意的是，本發(fā)明下列實施例中的描述僅用于描述與圖式之用，并不限制發(fā)明的保護(hù)范圍。實施例參考實施例1 豬軟骨的分離為了分離豬軟骨，豬軟骨是從一家符合EN 1M42標(biāo)準(zhǔn)“應(yīng)用于制造醫(yī)療裝置的動物組織及其衍生物，第1部份；分析及風(fēng)險管理，第2部份；來源、收集及處理的控制”的公司所購入并使用。從豬軟骨將軟骨分離出來并切成小片(約20x30mm)，然后，以鹽水沖洗三次，10分鐘。將軟骨切片浸泡在含有抗生素抗霉菌劑的PBS緩沖溶液中，再將其儲存于-80C的超低溫冰箱中(參見圖1(a))。實施例1 粉碎豬軟骨通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知并已充分使用于商業(yè)上的粉碎機(Hood Mixer HMF-505, Hanil股份有限公司，韓國)，將洗好的軟骨切片粉碎，以將其尺寸縮小到約 h2mm。將粉碎的軟骨切片冷凍干燥，再將冷凍干燥的軟骨切片通過冷凍磨粉機(JAI， JFC-300,日本)磨成尺寸約10 μ m的粉末。1-1.豬軟骨粉末的形態(tài)分析以電子掃描顯微鏡將豬軟骨粉末進(jìn)行形態(tài)分析。將實施例1所制備的豬軟骨粉末以2. 5%的戊二醛處置約1小時，再以磷酸鹽緩沖溶液沖洗。將樣本脫水并干燥，再以顯微鏡(JEOL，JSM-6380，日本；20KV)觀察，以測量粉末的尺寸及形狀。經(jīng)觀察，該粉末的尺寸約為 ΙΟμπι(圖 1(c))。實施例2 豬軟骨粉末的去細(xì)胞化及特件2-1.豬軟骨粉末的去細(xì)胞化為了移除軟骨細(xì)胞及遺傳成份，以取得純的細(xì)胞外基質(zhì)，將以如下方式進(jìn)行去細(xì)胞化。將實施例1所制備的豬軟骨粉末加入到1公升0. 的十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS，Bio-Rad，美國)(每IOg的豬軟骨粉末)，并以IOOrpm攪拌M小時。 在進(jìn)行SDS處理之后，將產(chǎn)物用三級蒸餾水以IOOrpm的轉(zhuǎn)速下沖洗5次，30分鐘。為了讓軟骨粉末沉淀以便替換沖洗溶液，將軟骨粉末以超速離心機(US-21SMT， Vision，韓國)10，OOOrpm的轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)1小時。將200ml的200U/ml脫氧核糖核酸酶(Sigma，美國)加入到軟骨粉末并在37C下以IOOrpm的轉(zhuǎn)速攪拌M小時。將產(chǎn)物用三級蒸餾水以IOOrpm的轉(zhuǎn)速下沖洗5次，30分鐘。 以如上相同的SDS沖洗方式將該沖洗溶液作替換。該去細(xì)胞化軟骨粉末顯示于圖1(b)。雖然在本發(fā)明此一實施例中，該去細(xì)胞化步驟是在制備軟骨粉末之后進(jìn)行，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解本發(fā)明不限于此流程，該去細(xì)胞化步驟亦可在軟骨制成粉末之前進(jìn)行。2-2.去細(xì)胞化豬軟骨粉末的DNA含量分析將去細(xì)胞化之前未受處置的軟骨組織(在此之后，簡稱為“PC”)、去細(xì)胞化軟骨切片(PC)及去細(xì)胞之后化的軟骨粉末(在此之后，簡稱為“PCP”)制成樣本，并以Qubic DNA 定量裝置(Qubic，Bio-Rad，美國)定量測量其DNA含量。DNA含量的定量分析結(jié)果如下顯示于表1及圖2。更明確的說，該去細(xì)胞化流程依據(jù)實施例2-1所述的流程進(jìn)行。^ 1DNA殘余數(shù)量的測量
DNA含量 (殘余數(shù)量)C. V.值去細(xì)胞化之前的PC48513. 22876去細(xì)胞化之后的PC3944. 358899去細(xì)胞化之后的PCP9. 480^MM 3 禾U用去細(xì)朐,仆^軟骨粉末泡丨造立體支奧并i兌日月 Φ寺征3-1.制造多孔立體支架以實施例2-1相同流程所制備的去細(xì)胞化軟骨粉末，以1 9的比例與氯化鈉(具有250到350 μ m的晶體尺寸)均勻混合。再以10%的比例將IOOmM EDC(N-(3-dimethyla minopropyl) -N-ethylcarbodiimide hydrochloride) (Sigma,美國)及三級蒸溜水所配成的溶液加入到該混合溶液中。該EDC溶液與該軟骨粉末及氯化鈉的混合溶液均勻混合。再將前述混合溶液倒入到硬質(zhì)合金的自制鑄模中，并以IOOOpsi的壓力鑄造成型，以制成一盤形產(chǎn)物。該鑄模包含固定組件及移動組件，并在固定組件及/或移動組件之內(nèi)形成一立體支架。雖然在此實施例中，以制造盤形立體支架為例，但其亦可制造其他具有多種形狀與尺寸的立體支架，以因應(yīng)其目的與治療用途。雖然在此實施例中，以氯化鈉作為制造多孔立體支架的造孔劑，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解本發(fā)明不限于此，亦可使用其他例如糖顆?；虮w粒做替代物。接下來，將該盤形產(chǎn)物于室溫下干燥，然后以IOOmM EDC溶液(溶解于99. 9%的乙醇)交聯(lián)1小時。再將IOOmM NHS(N-hydroxysuccinimide,Fluka,日本)加入到該反應(yīng)物并讓其作用4小時。其交聯(lián)作用是用來增進(jìn)軟骨粉末所制成的多孔立體支架的物理特性并延長其降解期。在交聯(lián)作用完成后，以三級蒸餾水浸泡該盤形產(chǎn)物，并將該三級蒸餾水至少替換5 次，以將該盤形產(chǎn)物中的鹽完全洗滌掉。為了移除交聯(lián)后未作用的部份，以NH2PO4W洗該盤形產(chǎn)物3次。最后，再以三級蒸餾水重新沖洗3次并冷凍干燥。圖3顯示利用軟骨粉末制造多孔立體支架的流程，而圖4顯示通過該流程所制成的最終產(chǎn)物。3-2.豬軟骨粉末支架的孔洞結(jié)構(gòu)分析以電子掃描顯微鏡分析豬軟骨粉末支架的孔洞結(jié)構(gòu)。由實施例3-1所制備的豬軟骨粉末支架是以2. 5%的戊二醛處置約1小時，再以磷酸鹽緩沖溶液沖洗。將樣本以乙醇脫水干燥，再以顯微鏡(JEOL，JSM-6380,日本；20KV)分析，以觀察豬軟骨粉末支架的孔洞尺寸及形狀。經(jīng)觀察，支架的孔洞尺寸約為200 μ m且這些孔洞彼此相互連接在一起。此外，這些孔洞皆均勻分布且支架的表面孔洞為向外開啟(參見圖5)。3-3.豬軟骨粉末支架的孔隙率分析以水銀測孔儀分析豬軟骨粉末支架的孔隙率。該分析樣本的重量為0. 0193克。其分析條件如下壓力50ymHg;時間5分鐘；及水銀-填充壓力0. 44psia。因此，豬軟骨粉末支架所測得的孔隙率為82. 39% (參見圖6)。實施例4 豬軟骨粉末支架的親水性評估為了檢測豬軟骨粉末支架的親水性，利用染劑以裸眼觀察其吸水能力。將豬軟骨粉末支架浸入到2. 5%的錐藍(lán)細(xì)胞染色溶液。在浸入10秒后，拍攝一張照片，從照片可觀察到該豬軟骨粉末支架會立即吸收染劑。因此，可確認(rèn)本發(fā)明的豬軟骨粉末支架具有顯著的親水性(參見圖7)。實施例5 豬軟骨粉末支架的功效評估5-1.φ mm^m afo,軟骨細(xì)胞是從2周大來自紐西蘭的兔子的軟骨所分離出來。其軟骨組織是從膝關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)軟骨中單獨分離出來，再切成約l_2mm大小的切片，并在37C的細(xì)胞培養(yǎng)器中以 0. 的膠原酶(type II,Washington，美國)處置12小時以分離軟骨細(xì)胞。在以0. 膠原酶處置12小時后，以細(xì)胞過濾機篩選出軟骨細(xì)胞并以離心機(1，700rpm, 10分鐘)純粹
11分離出軟骨細(xì)胞。從兔子分離出來的軟骨細(xì)胞以5xl06細(xì)胞的濃度播種到由實施例1-3的流程所制備的多孔立體軟骨粉末支架(半徑5mm，高2mm)之上或之中。然后，每周3次更新細(xì)胞培養(yǎng)基[DMEM+1 %的抗生素抗霉菌+ITS包括“1. Omg/ ml的胰島素、0. 55mg/ml的人類運鐵蛋白及0. 5mg/ml的亞硒酸鈉”+50 μ g/ml的抗壞血酸 +1. 25mg/ml的牛血清白蛋白+IOOnM的合成葡萄糖性類固醇+40 μ g/ml的脯氨酸]。5-2.豬軟骨粉末支架的細(xì)胞種棺率評估通過靜置播種的方式將切106個兔子軟骨細(xì)胞灌輸?shù)截i軟骨粉末支架之上或之中。灌輸?shù)募?xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)器中以37C培養(yǎng)4小時以允許該細(xì)胞附著于支架之上或之中， 然后將培養(yǎng)基倒入到支架中。此時，計算沒有附著于支架之上或之中并從中掉落的自由細(xì)胞數(shù)量。M小時后，將該支架移到新的盤子上，并再次計算掉落到盤子上的自由細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果，經(jīng)觀察，膠原蛋白海棉及豬軟骨粉末支架在4小時之后所測得的細(xì)胞種植率分別為90. 5%及80%。此外，膠原蛋白海棉及豬軟骨粉末支架在M小時之后所測得的細(xì)胞種植率分別為90%及79%。即使膠原蛋白海棉的細(xì)胞種植率顯示比豬軟骨粉末支架來得高，但可確認(rèn)軟骨粉末支架亦顯示約80%的高細(xì)胞種植率(參見圖9)。5-3.隨著時間軟骨組織形成的比較將第I型去端肽膠原蛋白(MATRIXENTM，Bi0land，韓國)溶解成1 %的濃度，再以冷凍干燥的方式制成海棉。所制成的海綿被使用來作為對照組，以與本發(fā)明的支架作比較。如上所述，將用以作為對照組的膠原蛋白海棉及本發(fā)明的軟骨粉末支架在兔子軟骨細(xì)胞播種之后，培養(yǎng)1星期及2星期。然后，在一段時間之后，重新取得該些樣本并以10 % 的福爾馬林處置M小時。再將該些樣本埋入石蠟中，切成片段并以藏紅-0及H&E染色法染色，以比較膠原蛋白海棉及軟骨粉末支架形成軟骨組織的能力。結(jié)果，經(jīng)觀察，在將兔子軟骨細(xì)胞培養(yǎng)到膠原蛋白海棉及軟骨粉末支架之后的1 星期，形成白色半透明組織(參見圖10)。當(dāng)以藏紅-0染色，該軟骨細(xì)胞分布于膠原蛋白海棉及軟骨粉末支架兩者之上。然而，本發(fā)明的軟骨粉末支架相較于膠原蛋白海棉顯示具有較高的細(xì)胞分布。此外，由于糖胺聚糖的合成及沿著支架壁骨質(zhì)溶解進(jìn)展，本發(fā)明的軟骨粉末支架優(yōu)于膠原蛋白海棉(參見圖10)。如圖11所示，兩個群組皆在培養(yǎng)兔子軟骨細(xì)胞之后的2星期呈現(xiàn)半透明。通過藏紅-0染色法觀察得知兩個群組的軟骨再生能力在2星期后相較于1星期后來得好。尤其， 本發(fā)明的多孔立體軟骨粉末支架確實幾乎可以完全再生軟骨(參見圖12)。因此，由于本發(fā)明的多孔立體支架的立體結(jié)構(gòu)，其可以在不受限于其物理特性、孔隙率、形狀、結(jié)構(gòu)及尺寸下重生軟骨，并提供一個適合細(xì)胞移動、細(xì)胞生長及細(xì)胞分化的環(huán)境。此外，由于本發(fā)明的多孔立體支架的高生物兼容性、生物可降解性及立體結(jié)構(gòu)，使得其可有效應(yīng)用于制備治療軟骨損耗的組織工程支架中。雖然本發(fā)明已以實施例揭露如上，但其并非用以限定本發(fā)明。反之，所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，可作些許的更動與潤飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)當(dāng)以權(quán)利要求書所界定的范圍為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種利用動物組織粉末制造多孔立體支架的方法，包括將動物衍生組織制成粉末；在將該動物衍生組織制成粉末之前或之后，或在制成粉末的同時，將其去細(xì)胞化；及通過顆粒過濾法將該去細(xì)胞化的動物衍生組織粉末制成多孔立體支架。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該顆粒過濾法包括在不溶解于有機溶劑或任何其他溶劑下將該去細(xì)胞化的動物衍生組織粉末與造孔劑混合在一起，并使用交聯(lián)劑將該去細(xì)胞化的動物衍生組織粉末聚集在一起。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中該顆粒過濾法使用的造孔劑選自氯化鈉的鹽顆粒、 有機糖顆粒、葡萄聚糖顆粒、蔗糖顆粒、冰顆粒或石蠟顆粒其中至少一種或幾種的混合物。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中通過將該去細(xì)胞化的動物衍生組織粉末與該顆粒過濾法所使用的造孔劑顆?；旌显谝黄穑賹⑵涞谷腓T模中，根據(jù)其用途及治療部位的不同， 以壓力將該去細(xì)胞化的動物衍生組織粉末鑄造成具有多種形狀與尺寸的多孔立體支架。
5.如權(quán)利要求1到4任一項所述的方法，進(jìn)一步包括通過選自UV、EDC、NHS、脫水加熱法或戊二醛其中至少一種方式來交聯(lián)該多孔立體支架。
6.如權(quán)利要求1到4任一項所述的方法，進(jìn)一步包括將至少一個生長因子加入到該動物衍生組織粉末中并將其冷凍干燥。
7.如權(quán)利要求1到4任一項所述的方法，進(jìn)一步包括將軟骨細(xì)胞灌輸?shù)酵ㄟ^該顆粒過濾法所形成的多孔立體支架之上或之中，再將多孔立體支架之上或之中的軟骨細(xì)胞再培養(yǎng)，取得組織工程軟骨組織。
8.如權(quán)利要求1到4任一項所述的方法，其中該動物衍生組織為衍生自豬、牛、羊、馬、 狗或貓的軟骨。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中該動物衍生組織粉末為豬軟骨粉末。
10.如權(quán)利要求1到4任一項所述的方法，其中將該動物衍生組織制成粉末的步驟包括將軟骨從動物衍生軟骨組織中分離出來，通過粉碎機將該軟骨粉碎，并通過冷凍磨粉機將該粉碎的軟骨磨成粉末。
11.如權(quán)利要求1到4任一項所述的方法，其中該動物衍生組織為衍生自豬、牛、羊、馬、 狗或貓的羊膜、皮膚、小腸黏膜下組織(SIQ、筋膜、或脊髓膜。
12.如權(quán)利要求1到4任一項所述的方法，其中該去細(xì)胞化是通過物理去細(xì)胞化、化學(xué)去細(xì)胞化或該物理去細(xì)胞化及該化學(xué)去細(xì)胞化的組合來達(dá)成。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中該物理去細(xì)胞化可利用冷凍-解凍、超音波或物理震動的方式來進(jìn)行，而該化學(xué)去細(xì)胞化是通過將該動物衍生組織粉末以低滲溶液、負(fù)離子去污劑、非離子去污劑、陽離子去污劑、脫氧核糖核酸酶、核糖核酸酶或胰蛋白酵素處置來達(dá)成。
14.如權(quán)利要求1到4所述的方法，其中該去細(xì)胞化在0到50C的溫度下進(jìn)行。
15.如權(quán)利要求13所述的方法，其中在該化學(xué)去細(xì)胞化過程中，使用的低滲溶液為Tris HCl (pH 8. 0)溶液，使用的負(fù)離子去污劑為十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate, SDS)、脫氧膽酸鈉(sodium deoxycholate)或 iTriton X-200，使用的非離子去污劑為Triton X-100，而使用的陽離子去污劑為CHAPS、磺基甜菜堿-10 (Sulfobetaine_10， SB-10)、磺基甜菜堿-16(Sulfobetaine-16，SB-16)或磷酸三正丁酯(tri-n-butyl 磷酸鹽)。
16.一種利用來自動物組織的粉末制成的立體支架，其是使用權(quán)利要求1到4任一項所述的制造方法所制造。
17.如權(quán)利要求16所述的立體支架，其中該立體支架用于再生軟骨。
18.如權(quán)利要求16所述的立體支架，其中該立體支架用于構(gòu)成關(guān)節(jié)軟骨組織、間盤組織或骨骼組織。
19.如權(quán)利要求16所述的立體支架，進(jìn)一步包括至少一個生長因子。
20.如權(quán)利要求16所述的立體支架，其中通過將軟骨細(xì)胞灌輸?shù)蕉嗫琢Ⅲw支架之上或之中以將組織工程軟骨組織形成于立體支架之上或之中，再將該多孔立體支架之上或之中的軟骨細(xì)胞再培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種利用動物組織粉末來制造多孔立體支架的方法，包括將動物衍生組織制成粉末，在將該動物衍生組織制成粉末之前或之后，或在制成粉末的同時，將其去細(xì)胞化，并通過顆粒過濾法將該去細(xì)胞化的動物衍生組織粉末制成多孔立體支架。
文檔編號A61L27/38GK102238970SQ200980148574
公開日2011年11月9日 申請日期2009年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月13日
發(fā)明者張志旭, 閔炳顯 申請人:亞洲大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團(tuán)