專利名稱：用于測定組合物中的TGF-β的生物活性的方法
背景技術(shù)：
(1)發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明一般涉及測定組合物中的轉(zhuǎn)化生長因子-β (TGF-β)的生物活性的方法。

發(fā)明內(nèi)容
簡言之，本發(fā)明涉及用于測定粉末狀營養(yǎng)組合物或粉末狀粗蛋白質(zhì)(raw protein)來源的樣品中TGF-β的生物活性的方法，所述方法包括 a.讓樣品復(fù)溶為約140mg/mL-約150mg/mL的濃度； b.讓復(fù)溶的樣品以約10，OOOrpm離心約10分鐘，保留上清液層； c.使上清液層酸化到pH為約2-約3 ； d.讓上清液層于室溫孵育約15分鐘； e.讓上清液層以約10，OOOrpm離心約10分鐘，保留上清液層； f.將來自步驟(e)的上清液層中和到pH約7-約7. 5 ； g.讓步驟(f)的上清液層以約10，OOOrpm離心約10分鐘，保留上清液層； h.讓上清液層與HT-2細胞接觸；和 i.測定抑制50%的HT-2細胞的生物活性的濃度。
在實施方案中，本發(fā)明亦涉及用于測定液態(tài)奶樣品中的TGF-β的生物活性的方法，所述方法包括 a.讓樣品以約13，OOOrpm離心約15分鐘； b.收集樣品的上清液層，并用該上清液重復(fù)步驟(a)； c.收集來自步驟(b)的樣品的上清液層，并用步驟(b)的上清液重復(fù)步驟(a)； d.使上清液層酸化到pH約2-約3 ； e.讓上清液層于室溫孵育約3小、時； f.將上清液層中和到pH約7-約7. 5 ； g.讓步驟(f)的上清液層以約10，OOOrpm離心約10分鐘，保留上清液層； h.讓該上清液層與HT-2細胞接觸；和 i.測定抑制50%的HT-2細胞的生物活性的濃度。
在另一實施方案中，本發(fā)明涉及用于測定液態(tài)奶樣品中的TGF-β的生物活性的方法，所述方法包括 a.使樣品酸化到pH約2-約3 ； b.讓樣品于室溫孵育約3小時； c.將樣品中和到pH約7-約7. 5 ； d.讓樣品以約10，OOOrpm離心約5分鐘，保留上清液層； e.讓上清液層以約10，OOOrpm離心約5分鐘，保留上清液層； f.讓來自步驟(e)的上清液層與HT-2細胞接觸；和
4 g.測定抑制50%的HT-2細胞的生物活性的濃度。
在又一實施方案中，本發(fā)明涉及用于測定粉末狀營養(yǎng)組合物或粉末狀粗蛋白質(zhì)來源的樣品中TGF-β的生物活性的方法，所述方法包括 a.讓樣品復(fù)溶為約140mg/mL-約150mg/mL的濃度； b.使復(fù)溶的樣品酸化到pH約2-約3 ； c.讓上清液層于室溫孵育約15分鐘； d.讓上清液層以約10，OOOrpm離心約10分鐘，保留上清液層； e.中和來自步驟(d)的上清液層到pH約7-約7. 5 ； f.在1 %血清存在下讓樣品與MDA-MB-468細胞接觸；和 g.基于GFP標記的Smad2從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)運到細胞核來分析TGF- β反應(yīng)。
在再一實施方案中，本發(fā)明涉及用于測定液態(tài)奶樣品中TGF-β的生物活性的方法，所述方法包括 a.使樣品酸化到pH約2-約3 ； b.讓樣品于室溫孵育約15分鐘； c.讓樣品以約10，OOOrpm離心約10分鐘，保留上清液層； d.將步驟(c)的上清液層中和到pH約7-約7. 5 ； e.在1 %血清存在下讓樣品與MDA-MB-468細胞接觸；和 f.基于GFP標記的Smad2從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)運到細胞核來分析TGF- β反應(yīng)。
附圖簡述

圖1 顯示具有 TGF- β 2 活性為 7175. 3pg/mL 及 ED50 為 0. 118ng/mL 的 rhTGF- β 2 的樣品的TGF-β生物活性相當量(equivalency)計算值。
圖2A-D為相當量圖和數(shù)據(jù)。
圖3顯示通過激活方法處理的Enfamil Lipil+相對于人乳的TGF-β功效。
圖4A-C闡明eelIomics研究結(jié)果。
發(fā)明最佳實施方式 現(xiàn)在將詳細談及本發(fā)明實施方案，以下給出了其一個或多個實施例。提供每一個實施例是為了說明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明。事實上，本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然明白，可對本發(fā)明實施不偏離本發(fā)明范圍或精神的各種修改及改變。例如，作為一個實施方案的部分來闡明或闡述的特征可用于另一個實施方案，以產(chǎn)生又一個實施方案。
因此，本發(fā)明意欲涵蓋所述落在所附權(quán)利要求范圍內(nèi)的這類修改和改變及其等同物。在以下詳述中揭示或可明顯看出本發(fā)明的其它目的、特征及方面。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)該理解，本發(fā)明論述僅為了說明例示性實施方案，并非意欲限制本發(fā)明的更寬廣的方面。
如上所述，本發(fā)明一般涉及用于測定各種樣品中TGF-β的生物活性的方法。與所述方法有關(guān)的參考資料可包括美國專利號6，194，208,7, 094，550和EP 759，029。
轉(zhuǎn)化生長因子-β (TGF-β)是其成員具有多功能調(diào)節(jié)活性的多肽家族的通稱。三種差異調(diào)節(jié)的哺乳動物同種型(命名為TGF-β 1、TGF-β 2和TGF-β 3)在胚胎、嬰兒、兒童及成人發(fā)育的多個過程中起著重要作用。TGF-β是25-kDa的同型二聚體細胞因子，已知其既在免疫系統(tǒng)中又全身性地介導(dǎo)多效功能。TGF-β在腸粘膜的幾種細胞類型(包括淋巴細胞、上皮細胞、巨噬細胞和基質(zhì)細胞)以及T-細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、上皮細胞、成纖維細胞、血小板、造骨細胞、破骨細胞及其它細胞中中表達。另外，TGF-β存在于人母奶中， 可影響嬰兒健康和發(fā)育的多個方面。
TGF-β以大的前體蛋白合成，后者由包含信號序列和潛伏狀態(tài)相關(guān) (latency-related)復(fù)合物的氨基末端原結(jié)構(gòu)域和成熟的羧基末端亞單位組成。具生物活性的TGF-β是同型二聚體，由兩個相同的二硫鍵連接的成熟亞基組成。要發(fā)揮TGF-β對靶細胞的生物活性，必須從潛伏狀態(tài)相關(guān)復(fù)合物釋放TGF-β同型二聚體。潛伏狀態(tài)相關(guān)復(fù)合物的特性和負責釋放TGF-β的機理是理解體內(nèi)TGF-β生物活性的關(guān)鍵。在人腸道中， 可通過蛋白質(zhì)水解酶、極端ΡΗ、熱、鈣和/或機械分裂來完成這一任務(wù)。
基于TGF-β提供多種益處，在各種營養(yǎng)品中存在或補充該生長因子通常很重要。 例如，某些營養(yǎng)品的蛋白質(zhì)來源可提供TGF-β來源?；蛘?，若該營養(yǎng)品本身不含TGF-β，則可將該生長因子補充到產(chǎn)品中。然而，如上所述，釋放的TGF-β呈其無活性形式。營養(yǎng)品的蛋白質(zhì)來源中存在的或加到那些營養(yǎng)品中的TGF-β亦呈其無活性形式。于是其在人腸道中由酶、極端PH和/或分裂來激活。
基于TGF-β提供多種益處，在各種液態(tài)營養(yǎng)品中存在或補充該生長因子通常很重要。然而，在本發(fā)明以前，一直沒有用于測定奶、營養(yǎng)品或粗蛋白質(zhì)來源(例如乳清蛋白濃縮物)的樣品中TGF-β的生物活性的有效方法。在某種程度上，這可能是由于在報道這些組合物的TGF-β生物活性的研究之中及之間的變異性高。此外，對影響奶、營養(yǎng)品或粗蛋白質(zhì)來源中所報道的生物活性的因素的了解相對很少。
因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供用于測定組合物中TGF-β (包括TGF-β 1 和TGF-i3 2)的生物活性的準確并可再現(xiàn)的方法。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了用于測定奶、營養(yǎng)品或粗蛋白質(zhì)來源的樣品中TGF-β的生物活性的新穎方法。
如上所述，可用本發(fā)明方法來測定奶來源中TGF-β的生物活性。在該實施方案中，所述奶可為人乳、牛奶、山羊奶、綿羊奶或來源于哺乳動物的任何其它奶。
在另一實施方案中，可用本發(fā)明方法來測定營養(yǎng)品中的TGF-β生物活性。營養(yǎng)品可為嬰兒配方奶粉。在某些實施方案中，所述營養(yǎng)品可為嬰兒配方奶粉。術(shù)語“嬰兒配方奶粉”適用于這樣的組合物，其為液態(tài)或粉末狀形式，必要時意欲作為人乳代用品(母乳代用品)使用以滿足嬰兒的正常營養(yǎng)需求。在獨立的實施方案中，所述營養(yǎng)品可為人乳增強劑，意即其為添加到人乳中以便提高人乳的營養(yǎng)價值的組合物。本發(fā)明組合物作為人乳增強劑可呈粉末或液態(tài)形式。在另一實施方案中，本發(fā)明營養(yǎng)品可為較大嬰兒及幼兒配方奶粉(follow-upformula)。本文所用術(shù)語“幼兒配方奶粉”指意欲用作6個月的嬰兒及幼兒的斷奶飲食的液體部分的食物。在又一實施方案中，本發(fā)明營養(yǎng)品可為兒童營養(yǎng)組合物。本文所用術(shù)語“兒童”意即超過3歲并在青春期之前的人。在再一實施方案中，本發(fā)明營養(yǎng)品可為成長奶(growing-upmilk)。術(shù)語“成長奶”指以奶為基礎(chǔ)的多種多樣種類的加強飲料， 其意欲用作多樣化飲食的部分，以便支持1-6歲兒童的正常生長和發(fā)育。
在某些實施方案中，所述組合物為酸化產(chǎn)品。本文所用術(shù)語“酸化產(chǎn)品”指成品平衡pH為4. 6或以下并且水活性大于0. 85的營養(yǎng)組合物。在再一實施方案中，營養(yǎng)品可為醫(yī)用食物。術(shù)語“醫(yī)用食物”定義為調(diào)配用于在醫(yī)生監(jiān)督下消費或經(jīng)腸道給予的食物，其意欲用于有特別營養(yǎng)需求的疾病或病況的特定飲食管理，所述特別營養(yǎng)需求基于公認的科學原理，通過醫(yī)學評估確定。一般而言，被認為是醫(yī)用食物的產(chǎn)品應(yīng)該至少滿足以下標準該
6產(chǎn)品應(yīng)該為口服或管飼食物；該產(chǎn)品應(yīng)該標示為用于有特定營養(yǎng)需求的特定醫(yī)學病癥、疾病或病況的飲食管理；和該產(chǎn)品應(yīng)該計劃在醫(yī)學監(jiān)督下使用。
在又一實施方案中，可用本發(fā)明方法來測定粗蛋白質(zhì)來源中TGF-β的生物活性， 所述粗蛋白質(zhì)來源例如乳清蛋白濃縮物、脫脂奶粉或酪蛋白蛋白質(zhì)。
本發(fā)明組合物可以以本領(lǐng)域已知的任何形式提供，例如粉末、凝膠、混懸劑、糊狀物、固體、液體、液體濃縮物或即用型產(chǎn)品。
在本發(fā)明方法中，用HT-2細胞生物測定來測量TGF-β 1和TGF-β 2的生物活性。 生物活性是以所測組合物的IC50值來測定。IC50值是組合物抑制一半生物功能或生物化學功能的效能的量度。在這種情況下，IC50值是抑制HT-2細胞的50%生物活性的濃度。
HT-2細胞系是由James Watson博士建立的因子依賴性克隆鼠T-輔助細胞系 (J.Exp. Med. 1979 ；150 :1510)。該生物測定測量TGF-β對細胞生長的劑量反應(yīng)性抑制， 所述TGF-β劑量通常為2倍系列稀釋。該生物測定測量TGF-β抑制這些業(yè)已用鼠白介素-4(mIL-4)激活的細胞的生長的活性。當與貂肺上皮細胞生長抑制(MvlLu生物測定) 比較時，該細胞生物測定業(yè)已顯示具有高度再現(xiàn)性及準確性。證明該生物測定對皮摩爾濃度的TGF-β高度靈敏，抑制用IL-4刺激的ΗΤ-2細胞的S期進展。
在本發(fā)明之前，關(guān)于制備營養(yǎng)品、粗蛋白質(zhì)來源或奶來源的樣品用于ΗΤ-2細胞生物測定來測量TGF-β生物活性的方法尚未開發(fā)。本發(fā)明人開發(fā)了制備這些組合物并測量其中的TGF-β 1和TGF-β 2的生物活性的新穎方法。
在某些實施方案中，所述方法涉及測量未消化的粉末狀營養(yǎng)品或粗蛋白質(zhì)來源的樣品中的TGF-β 1和TGF-β 2的生物活性。在該實施方案中，本發(fā)明方法可包括讓營養(yǎng)品或粗蛋白質(zhì)來源的樣品在蒸餾水或磷酸緩沖鹽水(PBQ中復(fù)溶至約200-約300mg/mL。在另一實施方案中，所述方法涉及讓營養(yǎng)品或粗蛋白質(zhì)來源的樣品在蒸餾水或PBS中復(fù)溶為約250mg/mL。在實施方案中，復(fù)溶可包括將1克樣品加到4mL蒸餾水或PBS中。
然后可使樣品酸化到pH約1-約2。在實施方案中，可使樣品酸化到pH約1. 5?？捎帽绢I(lǐng)域已知的任何酸完成酸化步驟。在特定實施方案中，所述酸可為6M HCl0樣品酸的比率可為約2 0.06。因此，在一個實例中，2mL樣品可用0.06mL的酸來酸化?？勺寴悠酚谑覝胤跤s3小時，然后以13，OOOrpm離心約5分鐘。
然后可收集并中和清澈的上清液層?？捎帽绢I(lǐng)域已知的任何堿完成中和步驟。在特定實施方案中，所述堿可為6M NaOH?？杉尤雺A使樣品pH為約7-約8。在特定實施方案中，樣品pH可為約7-約7.5。樣品堿的比率可為約2.6 0.05。因此，在一個實例中，2. 6mL樣品可用0. 05mL的酸來酸化。樣品酸堿的總比率可為1 0. 03 0. 02或 1. 05。
作為酸激活的替代方案，可過濾復(fù)溶樣品。因此，在實施方案中，復(fù)溶后可讓樣品于室溫孵育約1. 5小時。然后可讓樣品以約13，OOOrpm離心約5分鐘。在實施方案中，可讓樣品以該方式離心兩次。然后可收集樣品的上清液，并用0. 8/0. 2 μ m過濾器過濾。
根據(jù)本發(fā)明方法，然后可對樣品實施HT-2生物測定，在每一圖表的第一個點以 1 5稀釋，在每一圖此后的9個點以2倍系列稀釋。
在不同實施方案中，若樣品為粉末，則可通過首先將樣品復(fù)溶為約140mg/mL-約 150mg/mL，來測量營養(yǎng)品或粗蛋白質(zhì)來源的樣品中的TGF-β 1和TGF-β 2的生物活性。在一個實施方案中，可將樣品復(fù)溶到約14aiig/mL。該復(fù)溶可包括將約8. 5克樣品加到約2液量盎司的水中。或者，復(fù)溶可包括將約2. 84克樣品加到約20mL水中。若樣品為液體，則不需復(fù)溶。在一個實施方案中，PPBS可在復(fù)溶中代替水。
在該實施方案中，如下表1中所顯示，由于復(fù)溶率較低TGF-β優(yōu)先分級分離到復(fù)溶樣品的乳清部分(占約約30%)中。如所觀察到的，乳清相關(guān)TGF-β 2的量視嬰兒配方奶粉的復(fù)溶率而定。
表 1.
樣品重量酸姿封部分乳清部分e/o乳清部分食物樣品重量食物樣品重量I！ Enf. Lip 250 mg/ml(1)5.06090,60442.7234 IhbhhhbmI Enf. Lip 250 mg/ml (2)5.05620.53692.8210Enf. Lip 142 mg/ml (1)2.84630.14071.854564Enf. Lip 142 mg/ml (2)2.84080.16421.7570 在該實施方案中，然后可讓樣品以10，OOOrpm離心約10分鐘。應(yīng)該保留沉淀及頂部脂肪層。然后可將濃HCl加到上清液中使ρΗ為約2-約3。然后可讓樣品于室溫孵育約 15分鐘。再次讓樣品以約10，OOOrpm離心約10分鐘。再次應(yīng)該保留酪蛋白層(沉淀或頂層)以及乳清(上清液)部分?？捎?0% NaOH中和上清液層使其ρΗ為約7-約7. 5。然后可讓上清液再次以約10，OOOrpm離心約10分鐘。然后可將沉淀及上清液部分凍干。用水將凍干粉復(fù)溶為濃度500mg/ml用于HT-2細胞生物測定。
在另一實施方案中，本發(fā)明方法包括測量未消化奶樣品中的TGF-β 1和TGF-β 2 的生物活性。在該實施例中，可讓樣品以約13，OOOrpm離心約15分鐘三次。然后樣品可用 IN HCl (125 μ L樣品/25 μ L 1NHC1)激活，并于室溫孵育約3小時。然后可用1. N NaOH中和樣品(125 μ L樣品/25 μ L IN NaOH)。然后用2倍稀釋的樣品實施ΗΤ-2生物測定。
在備選實施方案中，可通過首先用IN HCl將樣品激活(125 μ L樣品/25 μ L IN HCl)并于室溫孵育約3小時，來制備用于ΗΤ-2生物測定的未消化奶樣品。然后可讓樣品以約13，OOOrpm離心約5分鐘?？墒占锨逡翰⒁约s13，OOOrpm離心約5分鐘。然后可用 IN NaOH中和樣品(125 μ L樣品/25 μ L IN NaOH)。然后可用2倍稀釋的樣品實施ΗΤ-2生物測定。
在本發(fā)明另一實施方案中，所述方法可包括測量消化的營養(yǎng)品、粗蛋白質(zhì)來源或奶的樣品中TGF-β 1和TGF-β 2的生物活性。在所述實施方案中，樣品若凍干則可讓樣品于室溫融化?？蓽y定樣品ΡΗ，然后調(diào)整為ρΗ約6. 7-約6. 8。然后可讓樣品以13，OOOrpm 離心約5分鐘。在實施方案中，可讓樣品以該方式離心兩次。然后可收集上清液層，并以2 倍稀釋實施ΗΤ-2生物測定。
在實施ΗΤ-2生物測定時，方案如下。ΗΤ-2細胞應(yīng)該處于對數(shù)生長期。然后可用測定培養(yǎng)基將標準品及樣品稀釋到工作濃度?？蓪⒋蠹s50 μ L測定培養(yǎng)基加到96孔板的每一孔中。然后可將標準品及樣品加到每板中。可向第一孔中加入25yL，此后以2倍系列稀釋。最后一孔可作為空白，可僅加入稀釋用培養(yǎng)基?？勺寴悠芬皇蕉葸M行測量。
在接下來的步驟中，可將測定培養(yǎng)基以大約25 μ L/孔的量加到各孔中。然后可收獲HT-2細胞，并用RPMI洗滌3次。然后可讓細胞以虹IO5個細胞/mL懸浮在測定培養(yǎng)基中?？蓪⒋蠹s25 μ L的細胞加到對照孔(無IL-4的孔)中。然后可在將25yL細胞加到其余孔之前將IL-4以約30ng/mL加到剩余的細胞懸浮液中。
然后可讓細胞在潮濕小室中于約37°C、5% CO2孵育約48小時。在孵育的最后 4-6小時期間，可將大約10μ L的0. lmg/mL刃天青(Resazurin)加到各孔中。孵育后可以 560nmm激發(fā)波長和590nm發(fā)射波長測定熒光強度。
可用rhTGF-β生物活性作圖計算TGF-β生物活性相當量。在實施例中，在圖1所示的產(chǎn)生的圖中計算具有7175. 3pg/mL的TGF- β 2活性和0. 118ng/mL的ED5tl的rhTGF- β 2 的樣品的TGF-β生物活性相當量。可從rhTGF-β 2的ED5tl(在本實施例中為0. 118ng/mL) 開始向上做垂線(1)?？蓮膔hTGF-β 2線與所述垂線交點開始作水平線(2)。然后可從水平線O)與樣品線交點作垂線(3)?；诖咕€(3)與χ-軸交點確定稀釋因子。如圖1所示， 在本案例中稀釋因子為0. 0048。用該稀釋因子及0. 118ng/mL的ED5tl，可計算樣品相當量 (0. 118/0. 0048 = 24. 583ng/mL或24583pg/mL)。為了產(chǎn)生相當量圖，可用計算的活性相當量(pg/mL)對通過ELISA測量的樣品濃度(pg/mL)作圖。相當量圖和數(shù)據(jù)示于圖2A-D中。
在本發(fā)明單個實施方案中，可用cellomics生物測定來測量TGF-β生物活性。 TGF-β通過提供絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的細胞表面受體將信號傳導(dǎo)到稱為Smad的細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)組分，進而調(diào)節(jié)細胞核中的靶基因的活性?？蓪mad分為3類受體激活的 Smad (Smad 1、2、3、5、8)、通用或中介 Smad (Smad 4)和抑制性 Smad (Smad 6 禾Π 7)。Smad 2 和 3由TGF-β本身激活，而Smad 1和5由轉(zhuǎn)化生長因子超家族的其它成員激活。生物信號傳導(dǎo)是個復(fù)雜的過程，涉及多種信號傳導(dǎo)分子的激活及轉(zhuǎn)運。大部分信號傳導(dǎo)事件涉及多種互相作用的組分，在很多情況下，激活與靶分子從細胞的一個位置到另一位置的移動偶聯(lián)， 在該過程中傳導(dǎo)生物信號。
本發(fā)明方法中使用的cellomics儀器可為本領(lǐng)域已知的任何儀器。在一個實施方案中，儀器為 Thermo Scientific Cellomics MolecularTranslocation Bioapplication。 一般而言，cellomics生物測定提供以完全自動方式定量測定單個細胞內(nèi)熒光標記的靶分子在細胞內(nèi)移動的能力。更具體地講，cellomics提供用于通過監(jiān)測細胞質(zhì)和細胞核之間的移動來分析轉(zhuǎn)錄因子和激酶激活的極為有效的方法。
設(shè)計了用于TGF-β 1-誘導(dǎo)的Smad2轉(zhuǎn)運的抑制劑的本文所述Smad重分配測定， 其通過監(jiān)測GFP-Smad2融合蛋白從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)運到細胞核來實現(xiàn)。TGF-β 1用作參考激動劑， 測定化合物的抑制TGF-β 1-刺激的Smad2核轉(zhuǎn)運的能力。然而，先前尚未采用標準Smad cellomics研究來測量奶、營養(yǎng)品或粗蛋白質(zhì)來源樣品中TGF-β的生物活性。在本發(fā)明中， 本發(fā)明人開發(fā)了這一方法。
在所述方法的第一步中，可用水或PBS讓粉末狀樣品復(fù)溶為濃度8. 5g/l f 1. oz或 0. 284g/mL0在另一實施方案中，可讓粉末狀樣品復(fù)溶為濃度約14aiig/mL。對于液體例如奶不需復(fù)溶，樣品可原樣使用。工作體積可為lml。
然后可通過加入酸例如濃HCl達到pH約2-約3來激活TGF- β。對于復(fù)溶的粉末狀營養(yǎng)品，HCl量可為約13 μ L-約16 μ L0對于奶，HCl量可為約4 μ L-約5 μ L。
然后所有樣品都可于室溫孵育15分鐘。然后可讓樣品以10，OOOrpm離心約10分鐘?？杀Ａ衾业鞍?沉淀或頂層)和乳清(上清液)部分。
然后可用堿例如50% NaOH中和乳清部分/上清液以達到pH約7_約7. 5。對于營養(yǎng)品，NaOH的量可為約4 μ L-約8 μ L。對于奶，NaOH的量可為約1 μ L-約2 μ L。
然后可按照MDA-MB-468細胞的Smad2生物測定的cellomics方案將樣品加到細胞中。該方案如下所述。讓細胞在血清存在下與含有TGF-β的樣品接觸90分鐘。固定后在Cellomics ArrayScan VTI上分析細胞。基于GFP標記的Smad2從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)運到細胞核來計算TGF-β反應(yīng)。
以下實施例闡述本發(fā)明不同實施方案。通過參考本文揭示的本發(fā)明說明書或本發(fā)明的實施，本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然明了本文權(quán)利要求范圍內(nèi)的其它實施方案。應(yīng)該將說明書連同實施例僅看作是例示，本發(fā)明范圍及精神由權(quán)利要求所指示。在實施例中，除非另外指出，否則給出的所有百分比皆基于重量。
實施例1 本實施例闡明經(jīng)由用ΗΤ-2細胞的生物測定來測量TGF- β的生物活性。從 P. Marrak 博士實驗室獲得 ΗΤ-2 亞克隆(Kappler，J. W.等，J. Exp. Med. 153 1198-214(1981))。該亞系無可檢測的輔助細胞活性。細胞處于對數(shù)生長期。
細胞生長和制備 材料 HT-2 細胞 生長培養(yǎng)基 1. RPMI 1640 2. 10% FBS (JRH # :12107-1000M) 3. 50uM β-巰基乙醇 4. 2mML谷氨酰胺 5. 10ng/mL rhIL-2 細胞維持方案 將細胞以h IO4個細胞/mL接種于生長培養(yǎng)基中。
每2-3天給細胞傳代一次。
樣品制備 從供者獲得人乳樣品。通過讓125μ L樣品與25μ L IN HCl混合來激活樣品。然后讓樣品于室溫孵育約3小時。然后讓樣品以13，OOOrpm離心5分鐘。收集上清液，并以約13，OOOrpm離心約5分鐘。然后用1. 2Ν NaOH(125 μ L樣品/25 μ L IN NaOH)中和樣品。
ΗΤ-2生物測定 材料 ΗΤ-2 細胞 測定培養(yǎng)基 1. RPMI 1640 2. 10% FBS(JRH# 12107—1000M) 3. 50uM β-巰基乙醇 4. 2mML谷氨酰胺 rmIL-4 Dulbecco' s PB S (Irvine#9240)
10 BSA(Sigma#A-7888) 刃天青(R&DCatalog#AR002) 用于激活潛伏狀態(tài)TGF β 冰乙酸(來自Mallinckrodt Baker) TGF-β生物測定方案 1.用測定培養(yǎng)基將標準品和樣品稀釋為工作濃度 i.將50 μ L測定培養(yǎng)基加到96孔板的各孔中。
ii.然后將標準品和樣品加到板中。
1.將25μ L樣品加到第一孔中，從此處開始3倍系列稀釋。
2.最后一孔僅含稀釋用培養(yǎng)基(空白)。
3.樣品一式二份進行。
iii.所有孔中加入25uL/孔的測定培養(yǎng)基。
2.然后收獲HT-2細胞，用RPMI洗滌3次。
3.將細胞以4xl05個細胞/mL懸浮在測定培養(yǎng)基中。
4.將25 μ L細胞加到對照孔(無IL_4的孔)中。在將25 μ L細胞加到其余孔之前向剩余細胞懸浮液中加入30ng/mL的mIL_4。
5.讓板在潮濕小室中于37°C、5% CO2孵育48小時。
6.在孵育的最后4-6小時期間向每孔中加入10 μ L的0. lmg/mL刃天青。
7.孵育結(jié)束時，用560nm激發(fā)波長和590nm的發(fā)射波長測量熒光強度。
同時制備同樣的人乳樣品，用標準HT-2細胞生物測定技術(shù)檢測。圖3闡明用兩種不同的激活程序處理的人乳樣品的生物活性差異。圖3闡明用本發(fā)明方法制備(“改良激活")的人乳樣品與按照標準程序制備(“標準激活")的人乳樣品相比具有5倍的生物活性。因此，顯然本發(fā)明方法提供了對TGF-β生物活性的令人驚訝的出乎意料之外的增強。
實施例2 本實施例闡明本發(fā)明測量TGF-β生物活性的cellomics方法。
在本實施例中使用以下樣品 嬰兒配方奶粉 i.21g 干奶粉 ii. TGF-β 2 濃度 0. 05ppm 含TGF-β 2的奶蛋白部分 i. 11.5g 干奶粉 ii. TGF-β 2 濃度 0. 9ppm 樣品制備 用水將樣品復(fù)溶為0. 142g/ml。然后讓樣品以10，OOOrpm離心10分鐘。保留沉淀和溶液頂部的脂肪層。通過加入濃HCl直到pH為2-3來激活TGF-β。然后讓樣品于室溫孵育15分鐘。孵育后讓樣品以10，OOOrpm離心10分鐘。保留酪蛋白(沉淀或頂層)和乳清(上清液)部分。用50% NaOH中和乳清部分/上清液直到ρΗ為7-7. 5。然后讓樣品以 10，OOOrpm離心10分鐘。
純化的重組人TGF-β 2購自Sigma(貨號Τ4815)，按照廠商說明書來溶解及儲存。
樣品從0. 071g/ml (最終測定濃度)開始、重組人TGF- β 2從lOng/ml (最終測定濃度)開始，在9點半log對數(shù)濃度反應(yīng)中作出所有化合物的曲線。相對于同一塊板的陰性對照和陽性對照來計算化合物活性。
表2.板圖
權(quán)利要求
1.用于測定粉末狀營養(yǎng)組合物或粉末狀粗蛋白質(zhì)來源的樣品中TGF-β的生物活性的方法，所述方法包括a.讓所述樣品復(fù)溶為約140mg/mL-約150mg/mL的濃度；b.讓所述復(fù)溶樣品以約10，OOOrpm離心約10分鐘，并保留上清液層；c.使所述上清液層酸化到pH約2-約3；d.讓所述上清液層于室溫孵育約15分鐘；e.讓所述上清液層以約10，OOOrpm離心約10分鐘，并保留上清液層；f.將來自步驟(e)的上清液層中和到pH約7-約7.5;g.讓步驟(f)的上清液層以約10，OOOrpm離心約10分鐘，并保留上清液層；h.讓所述上清液層與HT-2細胞接觸；和i.測定抑制50%的HT-2細胞的生物活性的濃度。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述營養(yǎng)組合物選自營養(yǎng)增補劑、兒童營養(yǎng)品、嬰兒配方奶粉和人乳增強劑。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述酸化步驟包括加入濃HCl。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述中和步驟包括加入50%NaOH。
5.用于測定液態(tài)奶樣品中TGF-β的生物活性的方法，所述方法包括a.讓所述樣品以約13，OOOrpm離心約15分鐘；b.收集所述樣品的上清液層并用所述上清液重復(fù)步驟(a)；c.收集來自步驟(b)樣品的上清液層并用來自步驟(b)的該上清液重復(fù)步驟(a)；d.使所述上清液層酸化到pH約2-約3；e.讓所述上清液層于室溫孵育約3小時；f.將所述上清液層中和到PH約7-約7.5 ；g.讓步驟(f)的上清液層以約10，OOOrpm離心約10分鐘，并保留上清液層；h.讓所述上清液層與HT-2細胞接觸；和i.測定抑制50%的HT-2細胞的生物活性的濃度。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述酸化步驟包括將約25μ L IN HCl加到約125 μ L樣品中。
7.權(quán)利要求5的方法，其中所述中和步驟包括將約25μ L INNaOH加到約125 μ L樣品中。
8.用于測定液態(tài)奶樣品中TGF-β的生物活性的方法，所述方法包括a.使所述樣品酸化到pH約2-約3；b.讓所述樣品于室溫孵育約3小時；c.將所述樣品中和到pH約7-約7.5 ；d.讓所述樣品以約10，OOOrpm離心約5分鐘，并保留上清液層；e.讓所述上清液層以約10，OOOrpm離心約5分鐘，并保留上清液層；f.讓來自步驟(e)的上清液層與HT-2細胞接觸；和g.測定抑制50%的HT-2細胞的生物活性的濃度。
9.用于測定粉末狀營養(yǎng)組合物或粉末狀粗蛋白質(zhì)來源的樣品中TGF-β的生物活性的方法，所述方法包括a.讓所述樣品復(fù)溶為約140mg/mL-約150mg/mL的濃度；b.使所述復(fù)溶的樣品酸化到pH約2-約3；c.讓所述上清液層于室溫孵育約15分鐘；d.讓所述上清液層以約10，OOOrpm離心約10分鐘，并保留上清液層；e.中和來自步驟⑷的上清液層到pH約7-約7.5;f.在血清存在下讓所述樣品與MDA-MB-468細胞接觸；和g.基于GFP標記的Smad2從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)運到細胞核來分析TGF-β反應(yīng)。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述酸化步驟包括將約13μ L-約16 μ L的HCl加到約ImL 樣品中。
11.權(quán)利要求9的方法，其中所述中和步驟包括將約4μ L-約8 μ L的NaOH加到約ImL 樣品中。
12.用于測定液態(tài)奶樣品中TGF-β的生物活性的方法，所述方法包括a.使所述樣品酸化到pH約2-約3；b.讓所述樣品于室溫孵育約15分鐘；c.讓所述樣品以約10，OOOrpm離心約10分鐘，并保留上清液層；d.將步驟(c)的上清液層中和到pH約7-約7.5 ；e.在血清存在下讓所述樣品與MDA-MB-468細胞接觸；和f.基于GFP標記的Smad2從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)運到細胞核來分析TGF-β反應(yīng)。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述酸化步驟包括將約4μ L-約5 μ L的HCl加到約ImL 樣品中。
14.權(quán)利要求12的方法，其中所述中和步驟包括將約1μ L-約2 μ L的NaOH加到約ImL 樣品中。
全文摘要
本發(fā)明提供用于測定奶、粗蛋白質(zhì)來源或營養(yǎng)組合物樣品中TGF-β的生物活性的新穎方法。所述方法包括特別的復(fù)溶步驟、離心步驟、孵育步驟和激活步驟?？稍贖T-2細胞生物測定或cellomics生物測定中測量樣品中的TGF-β的生物活性。
文檔編號A61K38/00GK102186492SQ200980142165
公開日2011年9月14日 申請日期2009年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月24日
發(fā)明者G·P·賴, F·J·羅塞爾斯, Z·E·朱尼, R·瓦沃倫圖 申請人:美贊臣營養(yǎng)品公司