專(zhuān)利名稱(chēng)：包含抗-聚合物抗體的靶向構(gòu)建體和結(jié)合它們的脂質(zhì)體或微泡的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種集合體(assembly)，該集合體包含⑴靶向構(gòu)建體，其包含靶向配體和抗-聚合物抗體，和(ii)含有聚合物的脂質(zhì)體或充氣微泡，其能結(jié)合或聯(lián)合所述集合體。本發(fā)明另外涉及制備和施用所述集合體的方法，以及包含所述靶向構(gòu)建體和所述脂質(zhì)體或充氣微泡的藥用試劑盒。
背景技術(shù)：
采用能增強(qiáng)使用不同成像技術(shù)可得到圖像的試劑(稱(chēng)作“造影劑”或“圖像增強(qiáng)劑”)的診斷性成像已經(jīng)成為診斷領(lǐng)域中被廣泛采用的實(shí)踐。近年來(lái)造影劑的快速發(fā)展已經(jīng)產(chǎn)生了許多不同的制劑，它們可用于人或動(dòng)物體的器官和組織的反差增強(qiáng)的成像。對(duì)超聲反差成像特別有用的一類(lèi)造影劑包括分散在水性介質(zhì)中的納米和/或微米尺寸的氣泡的懸浮液。特別感興趣的是，其中氣泡被穩(wěn)定化的那些制劑，所述穩(wěn)定化例如通過(guò)使用乳化劑、油、增稠劑或糖類(lèi)，或通過(guò)使氣體或其前體陷入或包封在多種系統(tǒng)中。這些穩(wěn)定化的氣泡在本領(lǐng)域通常用不同的術(shù)語(yǔ)來(lái)表示，例如，“微泡”、“微球”、“微氣泡”、“微囊”或“微氣球”。在本發(fā)明的說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中，使用術(shù)語(yǔ)“微泡”來(lái)表示上述穩(wěn)定化的氣泡中的任一種。其它造影劑包括碘化產(chǎn)物(諸如碘帕醇或碘美普爾)，它們廣泛地用于X-射線反差分析中，尤其是計(jì)算機(jī)體層成像(CT)X-射線，而含有順磁離子的化合物(諸如 ProHance 或MultiHance ，Bracco imaging)被廣泛地用于MRl分析中。可以有利地將有活性的(X-射線或MRI)成像劑摻入脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)中(參見(jiàn)例如參考文獻(xiàn)1或參考文獻(xiàn)2)。充氣微泡可以在它們的制劑中包括聚合物，尤其是親水聚合物(例如聚乙二醇， PEG)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)所述聚合物可以用于例如，降低免疫原性、提高生物相容性、減少受體介導(dǎo)的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)的攝取和/或增加造影劑的血清半衰期。出于類(lèi)似的原因，諸如PEG 等聚合物也已經(jīng)被包含在用作造影劑或治療劑的載體的脂質(zhì)體制劑中。最近，已經(jīng)用合適的靶向特異性的組分修飾充氣微泡，所述組分能使微泡選擇性地結(jié)合到目標(biāo)器官或組織上。例如，可以給微泡或脂質(zhì)體結(jié)合(例如通過(guò)包含在它們的邊界外膜(envelope) 內(nèi))特異性的組分，所述組分能結(jié)合到患者體內(nèi)的確定的靶物或區(qū)域(稱(chēng)作“靶向配體”)， 從而選擇性地增強(qiáng)所述靶物或區(qū)域的成像。靶向配體的實(shí)例包括，例如，肽、蛋白或抗體，其能結(jié)合特定器官或組織，例如，生成血管的炎性的或形成血栓的組織。例如，通過(guò)使靶向配體結(jié)合到合適的分子上(所述分子用于形成微泡的或脂質(zhì)體的外膜)，可以修飾微泡或脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)。靶向部分可以直接或通過(guò)合適的間隔物連接到形成外膜的分子上。該方法學(xué)因而通常會(huì)使形成微泡或脂質(zhì)體外膜的組分修飾成為必需，以允許其結(jié)合希望的靶向部分。申請(qǐng)人:現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一種新方法，其中借助于能特異性地識(shí)別包含在脂質(zhì)體或微泡中的聚合物組分的抗體，使靶向配體結(jié)合所述含有聚合物的脂質(zhì)體或充氣微泡。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)方面涉及藥用試劑盒，其包含a)第一組合物，其包含脂質(zhì)體或充氣微泡或其前體，它們具有包含多個(gè)聚合物分子的穩(wěn)定化外膜；和b)第二組合物，其包含靶向構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含靶向配體和能選擇性地結(jié)合所述聚合物的抗體。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，所述聚合物是親水聚合物。優(yōu)選地，所述聚合物含有重復(fù)氧乙烯單元(oxyethylene units)，且更優(yōu)選地，它以甲氧基終止。根據(jù)一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案，所述聚合物是聚乙二醇。優(yōu)選地，所述抗體因而結(jié)合親水聚合物，更優(yōu)選地，它結(jié)合含有重復(fù)氧乙烯單元的聚合物，且甚至更優(yōu)選地，它結(jié)合含有重復(fù)氧乙烯單元并以甲氧基終止的聚合物。根據(jù)一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案，所述抗體結(jié)合聚乙二醇。根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，所述聚合物的摩爾量是相對(duì)于所述穩(wěn)定化外膜的組分的總量的至少0. 05%，優(yōu)選地是至少0. 2%，且甚至更優(yōu)選地是至少1%。根據(jù)一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案，所述聚合物共價(jià)結(jié)合到兩親化合物上，優(yōu)選磷脂。根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，所述微泡具有穩(wěn)定化外膜，所述外膜包含兩親物質(zhì)， 優(yōu)選磷脂；優(yōu)選地所述兩親物質(zhì)占所述穩(wěn)定化外膜的總組分的摩爾數(shù)超過(guò)50%，且更優(yōu)選地超過(guò)80 %，且甚至更優(yōu)選地超過(guò)90 %。根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及脂質(zhì)體或充氣微泡或其前體，其包含a)多個(gè)聚合物分子；b)與所述聚合物結(jié)合的抗體；和C)與所述抗體結(jié)合的靶向配體。優(yōu)選的抗體和聚合物如上面所定義。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及將脂質(zhì)體或充氣微泡施用至患者的身體部分的方法，所述方法包括下述步驟a)施用第一組合物，其包含靶向構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含(i)能選擇性地結(jié)合所述身體部分中的分子或組織的靶向配體，和(ii)能選擇性地結(jié)合聚合物分子的抗體；b)施用第二組合物，其包含所述脂質(zhì)體或所述充氣微泡，它們具有包含多個(gè)所述聚合物分子的穩(wěn)定化外膜。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，在足以允許靶向構(gòu)建體到達(dá)選擇的身體部分的時(shí)間后，施用所述脂質(zhì)體或充氣微泡。


圖1-3解釋了根據(jù)本發(fā)明的靶向構(gòu)建體的實(shí)施例。圖4解釋了本發(fā)明的靶向構(gòu)建體以及造影劑/治療劑的應(yīng)用實(shí)施例。
具體實(shí)施例方式
4
定義表述“結(jié)合”，特別當(dāng)表示靶向配體與能選擇性地結(jié)合親水聚合物的抗體的結(jié)合時(shí)，在它的含義中包括能在參與結(jié)合的組分之間建立相對(duì)穩(wěn)定的相互作用的任意共價(jià)的或非共價(jià)的結(jié)合。表述“非共價(jià)的結(jié)合”包括不參與共價(jià)鍵的2個(gè)或更多個(gè)分子之間的分子間相互作用，例如，離子或靜電相互作用、偶極-偶極相互作用、氫鍵合、親水的或疏水的相互作用、范德華力及其組合。非共價(jià)的結(jié)合另外包括親和結(jié)合對(duì)的部分之間的相互作用，例如， 抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白和生物素之間的相互作用；蛋白A或G結(jié)合和免疫球蛋白的Fc-區(qū)之間的相互作用；寡核苷酸和互補(bǔ)序列之間的相互作用，例如聚脫氧腺苷酸 (polydesoxyadenylic acid)禾口聚月兌氧月匈 ^f 酸(polydesoxythimidylic acid)，或聚月兌氧鳥(niǎo)苷酸和聚脫氧胞苷酸；Ni-NTA (次氮基三乙酸，鎳鹽)和聚組氨酸-標(biāo)簽化的配體。表述“造影劑”在它的含義中包括可以與下述方法聯(lián)合使用的任意化合物、構(gòu)建體、組合物或制劑，所述方法用于成像患者的目標(biāo)區(qū)域，和/或輔助診斷患者中疾病的存在與否，且通常能增強(qiáng)診斷性成像技術(shù)的成像。診斷技術(shù)的實(shí)例包括超聲成像、磁共振成像、 X-射線成像(尤其是計(jì)算機(jī)體層攝影術(shù))、光學(xué)成像、核成像或分子成像。合適的造影劑的實(shí)例包括，例如，充氣微泡(例如用于超聲成像)、碘化的化合物、碘化的脂質(zhì)體；磁性納米顆粒；順磁離子螯合的復(fù)合物；熒光染料；包含超極化的原子或放射性藥劑的化合物。術(shù)語(yǔ)“治療劑”在它的含義中包括可以用于任意治療用途(例如用于治療患者的疾病的方法中)的任意物質(zhì)、組合物、制劑或藥物遞送系統(tǒng)，以及在體外和/或在體內(nèi)能產(chǎn)生或負(fù)責(zé)產(chǎn)生生物學(xué)或生理學(xué)效應(yīng)的任意物質(zhì)。治療劑因而包括能用于治療(包括預(yù)防、 減輕、疼痛減輕或治愈)患者的任意病理學(xué)狀況(包括疾病、痛苦、病灶(disease lesion) 或損傷)的任意化合物或物質(zhì)，諸如藥物、藥劑、生物活性劑、細(xì)胞毒性劑、化療劑、放射療法劑、蛋白、天然的或合成的肽(包括寡肽和多肽)、維生素、留類(lèi)和遺傳物質(zhì)(包括核苷、核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸和質(zhì)粒)。在它們中，藥物或藥劑是優(yōu)選的。治療劑的實(shí)例包括抗?jié)儎┲T如奧美拉唑、法莫替丁或雷尼替??；抗高血壓劑諸如氨氯地平、纈沙坦或氯沙坦；β阻滯劑諸如阿替洛爾或普萘洛爾；鈣通道阻滯劑諸如尼群地平或維拉帕米；血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑諸如依那普利或雷米普利；血管緊張素II抑制劑諸如氯沙坦鉀；鉀通道活化劑、諸如尼可地爾；利尿劑和抗利尿劑諸如氫氯噻嗪或氨苯蝶啶；抗心絞痛藥諸如硝酸異山梨酯或地爾硫卓；促凝藥諸如綴合的甲萘醌或蝮蛇血凝酶；抗凝血藥、抗血栓藥或抗血小板藥諸如組織纖溶酶原活化劑或肝素；抗心律不齊藥諸如丙吡胺或胺碘酮；血管擴(kuò)張劑諸如洋地黃毒苷、地高辛或洋地黃苷；青霉素諸如哌拉西林或阿莫西林(任選地與克拉維酸相組合)；β -內(nèi)酰胺類(lèi)諸如亞胺培南或美羅培南；喹諾酮類(lèi)或熒光喹諾酮類(lèi)諸如萘啶酸、左氧氟沙星或莫西沙星；頭孢菌素類(lèi)諸如頭孢地尼或頭孢克洛；磺胺類(lèi)藥諸如磺胺甲基異^惡唑(sulphametoxazole)；氨基糖苷類(lèi)諸如阿奇霉素或慶大霉素；多粘菌素類(lèi)諸如多粘菌素_b ；四環(huán)素類(lèi)諸如多西環(huán)素；大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)諸如紅霉素或克林霉素；巧t唑烷酮類(lèi)諸如利奈唑胺；抗病毒劑諸如阿扎那韋、齊多夫定、依法韋侖、 替諾福韋、阿巴卡韋、替諾福韋、洛匹那韋、阿昔洛韋、伐昔洛韋、奧塞米韋(ozeltamivir)； 抗瘧藥諸如青蒿琥酯或甲氟喹；抗結(jié)核藥諸如異煙胼；鏈霉素或吡嗪酰胺；抗蠕蟲(chóng)藥和抗感染藥諸如哌嗪、雙羥萘酸噻嘧啶或甲苯達(dá)唑(membendazole)；抗麻風(fēng)藥諸如抗原生動(dòng)物藥；抗阿米巴藥諸如甲硝唑；抗真菌藥諸如卡泊芬凈、伏立康唑、氟康唑；抗過(guò)敏藥諸如莫米松、非索非那定、特非那定或西替利嗪；骨骼肌松弛藥諸如替扎尼定或巴氯芬；非留體抗炎藥諸如塞來(lái)考昔、美洛昔康或布洛芬；抗腫瘤藥諸如氮芥化合物(例如環(huán)磷酰胺)、氮丙啶(例如thioepa)、N-硝基脲衍生物(例如洛莫司汀)、鉬化合物(例如奧沙利鉬)、丙卡巴胼、達(dá)卡巴嗪甲氨蝶呤、多柔比星、絲裂霉素、安絲菌素、胞嘧啶阿糖核苷、長(zhǎng)春新堿、鹽酸柔紅霉素、鹽酸多柔比星、表柔比星、米托蒽醌、博來(lái)霉素、氨魯米特、醋酸亮丙瑞林、戈舍瑞林、比卡魯胺、檸檬酸他莫昔芬、曲洛司坦、門(mén)冬酰胺酶(L-門(mén)冬酰胺酶)、依托泊苷、干擾素α _2a、干擾素α _2b、替尼泊苷(VM-26)、硫酸長(zhǎng)春堿(VLB)、硫酸長(zhǎng)春新堿、紫杉醇、多西他賽、喜樹(shù)堿、伊立替康、甲氨蝶呤、多柔比星、阿拉伯糖基、羥基脲；葉酸拮抗劑諸如氨基蝶呤、甲氨蝶呤、培美曲塞；核苷類(lèi)似物拮抗劑諸如吉西他濱、卡培他濱、巰嘌呤、硫鳥(niǎo)嘌呤、 氟尿嘧啶或阿糖胞苷；酪氨酸激酶抑制劑諸如伊馬替尼、索拉非尼、抗體諸如利妥昔單抗、 西妥昔單抗、厄洛替尼、曲妥單抗或貝伐單抗；芳香酶抑制劑諸如阿那曲唑或來(lái)曲唑；麻醉品、阿片劑或鎮(zhèn)靜藥諸如檸檬酸芬太尼、鹽酸氟西泮、戊巴比妥、替馬西泮或三唑侖；局部的或全身的麻醉藥諸如七氟烷、普魯卡因、丁卡因或氟哌利多；神經(jīng)肌肉阻滯劑諸如阿曲庫(kù)銨甲磺酸酯；激素系統(tǒng)的治療劑諸如生長(zhǎng)激素、黑素細(xì)胞刺激激素、雌二醇、丙酸倍氯米松、倍他米松、醋酸可的松、地塞米松；針對(duì)肢端肥大癥的藥物諸如生長(zhǎng)抑素；針對(duì)阿爾茨海默病的藥物諸如美金剛、多奈哌齊、利斯的明；針對(duì)貧血的藥物諸如促紅細(xì)胞生成素；針對(duì)注意力缺陷伴多動(dòng)障礙的藥物諸如哌甲酯和阿托西汀；針對(duì)良性前列腺增生的藥物諸如坦洛新、非那雄胺、阿夫唑嗪；針對(duì)出血的藥物諸如凝血因子VII、因子VIII ；針對(duì)糖尿病的藥物諸如胰島素或格列美脲；針對(duì)丙型肝炎的藥物諸如聚乙二醇化的干擾素α 2a、聚乙二醇化的干擾素α-2b、針對(duì)不育的藥物諸如促卵泡素α和促卵泡素β ；針對(duì)多發(fā)性硬化的藥物諸如格拉默、干擾素β-Ia或干擾素β-Ib;針對(duì)骨質(zhì)疏松癥的藥物諸如阿屈膦酸鹽；針對(duì)呼吸道合胞病毒的藥物諸如帕利珠單抗；針對(duì)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物諸如英夫利昔單抗、 依那西普或阿達(dá)木單抗；針對(duì)精神分裂癥的藥物諸如利培酮或奧氮平；或針對(duì)移植排斥的藥物諸如他克莫司、麥考酚酯或環(huán)孢素。術(shù)語(yǔ)“充氣微泡”包括含有被穩(wěn)定化物質(zhì)的外膜或?qū)?包括膜形式層)包圍的微米或納米尺寸(例如0. 1-10 μ m，通常1-8 μ m)的氣泡的任意結(jié)構(gòu)。該術(shù)語(yǔ)特別地包括本領(lǐng)域已知的充氣的脂質(zhì)體、微氣泡、微球、微氣球或微囊。穩(wěn)定化物質(zhì)可以是本領(lǐng)域通常已知的任意物質(zhì)，包括，例如，表面活性劑、脂質(zhì)(lipids)、鞘脂、寡脂、糖脂、磷脂、蛋白、多肽、碳水化合物和合成的或天然的聚合物質(zhì)。優(yōu)選的充氣微泡是其中形成外膜的不同組分之間的相互作用屬于非共價(jià)類(lèi)型的那些，通常包括偶極_偶極相互作用、氫鍵合、親水的或疏水的相互作用、范德華力及其組合，尤其是疏水相互作用。典型地，充氣微泡用于CEUS (反差增強(qiáng)超聲)成像中。另外，這些微泡也可以用于治療性處理中，例如本文解釋的超聲介導(dǎo)的藥物遞送。術(shù)語(yǔ)“微氣泡”包括水性懸浮液，在懸浮液中，氣泡被非常薄的外膜(薄膜)(在本領(lǐng)域有時(shí)稱(chēng)作“揮發(fā)性的”外膜)限制在氣/液界面上，所述外膜包括安置在氣_液界面處的穩(wěn)定兩親物質(zhì)。可以如下制備微泡懸浮液通過(guò)使其合適的前體諸如粉末狀的兩親物質(zhì) (例如凍干的預(yù)制脂質(zhì)體或凍干的或噴霧干燥的磷脂溶液)接觸空氣或其它氣體，然后再與水性載體接觸，同時(shí)進(jìn)行攪拌，產(chǎn)生微泡懸浮液，其然后可以施用，優(yōu)選在懸浮液制成之
6后盡快施用。氣體微泡的水性懸浮液、前體及其制備的實(shí)施例公開(kāi)在例如參考文獻(xiàn)3、參考文獻(xiàn)4、參考文獻(xiàn)5、參考文獻(xiàn)6和參考文獻(xiàn)7中，它們通過(guò)引用整體并入本文。術(shù)語(yǔ)“微氣球”或“微囊”包括這樣的懸浮液在該懸浮液內(nèi)，氣泡被脂質(zhì)(lipid) 或天然或合成聚合物固體物質(zhì)外膜所包圍。微氣球及其制備的實(shí)施例公開(kāi)在例如參考文獻(xiàn) 8和參考文獻(xiàn)9中。術(shù)語(yǔ)“脂質(zhì)體”在它的含義中包括兩親化合物的基本上球形的聚集體，所述兩親化合物包括脂質(zhì)化合物，通常是分子的一個(gè)或多個(gè)同心雙層的形式，在所述雙層之間存在非共價(jià)相互作用。術(shù)語(yǔ)“其前體”包括這樣的任意組合物，其在與水性載體重配(reconstitution) 后，能生成希望的分子集合體的懸浮液。具體地，當(dāng)提及充氣微泡的前體時(shí)，該表述包括這樣的任意組合物，其在有氣體存在下與水性載體重配后，能生成如上定義的充氣微泡的懸浮液。所述前體組合物通常包含干粉形式(例如凍干的或噴霧干燥的)的任一種上面引用的穩(wěn)定化物質(zhì)，其在有氣體存在下?lián)u動(dòng)其水性懸浮液后，能形成充氣微泡。類(lèi)似地，脂質(zhì)體的前體包括干粉形式的合適的(兩親的)物質(zhì)，其在與水性載體重配后，能形成脂質(zhì)體懸浮液。短語(yǔ)“外膜形成部分”包括能參與脂質(zhì)體或充氣微泡的穩(wěn)定化外膜的形成的任意部分。所述部分優(yōu)選地是兩親物質(zhì)，優(yōu)選地包含磷脂。表述“MRI造影劑”是指這樣的造影劑，其包含對(duì)磁共振做出響應(yīng)的化合物、組合物或制劑，諸如順磁金屬離子或磁體顆粒，以及包含所述化合物的超分子構(gòu)建體，例如，脂質(zhì)體或膠束。表述“X-射線造影劑”或“CT-造影劑”是指能增強(qiáng)計(jì)算機(jī)體層成像分析的X-射線成像的那些造影劑，包括，例如，碘化的化合物，尤其是非離子(諸如碘帕醇或碘美普爾， 購(gòu)自Bracco Imaging)、硫酸鋇或金納米顆粒。表述“光學(xué)成像劑”是指能在不同的光學(xué)成像技術(shù)中增強(qiáng)成像的化合物或制劑，所述光學(xué)成像技術(shù)包括擴(kuò)散性光學(xué)體層攝影術(shù)(DOT)、光學(xué)投影體層攝影術(shù)(OPT)、近紅外熒光成像(NIR)或生物發(fā)光成像(BLI)。用于光學(xué)成像的造影劑包括有機(jī)熒光團(tuán)(例如熒光蛋白)和無(wú)機(jī)熒光半導(dǎo)體納米晶體或量子點(diǎn)(參見(jiàn)例如參考文獻(xiàn)10)。表述“核成像劑”是指能在核成像中增強(qiáng)成像的化合物或制劑，所述核成像包括正電子發(fā)射斷層攝影術(shù)(PET)和單光子發(fā)射斷層攝影術(shù)(SPECT)。第一種成像技術(shù)使用發(fā)射正電子的同位素諸如Hd15CK18F^8CX94mTc (參見(jiàn)例如參考文獻(xiàn)11)。第二種成像技術(shù)使用發(fā)射、的同位素諸如133Xe J9mTcJ23I^TlJ11In和67Ca。使用納米顆粒作為載體系統(tǒng)諸如脂質(zhì)體，可以配制所有這些試劑(參見(jiàn)例如參考文獻(xiàn)12和參考文獻(xiàn)13)。術(shù)語(yǔ)“聚合物”是指包含重復(fù)結(jié)構(gòu)單元(單體)的大分子，例如通過(guò)共價(jià)化學(xué)鍵連接的5至多達(dá)100萬(wàn)或更多的單體。聚合物可以是合成的、半合成的或天然存在的，且包含同聚物(即包含相同的重復(fù)單元)或共聚物(即包含至少2種不同的單體)。共聚物可以是周期共聚物(例如其中單體A和B排列成重復(fù)序列，諸如A-B-A-B-B-A-A-A-A-B-B-B)或具有單體A和B的隨機(jī)序列的隨機(jī)的(或統(tǒng)計(jì)的)共聚物。嵌段共聚物通常包含2個(gè)或更多個(gè)同聚物亞基，它們通過(guò)共價(jià)鍵或連接段彼此相連。具有2個(gè)或3個(gè)不同的段的嵌段共聚物分別稱(chēng)作二嵌段共聚物(AAAAA-BBBBB)和三嵌段共聚物(AAAAA-BBBBB-AAAAA)。聚合物可以是線性的(具有單個(gè)主鏈)或分支的(具有一個(gè)或多個(gè)連接到主鏈上的側(cè)鏈)。含有重復(fù)單元的聚合物鏈通常被鑒別為“聚合物主鏈”，而安置在該鏈的各個(gè)末端處的單元?jiǎng)t通常被鑒別為“末端基團(tuán)”。表述“親水聚合物”包括對(duì)水具有親和力的聚合物，通常在它們的主鏈中含有極性基團(tuán)，例如，-0-、-NH-、-SH-、-C0-或它們的任意組合。親水聚合物的實(shí)例包括聚(C2-C3)烷基_氧化物(例如PEG或PPG)、多糖(例如葡聚糖)、聚氨基酸、半合成肽和聚核苷酸。抗-聚合物抗體在下面的說(shuō)明書(shū)中，術(shù)語(yǔ)“抗-聚合物抗體”意圖在它的含義中包含能識(shí)別并選擇性地結(jié)合作為抗原的聚合物或其一部分的任意抗體，特別當(dāng)所述聚合物被包含在本文所述的脂質(zhì)體或充氣微泡的外膜中時(shí)。本文使用的術(shù)語(yǔ)抗體包括多克隆抗體、單克隆抗體、天然抗體片段、重組抗體片段和多特異性抗體。該術(shù)語(yǔ)另外包含設(shè)計(jì)用于與抗體競(jìng)爭(zhēng)特異性結(jié)合的蛋白的抗原結(jié)合片段，諸如親和體(affibodies)。通過(guò)本領(lǐng)域已知的任意方法(例如免疫野生型或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、從人患者血清分離、和篩選抗原結(jié)合片段文庫(kù))，可以生產(chǎn)抗-聚合物抗體。這里提及的抗體可以來(lái)自任意物種和任意類(lèi)別，包括，哺乳動(dòng)物IgG、M、A和E。它們可以遵循來(lái)源物種的天然抗體序列或其氨基酸變體，包括所謂的“人源化的”或raiMATIZED 抗體。在本領(lǐng)域中通常將抗體鑒別為免疫球蛋白(Ig)，即免疫系統(tǒng)響應(yīng)于病原體侵入而生產(chǎn)的多聚體糖蛋白家族。它們由抗原結(jié)合部分(Fab)和效應(yīng)子功能(Fe)組成。例如，小鼠IgG是2個(gè)相同重鏈(H)和2個(gè)相同輕鏈(L)的Y-形異四聚體。每個(gè)輕鏈通過(guò)疏水相互作用和經(jīng)常的共價(jià)二硫鍵連接到重鏈上，而重鏈之間的二硫鍵的數(shù)目在抗體亞類(lèi)中存在差異。每個(gè)重鏈和輕鏈還具有規(guī)則間隔的鏈內(nèi)二硫鍵，其參與稱(chēng)作“免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域”的球形折疊的穩(wěn)定化。每條鏈的氨基端結(jié)構(gòu)域稱(chēng)作“可變的”(Vh和\，相對(duì)于“恒定”結(jié)構(gòu)域 ChiXh2Xh3和CJ，因?yàn)樗诳贵w的序列之間存在廣泛差異，該差異是結(jié)合特異性的基礎(chǔ)。但是，差異性不是均勻地分布在抗體的可變結(jié)構(gòu)域中。它集中在3個(gè)稱(chēng)作互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR) 的區(qū)段中，而最保守的可變結(jié)構(gòu)域部分稱(chēng)作框架區(qū)(FR)。表述“多克隆抗體”通常包括針對(duì)相同抗原的不同決定簇(表位)的不同抗體。 多克隆抗體的制備是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，且描述在許多參考書(shū)中，例如，參考文獻(xiàn) 14。表述“單克隆抗體”是指從基本上同源的抗體群體得到的抗體，即除了可能存在的微量的可能的天然存在的突變以外，構(gòu)成該群體的單個(gè)抗體是相同的。單克隆抗體是高度特異性的，針對(duì)單個(gè)抗原決定簇。單克隆抗體經(jīng)常被鑒別為“完整”單克隆抗體，其中術(shù)語(yǔ) “完整”表示該抗體包含所有它的天然存在的部分(抗原結(jié)合部分和效應(yīng)部分)，且處于它的天然形式(例如單體二價(jià)(IgG)、二聚體四價(jià)(IgA)和五聚體十價(jià)(IgM))，無(wú)論它已經(jīng)通過(guò)下述哪種方法生產(chǎn)雜交瘤方法(參見(jiàn)例如參考文獻(xiàn)15)、重組DNA技術(shù)(參見(jiàn)例如參考文獻(xiàn)16)、直接克隆不同的氨基酸鏈(參見(jiàn)例如參考文獻(xiàn)17)、使B-細(xì)胞永生化(參見(jiàn)例如參考文獻(xiàn)18)或篩選抗體文庫(kù)(參見(jiàn)例如參考文獻(xiàn)19)。表述“天然抗體片段”是指包含抗體的一部分的那些化合物，優(yōu)選抗原結(jié)合區(qū)，其保留選擇性地結(jié)合它的抗原的一些能力。術(shù)語(yǔ)“天然的”指示，通過(guò)完整抗體的酶或化學(xué)裂解來(lái)得到它們。天然抗體片段的實(shí)例包括Fab、Fab，和F(ab，)2。術(shù)語(yǔ)“Fab”表示含有抗體分子的單價(jià)抗原結(jié)合片段的片段。Fab片段可以如下生產(chǎn)用木瓜蛋白酶消化完整抗體，以產(chǎn)生一個(gè)完整的輕鏈和一個(gè)重鏈的一部分。術(shù)語(yǔ)“Fab'，，(或“Fab已接觸抗原”)表示可以如下得到的抗體分子片段用胃蛋白酶處理完整抗體，隨后還原，以產(chǎn)生完整的輕鏈和重鏈的一部分。每個(gè)抗體分子得到2 個(gè)Fab'片段。Fab'片段與Fab片段的差別在于，在重鏈CHl結(jié)構(gòu)域的羧基端添加了幾個(gè)殘基，包括一個(gè)或多個(gè)來(lái)自抗體鉸鏈區(qū)的半胱氨酸。術(shù)語(yǔ)“(Fab' )2”表示可以如下得到的抗體片段用胃蛋白酶處理完整抗體，沒(méi)有隨后的還原。(Fab' )2是通過(guò)2個(gè)二硫鍵保持在一起的2個(gè)Fab'片段的二聚體。制備抗體片段的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。這些方法描述在例如參考文獻(xiàn)14中。“重組抗體片段”在體外直接合成為小抗體部分。工程化的抗體片段的實(shí)例包括 Fab,Fab'和 F(ab，)2、Fv、scFv、Fd、VH、VL、CDR 肽、微體(minibodies)、多體(multibodies)、 VhH 禾口 V-NAR0可變片段“Fv”由緊密的、非共價(jià)連接的一個(gè)重鏈和一個(gè)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的二聚體二聚體)組成。它是含有完整抗原識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。在該結(jié)構(gòu)中，
每個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的3個(gè)CDR相互作用，界定在二聚體表面上的抗原結(jié)合位點(diǎn)。或者， 所述可變鏈可以通過(guò)分子間二硫鍵相連，或通過(guò)諸如戊二醛等化學(xué)試劑交聯(lián)。"scFv"是單鏈可變片段，且是含有通過(guò)合適的多肽連接物彼此相連的輕鏈可變區(qū) (Vl)和重鏈可變區(qū)(Vh)的遺傳工程化的分子，諸如遺傳地融合的單鏈分子。在結(jié)構(gòu)域之間的多肽連接物使scFv能形成希望的用于抗原結(jié)合的結(jié)構(gòu)(參見(jiàn)例如參考文獻(xiàn)20)?！癋d”是包含2個(gè)氨基端結(jié)構(gòu)域(Vh和Cm)的免疫球蛋白重鏈部分。它可以通過(guò)體外表達(dá)系統(tǒng)與輕鏈一起生產(chǎn)，以便產(chǎn)生重組Fab，如在例如參考文獻(xiàn)21中所公開(kāi)的。6個(gè)CDR(每個(gè)可變區(qū)3個(gè))共同地賦予抗體抗原結(jié)合特異性。但是，即使單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域(或僅包含3個(gè)對(duì)抗原特異性的CDR的一半Fv)具有識(shí)別和結(jié)合抗原的能力，盡管親和力低于整個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。由于暴露的疏水殘基，它們單獨(dú)地表現(xiàn)出非常低的溶解度。但是，它們可以組合形成Fv。表述“⑶R肽”包括編碼單個(gè)互補(bǔ)性決定區(qū)的最小識(shí)別單元。通過(guò)構(gòu)建編碼目標(biāo)抗體的CDR的基因，可以得到CDR肽。這樣的基因如下制備，例如，通過(guò)使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來(lái)從抗體生產(chǎn)細(xì)胞的RNA合成可變區(qū)。或者，通過(guò)篩選噬菌體展示或核糖體展示文庫(kù)，可以得到CDR肽(參見(jiàn)例如參考文獻(xiàn)22)。術(shù)語(yǔ)“微體”是指完整抗體的微小形式，其在單鏈中編碼完整抗體的基本元件。它包含與鉸鏈區(qū)和Ch3結(jié)構(gòu)域融合的天然抗體的\和Vh結(jié)構(gòu)域。它們由用微體基因轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞表達(dá)(參見(jiàn)例如參考文獻(xiàn)23或參考文獻(xiàn)24)。術(shù)語(yǔ)“多體”是指具有幾個(gè)源自抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的多價(jià)構(gòu)建體，例如雙抗體、 二 -scFV、三鏈抗體、四抗體(tetrabody)。例如，“雙抗體”是具有2個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的小抗體片段，該片段包含在相同多肽鏈(VH-VL)中連接到輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)上的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)。通過(guò)使用太短而不允許在相同鏈上的2個(gè)結(jié)構(gòu)域之間配對(duì)的連接物，迫使所述結(jié)構(gòu)域與另一鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)，并建立2個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。雙抗體更詳細(xì)地描述在例如參考文獻(xiàn)25或參考文獻(xiàn)26中。二-scFv具有與雙抗體接近的總結(jié)構(gòu)，但是它由僅一個(gè)
9包含4個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的多肽組成(參見(jiàn)例如參考文獻(xiàn)25)。術(shù)語(yǔ)“VhH”和“V-NAR”分別是指駱駝狀和鯊魚(yú)Ig的單個(gè)高親和力V-樣結(jié)構(gòu)域 (參見(jiàn)例如參考文獻(xiàn)27)。不同于嚙齒動(dòng)物或靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物Vh結(jié)構(gòu)域(它們是可溶片段)，而駱馬(IIama)VhH結(jié)構(gòu)域似乎是僅微小免疫原性的。重組抗體片段的綜述可以參見(jiàn)例如參考文獻(xiàn)27，而生產(chǎn)這些重組抗體片段的方法描述在例如參考文獻(xiàn)28或參考文獻(xiàn)29中。抗-聚合物抗體實(shí)際上可以針對(duì)任意類(lèi)型的聚合物抗原產(chǎn)生。例如，已經(jīng)針對(duì)許多天然的、合成的和半-合成的聚合物產(chǎn)生了多克隆和單克隆抗體，例如，抗-血凝素、 抗-HIV gpl20、抗-磷蛋白、抗-DNA、抗-半乳聚糖、抗-葡聚糖、抗-聚賴(lài)氨酸、抗_聚精氨酸、抗_聚丙烯酰胺、抗_聚乙烯吡咯烷酮和抗-聚乙二醇抗體，如在例如參考文獻(xiàn)30中所述。優(yōu)選的抗體是識(shí)別并特異性地結(jié)合親水聚合物的那些，所述親水聚合物包括，例如，在它們的主鏈中包含氧乙烯重復(fù)單元的聚合物或共聚物，諸如聚乙二醇(PEG，在本領(lǐng)域也鑒別為“聚環(huán)氧乙烷”-PEO或“聚氧乙烯”-Ρ0Ε)及其衍生物，含有氧丙烯重復(fù)單元的聚合物或共聚物，諸如聚丙二醇(PPG，在本領(lǐng)域也鑒別為“聚環(huán)氧丙烷(polypropylene oxide)”-PPO或“聚氧丙烯”-POP)及其衍生物，多糖(例如葡聚糖)、聚氨基酸(例如聚賴(lài)氨酸)、多核苷酸或寡核苷酸或半合成肽。更優(yōu)選的抗體是能識(shí)別并特異性地結(jié)合在它們的主鏈中包含重復(fù)氧乙烯重復(fù)單元的聚合物或共聚物的那些，諸如PEG或環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷的共聚物(例如PEG和PPG的嵌段共聚物)。特別優(yōu)選的是識(shí)別并結(jié)合包含重復(fù)氧乙烯重復(fù)單元(例如PEG)且以甲氧基終止(例如mPEG，即甲氧基-終止的PEG)的聚合物的那些抗體。例如，能特異性地結(jié)合mPEG的抗體是特別有利的，因?yàn)樗鼈兛梢杂糜谔禺愋缘亟Y(jié)合含有所述mPEG的超分子集合體，其可以包含在還含有未甲氧基化的PEG聚合物的制劑中 (例如，沒(méi)有末端甲氧基的PEG經(jīng)常在充氣微泡或脂質(zhì)體的凍干前體的制備中用作冷凍保護(hù)劑物質(zhì))?？?PEG抗體是本領(lǐng)域眾所周知的，且描述在例如參考文獻(xiàn)31或參考文獻(xiàn)32中， 它們二者通過(guò)引用并入本文。對(duì)結(jié)合PEG-主鏈(即對(duì)聚合物主鏈中的重復(fù)氧乙烯單元序列)特異性的商業(yè)抗-PEG 抗體可作為 AGP3 和 Ell (Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica，Taipei，Taiwan)得到，而對(duì)結(jié)合以甲氧基終止的PEG聚合物特異性的抗體可作為抗體 PEG-B-47 (Epitomics Inc. USA)得到。靶向配體為了實(shí)現(xiàn)含有聚合物的脂質(zhì)體或充氣微泡與希望的身體區(qū)域或組織的有效結(jié)合， 使抗-聚合物抗體與能結(jié)合所述特定身體區(qū)域或組織的合適組分相結(jié)合。所述組分因而包含能結(jié)合所述特定身體區(qū)域或組織的對(duì)應(yīng)靶物(例如在特定身體區(qū)域或組織中表達(dá)的受體)的靶向部分。本文使用的術(shù)語(yǔ)“靶向配體”包括具有或能夠促進(jìn)在體內(nèi)對(duì)組織和/或受體的靶向活動(dòng)的任何化合物、部分或殘基。靶向配體可結(jié)合的靶物包括組織諸如心肌組織(包括心肌的細(xì)胞和心肌細(xì)胞(cardiomyocyte)、膜組織(包括內(nèi)皮和上皮)、層、結(jié)締組織(包括間質(zhì)組織)或腫瘤；血塊；和受體，諸如肽激素、神經(jīng)遞質(zhì)、抗原、補(bǔ)體片段、免疫球蛋白的細(xì)胞表面受體，以及類(lèi)固醇激素的胞質(zhì)受體。因?yàn)樗鼈兊钠骄叽?，脂質(zhì)體和充氣微泡具有保留在血管內(nèi)隔室中的一般趨勢(shì)；因而優(yōu)選地，靶向位點(diǎn)的位置最優(yōu)選地是在腔內(nèi)。 因此，分子靶物優(yōu)選地與血管內(nèi)皮襯里的內(nèi)皮細(xì)胞相結(jié)合。這些靶物可以是在內(nèi)皮細(xì)胞的表面處或整合進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞膜內(nèi)。合適的靶向配體的實(shí)例包括，例如，蛋白，包括抗體、抗體片段、受體分子、受體結(jié)合分子、糖蛋白和凝集素；肽，包括寡肽和多肽；假肽；糖類(lèi)，包括單糖和多糖；維生素；甾類(lèi)、類(lèi)固醇類(lèi)似物、激素、輔因子、生物活性劑，包括取代的小分子和遺傳物質(zhì)，包括核苷、核苷酸和多核苷酸及其模仿物諸如肽核酸。合適的靶物和靶向配體的實(shí)例公開(kāi)在例如參考文獻(xiàn)33中，它通過(guò)引用并入本文。本發(fā)明的靶向微泡的合適的特異性靶物的實(shí)例是，例如，纖維蛋白和活化的血小板上的GPIIbIIIa受體。纖維蛋白和血小板通常存在于“血栓”即凝塊中，所述凝塊可以形成在血流中，并造成血管阻塞。另外，纖維蛋白也可能與不同的腫瘤過(guò)程有關(guān)。優(yōu)選的對(duì)纖維蛋白靶向特異性的結(jié)合肽公開(kāi)在例如參考文獻(xiàn)34中，其通過(guò)引用并入本文。其它優(yōu)選的對(duì)纖維蛋白靶向特異性的結(jié)合肽也公開(kāi)在參考文獻(xiàn)35和參考文獻(xiàn)36中，它們也通過(guò)引用并入本文。重要的靶物的其它實(shí)例包括脆弱血小板中的受體和腫瘤特異性的受體，諸如激酶插入結(jié)構(gòu)域受體(KDR)和VEGF (血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)/KDR復(fù)合物。適用于靶向KDR或VEGF/ KDR復(fù)合物的結(jié)合肽的實(shí)例公開(kāi)在例如參考文獻(xiàn)37、參考文獻(xiàn)38、參考文獻(xiàn)39和參考文獻(xiàn) 40中，它們都通過(guò)引用并入本文。腫瘤特異性的配體的其它實(shí)例是，例如，轉(zhuǎn)鐵蛋白、葉酸、 精氨酸-甘氨酸-門(mén)冬氨酸序列(RGD)、NRG序列(用于靶向在新形成的血管上表達(dá)的氨肽酶)或GA3肽序列(靶向參與腫瘤血管發(fā)生的Tie2受體)、促吞噬肽-樣序列(靶向在參考文獻(xiàn)41中所述的NRP-I受體)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，所述靶向配體是抗體，其中術(shù)語(yǔ)抗體包括上面定義的多克隆抗體、單克隆抗體、天然抗體片段、重組抗體片段和多特異性抗體，以及它們的抗原結(jié)合片段(例如親和體)。在下表中列舉了合適的抗體和它們各自的潛在靶物(當(dāng)可得到時(shí))的實(shí)例。
權(quán)利要求
1.藥用試劑盒，其包含a)第一組合物，其包含脂質(zhì)體或充氣微泡或其前體，它們具有包含多個(gè)聚合物分子的穩(wěn)定化外膜；和b)第二組合物，其包含靶向構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含靶向配體和能選擇性地結(jié)合所述聚合物的抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的藥用試劑盒，其中所述聚合物是親水聚合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的藥用試劑盒，其中所述聚合物包含重復(fù)氧乙烯單元。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的藥用試劑盒，其中所述聚合物以甲氧基終止。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的藥用試劑盒，其中所述聚合物是聚乙二醇。
6.根據(jù)權(quán)利要求3的藥用試劑盒，其中所述抗體選擇性地結(jié)合所述重復(fù)氧乙烯單元的序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求4的藥用試劑盒，其中所述抗體選擇性地結(jié)合以甲氧基終止的重復(fù)氧乙烯單元的序列。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的藥用試劑盒，其中所述聚合物的摩爾量是相對(duì)于所述穩(wěn)定化外膜的組分的總量的至少0. 05%。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的藥用試劑盒，其中所述摩爾量是至少0.2%。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的藥用試劑盒，其中所述摩爾量是至少1%。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的藥用試劑盒，其中所述充氣微泡包含超過(guò)50%的按摩爾計(jì)的磷脂。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的藥用試劑盒，其中所述脂質(zhì)體包含治療劑或造影劑。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的藥用試劑盒，其中所述靶向配體非共價(jià)地結(jié)合所述抗體，以形成所述靶向構(gòu)建體。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的藥用試劑盒，其中所述靶向構(gòu)建體是膠束或脂質(zhì)體的形式。
15.脂質(zhì)體或充氣微泡或其前體，其包含a)親水聚合物；b)與所述親水聚合物結(jié)合的抗體；和c)與所述抗體結(jié)合的靶向配體。
全文摘要
藥用試劑盒，其包含(i)含有靶向配體和抗-聚合物抗體的靶向構(gòu)建體和(ii)含有聚合物的脂質(zhì)體或充氣微泡，其能結(jié)合或聯(lián)合所述構(gòu)建體。也公開(kāi)了制備和施用所述集合體的方法，以及包含所述靶向構(gòu)建體和所述脂質(zhì)體或充氣微泡的集合體。
文檔編號(hào)A61K49/22GK102202694SQ200980142131
公開(kāi)日2011年9月28日 申請(qǐng)日期2009年10月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月7日
發(fā)明者E·阿勒曼, F·嚴(yán), M·豪維爾, P·布薩特, T·拜亭格 申請(qǐng)人:博萊科瑞士股份有限公司