專利名稱：雞傳染性支氣管炎滅活疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種雞傳染性支氣管炎滅活疫苗，同時(shí)還涉及該雞傳染性支氣管炎滅
活疫苗的制備方法，屬于禽類疫苗技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
雞傳染性支氣管炎病毒屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，病毒粒子帶有囊膜和纖突，
單股正鏈RNA病毒，病毒粒子形態(tài)為多形性，但大多數(shù)為球形，直徑約為80 120nm。傳染
性支氣管炎病毒接種雞胚后，傳至第十代左右的病毒可使80%的雞胚死亡。 該病是目前嚴(yán)重危害世界養(yǎng)禽業(yè)的重大傳染病之一，尚無(wú)特效療法，所以采用接
種疫苗是目前最有效的措施。由于傳染性支氣管炎病毒血清型復(fù)雜且相互之間交叉保護(hù)力
弱，而且新的血清型和變異株不斷出現(xiàn)，如果選擇的疫苗不當(dāng)，不但起不到預(yù)防的效果，而
且還可能給當(dāng)?shù)卦鎏硇碌牟《局辍Ｋ杂靡呙缜氨仨氄莆债?dāng)?shù)丶膊×餍械牟《狙逍?，?br> 使用與當(dāng)?shù)亓餍卸局昕乖砸恢碌囊呙缙废担@樣才能達(dá)到有效的免疫預(yù)防目的。目前市
場(chǎng)上還是主要以弱毒苗為主，但是弱毒苗存在一個(gè)最大的威脅就是容易產(chǎn)生散毒，且傳染
性支氣管炎病毒容易發(fā)生變異，針對(duì)目前這種狀況，研制出一種安全、有效、經(jīng)濟(jì)、穩(wěn)定的疫
苗就顯得尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種雞傳染性支氣管炎滅活疫苗，解決毒苗散毒的問(wèn)題， 減小變異的幾率。 本發(fā)明的目的還在于提供一種雞傳染性支氣管炎滅活疫苗的制備方法，同時(shí)還提 供了一種疫苗用殼聚糖微球的制備方法。 為實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明的技術(shù)方案在于采用了一種雞傳染性支氣管炎滅活疫 苗，該疫苗是吸附在佐劑上滅活的雞傳染性支氣管炎病毒，其中使用的佐劑是殼聚糖微球。 本發(fā)明所使用的病毒株為來(lái)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所的Massachusetts"病毒株，該病毒的 滅活方法如下用2%的HEPESlmol/LpH7. 5和0. 14g/l NaHC03在4。C下調(diào)純化的病毒原液 pH至7. 4 7. 6，逐滴加入10% W/V BPL，使其最終濃度為0. 025%，滅活24h，然后將滅活 的病毒液再經(jīng)37t:水浴2小時(shí)即可。 本發(fā)明的技術(shù)方案還在于采用了一種雞傳染性支氣管炎滅活疫苗的制備方法，該 制備方法包括以下步驟 (1)病毒的繁殖-Massachusetts"病毒株接種雞胚，繁殖溫度為35_37°C ，每天照
兩次蛋，收獲24-60小時(shí)死亡的雞胚尿囊液；對(duì)于60小時(shí)的活胚需置2-8t:過(guò)夜，然后收獲
尿囊液，收獲尿囊液時(shí)，需棄去24小時(shí)之前死亡的雞胚；對(duì)收獲的病毒尿囊液進(jìn)行檢驗(yàn)，凡
菌檢為陰性，毒價(jià)^ 107EID5。/0. lmL，方可作為制備疫苗的部分的抗原液。 (2)病毒液的濃縮、純化用醋酸鋅沉淀法濃縮病毒液，S印harose 4FF凝膠層析
柱純化病毒液。
3
(3)病毒的滅活采用BPL作為滅活劑，具體方法為用2%的HEPES lmol/L pH7. 5
和O. 14g/l NaHC03在4。C下調(diào)純化的病毒原液pH至7. 4 7. 6，逐滴加入10% W/V BPL，
使其最終濃度為0. 025%。滅活24h，然后將滅活的病毒液再經(jīng)37t:水浴2小時(shí)即可。 (4)佐劑的制備所使用的佐劑為殼聚糖微球，其制備方法包括以下步驟 稱取殼聚糖5g分散于188ml滅菌蒸餾水中，在磁力攪拌下，緩慢加入12ml濃度
為36%乙酸，繼續(xù)攪拌10min，靜置lh，用細(xì)銅紗網(wǎng)過(guò)濾除去不溶物待氣泡消去即可用；在
殼聚糖乙酸溶液中加入吐溫-80 8ml，磁力攪拌下使其融解，再加入25X的戊二醛2.0ml，
快速攪勻2min，反應(yīng)溫度為5 l(TC，立即將殼聚糖溶液倒入高速攪拌的500ml液體石蠟
中，經(jīng)1. 5h微球化后，倒人砂芯漏斗真空抽干，然后用石油醚洗滌3 5次，無(wú)菌蒸餾水洗
滌3 5次，再次真空干燥得空白微球；分為10等份，每份樣品含殼聚糖500mg。 (5)疫苗的配制按1份(500mg)殼聚糖微球中加入入病毒液濃度為
1. 08X 107EID5。/0. lml的滅活的雞傳染性支氣管炎病毒液lOOml。 所述疫苗按500羽份/瓶或1000羽份/瓶進(jìn)行分裝，每只雞用量為0. 2ml。 本發(fā)明所使用的病毒株還可以是雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)SF毒株，由青島易
邦公司研發(fā)試驗(yàn)室保存。本發(fā)明所使用的接毒細(xì)胞還可以是非洲綠猴vero細(xì)胞。 本發(fā)明所使用的病毒株和接毒細(xì)胞也可以是上述毒株和接毒細(xì)胞中的任意一種，
如滿足要求，也可以是其他的病毒株或接毒細(xì)胞，以上給出的毒株和接毒細(xì)胞僅僅是為了
示例說(shuō)明本發(fā)明。 本發(fā)明的有益效果本發(fā)明采用的是雞傳染性支氣管炎滅活疫苗，解決了弱毒苗 存在的毒苗散毒問(wèn)題，同時(shí)減小了變異的幾率。并且本發(fā)明使用殼聚糖微球吸附疫苗，由于 殼聚糖可有效的誘導(dǎo)局部黏膜免疫、體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，因此疫苗的免疫活性得到 顯著提高，對(duì)禽類的免疫保護(hù)力增強(qiáng)，在實(shí)際應(yīng)用中將更有效的避免雞傳染性支氣管炎病 的發(fā)生和由此造成的禽類的死亡。
具體實(shí)施例
實(shí)施例1 殼聚糖微球的制備方法稱取殼聚糖5g分散于188ml滅菌蒸餾水中，在磁力攪拌 下，緩慢加入12ml濃度為36%乙酸，繼續(xù)攪拌10min，靜置lh，用細(xì)銅紗網(wǎng)過(guò)濾除去不溶物 待氣泡消去即可用；在殼聚糖乙酸溶液中加入吐溫-80 8ml，磁力攪拌下使其融解，再加入 25%的戊二醛2. Oml，快速攪勻2min，反應(yīng)溫度為8°C ，立即將殼聚糖溶液倒入高速攪拌的 500ml液體石蠟中，經(jīng)1. 5h微球化后，倒人砂芯漏斗真空抽干，然后用石油醚洗滌4次，無(wú)菌 蒸餾水洗滌4次，再次真空干燥得空白微球；分為10等份，每份樣品含殼聚糖500mg。
實(shí)施例2 雞傳染性支氣管炎滅活疫苗的制備方法 (1)病毒的繁殖病毒株接種雞胚，繁殖溫度為35°C，每天照兩次蛋，收獲24-60 小時(shí)死亡的雞胚尿囊液；對(duì)于60小時(shí)的活胚需置2t:過(guò)夜，然后收獲尿囊液，收獲尿囊液 時(shí)，需棄去24小時(shí)之前死亡的雞胚；對(duì)收獲的病毒尿囊液進(jìn)行檢驗(yàn)，凡菌檢為陰性，毒價(jià) > 107EID5。/0. lmL，方可作為制備疫苗的部分的抗原液。 (2)病毒液的濃縮、純化用醋酸鋅沉淀法濃縮病毒液，S印harose 4FF凝膠層析柱純化病毒液。 (3)病毒的滅活采用BPL作為滅活劑，具體方法為用2%的HEPES lmol/L pH7. 5
和0. 14g/l NaHC03在4"下調(diào)純化的病毒原液pH至7. 4，逐滴加入10% W/V BPL，使其最
終濃度為0. 025%。滅活24h，將滅活的病毒液再經(jīng)37t:水浴2小時(shí)即可。 (4)佐劑的制備所使用的佐劑為殼聚糖微球，其制備方法見(jiàn)實(shí)施例1。 (5)疫苗的配制按l份殼聚糖微球(含殼聚糖500mg)中加入病毒液濃度為
1. 08X 107EID5。/0. lmL的滅活的雞傳染性支氣管炎病毒液lOOml。 實(shí)施例3 雞傳染性支氣管炎滅活疫苗的制備方法 (1)病毒的繁殖病毒株接種雞胚，繁殖溫度為36°C，每天照兩次蛋，收獲24-60
小時(shí)死亡的雞胚尿囊液；對(duì)于60小時(shí)的活胚需置4t:過(guò)夜，然后收獲尿囊液，收獲尿囊液
時(shí)，需棄去24小時(shí)之前死亡的雞胚；對(duì)收獲的病毒尿囊液進(jìn)行檢驗(yàn)，凡菌檢為陰性，毒價(jià)
> 107EID5。/0. lml，方可作為制備疫苗的部分的抗原液。 (2)病毒液的濃縮、純化用醋酸鋅沉淀法濃縮病毒液，S印harose 4FF凝膠層析 柱純化病毒液。 (3)病毒的滅活采用BPL作為滅活劑，具體方法為用2%的HEPES lmol/L pH7. 5
和0. 14g/l NaHC03在4"下調(diào)純化的病毒原液pH至7. 5，逐滴加入10% W/V BPL，使其最
終濃度為0. 025%。滅活24h，然后將滅活的病毒液再經(jīng)37t:水浴2小時(shí)即可。 (4)佐劑的制備所使用的佐劑為殼聚糖微球，其制備方法見(jiàn)實(shí)施例1。 (5)疫苗的配制按l份殼聚糖微球(含殼聚糖500mg)中加入病毒液濃度為
1. 08X 107EID5。/0. lml的滅活的雞傳染性支氣管炎病毒液lOOml。 實(shí)施例4 雞傳染性支氣管炎滅活疫苗的制備方法 (1)病毒的繁殖病毒株接種雞胚，繁殖溫度為37°C，每天照兩次蛋，收獲24-60
小時(shí)死亡的雞胚尿囊液；對(duì)于60小時(shí)的活胚需置8t:過(guò)夜，然后收獲尿囊液，收獲尿囊液
時(shí)，需棄去24小時(shí)之前死亡的雞胚；對(duì)收獲的病毒尿囊液進(jìn)行檢驗(yàn)，凡菌檢為陰性，毒價(jià)
> 107EID5。/0. lml，方可作為制備疫苗的部分的抗原液。 (2)病毒液的濃縮、純化用醋酸鋅沉淀法濃縮病毒液，S印harose 4FF凝膠層析 柱純化病毒液。 (3)病毒的滅活采用BPL作為滅活劑，具體方法為用2%的HEPES lmol/L pH7. 5
和0. 14g/l NaHC03在4"下調(diào)純化的病毒原液pH至7. 6，逐滴加入10% W/V BPL，使其最
終濃度為0. 025%。滅活24h，將滅活的病毒液再經(jīng)37t:水浴2小時(shí)即可。 佐劑的制備所使用的佐劑為殼聚糖微球，其制備方法見(jiàn)實(shí)施例1。 (5)疫苗的配制按l份殼聚糖微球(含殼聚糖500mg)中加入病毒液濃度為
1. 08X 107EID5。/0. lml的滅活的雞傳染性支氣管炎病毒液lOOml。 實(shí)施例5 殼聚糖免疫功能檢測(cè) 將制備的雞傳染性支氣管炎殼聚糖微球疫苗(10 i！ g/只，口服)、雞傳染性支氣管 炎活疫苗(l羽份，滴鼻、點(diǎn)眼)、雞傳染性支氣管炎滅活疫苗(l羽份、肌肉注射)免疫30日齡SPF雞各5只，同時(shí)設(shè)未免疫SPF雞對(duì)照2只。MTT法檢測(cè)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，用酶標(biāo)儀測(cè) 0D560nm處的吸光值，用SPSS12. 0 for Windows軟件分析數(shù)據(jù)。 軟件分析數(shù)據(jù)對(duì)比結(jié)果表明，微球疫苗組與其它各組的t值分別為2. 420、2. 365 和2. 839 > t(O. 05， 7) = 2. 357，有顯著差異；雞傳染性支氣管炎活疫苗組雞傳染性支氣管 炎滅活疫苗組及對(duì)照組的t值< t(O. 05， 7) = 2. 357，差異不顯著，以上結(jié)果說(shuō)明殼聚糖具 有增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞免疫功能的作用(表1)。
表1不同疫苗免疫對(duì)SPF雞淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響
免疫后時(shí)間
123斗681012
微球疫苗組0,1310—1510,3"0,3410,3210—33
雞傳染性支氣管炎活疫苗組0—2100,20 0,221o工0 ，
雞傳染性支氣管炎滅活疫苗組0.1910—1490.2860.2580.2650.28 0—275
SPF對(duì)照組0.105O丄"0—1630.1400.1580.1400—151(U70 實(shí)施例6 雞血清IgG抗體檢測(cè) 將制備的雞傳染性支氣管炎殼聚糖微球疫苗(10 g/只，口服)、雞傳染性支氣管 炎活疫苗(l羽份，滴鼻、點(diǎn)眼)、雞傳染性支氣管炎滅活疫苗(l羽份、肌肉注射)免疫30日 齡SPF雞各5只。免疫后每周用常規(guī)HI方法檢測(cè)血清中雞傳染性支氣管炎病毒IgG抗體。
用SPSS12. 0對(duì)以上數(shù)值進(jìn)行成對(duì)比較，結(jié)果微球疫苗組與活疫苗組和滅活疫苗 組t值分別為6. 39、3. 16 > t(O.Ol，ll) = 3. 103，即P < 0. 01，有極顯著差異，說(shuō)明微球 疫苗的免疫效果顯著好于活疫苗組和滅活疫苗組(表2)。
表2疫苗免疫后各組IgG抗體結(jié)果
免疫后時(shí)間
l2346 791011 12
微球疫苗組5.16.87.6了,,2 7.36.86.66—26—0 5.6雞傳染性支氣管爽活疫苗組4.56—15.04.54.13.4 3.1
雞傳染性支氣管爽滅活疫苗組3.25.26.4，二，.l .O 6.86.15.84—94.5 43 實(shí)施例7 免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn) 將制備的雞傳染性支氣管炎殼聚糖微球疫苗(10 g/只，口服)、雞傳染性支氣管 炎活疫苗(l羽份，滴鼻、點(diǎn)眼)、雞傳染性支氣管炎滅活疫苗(l羽份、肌肉注射)免疫30日 齡SPF雞各20只，同時(shí)設(shè)未免疫SPF雞10只作為對(duì)照。 當(dāng)各免疫組血清IgG抗體降至31og2時(shí)隨機(jī)取11只雞，同時(shí)取SPF雞5 只。用雞傳染性支氣管炎強(qiáng)毒株H52進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，每只雞口服0. 2ml (抗原含量為 1. 08 X 107EID5。/0. lml)，觀察14d。 結(jié)果顯示，SPF雞對(duì)照攻毒組在攻毒后5d內(nèi)全部死亡，解剖學(xué)試驗(yàn)表明病雞具有 典型病癥，活疫苗組和滅活疫苗組分別有3只和1只死亡，并各有2只剖檢腸道出血嚴(yán)重；
6而接種雞傳染性支氣管炎殼聚糖微球疫苗的雞組在攻毒后無(wú)一死亡，采食、飲水及精神無(wú) 異常，剖檢氣管、泄殖腔無(wú)出血，僅在十二指腸的腸道淋巴濾泡密集區(qū)、盲腸扁桃體等部位 有輕微出血，說(shuō)明口服免疫殼聚糖微球疫苗免疫后具有較強(qiáng)的保護(hù)力。
權(quán)利要求
一種雞傳染性支氣管炎滅活疫苗，其特征在于所述的疫苗包括吸附在佐劑上滅活的雞傳染性支氣管炎病毒。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雞傳染性支氣管炎滅活疫苗，其特征在于所述佐劑為 殼聚糖微球。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種雞傳染性支氣管炎滅活疫苗，其特征在于所述的疫苗中，病毒液的濃度為1.08X 107EID5。/0. lml，殼聚糖含量為500mg。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雞傳染性支氣管炎滅活疫苗，其特征在于所述的滅 活是指使用滅活劑P丙內(nèi)酯滅活病毒的過(guò)程，具體的滅活方法為用2X的HEPESlmol/L pH7. 5和0. 14g/l NaHC03在4"C下調(diào)純化的病毒原液pH至7. 4 7. 6，逐滴加入10% W/ VBPL，使其最終濃度為0. 025%。滅活24h后，將滅活的病毒液37"C水浴2小時(shí)即可。
5. —種權(quán)利要求1所述的雞傳染性支氣管炎滅活疫苗的制備方法，其特征在于所述 的制備方法包括以下步驟(1)病毒的繁殖及病毒液的收??；(2)病毒液的濃縮、純化；(3)病毒的滅活；(4)佐劑 的制備；(5)疫苗的配制。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種雞傳染性支氣管炎滅活疫苗的制備方法，其特征在于 步驟(1)中，病毒的繁殖溫度為35-37t:;對(duì)收獲的病毒液需進(jìn)行檢驗(yàn)，凡菌檢為陰性，毒價(jià) > 107EID5。/0. lmL，方可作為制備疫苗的抗原液。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種雞傳染性支氣管炎滅活疫苗的制備方法，其特征在于 步驟(2)中所述的濃縮是指用醋酸鋅沉淀法濃縮病毒液，純化是指用S印harose 4FF凝膠 層析柱純化病毒液。
8. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種雞傳染性支氣管炎滅活疫苗的制備方法，其特征在于 步驟(4)中所述的佐劑為殼聚糖微球，該殼聚糖微球的制備方法包括以下步驟稱取殼聚糖5g分散于188ml滅菌蒸餾水中，在磁力攪拌下，緩慢加入12ml 36%乙酸， 繼續(xù)攪拌10min，靜置lh，用細(xì)銅紗網(wǎng)過(guò)濾除去不溶物待氣泡消去即可用；在殼聚糖乙酸溶 液中加入吐溫-808ml，磁力攪拌下使其融解，再加入25%的戊二醛2. 0ml，快速攪勻2min， 反應(yīng)溫度為5 l(TC，立即將殼聚糖溶液倒入高速攪拌的500ml液體石蠟中，經(jīng)1. 5h微球 化后，倒人砂芯漏斗真空抽干，然后用石油醚洗滌3 5次，無(wú)菌蒸餾水洗滌3 5次，再次 真空干燥得空白微球。
9. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種雞傳染性支氣管炎滅活疫苗的制備方法，其特征在于 步驟(5)中疫苗配制時(shí)按1份殼聚糖微球中加入100ml制備好的滅活的雞傳染性支氣管炎 病毒，其中每份殼聚糖微球含殼聚糖500mg，病毒液的濃度為1. 08X 107EID5。/0. lml。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種雞傳染性支氣管炎滅活疫苗及其制備方法，該滅活疫苗是吸附在殼聚糖微球上的滅活的雞傳染性支氣管炎病毒，其制備方法主要包括以下步驟病毒的繁殖及病毒液的收集；病毒液的濃縮、純化、滅活；殼聚糖微球的制備；疫苗的配制。本發(fā)明的疫苗具有性能穩(wěn)定、安全性好、動(dòng)物免疫后產(chǎn)生免疫作用快、免疫力強(qiáng)、保護(hù)率高等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61P31/14GK101757620SQ20091030955
公開(kāi)日2010年6月30日 申請(qǐng)日期2009年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月11日
發(fā)明者吳紅云, 徐進(jìn), 胡鳳領(lǐng), 韓改會(huì) 申請(qǐng)人:鄭州后羿制藥有限公司