專利名稱：青龍衣中胡桃苷b的鑒別方法及其含量測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種胡桃苷B的鑒別方法及其含量測定方法。
背景技術(shù)：
青龍衣為胡桃科植物核桃楸(1/"^""5 MAXIM')和胡桃
fyag^f7rsT^g^Z^的未成熟外果皮(吳征鎰，周太炎，肖培根，等.新華本草綱目(第
三冊).上海上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1990);有效治療胃癌、肝癌、食管癌、肺癌等消化 系統(tǒng)腫瘤。
目前，青龍衣及其制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中沒有青龍衣化學(xué)成分的鑒別和含量測定方法，因此 不能有效地控制藥材和制劑的質(zhì)量，不具有專屬性、準(zhǔn)確性和可靠性。
本發(fā)明的目的是提供青龍衣中胡桃苷B的鑒別方法及其含量測定方法，以解決現(xiàn)有青龍 衣及其制劑缺少穩(wěn)定有效的質(zhì)量控制指標(biāo)的問題。
胡桃苷B的化學(xué)名稱為(4S)-4， 5-二羥基-a -四氫萘酮-4-0- P -D-吡喃葡糖苷，結(jié)構(gòu)式為
本發(fā)明青龍衣中胡桃苷B的鑒別方法是通過薄層色譜實(shí)現(xiàn)的，具體是按下述步驟進(jìn)行的 :a、將青龍衣生藥粉末過三號(hào)篩(篩孔內(nèi)徑平均值355士13，工業(yè)篩目數(shù)60孔/英寸)，然 后稱取10g，加入50mL體積純度為50% 95%乙醇，超聲處理30分鐘，濾過，去除濾渣，再將 濾液蒸干，蒸干得到的殘?jiān)蛹状糽mL使溶解，作為供試品溶液；b、每毫升甲醇加入lmg胡 桃苷B配制成對照品溶液；c、分別吸取供試品溶液和對照品溶液各10uL，點(diǎn)于同一硅膠G板 上，再用展開劑展開，取出后晾干，再噴質(zhì)量濃度為10%的鉬酸銨硫酸水溶液，加熱至斑點(diǎn) 清晰，供試品薄層色譜與對照品薄層色譜在相應(yīng)的位置上呈現(xiàn)相同顏色的斑點(diǎn)證明胡桃苷B 存在；其中步驟c所述的展開劑由三氯甲烷與甲醇按8 3: 2體積比配成。
本發(fā)明青龍衣中胡桃苷B的含量測定方法是按下述步驟進(jìn)行的A、對照品溶液的制備 按每毫升甲醇加入60yg胡桃苷B配制成對照品溶液；B、供試品溶液得制備 一、將青龍衣
發(fā)明內(nèi)容生藥粉末過三號(hào)篩(篩孔內(nèi)徑平均值355士13，工業(yè)篩目數(shù)60孔/英寸)，然后精密稱定(精 密稱定系指準(zhǔn)確到所稱重量的千分之一)10g，再精密量取50mL體積純度為50% 95%乙醇 ，然后加入經(jīng)精密稱定的青龍衣生藥粉末中，再超聲處理30分鐘，濾過，去除濾渣，濾液蒸 干，將蒸干得到的殘?jiān)铀?0mL使溶解得到水液；二、水液通過大孔樹脂柱(內(nèi)徑1.5cm， 長15cm)，以50mL水作洗脫液洗脫，棄去洗脫液，然后用50mL體積純度為10。/。的乙醇作洗脫 液洗脫，棄去洗脫液，繼續(xù)用80mL體積純度為30%的乙醇作洗脫，收集洗脫液后蒸干，蒸干 得到的殘?jiān)蛹状既芙獠⒍哭D(zhuǎn)移至2mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液， 即得作為供試品溶液，洗脫的流速為2 mL/min; C、采用高效液相色譜法測定以十八烷基 硅烷鍵合硅膠作為填充劑，以體積為10:90:0.2的乙腈、水和磷酸混合液作為流動(dòng)相，理論 板數(shù)按胡桃苷B峰計(jì)算不低于3000，流動(dòng)相的流速為0.8 mL/min，檢測波長為258nm，柱溫為 室溫，分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10uL，注入高效液相色譜儀進(jìn)行測定，根 據(jù)峰面積用外標(biāo)法計(jì)算出胡桃苷B的含量。
胡桃苷B在青龍衣藥材中含量較高(0. 012% 0. 014%)，胡桃苷B的濃度在6y g/mL 48 yg/mL范圍內(nèi)，胡桃苷B有良好的線性關(guān)系和精密度，易于提取分離得到，且穩(wěn)定性較好； 本發(fā)明具有重現(xiàn)性良好、穩(wěn)定；用于控制青龍衣藥材和制劑的質(zhì)量，更具合理性和可操作性 ，是該化合物的一種新用途。本發(fā)明以該化合物為指標(biāo)成分，利用薄層色譜建立了鑒別項(xiàng)目 的方法，利用高效液相色譜法建立含量測定項(xiàng)目的方法，為青龍衣在抗腫瘤應(yīng)用上提供了科 學(xué)的保障。本發(fā)明采用的薄層色譜和高效液相色譜法，簡便易行，重現(xiàn)性好，能更有效地控 制青龍衣藥材和制劑的質(zhì)量，實(shí)現(xiàn)青龍衣藥材及其制劑質(zhì)量的穩(wěn)定和可控，比現(xiàn)有的質(zhì)量標(biāo) 準(zhǔn)更具專屬性、準(zhǔn)確性和可靠性；胡桃苷B可作為中藥對照品廣泛使用。


圖l是青龍衣的薄層色譜圖；圖2是青龍衣的高效液相色譜圖，圖中l(wèi)表示對照品溶液的 高效液相色譜，2表示供試品溶液的高效液相色譜；圖3是青龍衣中胡桃苷B含量測定的標(biāo)準(zhǔn) 曲線。
具體實(shí)施例方式
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式青龍衣中胡桃苷B的鑒別方法是通過薄層色譜(薄層層析 ，thin Layer Chromatography)實(shí)現(xiàn)的，具體是按下述步驟進(jìn)行的a、將青龍衣生藥粉末 過三號(hào)篩(篩孔內(nèi)徑平均值355士13，工業(yè)篩目數(shù)60孔/英寸)，然后稱取10g，加入50mL體 積純度為50% 95%乙醇，超聲處理30分鐘，濾過，去除濾渣，再將濾液蒸干，蒸干得到的 殘?jiān)蛹状糽mL使溶解，作為供試品溶液；b、每毫升甲醇加入lmg胡桃苷B配制成對照品溶液;c、分別吸取供試品溶液和對照品溶液各10uL，點(diǎn)于同一硅膠G板上，再用展開劑展開， 取出后晾干，再噴質(zhì)量濃度為10%的鉬酸銨硫酸水溶液，加熱至斑點(diǎn)清晰，供試品薄層色譜 與對照品薄層色譜在相應(yīng)的位置上呈現(xiàn)相同顏色的斑點(diǎn)證明胡桃苷B存在(參見圖l);其中 步驟c所述的展開劑由三氯甲烷與甲醇按8 3: 2體積比配成。
具體實(shí)施方式
二本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟a所述的乙醇的體積純 度為50%。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟a所述的乙醇的體積純 度為60% 80%。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟a所述的乙醇的體積純 度為95%。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
五本實(shí)施方式青龍衣中胡桃苷B的含量測定方法是按下述步驟進(jìn)行的
A、對照品溶液的制備按每毫升甲醇加入60yg胡桃苷B配制成對照品溶液。B、供試品溶 液得制備 一、將青龍衣生藥粉末過三號(hào)篩(篩孔內(nèi)徑平均值355士13，工業(yè)篩目數(shù)60孔/英 寸)，然后精密稱定(精密稱定系指準(zhǔn)確到所稱重量的千分之一)10g，再精密量取50mL體 積純度為50% 95%乙醇，然后加入經(jīng)精密稱定的青龍衣生藥粉末中，再超聲處理30分鐘， 濾過，去除濾渣，濾液蒸干，將蒸干得到的殘?jiān)铀?0mL使溶解得到水液；二、水液通過大 孔樹脂柱(內(nèi)徑1.5cm，長15cm)，以50mL水作洗脫液洗脫，棄去洗脫液，然后用50mL體積 純度為10%的乙醇作洗脫液洗脫，棄去洗脫液，繼續(xù)用80mL體積純度為30。/。的乙醇作洗脫，收 集洗脫液(約70mL)后蒸干，蒸干得到的殘?jiān)蛹状既芙獠⒍哭D(zhuǎn)移至2mL量瓶中，加甲醇 至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得作為供試品溶液，洗脫的流速均為2mL/min; C、采用 高效液相色譜法測定以十八烷基硅烷鍵合硅膠作為填充劑，以體積為10:90:0.2的乙腈、 水和磷酸混合液作為流動(dòng)相，理論板數(shù)按胡桃苷B峰計(jì)算不低于3000，流動(dòng)相的流速為 0.8mL/min，檢測波長為258nm，柱溫為室溫，分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10靚 ，注入高效液相色譜儀進(jìn)行測定，根據(jù)峰面積用外標(biāo)法計(jì)算出胡桃苷B的含量。
本實(shí)施方式步驟B的第二步驟中甲醇用量不超過2mL，以能完全溶解蒸干得到的殘?jiān)鼮橐?br> 具體實(shí)施方式
六本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
五不同的是步驟B中步驟一所述的大孔 樹脂柱為AB-8型大孔樹脂柱。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
五相同。 本實(shí)施方式高效液相色譜圖如圖2所示。 通過下述實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證本發(fā)明胡桃苷B含量測定方法1. 儀器與設(shè)備
LC-10ATVP高效液相色譜儀，紫外檢測器；YMC-Pack C18 (4. 6 X 50mm)色譜柱。 試劑乙腈(色譜純、Dikma公司)，磷酸(分析純)，甲醇、乙醇(分析純)。 藥材青龍衣采于黑龍江省五?？h(北青龍衣)，經(jīng)加工制成。
2. 線性范圍的考察
按每mL甲醇含60y g胡桃苷B配制成對照品溶液。分別精密吸取對照品溶液l. OmL， 2. OmL ，4.0mL， 6.0mL， 8. OmL置于10mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取10yL 進(jìn)行測定，以對照品的濃度為橫坐標(biāo)，以對照品的峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程 為Y46237X+15184， r=0. 9994。結(jié)果表明，在6 y g/mL 48 y g/mL的范圍內(nèi)，具有良好的線 性關(guān)系。
由圖3的結(jié)果表明，胡桃苷B的濃度在6yg/mL 48 yg/mL范圍內(nèi)，對照品峰面積值與進(jìn) 樣量有良好的線性關(guān)系。
3. 精密度試驗(yàn)
取濃度為24yg/mL的對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，RSD值為1.2P/。，表明精密度良好。
4. 重復(fù)性試驗(yàn)
對同一次采集的北青龍衣按樣品處理方法制備5份供試液，按上述色譜條件進(jìn)樣測定， 結(jié)果的RSD值為l. 32%，表明該方法重現(xiàn)性良好。
5. 穩(wěn)定性試驗(yàn)
將供試品溶液在O、 2、 4、 6、 8、 12小時(shí)分別測定，結(jié)果RSD值為1.82y。，表明樣品在12 小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。
6. 加樣回收率試驗(yàn)
精密稱取已知含量的北青龍衣5份，每份5g，分別精密加入適量對照品溶液，余下操作 按供試品溶液制備方法制備，依法測定，測得平均回收率為96. 12%， RSD值為l. 18%。
具體實(shí)施方式
七本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
五不同的是步驟B中步驟一所述的大孔 樹脂柱為D101型大孔樹脂柱。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
五相同。
權(quán)利要求
1.青龍衣中胡桃苷B的鑒別方法，其特征在于青龍衣中胡桃苷B的鑒別方法是通過薄層色譜實(shí)現(xiàn)的，具體是按下述步驟進(jìn)行的a、將青龍衣生藥粉末過三號(hào)篩，然后稱取10g青龍衣生藥粉末，加入50mL體積純度為50％～95％的乙醇，超聲處理30分鐘，濾過，去除濾渣，再將濾液蒸干，蒸干得到的殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液；b、每毫升甲醇加入1mg胡桃苷B配制成對照品溶液；c、分別吸取供試品溶液和對照品溶液各10μL，點(diǎn)于同一硅膠G板上，再用展開劑展開，取出后晾干，再噴質(zhì)量濃度為10％的鉬酸銨硫酸水溶液，加熱至斑點(diǎn)清晰，供試品薄層色譜與對照品薄層色譜在相應(yīng)的位置上呈現(xiàn)相同顏色的斑點(diǎn)證明胡桃苷B存在；其中步驟c所述的展開劑由三氯甲烷與甲醇按8～3∶2體積比配成。
2.青龍衣中胡桃苷B的含量測定方法，其特征在于青龍衣中胡桃苷B的含量測定方法是按下述步驟進(jìn)行的A、對照品溶液的制備按每毫升甲醇加入60yg胡桃苷B配制成對照品溶液；B、供試品溶液得制備 一、將青龍衣生藥粉末過三號(hào)篩，然后精密稱定10g，再精密量取50mL體積純度為50% 95%乙醇，然后加入經(jīng)精密稱定的青龍衣生藥粉末中，再超聲處理30分鐘，濾過，去除濾渣，濾液蒸干，將蒸干得到的殘?jiān)铀?0mL使溶解得到水液；二、水液通過大孔樹脂柱，以50mL水作洗脫液洗脫，棄去洗脫液，然后用50mL體積純度為10%的乙醇作洗脫液洗脫，棄去洗脫液，繼續(xù)用80mL體積純度為30%的乙醇作洗脫，收集洗脫液70 mL后蒸干，蒸干得到的殘?jiān)蛹状既芙獠⒍哭D(zhuǎn)移至2mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液，洗脫的流速均為2mL/min; C、采用高效液相色譜法測定以十八烷基硅烷鍵合硅膠作為填充劑，以體積為10:90:0.2的乙腈、水和磷酸混合液作為流動(dòng)相，理論板數(shù)按胡桃苷B峰計(jì)算不低于3000，流動(dòng)相的流速為O. 8mL/min，檢測波長為258nm，柱溫為室溫，分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各IO y L，注入高效液相色譜儀進(jìn)行測定，根據(jù)峰面積用外標(biāo)法計(jì)算出胡桃苷B的含量。
全文摘要
青龍衣中胡桃苷B的鑒別方法及其含量測定方法，它涉及一種胡桃苷B的鑒別方法及其含量測定方法。本發(fā)明解決了現(xiàn)有青龍衣及其制劑缺少穩(wěn)定有效的質(zhì)量控制指標(biāo)的問題。本發(fā)明胡桃苷B的鑒別方法通過薄層色譜實(shí)現(xiàn)的；胡桃苷B的含量測定方法采用高效液相色譜法進(jìn)行。胡桃苷B作為指標(biāo)成分進(jìn)行青龍衣及其制劑質(zhì)量的控制，具有合理性和可操作性。本發(fā)明采用的薄層色譜和高效液相色譜法，簡便易行，重現(xiàn)性好，能更有效地控制青龍衣藥材和制劑的質(zhì)量，實(shí)現(xiàn)青龍衣藥材及其制劑質(zhì)量的穩(wěn)定和可控，比現(xiàn)有的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)更具專屬性、準(zhǔn)確性和可靠性；胡桃苷B可作為中藥對照品廣泛使用。
文檔編號(hào)A61K36/52GK101637501SQ20091030554
公開日2010年2月3日 申請日期2009年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月12日
發(fā)明者劉麗娟 申請人:黑龍江大學(xué)