專利名稱：：委陵菜黃酮的提取分離純化生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種委陵菜抗糖尿病有效成分-委陵菜黃酮的提取分離和純化生產(chǎn)工藝，屬于中藥有效成分的提取和分離領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：中藥委陵菜又名翻白菜，白頭翁，蛤蟆草，天青地白，為薔薇科(Rosaceae)植物委陵菜PotentillachinesisSer.的全草。本實驗室根據(jù)中藥委陵菜的臨床應(yīng)用，以中藥化學結(jié)合藥理學手段，從中藥委陵菜中分離鑒定了一個具有抗糖尿病作用的化合物-委陵菜黃酮(下式)，其藥效與二甲雙胍相當，具有較高的臨床應(yīng)用價值。本發(fā)明為委陵菜黃酮的提取分離和純化生產(chǎn)工藝。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>式I委陵菜黃酮的結(jié)構(gòu)目前中藥生產(chǎn)中常用的提取方法為乙醇-水溶液加熱回流提取法，但針對不同藥材及目標化合物，所需條件有所不同，如乙醇溶液濃度、提取時間、提取次數(shù)等。需要利用單因素或正交試驗考察具體條件。大孔吸附樹脂色譜法是中藥生產(chǎn)中較常用的分離方法。但根據(jù)目標化合物的理化性質(zhì)，最佳分離色譜填料及分離條件均有不同，需要通過各種因素考察確定。本發(fā)明按照化學工藝研究方法，在提取工藝中，考察了提取溶劑濃度、提取時間、提取次數(shù)和不同料液比對委陵菜黃酮提取率和穩(wěn)定性的影響，并通過正交試驗確定了最佳提取工藝；在分離工藝中，考察了大孔吸附樹脂(2種型號)和聚酰胺，通過靜態(tài)吸附、動態(tài)吸附和解析率確定了分離色譜填料，再次考察了泄漏曲線和洗脫曲線、吸附流速和洗脫流速等因素對委陵菜黃酮分離效果的影響，以及二次色譜分離的效果，并進一步考察了上樣料液比、色譜柱徑高比對分離效果的影響，確立了最佳分離工藝；通過提取及分離，仍難以保證能夠得到純度較高的有效成分，還需要選擇適當?shù)募兓椒?，將被分離物質(zhì)純化。本發(fā)明以近年來在天然產(chǎn)物分離純化方面應(yīng)用很多的新分離技術(shù)-高速逆流色譜對委陵菜黃酮進行純化。高速逆流色譜(High-SpeedCounterCurrentChromatogr即hy，HSCCC)是一種連續(xù)高效的液_液分配色譜分離技術(shù)。該技術(shù)由于不需要固體支撐體，物質(zhì)的分離依據(jù)其在兩相中分配系數(shù)的不同而實現(xiàn)，因而避免了因不可逆吸附引起的樣品損失、失活、變性等，特別適合于天然生物活性成分的分離。在HSCCC純化工藝中，考察了兩種溶劑系統(tǒng)(石油醚_乙酸乙酯_甲醇_水，二氯甲烷_甲醇_水)和不同溶劑比例對純化效果的影響，最后確立了二氯甲烷-甲醇-水溶劑系統(tǒng)(5:4:2)純化委陵菜黃酮的工藝。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種提取分離中藥委陵菜有效成分委陵菜黃酮的生產(chǎn)工藝，為中藥新藥的開發(fā)提供一種提取效率高、產(chǎn)物純度高以及安全的有效成分生產(chǎn)工藝。本發(fā)明是通過以下提取、分離和純化技術(shù)方案加以實現(xiàn)的，其特征在于(1)提取工藝將采集的委陵菜自然干燥，粉碎成小于0.5厘米的短枝，按藥材與乙醇水溶液質(zhì)量比1:8的比例，以8倍量質(zhì)量濃度60%乙醇浸泡過夜，加熱回流提取1.5小時，過濾，然后以6倍量質(zhì)量濃度60%乙醇回流提取1.5小時，過濾；然后再以6倍量質(zhì)量濃度60%乙醇回流提取1.5小時，合并三次提取液，濃縮成流浸膏。(2)分離工藝將步驟(1)得到的流浸膏，按照重量比，以10倍量的質(zhì)量濃度30%乙醇溶解，充分攪拌，3000r/min離心10min，取上清液，以20-60目AB-8大孔吸附樹脂柱分離，10BV(10倍柱體積)上樣，吸附流速為2BV/h，然后依次以3BV質(zhì)量濃度30X乙醇、5BV質(zhì)量濃度60%乙醇、4BV質(zhì)量濃度95%乙醇洗脫，洗脫流速2BV/h，收集60%乙醇洗脫液，減壓濃縮至無醇味，得到一混懸液A;然后以等體積30%乙醇溶解，充分攪拌，3000r/min離心10min，取上清液以80-100目聚酰胺色譜柱分離，IOBV上樣，吸附流速為2BV/h，然后依次以3BV質(zhì)量濃度30%乙醇、5BV質(zhì)量濃度60%乙醇、4BV質(zhì)量濃度95%乙醇洗脫，洗脫流速2BV/h，收集60%乙醇洗脫液，減壓濃縮至無醇味，得到一混懸水溶液B。(3)純化工藝將步驟(2)得到的混懸液B離心，3000r/min離心10min，離心沉淀以制備高速逆流色譜儀純化溶劑系統(tǒng)(體積比)二氯甲烷甲醇水=5:4:2，以下相為固定相，上相為流動相，流速2ml/min，反轉(zhuǎn)分離，轉(zhuǎn)速800rpm，溫度25°C，檢測波長254nm，每次進樣量500mg。收集流分在開始出峰時間后13min開始收集，收集20min時間段的洗脫流分。收集流分經(jīng)減壓濃縮除去有機溶劑得一含水混懸液，離心一黃色沉淀，以少量30%乙醇溶液潤洗2次，即得委陵菜黃酮精品。通過本法制成的抗糖尿病有效成分委陵菜黃酮，可單獨或與適宜的賦形劑等結(jié)合，按照常規(guī)方法制成口服劑型或非口服劑型(針劑、噴霧劑、貼劑等)，用于制備治療糖尿病的藥物。本發(fā)明人通過多年研究，開發(fā)出一整套由委陵菜植物制備如上式I所述委陵菜黃酮的工藝，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下顯著區(qū)別和有益效果1、現(xiàn)有技術(shù)中沒有公開過完整的由委陵菜植物制備式I化合物的技術(shù)方案；2、現(xiàn)有技術(shù)中在分離步驟通常采用大孔樹脂或聚酰胺柱，很少有將二者結(jié)合的方案，尤其是沒有出現(xiàn)將二者結(jié)合后用于委陵菜黃酮分離的技術(shù)方案；3、現(xiàn)有技術(shù)中沒有用高速逆流色譜純化委陵菜黃酮的技術(shù)方案，由于不是每種目標物質(zhì)都適合用高速逆流色譜分離，因此選擇合適、有效的純化手段需要本領(lǐng)域技術(shù)人員付出創(chuàng)造性的勞動；4、由于針對不同的目標物質(zhì)所采用的洗脫系統(tǒng)一般是不同的，洗脫系統(tǒng)的差別將4直接影響洗脫的效果，本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，采用本發(fā)明所限定的洗脫系統(tǒng)(包括大孔樹脂、聚酰胺的梯度系統(tǒng)，HSCCC的洗脫系統(tǒng))能夠獲得最佳的洗脫效果，使得在同等條件下，產(chǎn)物中委陵菜黃酮的含量最高，這樣選擇能夠獲得如此的效果是本領(lǐng)域技術(shù)人員無法預(yù)料的；5、對于生產(chǎn)工藝中其他條件和參數(shù)，例如色譜柱型號、溶劑用量、流速、上樣量、收集時間等，發(fā)明人通過各種單因素考察進行了精心的選擇，由此獲得了最佳的產(chǎn)率，這也是本領(lǐng)域技術(shù)人員無法預(yù)測的。具體實施方式實施例1.取自然干燥，粉碎的天津薊縣產(chǎn)中藥委陵菜25kg，加入200kg60%乙醇浸泡過夜，加熱回流提取1.5小時，過濾，然后以150kg60%乙醇回流提取1.5小時，過濾；然后再以150kg60X乙醇回流提取1.5小時，合并三次提取液，濃縮得浸膏4.6kg，HPLC法測定委陵菜黃酮含量4.050%0。以上提取物以46kg30X乙醇溶解，充分攪拌，3000r/min離心10min，取上清液，以20-60目AB-8大孔吸附樹脂柱分離，10BV上樣，吸附流速為2BV/h，然后依次以3BV質(zhì)量濃度30%乙醇、5BV質(zhì)量濃度60%乙醇、4BV質(zhì)量濃度95%乙醇洗脫，洗脫流速2BV/h，收集60X乙醇洗脫液，減壓濃縮至無醇味，得到一混懸液A(該提取物中委陵菜黃酮含量為3.2%)。將所得混懸液A以等體積30%乙醇溶解，充分攪拌，3000r/min離心10min，取上清液以80-100目聚酰胺色譜柱分離，10BV上樣，吸附流速為2BV/h，然后依次以3BV質(zhì)量濃度30%乙醇、5BV質(zhì)量濃度60%乙醇、4BV質(zhì)量濃度95%乙醇洗脫，洗脫流速2BV/h，收集60%乙醇洗脫液，減壓濃縮至無醇味，得到一混懸液B(該混合物中委陵菜黃酮的含量為12.5%)。將混懸液B離心，3000r/min離心10min，離心后的沉淀以制備高速逆流色譜儀(TBE-300A)純化溶劑系統(tǒng)(體積比)二氯甲烷甲醇水=5:4:2，以下相為固定相，上相為流動相，流速2ml/min，反轉(zhuǎn)分離，轉(zhuǎn)速800rpm，溫度25°C，檢測波長254nm，每次進樣量0.5g。收集流分在開始出峰時間后13min開始收集，收集20min時間段的洗脫流分。收集流分經(jīng)減壓濃縮除去有機溶劑得一含水混懸液，離心得黃色沉淀，以少量30%乙醇溶液潤洗2次，即得委陵菜黃酮精品3.12g(HPLC測定委陵菜黃酮含量為94.5%，峰面積歸一化法)。實施例2.取自然干燥，粉碎的天津薊縣產(chǎn)中藥委陵菜30kg，加入240kg60X乙醇浸泡過夜，加熱回流提取1.5小時，過濾，然后以180kg60%乙醇回流提取1.5小時，過濾；然后再以180kg60%乙醇回流提取1.5小時，合并三次提取液，濃縮得浸膏5.4kg，其中委陵菜黃酮含量4.022%。。以54kg30X乙醇溶解，充分攪拌，3000r/min離心10min，取上清液，以20-60目AB-8大孔吸附樹脂柱分離，10BV上樣，吸附流速為2BV/h，然后依次以3BV質(zhì)量濃度30%乙醇、5BV質(zhì)量濃度60%乙醇、4BV質(zhì)量濃度95%乙醇洗脫，洗脫流速2BV/h，收集60%乙醇洗脫液，減壓濃縮至無醇味，得到一含水混懸液A(該提取物中委陵菜黃酮含量為3.4%)。將所得混懸液以等體積30X乙醇溶解，充分攪拌，3000r/min離心10min，取上清液以聚酰胺色譜柱分離，10BV上樣，吸附流速為2BV/h，然后依次以3BV質(zhì)量濃度30%乙醇、5BV質(zhì)量濃度60%乙醇、4BV質(zhì)量濃度95%乙醇洗脫，洗脫流速2BV/h，收集60%乙醇洗脫液，減壓濃縮至無醇味，得到一混懸液B(該分離組分中委陵菜黃酮的含量為12.1%)。將混懸液B離心，3000r/min離心10min，離心后的沉淀以制備高速逆流色譜儀(TBE-300A)純化溶劑系統(tǒng)(體積比)二氯甲烷甲醇水=5:4:2，以下相為固定相，上相為流動相，流速2ml/min，反轉(zhuǎn)分離，轉(zhuǎn)速800rpm，溫度25°C，檢測波長254nm，每次進樣量0.5g。收集流分在開始出峰時間后13min開始收集，收集20min時間段的洗脫流分。收集流分經(jīng)減壓濃縮除去有機溶劑得一含水混懸液，離心得黃色沉淀，以少量30%乙醇溶液潤洗2次，即得委陵菜黃酮精品3.68g(HPLC測定委陵菜黃酮含量為92.8%，峰面積歸一化法)。實施例3.取自然干燥，粉碎的天津薊縣產(chǎn)中藥委陵菜35kg，加入280kg60X乙醇浸泡過夜，加熱回流提取1.5小時，過濾，然后以210kg60%乙醇回流提取1.5小時，過濾；然后再以210kg60%乙醇回流提取1.5小時，合并三次提取液，濃縮得流浸膏6.lkg，其中委陵菜黃酮含量4.502%。。以61kg30X乙醇溶解，充分攪拌，3000r/min離心10min，取上清液，以AB-8大孔吸附樹脂柱分離，10BV上樣，吸附流速為2BV/h，然后依次以3BV質(zhì)量濃度30%乙醇、5BV質(zhì)量濃度60%乙醇、4BV質(zhì)量濃度95%乙醇洗脫，洗脫流速2BV/h，收集60%乙醇洗脫液，減壓濃縮至無醇味，得到的混懸液A(該提取物中委陵菜黃酮含量為3.6%)。將混懸液A以等體積30X乙醇溶解，充分攪拌，3000r/min離心10min，取上清液以聚酰胺色譜柱分離，IOBV上樣，吸附流速為2BV/h，然后依次以3BV質(zhì)量濃度30%乙醇、5BV質(zhì)量濃度60%乙醇、4BV質(zhì)量濃度95%乙醇洗脫，洗脫流速2BV/h，收集60%乙醇洗脫液，減壓濃縮，得到混懸液B(該分離組分中委陵菜黃酮的含量達12.7%)。將混懸液B離心，3000r/min離心10min，離心后的沉淀以制備高速逆流色譜儀(TBE-300A)純化溶劑系統(tǒng)(體積比)二氯甲烷甲醇水=5:4:2，以下相為固定相，上相為流動相，流速2ml/min，反轉(zhuǎn)分離，轉(zhuǎn)速800rpm，溫度25°C，檢測波長254nm，每次進樣量0.5g。收集流分在開始出峰時間后13min開始收集，收集20min時間段的洗脫流分。收集流分經(jīng)減壓濃縮除去有機溶劑得一含水混懸液，離心得黃色沉淀，以少量30%乙醇溶液潤洗2次，即得委陵菜黃酮精品4.46g(HPLC測定委陵菜黃酮含量為93.8%，峰面積歸一化法)。附錄實施例1-3最終產(chǎn)品_委陵菜黃酮的理化數(shù)據(jù)和藥理評價1.委陵菜黃酮(式1)的理化數(shù)據(jù)黃色無定型粉末。UV356下有強烈的紫外吸收。ESI-MSm/z:593[M-H]—(C3。H25013)。HRESI-MS:m/z617.1284[M+Na]+calcd.617.1271，C30H26013Na;m/z593.1204[M-H]—，calcd.593.1295，C3。H25013.因此確定該化合物分子式為C3。H26013。^-NMR(CD30D)S:6.14(lH，brs，6—H)，6.31(1H，brs，8—H)，7.97(2H，d，J=8.7Hz，H-2—，6—)，6.82(2H，d，J=8.7Hz，H-3—，5—)，7.300(2H，d，J=8.8Hz，H-5——，9——)，6.79(2H，d，J=8.8Hz，H-6——，8——)，6.06(1H，d，J=15.9Hz，H-2——)，7.40(1H，d，J=15.9Hz，H-3——)，5.23(1H，d，J=7.8Hz，H-l—)，4.184.30(2H，m，)，3.50(2H，m)，3.32(lH，m，H-4—)。13C_NMR(CD3OD)苷元159.4，135.4，179.5，163.1，100.1，166.0，95.0，158.2，105.7，122.9，132.3，116.2，161.6，116.2，132.2;葡萄糖基104.2，78.2，75.8，71.9，75.9，64.4;反式對羥基桂皮?；?68.9，115.0，146.6，127.3，131.2，116.9，161.2，116.9,131.2。以上光譜數(shù)據(jù)與文獻[SachikoT.，KyokoT.，MakiA.，etal，IsolationofCytochromeP450InhibitorsfromStrawberryFruit，F(xiàn)ragariaananassa，J.Nat.Prod.2004,67:18391841.]報道的山奈酚-3-0-P-D-(6-0-trans-對羥基桂皮?；?葡萄糖甙波譜數(shù)據(jù)一致，因此，鑒定該化合物E式為山奈酚-3-0-13-D-(6-0-trans-對羥基桂皮酉先基)葡萄糖武(kaempferol_3_0_P_D_(6_0_trans_p_coumaroyl)glucopyranoside)。2.委陵菜黃酮的抗糖尿病藥理評價2.1委陵菜降血糖有效成分量效關(guān)系考察2.1.1分組與給藥選取正常小鼠，建立四氧嘧啶高血糖糖尿病小鼠模型，按血糖值均勻原則隨機分成6組。分成模型對照組、二甲雙胍陽性對照組(125mg/kg)以及本發(fā)明式I的委陵菜黃酮最高劑量(1.6mg/kg)、高劑量(0.8mg/kg)、中劑量(0.4mg/kg)、低劑量組(0.lmg/kg)。另設(shè)有正常對照組和正常給藥組，正常對照組給予蒸餾水(10ml/kg)，正常給藥組按0.4mg/kg劑量給予委陵菜黃酮，每組10只。以上各組每日灌胃l次，連續(xù)灌胃15天。用藥治療期間各組大鼠每日均飼以普通飼料，自由進食、飲水。2.1.2委陵菜黃酮對實驗性糖尿病小鼠血糖的影響表1委陵菜黃酮對實驗性糖尿病小鼠空腹血糖的影響(x士s)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>*與同時間模型組比較p<0.05，**與同時間模型組比較p<0.01，A與同時間反式低劑量組比較p<0.05可以看出，糖尿病小鼠各組經(jīng)委陵菜黃酮治療7天后，僅反式委陵菜黃酮1.6mg/kg劑量組與模型組比較，空腹血糖有顯著性差異(P<0.05)，其余各組均無顯著性差異。糖尿病小鼠各組經(jīng)委陵菜黃酮治療15天后，與給藥前空腹血糖相比均顯著降低(P<0.05，P<0.01)。給藥后，反式委陵菜黃酮各劑量組與模型組比較空腹血糖亦顯著降低(P<0.05，P<0.01)，并且反式委陵菜黃酮各組在降血糖作用上呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系與時效關(guān)系。正常小鼠給藥組同空白對照組及同組給藥前比較均無顯著性差異，說明反式委陵菜黃酮對正常小鼠的血糖水平不產(chǎn)生影響。2.1.3委陵菜黃酮對實驗性糖尿病小鼠血脂的影響從表2可以看出，給藥后，反式委陵菜黃酮4個劑量組和順式組的總膽固醇濃度和甘油三酯濃度與模型組比較均有顯著性差異(P<0.Ol，P<0.05)。反式四個不同劑量組的結(jié)果顯示，隨著劑量增加甘油三酯和總膽固醇水平的均值呈現(xiàn)逐步降低的趨勢。而給藥后反式委陵菜黃酮四個劑量組和順式組同陽性對照組的兩個指標比較均無顯著性差異，說明在一定程度上，委陵菜黃酮可以達到鹽酸二甲雙胍在降低甘油三酯和總膽固醇濃度方面的效果。并且兩個指標分別與空白對照組比較均無顯著性差異，說明作用效果顯著，可以部分糾正糖尿病造成的脂代謝異常。使糖尿病小鼠的甘油三酯和總膽固醇濃度達到正常小鼠的水平。正常小鼠給藥組同空白對照組及同組給藥前比較均無顯著性差異，說明反式委陵菜黃酮對正常小鼠的總膽固醇和甘油三酯水平不產(chǎn)生影響。表2委陵菜黃酮對實驗性糖尿病小鼠甘油三酯和總膽固醇的影響(x±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>*與模型組比較p<0.05，**與模型組比較p<0.01，A與空白對照組比較p<0.05，AA與空白對照組比較p<0.0權(quán)利要求一種委陵菜有效成分黃酮化合物提取分離純化工藝，所述的委陵菜抗糖尿病化學成分，其結(jié)構(gòu)式如下所示上述的委陵菜黃酮的提取分離純化工藝，其特征在于包括以下過程(1)將委陵菜粉碎，以委陵菜的質(zhì)量8倍的質(zhì)量濃度60％乙醇浸泡過夜，加熱回流提取1.5小時，過濾的濾渣，再以委陵菜的質(zhì)量6倍的質(zhì)量濃度60％乙醇加熱回流提取1.5小時，過濾的濾渣，再以委陵菜的質(zhì)量6倍的質(zhì)量濃度60％乙醇加熱回流提取1.5小時，合并三次提取的濾液，減壓蒸發(fā)濃縮至浸膏狀物；(2)將步驟(1)得到的膏狀物用10倍量質(zhì)量濃度30％乙醇溶解，3000r/min離心10min，以20-60目的AB-8大孔吸附樹脂柱分離，上樣體積10BV(10倍柱體積)，吸附流速為2BV/h，然后以3BV30％乙醇，5BV60％乙醇，4BV95％乙醇依次洗脫，洗脫流速2BV/h，收集60％乙醇洗脫液，減壓濃縮至無醇味，得一混懸液A；(3)將步驟(2)得到的混懸液A以等體積30％乙醇溶解，3000r/min離心10min，以80-100目聚酰胺色譜柱分離，上樣體積10BV，吸附流速為2BV/h，然后以3BV30％乙醇，5BV60％乙醇，4BV95％乙醇依次洗脫，以洗脫流速2BV/h，收集60％乙醇洗脫液，減壓濃縮至無醇味，得一混懸液B；(4)將步驟(3)得到的混懸液B離心，3000r/min離心10min，離心后的沉淀以制備高速逆流色譜儀純化溶劑系統(tǒng)(體積比)二氯甲烷∶甲醇∶水＝5∶4∶2，以下相為固定相，上相為流動相，流速2ml/min，反轉(zhuǎn)分離，轉(zhuǎn)速800rpm，溫度25℃，檢測波長254nm。收集流分在開始出峰時間后13min開始收集，收集20min時間段的洗脫流分。收集流分經(jīng)減壓濃縮除去有機溶劑得一含水混懸液，離心得到一黃色沉淀，以少量30％乙醇溶液潤洗2次，即得委陵菜黃酮精品。F2009102448613C00011.tif全文摘要本發(fā)明公開了一種中藥委陵菜抗糖尿病作用化學成分-委陵菜黃酮的提取分離純化工藝，屬于中藥有效成分提取分離工藝技術(shù)。所述化合物的結(jié)構(gòu)如下所示該化合物的提取分離和純化工藝，其過程包括將委陵菜粉碎，加60％乙醇以料液比8-6-6加熱回流提取三次，過濾，合并濾液，減壓蒸發(fā)濃縮至浸膏狀物；然后以10倍量質(zhì)量濃度30％乙醇溶解，3000r/min離心，上清液以20-60目的AB-8大孔吸附樹脂柱分離，上樣體積10BV(10倍柱體積)，吸附流速和洗脫流速為2BV/h，然后以3BV30％乙醇，5BV60％乙醇依次洗脫，收集60％乙醇洗脫液，減壓濃縮至無醇味，得一混懸液A；然后以等體積30％乙醇溶解，離心，上清液以80-100目聚酰胺色譜柱分離，上樣體積10BV，吸附和洗脫流速為2BV/h，以3BV30％乙醇，5BV60％乙醇依次洗脫，收集60％乙醇洗脫液，減壓濃縮至無醇味，得一混懸液B；將混懸液B離心，離心后的沉淀以制備高速逆流色譜儀純化溶劑系統(tǒng)(體積比)二氯甲烷∶甲醇∶水＝5∶4∶2，以下相為固定相，上相為流動相，流速2ml/min，反轉(zhuǎn)分離，轉(zhuǎn)速800rpm，檢測波長254nm。收集流分在開始出峰時間后13min開始，收集20min時間段的洗脫流分，減壓濃縮除去有機溶劑，離心得到黃色沉淀，以少量30％乙醇溶液潤洗2次，即得委陵菜黃酮精品。文檔編號A61P3/10GK101735292SQ20091024486公開日2010年6月16日申請日期2009年12月17日優(yōu)先權(quán)日2009年12月17日發(fā)明者段宏泉,趙川申請人:天津醫(yī)科大學