專(zhuān)利名稱(chēng)：核苷酸磷脂分子及脂質(zhì)體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥物轉(zhuǎn)運(yùn)載體技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用于核酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的新型核苷酸磷
脂分子及其制備方法，還涉及該核苷酸磷脂分子所形成的脂質(zhì)體及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
基于核酸的一些藥物和生物活性分子如異核苷、寡核苷酸、小干擾RNA(siRNA)及 各種RNA、 DNA單鏈和雙鏈要想發(fā)揮其生物活性，必須能有效的解決其透過(guò)細(xì)胞膜的能力。 很多技術(shù)已經(jīng)被用來(lái)提高這些化合物的細(xì)胞攝取，例如，高壓靜脈注射、脂質(zhì)體和納米聚合 物等，但是這些方法都存在各自的短板而限制其發(fā)展。 目前在核酸類(lèi)分子跨膜方面應(yīng)用最廣泛的是脂質(zhì)體載體，包括天然磷脂脂質(zhì)體和 陽(yáng)離子脂質(zhì)體。天然磷脂含負(fù)電荷，對(duì)核酸類(lèi)分子的攜帶能力差，需要繁瑣的處理和制劑設(shè) 備及工藝方能制成脂質(zhì)體，雖然有成本優(yōu)勢(shì)但是易用性差，且不可能作為轉(zhuǎn)染試劑使用。陽(yáng) 離子脂質(zhì)體雖然能高效地?cái)y帶轉(zhuǎn)運(yùn)核酸類(lèi)分子，但其對(duì)細(xì)胞膜也會(huì)造成嚴(yán)重?fù)p傷，雖然使 用簡(jiǎn)便，但細(xì)胞毒性決定了其只能在低濃度下用于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，無(wú)法大規(guī)模用于藥物制劑。而 且作為高效轉(zhuǎn)染試劑的陽(yáng)離子脂質(zhì)體工藝為外國(guó)所把持，價(jià)格高昂。這一切，使得尋找高效 的電中性的脂質(zhì)體載體成為極為必要的舉措。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一類(lèi)具有高效轉(zhuǎn)運(yùn)
核酸類(lèi)化合物透膜能力的磷脂脂質(zhì)體及其制備方法和應(yīng)用，包括方便地大量制備核苷酸磷
脂化合物并進(jìn)一步形成脂質(zhì)體的方法。 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案 —種核苷酸磷脂分子，其具有如式(VIII)或式(IX)所示的兩親性結(jié)構(gòu)
VIII IX
S卩，一個(gè)核苷結(jié)構(gòu)的親水基團(tuán)和一個(gè)脂肪醇或甘油脂的親脂基團(tuán)，兩種基團(tuán)由磷 脂連接構(gòu)成一個(gè)核苷酸磷脂分子。 其中，所述核苷酸磷脂分子中所含堿基，即式(VIII)和式(IX)中的Base基團(tuán)，為 各種常見(jiàn)的天然嘌呤和嘧啶堿基，包括腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、次黃嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶及尿嘧啶等。
磷酸部分除結(jié)合親水及親脂基團(tuán)的兩個(gè)羥基之外的第三個(gè)羥基，即式(VIII)和 式(IX)中的&基團(tuán)，為長(zhǎng)度在lnm以內(nèi)，含12個(gè)碳原子以下的非離子型取代基，如甲基、 乙基、腈乙基、芐基等，也可以是非取代的氫原子。 所含的脂肪醇或甘油脂的親脂基團(tuán)，即式(VIII)和式(IX)中的&基團(tuán)，為長(zhǎng)度在 10到18個(gè)碳原子的脂肪烴或醚類(lèi)取代基，可以是飽和的或不飽和的，例如十六烷基、十八 烯基、聚乙二醇等。 本發(fā)明還提供所述核苷酸磷脂分子的制備方法，是亞磷酰化方法，其可以但不必 須經(jīng)由一釜法策略制備。 所述一釜法策略使用能夠簡(jiǎn)單大量獲得的試劑，在常溫條件下，8小時(shí)之內(nèi)得到目 標(biāo)化合物。該策略包括下列步驟 (a)在無(wú)水無(wú)氧條件下的亞磷?；磻?yīng)；通過(guò)三價(jià)亞磷酰試劑構(gòu)建磷脂分子，尤
其是存在含有三價(jià)磷的亞磷脂化合物中間體； (b)反應(yīng)完成后蒸干溶劑，無(wú)需轉(zhuǎn)移的氧化反應(yīng)； (c)氧化之后無(wú)需轉(zhuǎn)移、條件溫和的脫保護(hù)基反應(yīng)。 進(jìn)一步，所得化合物還可經(jīng)由正相硅膠色譜方法純化。 本發(fā)明進(jìn)一步提供所述核苷酸磷脂分子的應(yīng)用，可將其用于制備脂質(zhì)體，但不僅 僅局限于此一用途。 所述脂質(zhì)體可以由本發(fā)明公開(kāi)的核苷酸磷脂分子構(gòu)成，或由本發(fā)明公開(kāi)的核苷酸 磷脂分子和其他化合物混合構(gòu)成。這些化合物可以是膽固醇、含陽(yáng)離子的磷脂、大豆磷脂 等，但不僅僅局限于這一范圍。 上述由本發(fā)明公開(kāi)的核苷酸磷脂分子構(gòu)成，或由本發(fā)明公開(kāi)的核苷酸磷脂分子和 其他化合物混合構(gòu)成的空白脂質(zhì)體可以攜帶核苷分子、核苷酸鏈、siRNA分子透過(guò)細(xì)胞膜。 所述的核苷分子是指天然核苷、經(jīng)由化學(xué)修飾的核苷、異核苷；所述的核苷酸鏈?zhǔn)侵父鞣N天 然核苷酸鏈和經(jīng)由化學(xué)修飾的核苷酸鏈，包括但不局限于單/雙鏈寡核苷酸、直鏈/環(huán)狀核 苷酸鏈、脫氧/非脫氧核苷酸形成的鏈；所述的siRNA分子是指化學(xué)合成的siRNA分子、經(jīng) 由Dicer酶降解生產(chǎn)的siRNA分子和化學(xué)修飾的siRNA分子。 本發(fā)明進(jìn)一步提供一種制備上述脂質(zhì)體的方法，可以是通過(guò)制劑手段使核苷分 子、核苷酸鏈或siRNA分子包裹在脂質(zhì)體內(nèi)，也可以是將空白脂質(zhì)體和上述分子簡(jiǎn)單混合 后孵育形成可以透過(guò)細(xì)胞膜的結(jié)合物。 本發(fā)明還提供所述脂質(zhì)體的用途，可以作為轉(zhuǎn)染試劑，攜帶基因分子透過(guò)細(xì)胞膜； 所述的基因分子指攜帶遺傳性息的DNA單鏈、RNA單鏈、DNA雙鏈、RNA雙鏈及其他可以用作 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的DNA分子。 本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)以下優(yōu)點(diǎn)提供了一類(lèi)核苷和各種核酸的高效透膜載體，低細(xì)胞 毒性，體內(nèi)可降解為內(nèi)源性物質(zhì)，且使用簡(jiǎn)便；且該類(lèi)載體經(jīng)由一釜法完成的合成路線及簡(jiǎn)
單的純化方法制備得到，具有相對(duì)低廉的制造成本。本發(fā)明涉及的磷脂脂質(zhì)體，具有制備簡(jiǎn) 單、效用良好、應(yīng)用范圍廣泛等特點(diǎn)，是一類(lèi)膜透性好的載體分子，可用于介導(dǎo)核苷酸類(lèi)化 合物如siRNA、質(zhì)粒的透膜。該種脂質(zhì)體可以作為研究反義寡核苷酸與小干擾RNA(siRNA) 機(jī)理的分子生物學(xué)工具，或一種通用的轉(zhuǎn)染試劑，同時(shí)也具有潛在的藥物開(kāi)發(fā)前景。


圖1為代表性化合物B的合成路線； 圖2為代表性化合物B的核磁共振氫譜譜圖； 圖3為代表性化合物F的合成路線； 圖4為毛細(xì)管電泳評(píng)價(jià)脂質(zhì)體對(duì)核酸鏈的親和力； 圖5為熒光法觀測(cè)脂質(zhì)體內(nèi)包合siRNA的情況及使用其進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染的結(jié)果，其 中A表示HEK293細(xì)胞系轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)；B表示BT474細(xì)胞系轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)；C和D表示激光共聚焦顯 微觀測(cè)脂質(zhì)體_核酸復(fù)合物顆粒。
具體實(shí)施例方式
— 、核苷酸磷脂化合物的合成 根據(jù)本發(fā)明，制備核苷酸磷脂化合物的合成方法，主要包括以下步驟 A.使用式(I)的結(jié)構(gòu)與式(II)或式(III)通過(guò)亞磷?；椒?gòu)建式(IV)化合物
或式(V)化合物，即在無(wú)水無(wú)氧條件下進(jìn)行亞磷?；磻?yīng)，亞磷酰試劑式(I)Ri基團(tuán)為一短
的親脂基團(tuán)，可以是但不局限于甲基、腈乙氧基、芐基；
B.對(duì)式(IV)、式(V)的亞磷酰進(jìn)行氧化，氧化劑可以是但不局限于雙氧水、過(guò)氧叔
丁醇，得到式(VI)和式(VII);
6VI VII
C.將式(VI)和式(VII)脫除匿Tr保護(hù)，從而形成核苷酸磷脂分子式(VIII)和式 (IX)。
VIII IX
以上所示Base為各種常見(jiàn)的天然嘌呤和嘧啶堿基，包括腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、次黃嘌 呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶及尿嘧啶等； 以上所示&為長(zhǎng)度在lnm以內(nèi)，含12個(gè)碳原子以下的不含電荷的取代基，如甲基、 乙基、月青乙基、節(jié)基等； 以上所示R2為長(zhǎng)度在10到18個(gè)碳原子內(nèi)的脂肪烴取代基，為長(zhǎng)度在10到18個(gè) 碳原子的脂肪烴或醚類(lèi)取代基，可以是飽和的或不飽和的，例如十六烷基、十八烯基、聚乙
二醇等。
(1) —釜法策略 根據(jù)本發(fā)明，核苷酸磷脂化合物的制備應(yīng)通過(guò)包括下列步驟的方法實(shí)現(xiàn)(a)在 無(wú)水無(wú)氧條件下的亞磷?；磻?yīng)；(b)反應(yīng)完成后蒸干溶劑，無(wú)需轉(zhuǎn)移的氧化反應(yīng)；(c)氧 化之后無(wú)需轉(zhuǎn)移條件溫和的脫保護(hù)基反應(yīng)； 根據(jù)本發(fā)明，用于亞磷?；脑噭┛梢允?H-四氮唑。 根據(jù)本發(fā)明，用于脫除匿Tr保護(hù)基的試劑可以是三氟乙酸(TFA)。 根據(jù)本發(fā)明，用于反應(yīng)的溶劑包括，但不限于吡啶(Py)、二氯甲烷(DCM)、乙腈
(MeCN)、甲醇(MeOH)禾P N， N_ 二甲基甲酰胺(DMF)。 (2)純化方法 —釜法合成核苷酸磷脂之后的產(chǎn)物可進(jìn)一步經(jīng)由正相硅膠色譜方法純化，以二氯
甲烷甲醇=50 : i io : i(體積比)的洗脫條件可分離純化上述系列核苷酸磷脂產(chǎn)物。 以下通過(guò)具體合成的實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但不代表對(duì)本發(fā)明有任何限制。
根據(jù)上述的方法，我們得到了一系列核苷酸磷脂化合物，代表性的例舉其中六個(gè)
7化合物A-F :
<formula>formula see original document page 8</formula> 實(shí)施例1化合物B的合成
反應(yīng)路線如圖l所示。 取化合物Bl (亞磷酰化核苷單體均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)，為DNA合成常用化合物，市場(chǎng)來(lái) 源廣泛)(740mg) ， 1H-四唑(70mg)，無(wú)水無(wú)氧條件下混合，溶于雙蒸無(wú)水CH3CN 15ml中，攪 拌。取化合物正十六醇(棕櫚醇)(360mg)，溶于10ml雙蒸無(wú)水CH3CN中，緩緩注入前述攪 拌反應(yīng)中。室溫繼續(xù)攪拌反應(yīng)2小時(shí)，TLC鑒定反應(yīng)基本完全后冰浴降溫。
冰浴攪拌下逐滴滴加過(guò)氧叔丁醇(0. 3ml， 4eq.)，觀察無(wú)劇烈放熱后撤去冰浴，繼 續(xù)反應(yīng)30分鐘。然后向反應(yīng)體系中加入30ml 5% CHC12C00H的CH2C12溶液，室溫?cái)嚢璺磻?yīng) 15分鐘，TLC鑒定反應(yīng)完全后，硅膠柱層析(環(huán)己烷乙酸乙酯=3 : l)分離，產(chǎn)物為白色 小膠珠狀固體，完全抽干后為貼壁白色間帶紅色固體，共計(jì)390mg，總收率66% .
產(chǎn)物核磁氫譜檢驗(yàn)如圖2所示。 4 NMR(CD30D) :67. 73 (s， 1H) ，6. 24(t， 1H， J = 6. 0Hz， 1H) ， 5. 01 (m， 1H)， 4. 78-4. 08 (m， 5H) ， 3. 73 (d， J = 2. 8， 2H) ， 2. 83 (m， 2H) ， 2. 48 (m， 1H) ， 2. 34 (m， 1H) ， 1. 81 (s， 3H) ， 1. 62-1. 67(m，2H) ， 1. 33(s，26H) ，0. 82(t， J = 7. 2Hz，3H).
高分辨質(zhì)譜得MS :m/z 600. 3409 [M+H] +
實(shí)施例2化合物F的合成
反應(yīng)路線如圖3所示。 取化合物Fl (購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán))(400mg) ， 1H_四唑(40mg)，無(wú)水無(wú)氧條件下混合，溶 于雙蒸無(wú)水CH3CN 10ml中，攪拌。取化合物正十二醇(180mg)，溶于10ml雙蒸無(wú)水CH3CN 中，緩緩注入前述攪拌反應(yīng)中。室溫繼續(xù)攪拌反應(yīng)2小時(shí)，TLC鑒定反應(yīng)基本完全后冰浴降溫。 冰浴攪拌下逐滴滴加過(guò)氧叔丁醇(0. 2ml)，觀察無(wú)劇烈放熱后撤去冰浴，繼續(xù)反應(yīng) 30分鐘。然后向反應(yīng)體系中加入25ml 5% CHC12C00H的CH2C12溶液，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)15分 鐘，TLC鑒定反應(yīng)完全后，注入飽和濃氨水lOml，攪拌反應(yīng)30分鐘，TLC鑒定反應(yīng)完全后，以硅膠柱層析(二氯甲烷甲醇=30 : 1)分離，產(chǎn)物為白色小膠珠狀固體，共計(jì)183mg，總收 率73% . 高分辨質(zhì)譜得MS:m/z 514. 3233 [M+H]+. 本發(fā)明要求權(quán)利的系列化合物都可以用和產(chǎn)物相對(duì)應(yīng)的原料，以上述方法合成，
故不再一一贅述。 二、核苷酸磷脂脂質(zhì)體的制備
(1)空白脂質(zhì)體的制備 經(jīng)過(guò)純化后的上述核苷酸磷脂化合物可用于制備空白脂質(zhì)體，通過(guò)以下方法實(shí) 施 (a)將核苷酸磷脂的乙醇溶液通過(guò)薄膜分散法制為空白脂質(zhì)體；
(b)透析去小分子雜質(zhì)；
(c)凍干。 該空白脂質(zhì)體可按照中華人民共和國(guó)藥典中關(guān)于脂質(zhì)體藥物載體的使用方法，用 做各種藥物的載體。
(2)脂質(zhì)體_核酸復(fù)合物的制備 除預(yù)制空白脂質(zhì)體用于包載藥物之外，本發(fā)明公開(kāi)的系列核苷酸磷脂化合物還可 以通過(guò)溶液狀態(tài)與核酸分子相互作用，形成脂質(zhì)體_核酸復(fù)合物，從而發(fā)揮轉(zhuǎn)染試劑的作 用。具體通過(guò)以下方法實(shí)施 (a)將核苷酸磷脂分散在乙醇水=100 : 0 50 : 50的溶液中；
(b)將上述溶液同核酸(如siRNA、反義寡核苷酸、質(zhì)粒)溶液混合；
(c)將上述混合液25攝氏度下振搖孵育30分鐘； (d)上述孵育后混合液即為脂質(zhì)體-核酸復(fù)合物，可以直接用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染，也可以 通過(guò)薄膜法、凍融法等方法修飾粒徑或進(jìn)一步提高包封率。 根據(jù)本發(fā)明，用于制備脂質(zhì)體和透析的主要溶劑包括，但不限于，去離子水(H20)、
吡啶(Py)、二氯甲烷(DCM)、乙腈(MeCN)、甲醇(MeOH)和N， N-二甲基甲酰胺(DMF)。其中
具體操作方法為相關(guān)專(zhuān)業(yè)人員所熟知，故不再贅述。三、根據(jù)本發(fā)明，核苷酸磷脂脂質(zhì)體可
以用于以下用途 A. siRNA透膜轉(zhuǎn)運(yùn) 核苷酸磷脂脂質(zhì)體可以用于協(xié)助siRNA的透膜轉(zhuǎn)運(yùn)。通過(guò)制備脂質(zhì)體包裹的 siRNA或者將siRNA和核苷酸磷脂簡(jiǎn)單共孵育制得的復(fù)合物，可以有效的將siRNA轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)細(xì) 胞膜。 B.寡核苷酸透膜轉(zhuǎn)運(yùn) 寡核苷酸也可以用和A所述同樣的方式進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。
C.基因轉(zhuǎn)染 本發(fā)明也可以用作基因轉(zhuǎn)染試劑，通過(guò)將核苷酸磷脂和質(zhì)粒進(jìn)行大約30分鐘的 簡(jiǎn)單共孵育，g卩能形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，完成有效轉(zhuǎn)染。
應(yīng)用實(shí)例1 :對(duì)寡核苷酸雙鏈的結(jié)合能力； 使用21個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)度的雙鏈DNA和化合物合成方法舉例中的核苷酸磷脂化合物 C，對(duì)比在有無(wú)脂質(zhì)體參與情況下DNA雙鏈的毛細(xì)管電泳行為，說(shuō)明該類(lèi)脂質(zhì)體對(duì)寡核苷酸的結(jié)合能力，如圖4所示。
實(shí)驗(yàn)條件 所用雙鏈DNA序列(購(gòu)買(mǎi)自北京奧科生物技術(shù)有限公司)如下 5， -TCGGGAAATTTCTCTATTATT-3， 3' -TTAGCCCTTTAAAGAGATAAT-5' 所用核苷酸磷脂化合物C為其乙醇的真溶液。 毛細(xì)管電泳實(shí)驗(yàn)溫度25°C ，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，電泳電壓25kV，流動(dòng)相緩沖液為25mM
TBE，pH = 8. 0。圖中所示峰為溶液中游離的雙鏈DNA的檢出峰。所用DNA為0. 2od/ y L的
21堿基dsDNA在25mM的TBE中的溶液。 圖4中所示三條曲線，自上而下分別為 (l)DNA :僅以DNA雙鏈溶液?jiǎn)为?dú)進(jìn)行毛細(xì)管電泳； (2)0':以DNA雙鏈和50倍質(zhì)量當(dāng)量的核苷酸磷脂混合振搖后立刻進(jìn)行毛細(xì)管電泳； (3) 30':以DNA雙鏈和50倍質(zhì)量當(dāng)量的核苷酸磷脂混合后振搖30分鐘再進(jìn)行毛細(xì)管電泳。 電泳結(jié)果顯示，加入該種磷脂后，溶液中游離的雙鏈DNA片段大幅減少，說(shuō)明該磷脂可以迅速捕捉結(jié)合雙鏈DNA寡核苷酸片段。
應(yīng)用實(shí)例2 :轉(zhuǎn)染和透膜能力，如圖5所示。 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)使用化合物合成方法舉例中的核苷酸磷脂B和羧基熒光素(FAM)熒光標(biāo)記的siRNA(序列如下，購(gòu)買(mǎi)自北京奧科生物技術(shù)有限公司)混合孵育，即將核苷酸磷脂B的乙醇真溶液加入到siRNA中孵育，在激光共聚焦顯微下能夠觀察到脂質(zhì)體-siRNA復(fù)合物(圖5C、D，脂質(zhì)體中可見(jiàn)明顯綠色熒光聚集)；以粒度儀檢測(cè)該復(fù)合物的平均粒徑為350nm。將該復(fù)合物和細(xì)胞共孵育后，觀察到細(xì)胞內(nèi)熒光(圖5A、B)，證明siRNA已被轉(zhuǎn)染入細(xì)胞內(nèi)。
實(shí)驗(yàn)所用siRNA序列
5' -UCGGGAAAUUUCUCUAUUAdTdT-3'
3' -dTdTAGCCCUUUAAAGAGAUAAU-5' 本文顯示并詳細(xì)描述的信息足以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，因此本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案代表本發(fā)明的主題，該主題為本發(fā)明所廣泛涵蓋。本發(fā)明的范圍完全涵蓋其它對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見(jiàn)的實(shí)施方案，因此，本發(fā)明的范圍不被除所附權(quán)利要求之外的任何內(nèi)容所限制，其中除了明確說(shuō)明外，所用元素的單數(shù)形式并不是指"一個(gè)和唯一"，而是指"一個(gè)或更多"。對(duì)本領(lǐng)域一般技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，所有公知的上述優(yōu)選的實(shí)施方案和附加實(shí)施方案部分的結(jié)構(gòu)、組成和功能上的等價(jià)物因此引入本文作參考，而且試圖被本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。 此外，不需要某種設(shè)備或方法來(lái)表達(dá)本發(fā)明所解決的每個(gè)問(wèn)題，因?yàn)樗鼈兌家寻ㄔ诒景l(fā)明的權(quán)利要求之內(nèi)。另外，無(wú)論本發(fā)明公開(kāi)事實(shí)中的所有部分、成分，或者方法步驟是否在權(quán)利要求中被明確敘述，它們都沒(méi)有貢獻(xiàn)給公眾。但是，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，很明顯在不背離如所附權(quán)利要求中所闡明的本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍的前提下，可以在形式、試劑和合成細(xì)節(jié)上做出各種改變和修飾。
10
權(quán)利要求
一種核苷酸磷脂分子，其具有如式(VIII)或式(IX)所示的兩親性結(jié)構(gòu)即，一個(gè)核苷結(jié)構(gòu)的親水基團(tuán)和一個(gè)脂肪醇或甘油脂的親脂基團(tuán)，兩種基團(tuán)由磷脂連接構(gòu)成一個(gè)核苷酸磷脂分子。F2009102387376C0000011.tif
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述核苷酸磷脂分子，其中所含堿基，即式(VIII)和式(IX)中的 Base基團(tuán)，為各種常見(jiàn)的天然嘌呤和嘧啶堿基，包括腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、次黃嘌呤、胞嘧啶、胸 腺嘧啶及尿嘧啶等。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述核苷酸磷脂分子，其中磷酸部分除結(jié)合親水及親脂基團(tuán)的兩個(gè) 羥基之外的第三個(gè)羥基，即式(VIII)和式(IX)中的R1基團(tuán)，為長(zhǎng)度在lnm以內(nèi)，含12個(gè) 碳原子以下的非離子型取代基，如甲基、乙基、腈乙基、芐基等，也可以是非取代的氫原子。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述核苷酸磷脂分子，其中所含的脂肪醇或甘油脂的親脂基團(tuán)，即 式(VIII)和式(IX)中的&基團(tuán)，為長(zhǎng)度在10到18個(gè)碳原子的脂肪烴取代基，可以是飽 和的或不飽和的，例如十六烷基、十八烯基等。
5. —種制備權(quán)利要求1所述核苷酸磷脂分子的方法，是亞磷酰化方法，其可以但不必 須經(jīng)由一釜法策略制備。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，所述一釜法策略應(yīng)通過(guò)包括下列步驟的方法實(shí)現(xiàn)(a) 在無(wú)水無(wú)氧條件下的亞磷?；磻?yīng)；通過(guò)三價(jià)亞磷酰試劑構(gòu)建磷脂分子，尤其是 存在含有三價(jià)磷的亞磷脂化合物中間體；(b) 反應(yīng)完成后蒸干溶劑，無(wú)需轉(zhuǎn)移的氧化反應(yīng)；(c) 氧化之后無(wú)需轉(zhuǎn)移、條件溫和的脫保護(hù)基反應(yīng)； 進(jìn)一步，優(yōu)選脫除保護(hù)基完成后經(jīng)由正相硅膠色譜方法進(jìn)行純化。
7. —種脂質(zhì)體，其是由權(quán)利要求1所述的核苷酸磷脂分子構(gòu)建；該脂質(zhì)體可以單獨(dú)由 權(quán)利要求1所述的核苷酸磷脂分子構(gòu)成，也可以由權(quán)利要求1所述的核苷酸磷脂分子和其 他化合物混合構(gòu)成，混合的其他化合物可以是但不局限于膽固醇、含陽(yáng)離子的磷脂、大豆磷 脂。
8. 權(quán)利要求7所述的脂質(zhì)體，可以攜帶核苷分子、核苷酸鏈或siRNA分子；所述的核苷 分子是指天然核苷、經(jīng)由化學(xué)修飾的核苷、異核苷；所述的核苷酸鏈?zhǔn)侵父鞣N天然核苷酸鏈 和經(jīng)由化學(xué)修飾的核苷酸鏈，包括但不局限于單/雙鏈寡核苷酸、直鏈/環(huán)狀核苷酸鏈、脫 氧/非脫氧核苷酸形成的鏈；所述的siRNA分子是指化學(xué)合成的siRNA分子、經(jīng)由Dicer酶 降解生產(chǎn)的siRNA分子和化學(xué)修飾的siRNA分子。
9. 一種制備權(quán)利要求7或8所述脂質(zhì)體的方法，可以是通過(guò)制劑手段使核苷分子、寡核 苷酸鏈或siRNA分子包裹在脂質(zhì)體內(nèi)，也可以是將空白脂質(zhì)體和上述分子簡(jiǎn)單混合后孵育形成可以透過(guò)細(xì)胞膜的結(jié)合物。
10.權(quán)利要求7或8所述脂質(zhì)體的用途，可作為轉(zhuǎn)染試劑，攜帶基因分子透過(guò)細(xì)胞膜； 所述的基因分子指攜帶遺傳性息的DNA單鏈、RNA單鏈、DNA雙鏈、RNA雙鏈及其他可以用作 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的DNA分子。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一類(lèi)核苷酸磷脂化合物及其制備方法，具有通式(VIII)或(IX)的結(jié)構(gòu)，基于“一釜法”策略大量簡(jiǎn)便制取得到。本發(fā)明進(jìn)一步提供一類(lèi)新型脂質(zhì)體以及其制備方法，本發(fā)明涉及的磷脂脂質(zhì)體，具有制備簡(jiǎn)單、效用良好、應(yīng)用范圍廣泛等特點(diǎn)。該種脂質(zhì)體可以作為研究反義寡核苷酸與小干擾RNA(siRNA)機(jī)理的分子生物學(xué)工具，也具有潛在的藥物開(kāi)發(fā)前景。
文檔編號(hào)A61K47/26GK101709073SQ20091023873
公開(kāi)日2010年5月19日 申請(qǐng)日期2009年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月1日
發(fā)明者唐晨, 張禮和, 楊振軍, 潘德林 申請(qǐng)人:北京大學(xué)