專利名稱：：抗體或其片段的結(jié)晶的制作方法抗體或其片段的結(jié)晶本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2005年07月22日、申請(qǐng)?zhí)枮?00580032185.3(國(guó)際申請(qǐng)?zhí)枮镻CT/US2005/026017)、發(fā)明名稱為"抗體或其片段的結(jié)晶"的發(fā)明申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用根據(jù)35U.S.C.§119(e)，本申請(qǐng)要求2004年7月23日提交的美國(guó)申請(qǐng)60/590，707的權(quán)益，在此將該申請(qǐng)收入本文作為參考。
背景技術(shù)：
：在包括但不限于癌癥，呼吸系統(tǒng)疾病，炎性疾病和傳染病的多種疾病和病癥的治療中，單克隆抗體日益成為強(qiáng)有力的治療劑。一般而言，包含抗體的療法需要每劑投遞100mg到lg的抗體。為了進(jìn)行這樣的治療，一種常用的手段是用約2到20mL的50mg/mL抗體溶液作靜脈內(nèi)輸注。由于靜脈內(nèi)給藥之外的導(dǎo)入方法是人們所希望的，諸如皮下注射，更濃的抗體溶液可能具有優(yōu)勢(shì)。但是，濃的抗體溶液可能導(dǎo)致一些問(wèn)題，包括，但不限于高粘度的溶液、蛋白質(zhì)聚集、以及溶液的穩(wěn)定性的問(wèn)題?？贵w片段已經(jīng)被結(jié)晶，例如用于X射線晶體學(xué)。先前報(bào)道的結(jié)晶單克隆抗體的方法一般使用蒸氣擴(kuò)散(vapordiffusion)技術(shù)。這種技術(shù)的缺陷包括生成晶體的量極小，和使用某些情況下不適用于人的試劑。還可以使用分批過(guò)程的方法來(lái)制備稍大一些的量的晶體。常用的分批過(guò)程方法通常使用有機(jī)或聚合沉淀劑。已經(jīng)描述了使用有機(jī)沉淀劑來(lái)結(jié)晶抗體的方案。Yangetal，PNAS，vol.100，no.12，pp.6934—6939(2003);Kuznetsovetal，J.CrystalGrowth,vol.232，pp.30-39(2001);Kuznetsovetal，J.StructuralBiology，vol.131，pp.108-115(2000);Harrisetal，ImmunologicalReviews,vol.163，pp.35-43(1998);Harrisetal，J.Mol.Biol.，vol.275，pp.861—872，(1998);andHarrisetal，Proteins,vol.23，pp.285-89(1995)。常用的有機(jī)或聚合沉淀劑的例子包括聚乙二醇(PEG)、異丙醇、Jeffamine⑧(HuntsmanPetrochemicalCorp.，SaltLakeCity，UT)，以及(+/-)_2-甲基-2，4-戊二醇(MPD)。目前有許多抗體被大規(guī)模地加工以供施用于人，因此需要大規(guī)模形成晶體和/或濃縮的蛋白質(zhì)凝膠的方法，特別是不包含有機(jī)或聚合沉淀劑的方法。晶體和/或凝膠對(duì)貯藏和治療施用是有用的。發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)方面提供了制備抗體或其片段的晶體的方法，其包括下列步驟使抗體或其片段接觸含有約1到500毫摩爾每升(mM)的二價(jià)陽(yáng)離子鹽和約l到100mM緩沖劑的溶液，并將所述抗體或其片段和所述溶液共同溫育直到形成所述抗體或其片段的晶體。在一些實(shí)施方案中，一種方法包括使抗體或其片段接觸包含約1到120mM鋅鹽的溶液，并將所述抗體或其片段和所述溶液共同保溫直到形成所述抗體或其片段的晶體和/或蛋白質(zhì)凝膠。在一些實(shí)施方案中，溫育在環(huán)境溫度進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，溫度為約20到27°C。在其它實(shí)施方案中，溫育在低于約2(TC的溫度，優(yōu)選約0到2(TC，更優(yōu)選約0到l(TC進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，一種方法包括使抗體或其片段接觸基本上由鋅鹽和緩沖劑組3成的溶液，并將所述抗體或其片段和所述溶液共同溫育直到形成所述抗體或其片段的晶體和/或蛋白質(zhì)凝膠。制備抗體或其片段的晶體的方法包括使抗體或其片段接觸包含鋅鹽并缺少其它沉淀劑的溶液；并將所述抗體或其片段和所述溶液共同溫育直到形成所述抗體或其片段的晶體。在一些實(shí)施方案中，所述二價(jià)鹽為約10到80mM，更優(yōu)選25mM到60mM的氯化鋅(ZnCl2)。在其它實(shí)施方案中，所述緩沖劑是約1到20mM的NaOAc，更優(yōu)選約25到75mM的乙酸鈉(NaOAc)。在一些實(shí)施方案中，所述溶液包含多于約10mM的ZnCl2和多于約5mM的NaOAc。例如，該溶液包含約100mM的ZnCl2和約10mM的NaOAc。在其它實(shí)施方案中，所述緩沖劑的pH為約4到約9，更優(yōu)選約4.7到5.7。本發(fā)明還提供了通過(guò)本文所述方法制備的抗體或其片段的晶體。所述抗體可以是多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、雙特異性抗體、人源抗體或人源化抗體。本發(fā)明還提供了組合物，其包含選自下組的抗體的晶體或蛋白質(zhì)凝膠以及載體抗VEGF抗體、抗CD20、抗CDlla、抗CD40、抗Apo-2、抗HER2、抗IgE、及其片段。優(yōu)選地，所述抗體是全長(zhǎng)的糖基化抗體。本發(fā)明還提供一種配制劑，其包含選自下組的抗體的晶體或蛋白質(zhì)凝膠以及至少一種成分抗VEGF抗體、抗Apo-2、抗CD20、抗CDlla、抗CD40、抗HER2、抗Apo-2、抗IgE、及其片段。本發(fā)明還提供了治療哺乳動(dòng)物中的病癥的方法，其包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用有效量的上述組合物或配制劑之一。所述病癥包括與VEGF、CD20、CDlla、CD40、Apo_2和HER2相關(guān)的那些病癥。本發(fā)明還提供了制品，其包含至少一種上述組合物或配制劑，以及容器。本發(fā)明還提供了格外可用于濃縮、純化、保存和送遞抗體或其片段的方法、組合物和配制劑。本發(fā)明涉及以下各項(xiàng)。1.制備抗體或其片段的晶體的方法，包括a)使抗體或其片段接觸包含約1到500mM的二價(jià)陽(yáng)離子鹽和約1到100mM的緩沖劑的溶液；并b)將所述抗體或其片段和所述溶液共同溫育直到形成所述抗體或其片段的晶體。2.項(xiàng)1的方法，其中所述二價(jià)陽(yáng)離子鹽是大約10mM到80mM的ZnCl2。3.項(xiàng)2的方法，其中所述二價(jià)陽(yáng)離子鹽是大約25mM到60mMZnCl2。4.項(xiàng)1-3任一項(xiàng)的方法，其中所述緩沖劑包含乙酸鈉(NaOAc)。5.項(xiàng)4的方法，其中所述緩沖劑包括約lmM到20mMNaOAc。6.項(xiàng)5的方法，其中所述緩沖劑包括約25mM到75mMNaOAc。7.項(xiàng)1-6任一項(xiàng)的方法，其中所述溶液包含多于約10mM的ZnCl2和多于約5mM的NaOAc。8.項(xiàng)7的方法，其中所述溶液包含約100mM的ZnCl2和約10mM的NaOAc。9.項(xiàng)1-8任一項(xiàng)的方法，其中所述抗體或抗體片段是抗VEGF、抗CD20、抗CDlla、抗HER2、抗Apo-2或抗IgE抗體，或其片段。10.項(xiàng)l-9任一項(xiàng)的方法，其中所述接觸在環(huán)境溫度進(jìn)行。11.項(xiàng)1-10任一項(xiàng)的方法，其中所述緩沖劑的pH至少為4.7。12.項(xiàng)11的方法，其中所述緩沖劑的pH為約4.7到5.7。13.項(xiàng)1的方法，其中所述二價(jià)陽(yáng)離子鹽是約200到500mMMgCl2。14.項(xiàng)l-13任一項(xiàng)的方法，其中所述抗體是多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、親和力成熟的抗體、雙特異性抗體、多特異性抗體、人源抗體或人源化抗體。15.項(xiàng)l-14任一項(xiàng)的方法，其中所述抗體是全長(zhǎng)抗VEGF抗體。16.項(xiàng)1-15任一項(xiàng)的方法，其中所述接觸在2-8t:進(jìn)行。17.項(xiàng)1-16任一項(xiàng)的方法，其中所述抗體是選自Fab、Fab'、Fab2、Fab，2、Fd、Fd'、scFv、ScFv2、dAb、缺鉸鏈抗體、線性抗體和雙抗體的抗體片段。18.項(xiàng)1-17任一項(xiàng)的方法，其中所述抗體是IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgMl、IgM2、IgA或IgA2。19.組合物，其包含抗VEGF、抗CD20、抗CDlla、抗HER2、抗Apo-2或抗IgE抗體、或其片段的晶體，以及載體。20.項(xiàng)19的組合物，其中所述載體是聚合載體。21.項(xiàng)19的組合物，其中所述晶體是抗VEGF抗體或其片段的晶體。22.項(xiàng)19-21任一項(xiàng)的組合物，其中所述載體是聚合載體。23.組合物，其包含抗VEGF、抗CD20、抗CDlla、抗HER2、抗Apo-2或抗IgE抗體、或其片段的凝膠，以及載體。24.項(xiàng)22的組合物，其中所述載體是聚合載體。25.項(xiàng)19-24任一項(xiàng)的組合物，其中所述聚合載體選自聚(丙烯酸)、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(氨基酸)、聚胺、聚(酸酐)、聚(酯肽)、聚(酯)、聚(乳酸)、乳酸_乙醇酸共聚物或PLGA、聚(P-羥基丁酸酯)、聚(己內(nèi)酯)、聚(二噁烷酮)、聚(乙二醇)、聚((羥丙基)甲基丙烯酰胺)、聚[(有機(jī))磷腈]、聚(原酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡咯烷酮)、馬來(lái)酸酐_烷基乙烯醚共聚物、pluronic多元醇、白蛋白、藻酸鹽、纖維素和纖維素衍生物、膠原、纖維蛋白、明膠、透明質(zhì)酸、寡糖、糖胺聚糖、硫酸化多糖、及其混合物和共聚物。26.配制劑，其包含抗VEGF、抗CD20、抗CDlla、抗HER2、抗Apo-2或抗IgE抗體、或其片段的凝膠，以及至少一種成分。27.項(xiàng)26的配制劑，其中所述凝膠是抗VEGF抗體或其片段的凝膠。28.項(xiàng)19-27任一項(xiàng)的配制劑，其中所述配制劑或組合物的抗體或抗體片段的濃度為lmg/ml或更高。29.項(xiàng)28的配制劑，其中所述配制劑或組合物的抗體或抗體片段的濃度為3mg/ml或更高。30.項(xiàng)26-29任一項(xiàng)的配制劑，其中所述至少一種成分是白蛋白。31.項(xiàng)26-39的配制劑，其中所述成分選自蔗糖、海藻糖、乳糖醇、明膠、羥丙基-e-環(huán)糊精。32.通過(guò)項(xiàng)1的方法制備的抗體或其片段的晶體。33.項(xiàng)19-31任一項(xiàng)的組合物或配制劑，其中所述晶體是交聯(lián)的。34.治療哺乳動(dòng)物中VEGF相關(guān)病癥的方法，其包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用有效量的5項(xiàng)21的組合物或配制劑。35.制備抗體或其片段的晶體的方法，其包括a)使抗體或其片段接觸包含約1到120mM鋅鹽的溶液；并b)將所述抗體或其片段與所述溶液共同溫育直到形成所述抗體或其片段的晶體。36.制備抗體或其片段的晶體的方法，其包括a)使抗體或其片段接觸基本上由鋅鹽和緩沖劑組成的溶液；并b)將所述抗體或其片段與所述溶液共同溫育直到形成所述抗體或其片段的晶體。37.制備抗體或其片段的晶體的方法，其包括a)使抗體或其片段接觸包含鋅鹽而缺少其它沉淀劑的溶液；并b)將所述抗體或其片段與所述溶液共同溫育直到形成所述抗體或其片段的晶體。38.制備抗體或其片段的蛋白質(zhì)凝膠的方法，其包括a)使抗體或其片段接觸包含約1到120mM的二價(jià)陽(yáng)離子鹽和約1到lOOmM的緩沖劑的溶液；并b)將所述抗體或其片段與所述溶液共同溫育直到形成所述抗體或其片段的蛋白質(zhì)凝膠。39.項(xiàng)35-38任一項(xiàng)的方法，其中所述抗體或其片段是抗VEGF、抗CD20、抗CD20、抗CDlla、抗HER2、抗IgE抗體、或其片段。40.項(xiàng)35-38任一項(xiàng)的方法，其中所述抗體是多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、雙特異性抗體、人源抗體或人源化抗體。41.項(xiàng)35-38任一項(xiàng)的方法，其中所述抗體是選自Fab、Fab'、Fab2、Fab'2、Fd、Fd'、scFv、ScFv2、dAb、缺鉸鏈抗體、線性抗體和雙抗體的抗體片段。圖1是顯示抗VEGF在不同濃度的ZnCl2和NaOAc，pH5.7，室溫條件下的溶解度的圖表。該圖顯示了可溶性抗VEGF濃度作為ZnCl2濃度和NaOAc濃度的函數(shù)的作圖。不同的NaOAc濃度如下所示xlOmMNaOAc;A25mMNaOAc(白線)；令50mMNaOAc;B75mMNaOAc;承100mMNaOAc。圖2a是非雙折射光下200倍放大的在5mMZnCl2、100mMNaOAc，pH5.7存在下形成的抗VEGF晶體的圖像。圖2b是雙折射光下200倍放大的在5mMZnCl2、100mMNaOAc，pH5.7存在下形成的抗VEGF晶體的圖像。圖2c是非雙折射光下200倍放大的在25mMZnCl2、10mMNaOAc，pH5.7存在下形成的抗VEGF晶體的圖像。圖2d是雙折射光下200倍放大的在25mMZnCl2、10mMNaOAc，pH5.7存在下形成的抗VEGF晶體的圖像。圖2e是非雙折射光下200倍放大的在10mMZnCl2、100mMNaOAc，pH5.7存在下形成的抗VEGF晶體的圖像。圖2f是雙折射光下200倍放大的在10mMZnCl2、100mMNaOAc，pH5.7存在下形成的抗VEGF晶體的圖像。圖3顯示了通過(guò)以ZnCl2濃度對(duì)NaOAc濃度作圖生成的靜態(tài)條件的相圖。下列符號(hào)代表O游離晶體；B相變；A凝膠晶體(白色三角形)。圖4顯示了混合對(duì)靜態(tài)條件的相圖。下列符號(hào)代表O游離混合；令凝膠混合；一一相變混合；一■一相變靜態(tài)；口游離靜態(tài)；和B凝膠靜態(tài)。圖5顯示了經(jīng)過(guò)分離、洗滌和重溶的抗VEGF晶體的SDS-PAGE。泳道1是分子量標(biāo)記。泳道2是5iig的抗VEGF;泳道3為空；泳道4是上清液；泳道5是洗滌1，母液；泳道6是洗滌2，母液；泳道7是洗滌3，母液；泳道8為空；泳道9是1ml晶體(溶于水)；泳道10是5ml晶體(溶于水)；泳道11是10ml晶體(溶于水)；泳道12是15ml晶體(溶于水)；泳道13是20ml晶體(溶于水)。圖6顯示了向抗VEGF結(jié)晶條件10mMZnCl2，10mMNaOAc，pH5.7中加入沉淀劑。用可溶性抗VEGF對(duì)加入的沉淀劑的％作圖。圖7A-7D顯示了抗VEGF儲(chǔ)液(D)、抗VEGF晶體溶液(A，C)和洗滌晶體的溶液(B)的質(zhì)譜分析?？筕EGF的還原輕鏈的質(zhì)量為約23，449D。優(yōu)選實(shí)施方案詳述詳述定義術(shù)語(yǔ)"抗體"和"免疫球蛋白"可互換使用，且使用其最寬泛的意義，包括單克隆抗體(全長(zhǎng)或完整的單克隆抗體)、多克隆抗體、具有多表位特異性的抗體組合物、親和力成熟的抗體、人源化抗體、人源抗體、嵌合抗體、人源化多價(jià)抗體、和多特異性抗體(例如雙特異性抗體，只要其表現(xiàn)所需的生物活性)以及抗原結(jié)合片段(例如，F(xiàn)ab、F(ab')^scFv和Fv)，只要它們表現(xiàn)所需的生物活性。全長(zhǎng)的抗體包含四條多肽鏈，即由二硫鍵相互連接的兩條相同的重鏈(H)和兩條相同的輕鏈(L)。每條重鏈包括一重鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域(VH)和一重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)包括三個(gè)結(jié)構(gòu)域CH1、CH2和CH3。每條輕鏈包括一輕鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域(\)和一輕鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域。輕鏈恒定區(qū)包括一個(gè)結(jié)構(gòu)域，&。VH和VL結(jié)構(gòu)域可進(jìn)一步分成互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)或高變環(huán)(HVL)，其中散布著更加保守的區(qū)域，稱為框架區(qū)(FR)。毎個(gè)Vh和、通常包含3個(gè)CDR和4個(gè)FR，它們以下面的順序從氨基末端到羧基末端排列FR1，CDR1，F(xiàn)R2，CDR2，F(xiàn)R3，CDR3，F(xiàn)R4。根據(jù)其重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，可將抗體(免疫球蛋白)歸入不同的類別。免疫球蛋白有五種主要的類別lgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可進(jìn)一步分為亞類(同種型)，如IgG-l、IgG-2、IgA-l、IgA-2等。將與不同免疫球蛋白類別對(duì)應(yīng)的重鏈恒定區(qū)分別稱作a、S、e、Y和ii。不同類別免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)造是眾所周知的，在例如Abbas等人，CellularandMol.Immunology,第4版(2000)中有一般性描述。抗體可以是更大的融合分子的一部分，該融合分子由抗體與一種或多種其它蛋白質(zhì)或肽共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合而構(gòu)成。根據(jù)其恒定區(qū)的氨基酸序列，可將來(lái)自任何脊椎動(dòng)物物種的抗體的輕鏈歸入兩種截然不同的類型中的一種，稱作卡帕(k)和拉姆達(dá)(入)。術(shù)語(yǔ)"全長(zhǎng)抗體"指包括至少2條重鏈和2條輕鏈的以基本上完整的形式存在的抗體，不是下面所定義的抗體片段。該術(shù)語(yǔ)特別指具有含F(xiàn)c區(qū)的重鏈的抗體。全長(zhǎng)抗體可組抗體。全長(zhǎng)抗體可以是人源的，人源化的和/或親和力成熟的。本文所用的術(shù)語(yǔ)"單克隆抗體"指由一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，即構(gòu)成群體的各個(gè)抗體本質(zhì)上相同，除了生產(chǎn)抗體的過(guò)程中可能產(chǎn)生的變體外。單克隆抗體在本文中特別包括"嵌合"抗體，在嵌合抗體中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的剩余部分與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源；還包括此類抗體的片段，只要它們顯示出所需的生物學(xué)活性(美國(guó)專利4，816，567;Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855(1984))。非人源(如鼠源)抗體的"人源化"形式指最低限度包含衍生自非人源免疫球蛋白的序列的嵌合抗體。在極大程度上，人源化抗體指人源免疫球蛋白(受體抗體)中的CDR或高變環(huán)(HVL)殘基用具有所需特異性、親和力和能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠、兔或非人靈長(zhǎng)類的CDR或HVL殘基替換的免疫球蛋白。在有些情況中，將人源免疫球蛋白的框架區(qū)(FR)殘基用相應(yīng)的非人源殘基替換以改善抗原結(jié)合親和力。此外，人源化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)的殘基?？梢赃M(jìn)行這些修飾以改進(jìn)抗體的親和力或功能活性。通常，人源化抗體將包含基本上全部的至少一個(gè)、通常為兩個(gè)如下所述的可變區(qū)，其中所有或基本上所有的高變區(qū)對(duì)應(yīng)于非人源免疫球蛋白的高變區(qū)，且所有或基本上所有的FR是人源免疫球蛋白序列的FR。人源化抗體還可制備為本文所述的抗原結(jié)合片段。任選的是，人源化抗體還將包含至少部分的免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，通常是衍生自人源免疫球蛋白的恒定區(qū)。更多細(xì)節(jié)參見(jiàn)Jones等人，Nature321:522-525(1986);Riechmann等人，Nature332:323-329(1988);及Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。還參見(jiàn)本文所弓l用的下列綜述禾口參考文獻(xiàn)Vaswani禾口Hamilton,Ann.Allergy,Asthma&Immunol.1:105-115(1998);Harris，Biochem.Soc.Transactions23:1035-1038(1995);Hurle禾口Gross,Curr.Op.Biotech5:428-433(1994)。"人源抗體"具有這樣的氨基酸序列，該序列對(duì)應(yīng)于人類所產(chǎn)生的抗體的氨基酸序列，并且/或者是使用任何制造人類抗體的方法所制造的。具體地，人源抗體的定義不包括包含非人源抗原結(jié)合殘基的人源化抗體。"親和力成熟"的抗體在一個(gè)或多個(gè)高變區(qū)中具有一個(gè)或多個(gè)改變，所述改變導(dǎo)致該抗體與不具有所述改變的親本抗體相比，對(duì)抗原的親和力得到改進(jìn)。優(yōu)選的親和力成熟的抗體將對(duì)目標(biāo)抗原具有納摩爾乃至皮摩爾的親和力。親和力成熟的抗體是用本領(lǐng)域已知的程序制造的。Marks等人，Bio/Technology10:779-783(1992)描述了利用VH和VL結(jié)構(gòu)域改組(shuffling)的親和力成熟。CDR和/或框架殘基的隨機(jī)誘變由下列文獻(xiàn)描述Barbas等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA91:3809-3813(1994);Scier等人，Gene169:147-155(1995);Yelton等人，J.Immunol.155:1994-2004(1995);Jackson等人，J.Immunol.154(7):3310-9(1995);禾PHawkins等人，J.MolBiol.226:889-896(1992)。"抗體片段"只包含完整抗體的一部分，通常包含完整抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)并因此保留結(jié)合抗原的能力。本定義所涵蓋的抗體片段的例子包括(i)Fab片段，其具有VL、CL、VH和CHI結(jié)構(gòu)域，在重鏈和輕鏈之間具有一個(gè)二硫鍵；(ii)Fab'片段，其是在CHI結(jié)構(gòu)域的C-末端具有一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基的Fab片段；(iii)Fd片段，其具有VH和CHI結(jié)構(gòu)域；(iv)Fd'片段，其具有VH和CHI結(jié)構(gòu)域，并在CHI結(jié)構(gòu)域的C-末端具有一個(gè)或多個(gè)半胱氨8酸殘基；(v)Fv片段，其具有抗體的一條臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域；(vi)dAb片段，其由VH結(jié)構(gòu)域組成；(vii)缺鉸鏈抗體，其至少包含VL、VH、CL、CH1結(jié)構(gòu)域且缺少鉸鏈區(qū)；(viii)F(ab)2片段，其是包含由鉸鏈區(qū)的二硫橋連接的兩個(gè)Fab'片段的二價(jià)片段；(ix)單鏈抗體分子(例如單鏈Fv;scFv);(x)"雙抗體"(diabodies)，其具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，包括在同一多肽鏈中相互連接的重鏈可變域(VH)和輕鏈可變域(VL);(xi)"線性抗體"，其包含一對(duì)串聯(lián)的Fd片段(VH-CH1-VH-CH1)，它與互補(bǔ)輕鏈多肽一起形成一對(duì)抗原結(jié)合區(qū)。本文中使用的"晶體"是指固態(tài)物質(zhì)的一種形式，其中原子在三維上周期重復(fù)地排列，通常形成晶格。本文中使用的"凝膠"是指抗體或抗體片段的濃縮形式，它是一種粘彈性溶液，比液體的膠體溶液更為堅(jiān)固。任選地，凝膠可包括晶體。使用本發(fā)明的方法所形成的凝膠通常含有高濃度的抗體或其片段，并且可任選包含晶體。本文中使用的"沉淀劑"是指導(dǎo)致化合物或分子變?yōu)椴豢扇艿脑噭?。在某些情況下，所述化合物或分子形成晶體?？捎脕?lái)形成化合物或分子的晶體的沉淀劑通常為鹽類、聚合物類或有機(jī)分子類。有機(jī)沉淀劑包括異丙醇、乙醇、己二醇和2-甲基-2，4-戊二醇(MPD)。聚合沉淀劑包括聚乙二醇和聚胺例如Jeffamine⑧。所用的鹽類包括硫酸銨、檸檬酸鈉、乙酸鈉、氯化銨、氯化鈉和甲酸鎂，濃度通常為0.2M或更高。"紊亂"或"病癥"是任何可從抗體治療獲益的狀態(tài)。它包括慢性和急性紊亂或疾病，包括那些導(dǎo)致哺乳動(dòng)物易于患上所討論紊亂的病理狀態(tài)。本文中要治療的紊亂的非限制性例子包括惡性和良性腫瘤，非白血病和淋巴樣惡性腫瘤；神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)、星形膠質(zhì)細(xì)胞、下丘腦以及其它腺、巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞、基質(zhì)和囊胚腔的紊亂；以及炎性、血管發(fā)生性和免疫紊亂。本文中使用的"治療"是指試圖改變受治療的個(gè)體或細(xì)胞的自然進(jìn)程的臨床干預(yù)。治療的理想結(jié)果包括癥狀的減輕，疾病的任何直接或間接的病理后果的減小，防止轉(zhuǎn)移，降低疾病進(jìn)展的速率，疾病狀態(tài)的改善或緩和，以及預(yù)后的減輕或改善。用于實(shí)施本發(fā)明的方法抗體和抗體片段已經(jīng)有了很大的用處，尤其在治療上。人們正在研究多種抗體的治療用途。治療用途通常需要大規(guī)模生產(chǎn)抗體或抗體片段。本發(fā)明的一個(gè)方面包括一種濃縮、純化和儲(chǔ)存抗體或其片段，尤其是大規(guī)模生產(chǎn)的抗體或其片段的方法。本發(fā)明的方法提供了晶體、凝膠和帶晶體的凝膠?？贵w或其片段的晶體和/或凝膠在例如通過(guò)x射線衍射表征抗體或其片段的三維結(jié)構(gòu)，以及抗體或其片段的儲(chǔ)存、濃縮、純化和送遞等方面有用處。許多蛋白質(zhì)由于其大小和三維構(gòu)造可能難以結(jié)晶。典型地，必須對(duì)沉淀劑、緩沖劑和PH的數(shù)種組合進(jìn)行篩選以確定可促成結(jié)晶的條件組合?？贵w和抗體片段特別難于結(jié)晶，這是由于它們的大小，以及鉸鏈區(qū)使得這些分子較多柔性和較少剛性的緣故。另外，根據(jù)抗體的來(lái)源，抗體或其片段可能發(fā)生糖基化。在一些實(shí)施方案中，一種方法包括使抗體或其片段接觸溶液，所述溶液包含二價(jià)陽(yáng)離子鹽，基本上由二價(jià)陽(yáng)離子鹽組成，或由二價(jià)陽(yáng)離子鹽組成。在一些實(shí)施方案中，二價(jià)陽(yáng)離子鹽以低濃度存在，例如約1到500mM。所述溶液還可以包含緩沖劑，基本上由緩沖劑組成，或由緩沖劑組成，所述緩沖劑例如乙酸鈉。在一些實(shí)施方案中，緩沖劑具有低離子強(qiáng)度，如大約l至ljlOOmM。二價(jià)陽(yáng)離子的例子包括但不限于鋅、鎂和f丐。所述二價(jià)陽(yáng)離子鹽起9沉淀劑的作用并促成蛋白質(zhì)晶體的形成，但這不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的任何限制。在某些情況下，所述溶液不包含其它的沉淀劑，例如有機(jī)或聚合沉淀劑。在一些實(shí)施方案中，一種方法包括使抗體或其片段接觸包含鋅鹽，基本上由鋅鹽組成，或由鋅鹽組成的溶液。在一些實(shí)施方案中，鋅鹽以低濃度存在，例如約1到120mM，優(yōu)選10到80mM，更優(yōu)選25到60mM。在一些實(shí)施方案中，所述鋅鹽是ZnCl2。所述溶液還可以包含緩沖劑，基本上由緩沖劑組成，或由緩沖劑組成，所述緩沖劑例如乙酸鈉。在一些實(shí)施方案中，緩沖劑具有低離子強(qiáng)度，如大約1到100mM，優(yōu)選1到20mM，更優(yōu)選25mM到75mM。在一些實(shí)施方案中，所述溶液包含約100mMZnCl2和約100mMNaOAc。在一些實(shí)施方案中，所述溶液不包含其它的沉淀劑，例如有機(jī)或聚合沉淀劑。所述方法提供了晶體和/或蛋白質(zhì)凝膠的形成?？扇芜x地，所述蛋白質(zhì)凝膠可包含晶體。在一些實(shí)施方案中，所述溶液包含多于約10mM的ZnCl2和多于約5mM的NaOAc。在其它實(shí)施方案中，所述溶液包含100mM的ZnCl2和10mM的NaOAc。在一些實(shí)施方案中，一種方法包括使抗體或其片段接觸包含鎂鹽，基本上由鎂鹽組成，或由鎂鹽組成的溶液。在一些實(shí)施方案中，使用低濃度的氯化鎂(MgCl》，例如，約1到500mM，更優(yōu)選約200到500mM，最優(yōu)選約1到100mM。溶液可以包含緩沖劑，基本上由緩沖劑組成，或由緩沖劑組成，所述緩沖劑例如乙酸鈉或tris。在一些實(shí)施方案中，所述緩沖劑具有低離子強(qiáng)度，例如約1到100mM。在某些情況下，所述溶液不包含其它的沉淀劑，例如有機(jī)或聚合沉淀劑。在某些情況下，所述溶液具有高pH，例如約7.5到約9。這些方法提供了晶體和/或蛋白質(zhì)凝膠的形成?？扇芜x地，所述蛋白質(zhì)凝膠可包含晶體。在一些實(shí)施方案中，一種方法包括使抗體或其片段接觸包含鋅鹽，基本上由鋅鹽組成，或由鋅鹽組成的溶液，以形成蛋白質(zhì)凝膠。可任選地，所述蛋白質(zhì)凝膠可包含晶體。在一些實(shí)施方案中，鋅鹽以低濃度存在，例如約1到120mM。所述溶液可以包含緩沖劑，基本上由緩沖劑組成，或由緩沖劑組成，所述緩沖劑例如乙酸鈉。在一些實(shí)施方案中，緩沖劑具有低離子強(qiáng)度，如大約1到100mM。在某些情況下，所述溶液不包含其它的沉淀劑，例如有機(jī)或聚合沉淀劑。本發(fā)明的方法提供了一種低成本的結(jié)晶、濃縮或純化抗體或其片段的方法。在某些情況下，本發(fā)明的方法提供了不包括使用可能不希望存在于產(chǎn)品中的其它沉淀劑，例如有機(jī)或聚合沉淀劑的方法。為了儲(chǔ)存和/或施用，抗體或抗體片段的晶體和/或蛋白質(zhì)凝膠可以與載體或其它成分組合?？贵w或其片段本發(fā)明的方法中使用了抗體或其片段。抗體包括但不限于多克隆抗體、單克隆抗體、親和力成熟的抗體、具有多表位特異性的抗體、人源化抗體、人源抗體、嵌合抗體、和多特異性抗體。在某些情況下，抗體作為全長(zhǎng)的抗體生產(chǎn)。全長(zhǎng)的抗體典型地包含2條輕鏈和2條重鏈。主要有5類免疫球蛋白，包括IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。其中幾類還可進(jìn)一步劃分為亞類，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgMl、IgM2、IgAl或IgA2。本發(fā)明的方法中可利用這些類中的一類或多類抗體。在一些實(shí)施方案中，所述抗體是IgG抗體。本發(fā)明的方法中還可以使用抗體片段?？贵w片段包含抗原結(jié)合片段，并包括Fab、Fab'、Fab2、Fab'"FcU單鏈Fv、ScFv2、dAb、缺鉸鏈(hingeless)抗體、雙抗體和線性抗體。根據(jù)抗體或其片段的來(lái)源，抗體可以是糖基化的。典型地，來(lái)源于或產(chǎn)生在哺乳動(dòng)物或昆蟲(chóng)細(xì)胞中的重組抗體是糖基化的。來(lái)源于或產(chǎn)生在原核細(xì)胞中的抗體或其片段缺乏糖基化或者是無(wú)糖基化的(aglycosylated)。通過(guò)糖基化位點(diǎn)序列的突變，抗體的糖基化還可以被改變或去除。抗體或抗體片段對(duì)抗原具有特異性。本發(fā)明的方法中有用的抗體包括以例如下面所述分子為抗原的抗體腎素；生長(zhǎng)激素，包括人生長(zhǎng)激素和牛生長(zhǎng)激素；生長(zhǎng)激素釋放因子；甲狀旁腺素；促甲狀腺激素；脂蛋白；a-l-抗胰蛋白酶；胰島素A鏈；胰島素B鏈；胰島素原；促卵泡激素；降鈣素；黃體生成素；胰高血糖素；凝血因子例如因子VIIIC，因子IX，組織因子(TP)，以及馮維勒布蘭德因子(vonWillebrandsfactor);抗凝血因子例如蛋白C;心鈉素；肺表面活性物質(zhì)(lungsurfactant);纖溶酶原激活物，例如尿激酶或人尿或組織型纖溶酶原激活物(t-PA);鈴蟾肽；凝血酶；造血生長(zhǎng)因子；腫瘤壞死因子a和|3;腦啡肽酶；RANTES(活化調(diào)節(jié)的，正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌的)；人巨噬細(xì)胞炎性蛋白(MIP-I-a);血清白蛋白例如人血清白蛋白；穆勒氏抑制物質(zhì)(Muellerian-inhibitingsubstance);松弛素A鏈；松弛素B鏈；松弛素原；小鼠促性腺激素相關(guān)肽；微生物蛋白質(zhì)，例如P_內(nèi)酰胺酶；DNA酶；細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原(CTLA)，例如CTLA-4;抑制素；激活素；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF);激素或生長(zhǎng)因子的受體；蛋白A或D;類風(fēng)濕因子；神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子例如骨衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNE)，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-3、-4、-5或-6(NT_3，NT_4，NT_5或NT_6)，或神經(jīng)生長(zhǎng)因子例如NGF-P;血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF);成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子例如aFGF和bFGF;表皮生長(zhǎng)因子(EGF);轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)例如TGF-a禾PTGF-P，包括TGF-P1，TGF-P2，TGF-P3，TGF-P4或TGF-P5;胰島素樣生長(zhǎng)因子-I禾PII(IGF-I禾PIGF—II);des(1-3)-IGF-I(腦IGF-I)，胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白；CD蛋白例如CD3，CD4，CD8，CD19，CD20和CD40;紅細(xì)胞生成素；骨誘導(dǎo)因子；免疫毒素；骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP);干擾素例如干擾素-a、-P和-y;集落剌激因子(CSF)，例如，M-CSF、GM-CSF和G-CSF;白介素(IL)，例如IL-1到IL-10;超氧化物歧化酶；T細(xì)胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子；病毒抗原例如AIDS被膜的一部分；轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；歸巢受體；地址素；調(diào)節(jié)蛋白；整聯(lián)蛋白例如CDlla、CDllb、CDllc、CD18，ICAM、VLA-4和VCAM;腫瘤相關(guān)抗原例如HER2，HER3或HER4受體；以及任何上述多肽的片段。本發(fā)明所涵蓋的抗體的優(yōu)選抗原包括CD蛋白例如CD3，CD4，CD8，CD19，CD20，CD40，CD34和CD46;ErbB受體家族成員例如EGF受體，HER2，HER3或HER4受體；細(xì)胞黏著分子例如LFA-I，Macl，p150.95，VLA-4，ICAM-1，VCAM，a4/P7整聯(lián)蛋白，及av/p7整聯(lián)蛋白，包括其a或P亞基(例如抗CDlla，抗CD18或抗CDllb抗體)；生長(zhǎng)因子例如VEGF;組織因子(TF);TGFP;a干擾素(a-IFN);白介素，例如IL-8;血型抗原；Apo_2死亡受體；flk2/flt3受體；肥胖(OB)受體；mpl受體；CTLA-4;蛋白C等。本文中最優(yōu)選的目標(biāo)是VEGF、TF、CD19、CD20、CD40、TGF-P、CDlla、CD18、Apo_2死亡受體禾口C24。在某些實(shí)施方案中，所述抗體或其片段包括抗VEGF、抗Apo-2、抗IgE、抗HER2、抗CDlla或抗CD20?？贵w或抗體片段可以從天然來(lái)源獲得，合成制備，或通過(guò)重組方法制備。制備抗體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，包括利用噬菌體展示技術(shù)(Phagedisplay)生產(chǎn)抗體或抗體片段。大規(guī)模生產(chǎn)的方法是已知的，包括以10升或更大的量生產(chǎn)抗體或其片段?？贵w或抗體片段通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法純化。在某些情況下，純化所生產(chǎn)的抗體或其片段以獲得基本上同質(zhì)的制品用于進(jìn)一步的測(cè)定和使用?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化方法。下面的程序是合適的純化程序的例子在免疫親和柱或離子交換柱上分級(jí)，乙醇沉淀，反相HPLC，在硅土或陽(yáng)離子交換樹(shù)脂例如DEAE上進(jìn)行層析，層析聚焦，SDS-PAGE，硫酸銨沉淀，以及使用例如S印hadex-75進(jìn)行凝膠過(guò)濾。例如，作為純化的第一步，將衍生自細(xì)胞培養(yǎng)的抗體或其片段加到固定了蛋白A的固相上，使抗體與蛋白A特異性結(jié)合。然后洗滌固相以去除與固相非特異性結(jié)合的污染物。最后通過(guò)洗脫從固相回收抗體。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，在本發(fā)明方法中所用的溶液中的抗體濃度至少為lg/L。溶液中抗體濃度的范圍為約1到約100g/L。在本發(fā)明的另一些實(shí)施方案中，溶液中抗體濃度的范圍為約20到約100g/L。在本發(fā)明的另一些實(shí)施方案中，溶液中抗體濃度的范圍為約40到約90g/L。方法本發(fā)明的方法牽涉從溶液中結(jié)晶或濃縮抗體或抗體片段的方法。晶體或蛋白質(zhì)凝膠對(duì)于例如表征抗體或其片段的結(jié)構(gòu)，以及抗體的儲(chǔ)存、濃縮、純化和送遞都是有用的。在一些實(shí)施方案中，被濃縮的抗體的濃度至少為lgm/L，更優(yōu)選地，至少40到90gm/L。本發(fā)明的方法提供了生產(chǎn)抗體或其片段的晶體的低成本方法。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，一種方法包括使抗體或其片段接觸包含二價(jià)陽(yáng)離子鹽，基本上由二價(jià)陽(yáng)離子鹽組成，或由二價(jià)陽(yáng)離子鹽組成的溶液，并將該抗體或其片段與該溶液一起溫育直到形成該抗體或其片段的晶體。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括使抗體接觸包含鋅鹽，基本上由鋅鹽組成，或由鋅鹽組成的溶液，其中鋅鹽的濃度為約1到約120mM，更優(yōu)選約10到約80mM，最優(yōu)選約25到60mM的鋅鹽。鋅鹽包括氯化鋅、磷酸鋅、檸檬酸鋅、乙酸鋅或硫酸鋅。在一些實(shí)施方案中，所述溶液包含約1到約100mM的ZnCl2，基本上由約1到約100mM的ZnCl2組成，或由約1到約lOOmM的ZnCl2組成。在特定的實(shí)施方案中，所述溶液包含多于10mM的ZnCl2和多于5mM的NaOAc，優(yōu)選約lOOmM的ZnCl2和約10mM的NaOAc。在一些實(shí)施方案中，所述方法提供了蛋白質(zhì)凝膠，其可任選地包含晶體。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括使抗VEGF抗體或其片段接觸包含鎂鹽，基本上由鎂鹽組成，或由鎂鹽組成的溶液，所述鎂鹽的濃度為約1到約500mM，更優(yōu)選約200到500mM，最優(yōu)選約10到100mM的鎂鹽。所述鎂鹽是在所述溶劑中可溶并可解離(disassociate)的鎂鹽。鎂鹽包括氯化鎂、磷酸鎂、擰檬酸鎂、乙酸鎂和硫酸鎂。在一些實(shí)施方案中，所述溶液包含約1到約100mM的氯化鎂，基本上由約1到約lOOmM的氯化鎂組成，或由約1到約100mM的氯化鎂組成。在一些實(shí)施方案中，所述溶液具有高pH，例如約7.5到約9的pH。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括使抗VEGF抗體或其片段接觸包含鈣鹽，基本上由f丐鹽組成，或由f丐鹽組成的溶液，所述f丐鹽的濃度為約1到約500mM，更優(yōu)選約1到200mM，最優(yōu)選約10到100mM的鈣鹽。所述鈣鹽是在所述溶劑中可溶并可解離的鈣鹽。鈣鹽包括氯化鈣、磷酸鈣、檸檬酸鈣、乙酸鈣和硫酸鈣。在一些實(shí)施方案中，所述溶液包含約1到約100mM的氯化f丐，基本上由約1到約100mM的氯化f丐組成，或由約1到約100mM的氯化鈣組成。在一些實(shí)施方案中，所述溶液具有高pH，例如約7.5到約9的pH。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括使抗體或其片段接觸包含鋅鹽，基本上由鋅鹽組成，或由鋅鹽組成，但缺少其它沉淀劑的溶液。在某些情況下，最大程度地減小其它沉淀劑的使用可能是理想的，這些其它沉淀劑例如有機(jī)分子，包括2-甲基-2，4-戊二醇，異丙醇或聚合化合物，包括聚乙二醇或聚胺。這些實(shí)施方案可提供相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)的結(jié)晶方法的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)樗鼈儾皇褂闷渌恋韯?。不使用任何有機(jī)或聚合沉淀劑的一個(gè)可能的優(yōu)點(diǎn)是經(jīng)濟(jì)上的，即在大規(guī)模操作中，例如，有機(jī)沉淀劑的花費(fèi)可能是可觀的，因此不使用有機(jī)沉淀劑的方法在經(jīng)濟(jì)上將會(huì)更劃算。不使用有機(jī)沉淀劑的另一種可能的優(yōu)點(diǎn)是在最終的晶體中不會(huì)存在有機(jī)沉淀劑的任何殘余。這可能是有利的，因?yàn)槿藗兿雽⒔Y(jié)晶的抗體配制成供施用于哺乳動(dòng)物的溶液。某些使用的有機(jī)沉淀劑可能不適用于對(duì)哺乳動(dòng)物例如人類的施用。本發(fā)明的方法還包括這樣的溶液，其包含二價(jià)陽(yáng)離子鹽和緩沖劑，基本上由二價(jià)陽(yáng)離子鹽和緩沖劑組成，或由二價(jià)陽(yáng)離子鹽和緩沖劑組成。本發(fā)明中可以使用的緩沖劑包括本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的任何緩沖劑。其例子包括但不限于乙酸、碳酸銨、磷酸銨、硼酸、檸檬酸、HEPES(4-(2-羥乙基)-l-哌嗪乙烷-磺酸)、N-二(羥乙基)甘氨酸(bicine)、MES、二甲胂酸鈉、咪唑、氯化銨、甲酸鎂、乳酸、磷酸、檸檬酸鉀、偏磷酸鉀、磷酸二氫鉀、乙酸鈉、檸檬酸鈉、乳酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、和Tris(trisroxymethylamin-ethane)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，使用乙酸鈉(NaOAc)作為緩沖劑。在一些實(shí)施方案中，所述溶液中緩沖劑的濃度范圍可為約1到約100mM。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，所述溶液中緩沖劑的濃度范圍可為約5到約100mM，更優(yōu)選1到20mM，最優(yōu)選25到75mM。在一些實(shí)施方案中，所述緩沖劑與所述二價(jià)陽(yáng)離子鹽和所述抗體或其片段組合為固體。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，所述緩沖劑與所述二價(jià)陽(yáng)離子鹽和所述抗體或其片段組合為溶液。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，可將固體的緩沖劑和固體的二價(jià)陽(yáng)離子鹽加入溶液，然后與溶液中的或固體形式的抗體組合。典型地，溶液的pH至少部分依賴于所用的特定緩沖劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，溶液的所希望的PH至少部分依賴于所述二價(jià)陽(yáng)離子鹽和該鹽在不同pH的溶解度。在一些實(shí)施方案中，緩沖劑的PH范圍可為約4.5到約9。在所述二價(jià)陽(yáng)離子是Zn的實(shí)施方案中，溶液的pH是約4到6。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，所述二價(jià)陽(yáng)離子是Zn，溶液中乙酸鈉的濃度為約1到100mM，該溶液的pH是約4.7到5.7。在其它實(shí)施方案中，所述二價(jià)陽(yáng)離子是Mg，緩沖劑是Tris，溶液的pH是約7.5到9。在一個(gè)實(shí)施方案中，溶液的pH，所用的緩沖劑，以及所用的二價(jià)鹽，可至少部分依賴于要結(jié)晶的抗體。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，這些因素之間可能相互有影響，因?yàn)榭贵w可能在特定的pH范圍內(nèi)穩(wěn)定，這可至少部分決定要使用的緩沖劑，而且類似地，可至少部分決定要使用的二價(jià)鹽(例如由于溶解度的問(wèn)題)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過(guò)制作溶解度曲線并確定濃度范圍或緩沖劑、二價(jià)鹽和導(dǎo)致相變的pH來(lái)確定緩沖劑濃度和二價(jià)陽(yáng)離子鹽濃度。在一些實(shí)施方案中，用至少25mM鋅鹽和至少50mM緩沖劑，例如乙酸鈉，來(lái)沉淀抗體或其片段。在其它實(shí)施方案中，優(yōu)選約10到80mM鋅鹽和25到75mM緩沖劑，例如乙酸鈉13的組合。本發(fā)明的方法包括使溶液與抗體或其片段接觸。在一些實(shí)施方案中，在蒸氣擴(kuò)散方法中使所述抗體或其片段接觸所述溶液。在蒸氣擴(kuò)散中，小體積(即數(shù)個(gè)毫升)的抗體或其片段的溶液與所述溶液混合。該混合物懸浮在含有小體積的所述溶液的孔上方。在其它實(shí)施方案中，接觸方法牽涉透析。透析牽涉半透性大小排阻膜，其保留抗體或其片段但容許小分子例如緩沖劑和沉淀劑擴(kuò)散進(jìn)出。沉淀劑緩慢地?cái)U(kuò)散通過(guò)膜并降低抗體或其片段的溶解度。另一實(shí)施方案是分批式的方法。在該分批方法中，將所述溶液加到抗體或其片段的溶液中。本發(fā)明的方法包括將所述抗體或其片段和所述溶液一起溫育直到形成晶體或蛋白質(zhì)凝膠。在一些實(shí)施方案中，在溫育過(guò)程中可以每天溫和攪拌該溶液一次或兩次。在其它實(shí)施方案中，可以連續(xù)地混合該溶液。如果想要大的晶體，應(yīng)該最大程度地減少混合。溫育可以在約ot:到約27t:，更優(yōu)選約2t:到25t:的范圍進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，溫度保持在環(huán)境溫度(例如約25°C)。在其它情況中，溫育在約2到『C進(jìn)行。將溶液和抗體或其片段一起溫育直到形成晶體或蛋白質(zhì)凝膠。典型地，溫育時(shí)間為約1小時(shí)到30天，更優(yōu)選1到5天。晶體可以形成為游離的固體或形成在凝膠中。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，抗體或其片段的晶體是凝膠的一部分。一般而言，本發(fā)明的方法中所形成的凝膠具有高濃度的抗體或其片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用本發(fā)明的方法形成的凝膠具有約200到約250mg抗體/mL的濃度。組合物或配制劑本發(fā)明的方法涉及形成抗體或其片段的晶體或蛋白質(zhì)凝膠。晶體具有規(guī)則的三維結(jié)構(gòu)，通常稱為晶格。這與無(wú)定形固體相反，無(wú)定形固體是沒(méi)有規(guī)則的分子晶格，且具有不均一的分子結(jié)構(gòu)或沒(méi)有分子結(jié)構(gòu)的非晶體固體。凝膠是濃縮的蛋白質(zhì)溶液，其可以是軟而粘的，或者是硬而脆的。在本文描述的方法中形成的晶體可具有多種形狀，包括針狀、類錐形，球形和花朵狀。晶體的尺寸可以在mm到y(tǒng)m級(jí)。在一些實(shí)施方案中，晶體的尺寸為至少10ym，以至于肉眼可見(jiàn)。就治療性施用而言，晶體的尺寸可根據(jù)施用途徑而變化，例如，供皮下施用的晶體尺寸可大于供靜脈內(nèi)施用的。在某些情況中，可能需要驗(yàn)證晶體是否是抗體或其片段的晶體?？梢酝ㄟ^(guò)顯微鏡在雙折射光下分析抗體或其片段的晶體。晶體可容許雙折射光通過(guò)，而非晶體物質(zhì)則不可。在另一種方法中，可以分離晶體，洗滌，重溶，在SDS-PAGE凝膠上運(yùn)行，并且，可選地，用抗Fc受體抗體染色?？蛇x地，還可以用標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定法來(lái)測(cè)試重溶的抗體或其片段與其特異抗原的結(jié)合。還可以通過(guò)質(zhì)譜來(lái)分析重溶的抗體或其片段。在某些情況中，可以將晶體相互交聯(lián)。這樣的交聯(lián)可以提高晶體的穩(wěn)定性。交聯(lián)晶體的方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，在例如美國(guó)專利5，849，296中有描述?？梢杂秒p功能試劑例如戊二醛交聯(lián)晶體。晶體一旦交聯(lián)，即可凍干并儲(chǔ)存?zhèn)溆茫缬糜谠\斷或治療用途。在某些情況中，可能需要干燥所述晶體或蛋白質(zhì)凝膠。可用N2和/或惰性氣體、真空烘箱干燥、凍干、蒸發(fā)、盤(pán)式干燥、流化床干燥、噴霧干燥、真空干燥或滾筒干燥來(lái)干燥14晶體或蛋白質(zhì)凝膠?？梢詫⒕w保持在溶液中，或者可以將其洗滌并與其它載體和/或成分組合而形成該晶體的組合物和/或配制劑。所述組合物和配制劑可用于，例如治療和診斷用途。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及所述抗體或其片段晶體或蛋白質(zhì)凝膠的組合物和/或配制劑。組合物包含抗體或其片段的晶體或蛋白質(zhì)凝膠，以及載體。配制劑包含抗體或其片段的晶體或蛋白質(zhì)凝膠，以及至少一種成分。在一些實(shí)施方案中，抗體選自抗VEGF、抗Apo-2、抗CD20、抗CDlla、抗HER2、抗IgE，及其片段。制備抗體或抗原結(jié)合片段的晶體或蛋白質(zhì)凝膠的配制劑或組合物，即將具有所需純度的抗體與生理學(xué)可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑混合(《Remington'sPharmaceuticalSciences》，第16版，Osol，A.編，1980)，以水溶液、凍干或其它干燥配制劑的形式貯存?？山邮艿妮d體、賦形劑或穩(wěn)定劑在所采用的劑量和濃度對(duì)接受者是無(wú)毒的，包括緩沖劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽、組氨酸和其它有機(jī)酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基芐基銨；氯化己烷雙胺；苯扎氯銨、苯索氯銨；酚、丁醇或苯甲醇；對(duì)羥基苯甲酸烷基酯，諸如對(duì)羥基苯甲酸甲酯或丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；和間甲酚)；低分子量(少于約10個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)，諸如血清清蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；糖類，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；和/或非離子表面活性劑，諸如TWEEN、PLUR0NICS或聚乙二醇(PEG)。在一些實(shí)施方案中，可將所述晶體或蛋白質(zhì)凝膠與聚合載體組合，以提供穩(wěn)定性和持續(xù)釋放。這樣的聚合物包括生物相容性的和生物可降解的聚合物。聚合載體可以是單一聚合物類型，或者可以由多種聚合物類型混合而成。聚合載體的非限制性例子包括例如聚(丙烯酸)，聚(氰基丙烯酸酯)，聚(氨基酸)，聚(酸酐)，聚(酯肽)(poly(d印sip印tide))，聚(酯)例如聚(乳酸)或PLA，乳酸-乙醇酸共聚物或PLGA，聚(e-羥基丁酸酯)，聚(己內(nèi)酯)和聚(二噁烷酮(poly(dioxanone));聚(乙二醇)；聚((羥丙基)甲基丙烯酰胺)，聚[(有機(jī))磷腈](poly[(organo)phosphazene])，聚(原酸酯)，聚(乙烯醇)，聚(乙烯吡咯烷酮)，馬來(lái)酸酐-烷基乙烯醚共聚物，pluronic多元醇，白蛋白，天然和合成多肽，藻酸鹽，纖維素和纖維素衍生物，膠原，纖維蛋白，明膠，透明質(zhì)酸，寡糖，糖胺聚糖，硫酸化多糖，改性淀粉例如直鏈淀粉，支鏈淀粉，羥乙基淀粉，甲基丙烯酸(酯/鹽)淀粉，和其它淀粉，以及任何可包裹(encapsulate)蛋白質(zhì)晶體的常規(guī)材料?？贵w或其片段的晶體的配制劑包括至少一種成分或賦形劑。成分或賦形劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，包括酸化劑、氣霧噴射劑、醇變性劑、堿化劑、消塊劑、消泡劑、微生物防腐劑、抗氧化劑、緩沖劑、潤(rùn)滑劑、染料、干燥劑、乳化劑、助濾劑、香精和香料、潤(rùn)濕劑、軟膏劑、增塑劑、溶劑(例如油或有機(jī)的)、吸附劑、二氧化碳吸附劑、硬化劑、栓劑基質(zhì)(suppositorybases)、懸浮或增粘劑、甜味劑、片劑粘合劑(tabletbinders)、片劑或膠囊稀釋劑、片劑崩解劑、片劑或膠囊潤(rùn)滑劑、張度劑(tonicityagent)、增香或增甜的賦形齊U(vehicles)、油質(zhì)賦形齊U(oleaginousvehicles)、固體載體賦形齊U(solidcarriervehicles)、防水劑、和潤(rùn)濕或增溶劑。在一些實(shí)施方案中，所述成分提高儲(chǔ)存穩(wěn)定性。在其它的實(shí)施方案中，所述成分或賦形劑優(yōu)選地選自白蛋白、蔗糖、海藻糖、乳糖醇(latitol)、明膠和羥丙基-|3_環(huán)糊精。本文中描述的組合物和配制劑還包括有效量的結(jié)晶抗體或其片段。使用標(biāo)準(zhǔn)的方法可以容易地確定劑量。合適地，將抗體一次性地或經(jīng)過(guò)多次治療施用給患者。根據(jù)疾病的種類和嚴(yán)重程度，用約1yg/kg到約50mg/kg(例如0.1-20mg/kg)的抗體作為初始候選劑量，通過(guò)例如一次或多次分開(kāi)的施用或通過(guò)連續(xù)輸注施用給患者。根據(jù)條件不同，通常的每日或每周劑量范圍可以為約lPg/kg到約20mg/kg或更多，重復(fù)該治療直到疾病癥狀發(fā)生所希望的抑制。但是，也可以使用其它的劑量方案。在某些情況中，組合物或配制劑包含重溶后濃度至少為約lg/L或更高的抗體或其片段。在其它實(shí)施方案中，重溶后的抗體濃度為至少約lg/L到約100g/L?？贵w或抗體片段的晶體和/或蛋白質(zhì)凝膠，或者包含這樣的晶體或蛋白質(zhì)凝膠的配制劑或組合物，可以單獨(dú)施用，作為藥物制品、個(gè)人保健(personalcare)制品或獸醫(yī)制品的一部分，或作為預(yù)防用制品的一部分施用，有或沒(méi)有佐劑。可以通過(guò)胃腸外、口服或局部途徑施用它們。例如，可以通過(guò)口服、肺、鼻、耳、肛門(mén)、皮膚、眼、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、粘膜、舌下、皮下、透皮、局部或顱內(nèi)途徑施用，或施用于口腔中。在藥物、個(gè)人保健或獸醫(yī)用途中，抗體或其片段的晶體，或其晶體配制劑或組合物，可局部施用于任何上皮表面。這樣的上皮表面包括口腔、眼、耳、肛門(mén)和鼻的表面，這些表面可通過(guò)施用抗體或其片段的晶體或其晶體配制劑或組合物而得到治療、保護(hù)、修復(fù)或解毒。本發(fā)明的另一個(gè)方面包括制品。制品包含組合物或配制劑，所述組合物或配制劑包含抗體或其片段的晶體或蛋白質(zhì)凝膠，以及容器。所述抗體或其片段優(yōu)選為抗VEGF、抗CD20、抗Apo-2、抗CD1la、抗HER2、抗IgE或其片段?？蛇x地，所述制品可包含關(guān)于對(duì)人施用以用于治療的說(shuō)明書(shū)。制品還可以包含抗體或其片段的晶體或蛋白質(zhì)凝膠的組合物或配制劑，以及多種用于檢測(cè)所述抗體或其片段與其特異抗原結(jié)合的診斷試劑。檢測(cè)抗體與其特異抗原結(jié)合的試劑包括針對(duì)所述抗體、用可檢測(cè)試劑標(biāo)記的抗體。所述可檢測(cè)試劑可包括熒光部分、放射性部分和酶部分。在一些實(shí)施方案中，制品包含抗體或其片段的晶體或蛋白質(zhì)凝膠的組合物或配制劑，以及容器。所述制品還可包含關(guān)于對(duì)人施用所述組合物或配制劑的說(shuō)明書(shū)。在其它實(shí)施方案中，所述制品還包含檢測(cè)所述抗體或其片段與其特異抗原結(jié)合的試劑。組合物或配制劑的用途包含抗體或其片段的晶體或蛋白質(zhì)凝膠的本發(fā)明組合物或配制劑可用于常規(guī)抗體制劑的任何用途。例如，組合物或配制劑可用于例如純化、濃縮、顯像、診斷和/或治療用途。在一些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)凝膠或凝膠中存在的晶體可用于局部施用，用作進(jìn)一步進(jìn)行結(jié)晶或純化的溶液，或作為儲(chǔ)存晶體的溶液。在一些實(shí)施方案中，所述組合物或配制劑包含抗VEGF抗體或其片段的晶體、結(jié)晶的抗VEGF抗體或其片段、或抗VEGF抗體或其片段的蛋白質(zhì)凝膠。這些組合物或配制劑在VEGF相關(guān)紊亂或病癥的診斷和治療方法中有用處。VEGF相關(guān)紊亂或病癥和診斷測(cè)定法在例如W098/45331中有描述?？筕EGF抗體可用于治療多種瘤性(neoplastic)和非瘤性疾病和紊亂。適于治療的瘤和相關(guān)病癥包括乳癌，肺癌，胃癌、食道癌、結(jié)腸直腸癌、肝癌、卵巢癌、泡膜細(xì)胞瘤、男性細(xì)胞瘤、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮內(nèi)膜增生、子宮內(nèi)膜異位癥、纖維肉瘤、絨毛膜癌、頭頸癌、鼻咽癌、喉癌、肝母細(xì)胞瘤、卡波西(Kaposi)肉瘤、黑色素瘤、皮16膚癌、血管瘤、海綿狀血管瘤、成血管細(xì)胞瘤、胰腺癌、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、許旺氏細(xì)胞瘤(Schwannoma)、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、髓母細(xì)胞瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤、骨源性肉瘤、平滑肌肉瘤、尿道癌、甲狀腺癌、維爾姆斯(Wilms)瘤、腎細(xì)胞癌、前列腺癌、瘢痣病相關(guān)的異常血管增殖、水腫(如與腦腫瘤相關(guān)的)，以及梅格斯(Meigs)綜合征。適于治療的非瘤性病癥包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病性或其它增殖性視網(wǎng)膜病包括早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病、晶體后纖維增生癥、新生血管性青光眼、與年齡相關(guān)的黃斑變性、甲狀腺增生(包括格雷夫斯(Graves)病)、角膜和其它組織移植、慢性炎癥、肺炎、腎炎綜合征、先兆子癇、腹水、心包積液(例如與心包炎相關(guān)的)，和胸腔積液。與年齡相關(guān)的黃斑變性(AMD)是在老年人群中造成嚴(yán)重視力喪失的主要原因。滲出形式的AMD的特征是脈絡(luò)膜新生血管形成和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞脫離。由于脈絡(luò)膜新生血管形成與急劇惡化的預(yù)后相關(guān)聯(lián)，本發(fā)明的VEGF抗體可望在降低AMD的嚴(yán)重程度中尤其起作用。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物或配制劑包含抗CDlla的晶體、結(jié)晶的抗CDlla、或抗CDlla的蛋白質(zhì)凝膠。這些組合物或配制劑在CDlla相關(guān)紊亂或病癥的診斷方法和治療方法中有用處。CDlla相關(guān)紊亂或病癥及診斷測(cè)定法在美國(guó)專利6，037，454中有描述，在此將其收入作為參考?？笴Dlla(LFA-l的a亞基)抗體可用來(lái)治療多種LFA-1介導(dǎo)的紊亂。淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原l(LFA-l;CD11a/CD18)涉及免疫應(yīng)答和炎癥的關(guān)鍵細(xì)胞相互作用中的白細(xì)胞黏附。術(shù)語(yǔ)"LFA-1介導(dǎo)的紊亂"指涉及淋巴細(xì)胞上LFA-1受體的細(xì)胞黏附相互作用導(dǎo)致的病理狀態(tài)。這樣的紊亂的例子包括T細(xì)胞炎性反應(yīng)，例如炎性皮膚病，包括銀屑??；炎性腸病相關(guān)反應(yīng)(例如克羅恩(Crohn)病和潰瘍性結(jié)腸炎)；成人呼吸窘迫綜合征；皮炎；腦膜炎；腦炎；葡萄膜炎；變應(yīng)性病癥例如濕疹和哮喘；涉及T細(xì)胞浸潤(rùn)和慢性炎性反應(yīng)的病癥；皮膚超敏反應(yīng)(包括野葛(poisonivy)和槲葉毒葛(poisonoak);動(dòng)脈粥樣硬化；白細(xì)胞黏附缺陷；自身免疫疾病例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)，糖尿病，多發(fā)性硬化，雷諾(Reynaud)綜合征，自身免疫性甲狀腺炎；實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎，斯耶格倫(Sjogren)綜合征，青少年型糖尿病，通常出現(xiàn)在結(jié)核病、結(jié)節(jié)病、多肌炎、肉芽腫病和血管炎中的與由細(xì)胞因子和T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的遲發(fā)的超敏反應(yīng)相關(guān)的免疫反應(yīng)；惡性貧血；慢性阻塞性肺病(C0PD);氣管炎；胰島炎(i固linitis);鼻炎；蕁麻疹；腎小球腎炎；涉及白細(xì)胞滲出的疾病；CNS炎性紊亂；敗血癥或外傷繼發(fā)的多器官損傷綜合征、自身免疫性溶血性貧血、重癥肌無(wú)力；抗原-抗體復(fù)合物介導(dǎo)的疾?。荒I病綜合征、惡性腫瘤(例如B細(xì)胞惡性腫瘤，如慢性淋巴細(xì)胞性白血病或毛細(xì)胞白血病)；所有類型的移植，包括移植物抗宿主或宿主抗移植物?。籋IV和鼻病毒感染；肺纖維化；腫瘤細(xì)胞侵入次級(jí)器官(secondaryorgan)等等。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物或配制劑包含抗HER2的晶體、結(jié)晶的抗HER2、或抗HER2的蛋白質(zhì)凝膠。這些組合物或配制劑可用于HER2相關(guān)紊亂或病癥的診斷方法和治療方法。HER2相關(guān)紊亂或病癥和診斷測(cè)定法在美國(guó)專利6，387，371中有記載，在此將其收入作為參考。對(duì)患者施用治療有效量的抗HER2受體抗體，通過(guò)抑制HER2受體的功能而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。Trastuzumab(Genentech，Inc.)是針對(duì)HER2胞外域的重組人源化單克隆抗體，用于治療HER2過(guò)表達(dá)/HER2基因擴(kuò)增的癌癥，特別是轉(zhuǎn)移性乳癌(MBC)。HER2基因也可在唾液腺腺癌、腎腺癌、乳腺癌、和胃癌細(xì)胞系中擴(kuò)增。該抗體還可以與其它治療劑例如紫杉醇(paclitaxel)或Tarceva⑧組合施用給患者。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物或配制劑包含抗CD20的晶體、結(jié)晶的抗CD20、或抗CD20的蛋白質(zhì)凝膠。這些組合物或配制劑可用于CD20相關(guān)紊亂或病癥的診斷方法和治療方法。CD20相關(guān)紊亂或病癥和診斷測(cè)定法在美國(guó)專利6，171，586和5，736，137中有記載，在此將其收入作為參考。CD20(又稱Bp35)由于其表達(dá)水平很高而成為靶向B細(xì)胞瘤相關(guān)疾病的目標(biāo)抗原。CD20是一種人類B細(xì)胞標(biāo)志物，其在前B細(xì)胞發(fā)育早期表達(dá)并保持到漿細(xì)胞分化。CD20分子可調(diào)節(jié)活化過(guò)程中細(xì)胞周期啟動(dòng)和分化所需要的步驟。因此，可以將CD20表面抗原作為目標(biāo)來(lái)治療B細(xì)胞淋巴瘤。C2B8是一種特異性免疫活性嵌合抗CD20抗體。利用C2B8進(jìn)行的治療性干預(yù)，清除或消減外周血和淋巴組織中的B細(xì)胞，作為去除B細(xì)胞淋巴瘤的手段，因?yàn)椴溉閯?dòng)物系統(tǒng)可容易且高效地恢復(fù)外周血B細(xì)胞。當(dāng)免疫系統(tǒng)存在外周血B細(xì)胞缺乏時(shí)，無(wú)需采取"非常"預(yù)防措施(即患者隔離等)，因?yàn)殪`長(zhǎng)類的主要免疫反應(yīng)是由T細(xì)胞介導(dǎo)的。C2B8也可以標(biāo)記上放射性標(biāo)記物，來(lái)摧毀目標(biāo)腫瘤細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物或配制劑包含抗Apo-2抗體的晶體、結(jié)晶的抗Apo-2抗體、或抗Apo-2抗體的蛋白質(zhì)凝膠。這些組合物或配制劑可用于治療紊亂例如癌癥?？笰po-2抗體的治療用途在美國(guó)專利6，252，050中有記載，在此將其收入作為參考。因此，本發(fā)明提供了使用抗體，例如交叉反應(yīng)性Apo-2L受體抗體來(lái)治療癌癥的方法。例如，可以利用激動(dòng)性(agonistic)Apo-2抗體在癌細(xì)胞中激活或剌激凋亡。當(dāng)然，認(rèn)為本發(fā)明的方法可以和其它的治療技術(shù)例如手術(shù)組合使用。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物或配制劑包含抗IgE抗體的晶體、結(jié)晶的抗IgE抗體、或抗IgE抗體的蛋白質(zhì)凝膠。這些組合物和配制劑可用于治療IgE介導(dǎo)的紊亂，例如變應(yīng)性紊亂和炎癥?？笽gE抗體的治療用途在美國(guó)專利6，329，509和5，994，511中有描述，在此將它們收入作為參考。在多種免疫成像和免疫測(cè)定程序中可以使用抗體和經(jīng)過(guò)標(biāo)記的抗體來(lái)檢測(cè)患者中癌癥的存在或監(jiān)測(cè)已診斷有癌癥的患者中該癌癥的狀態(tài)。當(dāng)用于監(jiān)測(cè)癌癥狀態(tài)時(shí)，必須使用定量的免疫測(cè)定程序。如果定期執(zhí)行這樣的監(jiān)測(cè)性測(cè)定并比較結(jié)果，可以做出關(guān)于該患者的腫瘤負(fù)荷(tumorburden)是上升還是下降的判斷?？梢允褂玫某Ｓ脺y(cè)定技術(shù)包括直接和間接測(cè)定法。如果樣品包含癌細(xì)胞，標(biāo)記抗體將與這些細(xì)胞結(jié)合。洗滌組織或細(xì)胞以去除未結(jié)合的標(biāo)記抗體后，檢查該組織樣品中帶標(biāo)記的免疫復(fù)合物的存在。在間接測(cè)定法中，將組織或細(xì)胞樣品與未標(biāo)記的單克隆抗體共同溫育。然后用針對(duì)所述單克隆抗體的標(biāo)記抗體(例如標(biāo)記抗鼠抗體)處理該樣品，洗滌，并檢查三元復(fù)合物的存在。盡管上文涉及了具體的實(shí)施方案，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不限于此。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，可以對(duì)公開(kāi)的實(shí)施方案做出多種變化而不改變本發(fā)明的總體概念。本發(fā)明的范圍意圖包括所有這些變化。在此明確地將說(shuō)明書(shū)中引用的所有參考文獻(xiàn)收入作為參考。實(shí)施例實(shí)施例1:抗VEGF抗體在不同濃度的氯化鋅和乙酸鈉中的溶解度18全長(zhǎng)和/或糖基化抗體的結(jié)晶可能是困難的。糖部分的大小、形狀和存在都是難以獲得抗體晶體的因素。可能需要考察有機(jī)和無(wú)機(jī)沉淀劑、緩沖劑和共溶質(zhì)(cosolute)的許多不同組合來(lái)尋找適于抗體結(jié)晶的條件?？疾炝巳L(zhǎng)糖基化VEGF抗體在不同濃度ZnCl2和NaOAc的溶液中的溶解度，以確定在這些條件下是否可以形成抗體蛋白質(zhì)晶體。材料和方法抗VEGF抗體的制備和純化一般地，抗VEGF抗體(bevaciz麗b)可以按W098/45331和Presta等人，Can.Res.，57:4593-4599所述制備，在此將其公開(kāi)內(nèi)容收入作為參考。下面對(duì)該過(guò)程作一般描述?？寺〔y(cè)序?qū)EGF特異的鼠源抗體，名為A4.6.1(Kunkel等人，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82:488-492)。使用合成的人輕、重鏈可變區(qū)共有序列生成計(jì)算機(jī)圖形模型，可使用InsightTM(Accelrys，Inc.SanDiegoCA)將鼠CDR輸入該模型。還生成了鼠源抗體A.4.5.1的VH和VL區(qū)的計(jì)算機(jī)模型來(lái)確定CDR的構(gòu)象。從F(ab)-l的質(zhì)粒模板構(gòu)建了編碼A4.6.1的所有F(ab)人源化變體的質(zhì)粒。質(zhì)粒pEMXl(Kunkel等人，1985Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82:488-492)含有編碼共有人VLP亞類I和VH亞類III的DNA片段。通過(guò)pEMXl(Kunkel等人，1985Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82:488-492)的定點(diǎn)誘變構(gòu)建人源化抗VEGF。編碼抗VEGF抗體的核酸序列在WO98/45331中提供。本文中描述了產(chǎn)生抗VEGF的方法的一個(gè)例子。為了表達(dá)穩(wěn)定的人源化IgGl變體(rhuMAbVEGF)，用為了共表達(dá)重鏈和輕鏈而設(shè)計(jì)的雙順?lè)醋虞d體轉(zhuǎn)染中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CH0)細(xì)胞(Lucas等人，1996NucleicAcidsRes.，24:1774-1779)。用脂轉(zhuǎn)染試劑(lipofectin)將質(zhì)粒導(dǎo)入DP12細(xì)胞，并選擇在不含甘氨酸/次黃嘌呤/胸苷(GHT)的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)(Chisolm等人，1996，DNACloning4.Mammaliansystems,pp.1—41，Oxford:OxfordUniversityPress)，其中DP12細(xì)胞是LChasin(ColumbiaUniversity,NewYork，NY)開(kāi)發(fā)的CH0-K1DUXBll細(xì)胞系的一種專有權(quán)所有的衍生物。隨機(jī)選擇20個(gè)未擴(kuò)增的克隆并重新接種到96孔板中。3天后用ELISA監(jiān)測(cè)各個(gè)集落的相對(duì)單位生產(chǎn)率(relativespecificproductivity)以定量各孔中積累的全長(zhǎng)人IgG。使用熒光染料CalceinAM作為每孔中活細(xì)胞數(shù)的替代標(biāo)志(surrogatemarker)。根據(jù)這些數(shù)據(jù)選擇數(shù)個(gè)未擴(kuò)增的克隆在存在遞增濃度的氨甲蝶呤下進(jìn)一步擴(kuò)增。選擇在存在10、50和lOOnM氨甲蝶呤下存活的個(gè)別克隆并轉(zhuǎn)移到96孔板中進(jìn)行生產(chǎn)率篩選。將一個(gè)可重復(fù)地顯示高單位生產(chǎn)率的克隆在T形瓶(T-flask)中擴(kuò)增，并用其接種旋動(dòng)培養(yǎng)物(spinnerculture)。傳代數(shù)次后，用適應(yīng)了懸浮的(suspension-adapted)細(xì)胞接種添加了多種激素和蛋白質(zhì)水解物的含GHT、無(wú)血清培養(yǎng)基中的生產(chǎn)培養(yǎng)物。收集含rhuMAb(重組人源化單克隆抗體)VEGF的細(xì)胞培養(yǎng)液并用蛋白A-Sepharose⑧CL-4B純化。此步驟后的純度為99%。然后先后用QSepharose⑧和CMSepharose⑥通過(guò)離子交換層析步驟進(jìn)行后續(xù)純化至均一。最終純化的抗體的內(nèi)毒素含量<0.10eu/mg。通過(guò)超濾和滲濾對(duì)純化的抗體進(jìn)行濃縮和進(jìn)一步純化。純化和/或濃縮的備選方法包括切向流過(guò)濾。結(jié)晶條件將如上述制備的抗VEGF在Milli-Q⑧水中透析并濃縮到84.4g/L。用6NHC1將1MNaOAc儲(chǔ)液的pH調(diào)節(jié)到5.7。用連續(xù)稀釋法制備緩沖液并用INNaOH將pH調(diào)節(jié)到pH5.7。ZnCl2的濃度范圍為5到lOOmM，NaOAc的濃度在10到lOOmM之間變化。透析結(jié)晶法使用半透性大小排阻膜，其保留蛋白質(zhì)但允許小分子(即緩沖劑和沉淀劑)自由地?cái)U(kuò)散通過(guò)該膜。透析法包括將一(1)毫升抗VEGF儲(chǔ)液注射到Slide-a-Lyzer⑧透析盒(Pierce,Rockford，II)中并在各儲(chǔ)液中于5。C透析過(guò)夜。在三天時(shí)間內(nèi)總共更換透析緩沖液3次。在各儲(chǔ)液中連續(xù)混合所述透析裝置，3天后回收所得物質(zhì)。為了回收所述物質(zhì)，小心切開(kāi)透析盒的膜，用無(wú)菌刮勺將凝膠溶液轉(zhuǎn)移到管中。測(cè)量從透析盒中回收的物質(zhì)的蛋白質(zhì)濃度以生成溶解度曲線。將蛋白質(zhì)濃度對(duì)Zn(^濃度作圖。題抗VEGF在ZnCl2和NaOAc，pH5.7中的溶解度曲線如圖1所示。當(dāng)ZnCl^農(nóng)度增加時(shí)，觀察到抗VEGF的溶解度下降。當(dāng)在含不同濃度ZnCl2的NaOAc緩沖液中透析抗VEGF時(shí)，發(fā)現(xiàn)透析盒中形成凝膠。凝膠開(kāi)始時(shí)呈云霧狀。在fC和室溫下透析25分鐘內(nèi)，在含低達(dá)2mMZnCl2的緩沖液中形成了帶有晶體的凝膠。用顯微鏡進(jìn)一步分析這些凝膠，在凝膠中觀察到了結(jié)晶物質(zhì)。凝膠中的晶體非常小且均勻。顯微鏡觀察時(shí)，凝膠中的晶體在正交偏光鏡(crosspolarizer)下顯示雙折射，說(shuō)明其是結(jié)晶物質(zhì)。先前考察過(guò)多種條件的結(jié)晶全長(zhǎng)糖基化抗體的能力，包括有機(jī)和無(wú)機(jī)沉淀劑連同多種緩沖劑和共溶質(zhì)。考察的許多條件沒(méi)有導(dǎo)致抗體晶體的形成(數(shù)據(jù)沒(méi)有顯示)。需要設(shè)計(jì)一種避免使用有機(jī)沉淀劑的結(jié)晶方法，對(duì)于要用于治療的抗體尤其如此。我們的研究顯示，可以利用NaOAc緩沖液中二價(jià)陽(yáng)離子例如以鹽例如ZnCl2形式的組合，在沒(méi)有任何有機(jī)沉淀劑的條件下形成全長(zhǎng)抗體的晶體。根據(jù)抗VEGF抗體在含不同濃度ZnCl2的NaOAc緩沖液中的溶解度，可以確定抗VEGF變?yōu)椴豢扇芏鴮?dǎo)致晶體產(chǎn)生時(shí)NaOAc中ZnCl2的濃度。在低濃度的ZnCl2下，觀察到游離晶體。增加ZnCl2濃度則形成含晶體的凝膠。溶解度研究的結(jié)果決定了下一個(gè)實(shí)施例中用于分批結(jié)晶研究的濃度范圍。實(shí)施例2:用氯化鋅和乙酸鈉結(jié)晶抗VEGF如實(shí)施例1中所述，用不同濃度ZnCl2和NaOAc的溶液透析抗VEGF溶液時(shí)，抗VEGF在特定的濃度變?yōu)椴豢扇?，并?dǎo)致晶體和/或凝膠的形成。在透析條件和分批條件下對(duì)用不含有機(jī)沉淀劑的ZnCl2和NaOAc溶液結(jié)晶抗VEGF進(jìn)行了研究。對(duì)所得晶體作了進(jìn)一步表征。在分批條件下結(jié)晶是想要的，因?yàn)檫@些條件可以放大為大規(guī)模生產(chǎn)。材料和方法結(jié)晶方法和分析通過(guò)離心超濾將抗VEGF從36g/L濃縮到84.4g/L，并在Milli-Q⑧水中透析，以制備抗VEGF。所得抗VEGF的濃度為84.4g/L，通過(guò)透析或以分批方式將其與不同濃度的ZnCl2和NaOAc—起溫育。通過(guò)測(cè)量280nm的吸光度來(lái)測(cè)定抗VEGF的濃度。如下制備4種ZnCl2和NaOAc的結(jié)晶儲(chǔ)液1:10mMZnCl2，lOOmMNaOAc，pH5.72:50mMZnCl2，lOOmMNaOAc，pH5.73:50mMZnCl2，10mMNaOAc，pH5.74:50mMZnCl2，用氫氧化鈉將pH調(diào)節(jié)到5.7ZnCl2和NaOAc濃度的組合如表la所示。為了進(jìn)行透析法，將一(1)毫升抗VEGF儲(chǔ)液置于Slide-a-Lyzer⑧透析裝置(Pierce,Rockford，IL)中，并在各個(gè)儲(chǔ)液中透析。在各個(gè)儲(chǔ)液中連續(xù)混合透析裝置，5天后將所得物質(zhì)從裝置中刮出并置于印pendorf管中。還使用"分批"方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。分批法開(kāi)始時(shí)，將0.75mL抗VEGF儲(chǔ)液以1:1的比例(即0.75mL)與各種結(jié)晶儲(chǔ)液加入印pendorf管。將各管每天翻轉(zhuǎn)2次以提供溫和的混合。將管保持在環(huán)境溫度并翻轉(zhuǎn)兩次達(dá)5天。表la條件#ZnCl2(mM)Na0AcpH5.7(mM)方法抗VEGF(g/L)規(guī)模(mL)110100透析84.41250100透析84.4135010透析84.414500透析84.415550分批42.21.562550分批42.21.57255分批42.21.58250分批42.21.5^本白勺、薩竟條回收所述物質(zhì)后，用顯微鏡分析晶體在存在和不存在雙折射光時(shí)的形態(tài)。使用雙折射光來(lái)區(qū)別結(jié)晶的固體和固態(tài)沉淀物。使光通過(guò)兩個(gè)偏振片之間來(lái)進(jìn)行分析。一個(gè)濾光片置于樣品下方，另一個(gè)濾光片置于樣品上方。如果樣品不是結(jié)晶的，兩個(gè)偏振片會(huì)阻擋光線到達(dá)觀察者。如果樣品是結(jié)晶的，它將會(huì)使光線偏折，允許其穿過(guò)第二個(gè)濾光片而進(jìn)入觀察者的眼睛。為了用顯微鏡分析晶體，將樣品置于載玻片上并以不同放大倍數(shù)觀察晶體。使用了其它方法來(lái)測(cè)試該固體物質(zhì)，包括用Izit染料染色以及壓扁/破碎測(cè)試(crush/cracktest)。壓扁/破碎測(cè)試不是決定性的，因?yàn)榇蠖鄶?shù)結(jié)晶物質(zhì)太小而無(wú)法測(cè)定壓扁/破碎比。Izit染料結(jié)果也不可靠，因?yàn)橛^察到很多假陰性和假陽(yáng)性。題結(jié)果在表lb和lc中顯示表lb顯示在表la給出的不同條件下，樣品于第1、2和5天的目測(cè)觀察結(jié)果。表lb<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>這些結(jié)果顯示，使用ZnCl2和NaOAc的組合在透析和分批方法中都使得抗VEGF結(jié)晶。研究的每種條件都使抗VEGF在接觸沉淀劑溶液后立即發(fā)生相變。在每種含ZnCl2和NaOAc的條件下都觀察到了顯示雙折射的固體，表明在每種這些條件下都形成了晶體。在某些情況中，觀察到的晶體位于抗VEGF的凝膠狀相中。在某些情況中，不能從凝膠分離晶體，因此不能確定無(wú)疑的證明它們是抗VEGF晶體。這些晶體形成錐體樣或花朵型的結(jié)構(gòu)。該實(shí)施例顯示，通過(guò)使用ZnCl2和NaOAc的透析或分批方法，不使用有機(jī)沉淀劑，可以產(chǎn)生抗VEGF晶體。圖2a-2f顯示了雙折射和非雙折射光下的代表性圖像。圖2a是存在5mMZnCl2和lOOmMNaOAc，pH5.7時(shí)形成的抗VEGF晶體在非雙折射光下200倍放大倍數(shù)的圖像。圖2b是存在5mMZnCl2和lOOmMNaOAc，pH5.7時(shí)形成的抗VEGF晶體在雙折射光下200倍放大倍數(shù)的圖像。圖2c是存在25mMZnCl2和10mMNaOAc，pH5.7時(shí)形成的抗VEGF晶體在非雙折射光下200倍放大倍數(shù)的圖像。圖2d是存在25mMZnCl2和10mMNaOAc，pH5.7時(shí)形成的抗VEGF晶體在雙折射光下200倍放大倍數(shù)的圖像。圖2e是存在10mMZnCl2和lOOmMNaOAc，pH5.7時(shí)形成的抗VEGF晶體在非雙折射光下200倍放大倍數(shù)的圖像。圖2f是存在10mMZnCl2和lOOmMNaOAc，pH5.7時(shí)形成的抗VEGF晶體在雙折射光下200倍放大倍數(shù)的圖像。實(shí)施例3:不同的結(jié)晶條件如前所述的，在不同的ZnCl2和NaOAc濃度下結(jié)晶了抗VEGF抗體。其它結(jié)晶條件可能影響結(jié)晶抗VEGF的能力或抗VEGF晶體的產(chǎn)率。檢查了pH、溫度和二價(jià)陽(yáng)離子種類的改變對(duì)結(jié)晶抗VEGF的影響。材料和方法通過(guò)10kD再生纖維素膜上的超濾和滲濾制備溶于Milli-Q⑧水的87g/L抗VEGF儲(chǔ)液。每個(gè)樣品包含l:1比例的蛋白質(zhì)溶液和緩沖劑溶液，從而抗VEGF的終濃度為43.5g/L。通過(guò)將合適量的固體溶于Milli-Q水并用無(wú)菌級(jí)濾器過(guò)濾溶液來(lái)制備1MZnCl2、氯化鈣(CaCl2)和MgC^的儲(chǔ)液。通過(guò)添加合適量的三水合乙酸鈉和冰乙酸到Milli-Q⑧水中并通過(guò)無(wú)菌級(jí)濾器過(guò)濾來(lái)制備1M的NaOAc，pH4.7和NaOAc，pH5.7的儲(chǔ)液。通過(guò)加入合適量的水、二價(jià)離子儲(chǔ)液、緩沖劑儲(chǔ)液和蛋白質(zhì)儲(chǔ)液來(lái)準(zhǔn)備溶液條件。蛋白質(zhì)儲(chǔ)液總是在最后加入。在兩個(gè)不同的pH和溫度考察ZnCl2、MgCl2、CaCl2和NaOAc的濃度的組合。ZnCl2的濃度范圍為5到100mM，NaOAc的范圍為10到100mM。在10mM的NaOAc中MgCl2的濃度范圍為5到100mM。在10mM的NaOAc中CaCl2的濃度范圍為5到lOOmM。使用分批方法的結(jié)晶按照實(shí)施例2所描述的進(jìn)行，但各批的樣品體積為1ml。題結(jié)果如表2所示。ZnCl2和NaOAc的組合可有效地形成全長(zhǎng)抗VEGF抗體的晶體和/或帶有晶體的凝膠。通過(guò)雙折射光的折射確定了所述固體物質(zhì)對(duì)結(jié)晶物質(zhì)為陽(yáng)性。通過(guò)測(cè)量280nm的吸光度測(cè)定上清液中的抗VEGF濃度。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>所有所述ZnCl"NaOAc組合都產(chǎn)生了凝膠中的或游離于溶液中的抗VEGF晶體。在這些條件下，氯化鎂和乙酸鈉溶液對(duì)抗VEGF沒(méi)有顯示任何效果(數(shù)據(jù)未顯示)。氯化鈣和乙酸鈉溶液，在lOOmMCaCl2，10mMNaOAc，pH4.7，4。C溫育的條件下產(chǎn)生了抗VEGF的晶體(數(shù)據(jù)未顯示)。將lOOmMZnCl2，10mMNaOAc，pH5.7，室溫溫育形成的結(jié)晶物質(zhì)從溶液中分離。用20mMNaOAc，20mMZnCl2，pH5.7洗滌晶體3次，并將晶體溶于水。在SDSPAGE上運(yùn)行不同量的重溶于水的晶體，并與結(jié)晶前的抗VEGF比較。也檢測(cè)了晶體的洗滌液中抗VEGF的存在。結(jié)果如圖5所示。該結(jié)果顯示所述洗滌液對(duì)任何抗VEGF為陰性，而重溶的晶體確實(shí)具有抗VEGF。晶體的量增加導(dǎo)致檢測(cè)到的抗VEGF增加。還通過(guò)質(zhì)譜來(lái)分析重溶的抗VEGF并與對(duì)照抗VEGF比較。完整抗體的MALDI-TOF質(zhì)譜通常在150kDa處顯示寬的峰，且不易將一種抗體與其它抗體區(qū)別開(kāi)來(lái)。但是，還原的抗體的質(zhì)譜對(duì)輕鏈顯示高靈敏度。由于每種抗體產(chǎn)物的輕鏈的質(zhì)量是獨(dú)特的，用TCEP還原樣品，并在線性正模式(linearpositivemode)下分析。為了說(shuō)明濃度的差異，用芥子酸基質(zhì)溶液將最先的兩個(gè)樣品稀釋50倍，接下來(lái)的兩個(gè)樣品稀釋10倍，并在室溫用TCEP還原(2小時(shí))。將樣品點(diǎn)在板上，風(fēng)干，用冷的O.1XTFA洗滌，并獲取質(zhì)譜。抗VEGF輕鏈的分子質(zhì)量是23433Da，MALDI-TOF質(zhì)譜在這個(gè)質(zhì)量范圍通常顯示+/-0.05%的質(zhì)量準(zhǔn)確度。儲(chǔ)液和上清液的譜圖顯示類似的圖形，即來(lái)自單質(zhì)子化和雙質(zhì)子化輕鏈的強(qiáng)峰和來(lái)自帶兩個(gè)電荷的重鏈的弱峰(圖7D，A和C)。洗滌溶液(在分析的條件下)沒(méi)有顯示輕鏈的存在(圖7B)，而晶體溶液確實(shí)顯示了輕鏈的峰。通過(guò)MALDI-TOFMS分析來(lái)自所述晶體的天然Lys_C消化物顯示了許多抗VEGF相關(guān)峰(以及Lys-C自消化產(chǎn)物)。但是，來(lái)自第一次洗滌溶液的消化物也顯示了一些所述的抗VEGF相關(guān)峰(數(shù)據(jù)未顯示)。一般而言，MALDI-TOFMS對(duì)于消化物較之完整的蛋白質(zhì)顯示更高的靈敏度?？偠灾诰w中清楚地看到抗VEGF，但第一次洗滌液也可能含有少量抗VEGF。該結(jié)果顯示，來(lái)自晶體的重溶抗VEGF與對(duì)照抗VEGF具有相同的質(zhì)譜圖譜。實(shí)施例4:抗VEGF溶液的凝膠-液相的考察在含有抗VEGF晶體的溶液中已經(jīng)確認(rèn)了兩個(gè)相。它們包括游離在溶液中的晶體和可含有晶體的凝膠?？筕EGF上清濃度直接與存在的晶體相相關(guān)。當(dāng)存在凝膠時(shí)，可溶性抗VEGF的濃度通常少于約10g/L。但不存在凝膠時(shí)，可溶性抗VEGF的濃度通常上升到40g/L以上。通過(guò)改變pH5.7時(shí)的NaOAc濃度和ZnCl2濃度研究了結(jié)晶條件的抗VEGF的相空間(phasespace)。通過(guò)考察相空間，有可能確定溶液是在哪里從凝膠轉(zhuǎn)變?yōu)橐合嗟?。這可能有助于尋找最優(yōu)的結(jié)晶條件以改善晶體產(chǎn)率。材料和方法使用Milli-Q⑧水中的84.4g/L抗VEGF儲(chǔ)液和ZnCl2和NaOAcpH5.7的IM儲(chǔ)液作為這些lmL分批實(shí)驗(yàn)的成分。建立了二十二(22)個(gè)批次，每批的抗VEGF濃度為42.2g/L，ZnCl2和NaOAc濃度的范圍分別為5到lOOmM和10到100mM(見(jiàn)表3)。在保存于環(huán)境溫度條件的聚丙烯管中制備所述溶液。22批有不同的兩組進(jìn)行，一組不混合，一組每天翻轉(zhuǎn)兩次以提供溫和的混合。觀察這些管3周的時(shí)間。在這3周的起點(diǎn)和終點(diǎn)目測(cè)確定不混合組中所形成凝膠的百分率。21天后將這些管離心，并通過(guò)A280分析上清液中的抗VEGF濃度。題表3顯示了不混合組，或稱靜態(tài)組的22個(gè)樣品的結(jié)果。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>在混合組的管中，無(wú)法對(duì)％凝膠定量，因?yàn)槟z相沿著管壁鋪散開(kāi)來(lái)。但是，在21天的起點(diǎn)和終點(diǎn)，測(cè)定了溶液的狀態(tài)、透明、凝膠、游離固體、或凝膠+游離固體的直觀指示。21天后，將管離心，并通過(guò)A280分析上清液中的抗VEGF濃度。表4顯示了每天翻轉(zhuǎn)(混合)2次組的22個(gè)樣品的結(jié)果。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>在所有管中均有晶體形成。一些晶體游離于溶液中，一些在凝膠中。用ZnCl2濃度對(duì)Na0Ac濃度作圖來(lái)生成不混合樣品的相圖。該圖可見(jiàn)于圖3。圖4比較了混合和非混合實(shí)驗(yàn)的相圖?？偟膩?lái)看，圖1(來(lái)自實(shí)施例1)、3和4顯示，當(dāng)系統(tǒng)向相變點(diǎn)接近時(shí)，如果ZnCl2在40mM以上并混合管，則可溶性抗VEGF降低到約10-22g/L。當(dāng)管靜止且ZnCl2濃度為40mM或更少時(shí)，可溶性抗VEGF濃度少許減少乃至不減少。這可能讓人相信ZnCl2是可溶性抗VEGF減少的主導(dǎo)因素。當(dāng)ZnCl2濃度少于10mM或大于80mM時(shí)，NaOAc的影響減少。當(dāng)ZnCl2濃度靠近轉(zhuǎn)變點(diǎn)(25-60mM)時(shí)，NaOAc濃度對(duì)可溶性抗VEGF濃度的影響似乎增大。實(shí)施例5:其它抗體的結(jié)晶現(xiàn)有技術(shù)中全長(zhǎng)抗體的結(jié)晶條件通常利用有機(jī)沉淀劑如PEG、MPD或丙醇。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)(見(jiàn)前面的實(shí)施例)，全長(zhǎng)抗體例如抗VEGF可以在沒(méi)有這些有機(jī)沉淀劑時(shí)的結(jié)晶。我們考察了其它全長(zhǎng)抗體是否能在存在NaOAc(pH4.7;pH5.7)、HEPES(pH7.5)或Tris(pH9.0)時(shí)用二價(jià)陽(yáng)離子結(jié)晶。材料和方法考察的單克隆抗體為抗HER2、抗CDlla、抗CD20(C2B8)和抗VEGF(Genentech，SouthSanFrancisco,CA)。美國(guó)專利5，736，137、6，387，371和6，037，454，及WO98/45331描述了具有這些特異性的抗體的制備和表征。使用三類層析，然后進(jìn)行超濾和滲濾來(lái)純化抗體，類似于實(shí)施例1中描述的純化步驟。在Milli-Q⑧水中透析所述單克隆抗體以產(chǎn)生大約80-100mg/mL的所得濃度。通過(guò)將1份抗體溶液與1份每種合適溶液合并以分批模式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。最終的樣品體積為1到2mL。將樣品儲(chǔ)存在6mL聚丙烯管中。所用的二價(jià)鹽是ZnCl2、CaCl2和MgCl2。所用緩沖液的最終濃度和pH分別為10mMNaOAc，pH4.7;10mMNaOAc，pH5.7;10mMHEPES(4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙烷-磺酸)，pH7.5，禾口10mMTris(trishydroxymethylamino-ethane)，pH9.0。含有Tris緩沖溶液的樣品在環(huán)境溫度保存，含有其它緩沖液的樣品在2-8°C的溫度保存。每天目視檢查這些樣品。如果儲(chǔ)存3天后沒(méi)有觀察到固體物質(zhì)則將溫度完全調(diào)換根據(jù)樣品原來(lái)的儲(chǔ)存條件，將樣品轉(zhuǎn)到2-8t:或室溫。如果再過(guò)3天仍沒(méi)有觀察到固體物質(zhì)，則將樣品保存在2-『C并每周監(jiān)測(cè)一次。對(duì)有固體物質(zhì)的樣品，在正交偏光鏡下觀察以確定雙折射。題在測(cè)試的條件下，對(duì)于抗CD40分子沒(méi)有觀察到晶體(數(shù)據(jù)未顯示)。ZnCl2與抗CD20(C2B8)分子的結(jié)果如表5所示。根據(jù)雙折射，觀察到的所有固體都不是結(jié)晶的。但是在某些情形中形成了蛋白質(zhì)凝膠。CaCl2和MgCl2與抗CD20(C2B8)分子在測(cè)試的條件下沒(méi)有觀察到晶體(數(shù)據(jù)未顯示)。表中的N/a表示上清液的280nm吸光度沒(méi)有測(cè)定。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>ZnCl2與抗HER2分子的結(jié)果如下面表6所示。根據(jù)雙折射確定，在下述的條件下形成的所有固體都不是結(jié)晶的。CaCl2和MgCl2與抗HER2分子在測(cè)試條件下沒(méi)有觀察到晶體(數(shù)據(jù)未顯示)。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>抗CDlla分子和ZnCl2的結(jié)果如下面表7所示。根據(jù)雙折射確定，在這些條件下形成的所有固體對(duì)晶體形成都為陰性。CaCl2或MgCl2與抗CDlla在測(cè)試條件下沒(méi)有觀察到晶體(數(shù)據(jù)未顯示)。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>抗VEGF分子與ZnCl2的結(jié)果如表8所示，抗VEGF與MgCl2的結(jié)果如表9所示。在這些條件下形成了晶體和凝膠。根據(jù)雙折射光，并非所有的沉淀物都是對(duì)結(jié)晶物質(zhì)為陽(yáng)性的。CaCl2和抗VEGF分子在測(cè)試條件下沒(méi)有觀察到晶體(數(shù)據(jù)未顯示)。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>表9<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>從上面的結(jié)果可見(jiàn)，似乎較高ZnCl2和NaOAc濃度的組合，以及pH4.7和5.7誘導(dǎo)抗HER2、抗CD20(C2B8)和抗CDlla的相從可溶性抗體到抗體凝膠的轉(zhuǎn)變。所有ZnCl2/NaOAc組合當(dāng)施加于抗VEGF時(shí)都產(chǎn)生了晶體。在pH7.5和pH9.0只考察了MgCl2和CaCl2(CaCl2的數(shù)據(jù)未顯示)?；谏厦娴慕Y(jié)果，在室溫、10mMTris，50mMMgCl2，pH9.0，以及室溫和2_8°C、10mMTris，lOOmMMgCl2，pH9.0的條件下，觀察到了抗VEGF的結(jié)晶。實(shí)施例6:沉淀劑在結(jié)晶條件中的使用我們對(duì)抗VEGF沉淀?xiàng)l件中是否可摻入添加劑進(jìn)行了考察。使用的結(jié)晶條件是10mMZnCl2禾P10mMNaOAc，pH5.7。已經(jīng)證明用10mMZnCl2和10mMNaOAc，pH5.7進(jìn)行結(jié)晶產(chǎn)生了抗VEGF晶體。為了嘗試提高產(chǎn)率，將三種最有效的有機(jī)沉淀劑(通過(guò)篩選確定的)加入結(jié)晶緩沖液中。測(cè)試的沉淀劑是購(gòu)自HamptonResearch的(+/-)_2_甲基_2，4_戊二醇(MPD)，購(gòu)自HamptonResearch的聚乙二醇(PEG)3350，和購(gòu)自HamptonResearch的丙醇。將每種沉淀劑加到裝有抗VEGF(Genentech，SouthSanFrancisco,CA)的Mi11i-Q水溶液的聚丙烯管中，得到的終濃度為42.4g/L抗VEGF，10mMZnCl2，10mMNaOAc，pH5.7;沉淀劑的百分率如下面的表10所示。將聚丙烯管置于環(huán)境溫度并每天翻轉(zhuǎn)以提供溫和的混合。2周后，收集上清液樣品并通過(guò)A280分析抗VEGF濃度。題結(jié)果如表IO所示。34<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>在所有批次的管中都目測(cè)觀察到了晶體。所有聚丙烯管中測(cè)得的上清液濃度為41到53g/L。發(fā)生了結(jié)晶，但結(jié)晶似乎不因添加這些沉淀劑而增加。圖6顯示對(duì)于三種不同沉淀劑，上清液濃度與沉淀劑濃度的函數(shù)關(guān)系?？梢源_定，相對(duì)于使用10mMZnCl2，10mMNaOAc，pH5.7時(shí)的產(chǎn)率，添加MPD、PEG3350或丙醇似乎并不顯著提高產(chǎn)率。實(shí)施例7:其它單克隆抗體的結(jié)晶我們考察了ZnCl2和NaOAc混合物是否可用作單克隆抗體的通用結(jié)晶條件。本文已確定的抗VEGF結(jié)晶條件中不包含聚乙二醇。文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)的所有其它條件在其結(jié)晶過(guò)程中都用到了聚乙二醇。在過(guò)去的實(shí)驗(yàn)中，其它抗體在這些條件影響下從溶液中形成凝膠(gelling)或沉淀出來(lái)。在此實(shí)驗(yàn)中，為了研究抗體的相空間并確定結(jié)晶條件，對(duì)更高的ZnCl2濃度進(jìn)行了研究。材料和方法比較的抗體為抗HER2、抗CDlla、抗2C4、抗CD20(2H7)、抗CD20(C2B8)和抗VEGF。將所有這些抗體在Milli-Q⑧水中透析并濃縮到100mg/mL。以分批模式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將1份抗體溶液與1份溶液合并。最終的樣品體積為約3-5mL，且樣品儲(chǔ)存在6mL的聚丙烯管中，沒(méi)有任何蛋白質(zhì)對(duì)照。在環(huán)境溫度和約2-『C儲(chǔ)存樣品。每天檢查一次樣品。如果儲(chǔ)存3天后沒(méi)有觀察到晶體或沉淀，則將溫度完全調(diào)換根據(jù)樣品原來(lái)的儲(chǔ)存條件，將樣品轉(zhuǎn)到2-『C或室溫。如果再過(guò)3天仍沒(méi)有觀察到任何東西，則將樣品保存在2-『C并每周監(jiān)測(cè)一次。各溶液具有不同的ZnCl2、CaCl2和MaCl2濃度，所有溶液都有0.OlMNaOAc，pH為4.7或5.7。題ZnCl2中抗VEGF分子的結(jié)果如表11所示。在這些條件下使用MaCl2或CaCl2沒(méi)有觀察到晶體(數(shù)據(jù)未顯示)表ll<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>在任何測(cè)試的條件下，抗CD20(C2B8)和抗2C4分子的結(jié)果沒(méi)有顯示晶體或凝膠的形成(數(shù)據(jù)未顯示)?？笴D20(2H7)分子的結(jié)果在下面的表12(ZnCl》、表13(CaCl2)和表14(MgCl2)中顯示。在許多情況中形成了蛋白質(zhì)凝膠。根據(jù)雙折射的確定，沉淀的物質(zhì)不是結(jié)晶的。表12<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>抗CDlla分子的結(jié)果如下表16(ZnCl》所示。在這些條件下使用MgCl2或CaCl2沒(méi)有觀察到晶體(數(shù)據(jù)未顯示)。表16<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>這些結(jié)果表明，不同抗體當(dāng)接觸ZnCl2和NaOAc時(shí)，可形成晶體或凝膠。權(quán)利要求組合物，其包含抗VEGF、抗CD20、抗CD11a、抗CD40、抗HER2、抗Apo-2或抗IgE抗體、或其片段的凝膠，以及載體。2.配制劑，其包含抗VEGF、抗CD20、抗CD1la、抗CD40、抗HER2、抗Apo_2或抗IgE抗體、或其片段的凝膠，以及至少一種成分。3.制備抗體或其片段的蛋白質(zhì)凝膠的方法，其包括a)使抗體或其片段接觸包含約1到120mM的二價(jià)陽(yáng)離子鹽和約1到lOOmM的緩沖劑的溶液；并b)將所述抗體或其片段與所述溶液共同溫育直到形成所述抗體或其片段的蛋白質(zhì)凝膠。4.權(quán)利要求3的方法，其中所述抗體或其片段是抗VEGF、抗CD20、抗CDlla、抗CD40、抗HER2、抗Apo-2或抗IgE抗體、或其片段。5.權(quán)利要求3的方法，其中所述抗體是多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、親和力成熟的抗體、雙特異性抗體、多特異性抗體、人源抗體或人源化抗體。6.權(quán)利要求3的方法，其中所述抗體是選自Fab、Fab'、Fab2、Fab'2、Fd、Fd'、scFv、ScFv2、dAb、缺鉸鏈抗體、線性抗體和雙抗體的抗體片段。7.權(quán)利要求1的組合物或權(quán)利要求2的配制劑在制備用于治療哺乳動(dòng)物中VEGF相關(guān)病癥的藥物中的用途。全文摘要本發(fā)明涉及抗體或其片段的結(jié)晶。本公開(kāi)涉及抗體或抗體片段的結(jié)晶和/或濃縮方法。所述方法包括使抗體或抗體片段與包含二價(jià)陽(yáng)離子鹽的溶液接觸?？贵w或抗體片段的晶體和/或蛋白質(zhì)凝膠可用于組合物和配制劑。文檔編號(hào)A61P19/00GK101721701SQ200910222868公開(kāi)日2010年6月9日申請(qǐng)日期2005年7月22日優(yōu)先權(quán)日2004年7月23日發(fā)明者安妮特·M·C·哈格威斯徹,朱莉·富卡米,瑪麗·E·M·克倫威爾,雷切爾·B·丁格斯申請(qǐng)人:健泰科生物技術(shù)公司