專利名稱：Morphine作為抗氧化應(yīng)激損傷劑的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及Morphine作為抗氧化應(yīng)激損傷劑在藥物中的應(yīng)用，確切地說涉及Morphine的醫(yī)藥新用途，屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
嗎啡(Morphine)是鴉片中最主要的生物堿，低濃度的嗎啡可以保護神經(jīng)細(xì)胞免受缺血再灌注的損傷。使用嗎啡預(yù)處理后進行缺血再灌注，神經(jīng)元存活率得到明顯提高。這種保護作用是通過鴉片受體的激活實現(xiàn)的(Li m， YJ， Zheng， S and Zuo， Z. Morphinepreconditions Purkinje cells against cell death under in vitrosimulatedischemiar印erfusion conditions. Anesthesiology2004 ;100 :562-568)。所以，嗎口非對神經(jīng)元的保護作用可能對臨床醫(yī)療有非常積極的作用。然而，嗎啡保護神經(jīng)元免于1 +的作用尚未報道。 MPP+是1-甲基-4-苯基_1，2，3，6-四氫妣啶(l-methyl-4-phenyl-l，2， 3， 6-tetrahydropyridine， MPTP)經(jīng)過單胺氧化酶B (MA0-B)催化后生成的具有細(xì)胞毒性的活性代謝產(chǎn)物，它與線粒體復(fù)合物-I結(jié)合抑制其活性，使細(xì)胞線粒體ATP的下降和膜電位的破壞，最終導(dǎo)致線粒體功能障礙和氧自由基生成增加，細(xì)胞凋亡。MPP+通常用來做帕金森病的細(xì)胞模型，MPP+抑制PC12細(xì)胞的生長增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(Jie Bai， Hajime Nakamura， Shugo Ueda， Yong-Won Kwon， Toru Tanaka，SadayukiBan， and Junji YodoiProteasome—d印endent Degra—dation of Cyclin Dlinl_Methyl_4_phenylpyridinium Ion(MPP+)-induced Cell Cycle Arrest. J. Biol.Chem. ，2004 ;279 :38710-38714.)。 硫氧還蛋白(thioredoxin， Trx)是 一 種普遍存在于原核生物和真核生物中的小分子蛋白質(zhì)，它與NAPDH和硫氧還蛋白還原酶共同組成細(xì)胞內(nèi)主要的氧化還原系統(tǒng)。Trx-1是生物體所必須的基因，如果選擇性地敲除小鼠的Trx-1基因，會造成小鼠早期胚月臺致死(Matsui M. ， 0shima M. ， 0shima H. ， Takaku K. ， Maruyama T. ， Yodoi J.，and Taketo M.M.Early embryonic lethality caused by targeteddisruption of themouse thior-edoxin gene. Dev. Biol. 1996， 178 :179-185)。作為細(xì)胞內(nèi)的抗氧化劑，Trx-1能保護細(xì)胞、減輕氧化應(yīng)激所致的損傷，并且能抑制p38MAPK和凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1活性，增強細(xì)胞的抗凋亡能力(Saito M. ， Nishitoh， H. ， Fujii， M. ， Takeda， K. ， Tobi聽，K. ， Sawada， Y. ， Kawabata， M. ， Miyazono， K. ， and Ichijyo， H. Mammalian thioredoxinis a direct inhibitorof apoptosis signal-regulating kinase(ASK)1. EMBO，1998，17 :2596—2606 ;Hashimoto S. ， Mats咖oto K. ， Gon Y. ， Furuichi S. ， Maruoka S.，Takeshita I. ， Hirota K. ， Yodoi J. ， and Horie T. Thioredoxin negatively regulatesp38 MAPkinase activation and IL_6 production by tumor necrosis factor—alpha.Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999， 258 :443-447)。至U目前為止，Trx與人類疾病有關(guān)的研究很多，Trx具有保護神經(jīng)元抑制帕金森病的作用(Thioredoxinsu卯resses 1_methyl_4_phenylpyridinium_induced neurotoxicity in rat PC12cells. Bai J，Nakamura H， Hattori I， Tanito M， Yodoi J.Neurosci Lett.2002Mar 15 ;321 (1-2):81_4. Does thioredoxin—lprevent mitochondria—andendoplasmic reticulum—mediatedneurotoxicity of l_methyl_4_phenyl_l，2，3，6-tetrahydropyridine7 Bai J，Nak咖uraH， Kwon YW， Tanito M， Ueda S， Tanaka T， Hattori I， Ban S， Momoi T， Kitao Y， 0gawa S，Yodoi J Antioxid RedoxSignal. 2007 9(5) :603-8)。 迄今為止，現(xiàn)有技術(shù)中未見Morphine保護神經(jīng)元免受MPP+損傷的作用的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供Morphine的醫(yī)藥新用途，涉及Morphine作為促進神經(jīng)細(xì)胞生長劑、促進Morphine細(xì)胞生長劑、抗氧化應(yīng)激損傷劑、PC12細(xì)胞免于帕金森病毒性物損傷劑的應(yīng)用，以及Morphine在制備治療帕金森病的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的上述目的是用下面的技術(shù)方案得以實現(xiàn)的
Morphine作為抗氧化應(yīng)激損傷劑的應(yīng)用。 本發(fā)明經(jīng)四噻唑藍(MTT)法，發(fā)現(xiàn)Morphine能促進大鼠腎上腺嗜鉻瘤細(xì)胞(PC12細(xì)胞)的生長。Morphine具有促進神經(jīng)細(xì)胞增殖的活性，并且抑制帕金森毒性物MPP+(l-Methyl-4-Phenylpyridinium ion)導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞的損傷；蛋白質(zhì)免疫印跡法表明，Morphine可以誘導(dǎo)PC12細(xì)胞中硫氧還蛋白的表達水平。因此，Morphine保護神經(jīng)細(xì)胞免于MPP+毒性與誘導(dǎo)硫氧還蛋白表達有關(guān)。


圖1 :四噻唑藍(MTT)法測定morphine對PC12細(xì)胞的存活率的影響； 圖2 :四噻唑藍(MTT)法測定morphine對MPP+剌激的PC12細(xì)胞的保護作用； 圖3 :Western Blot檢測morphine對MPP+剌激的PC12細(xì)胞Trx蛋白表達的影響。
具體實施例方式
下面用本發(fā)明的實施例來進一步說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此來限定本發(fā)明。 實施例1 :把Morphine (Morphine購自沈陽第一制藥廠)250mg，溶于1000ml水中制成0. 25%濃度的水溶液加熱溶解，混合均勻后，裝入藥瓶中密封，消毒制成產(chǎn)品。
實施例2 :把Morphine (Morphine購自沈陽第一制藥廠)125mg，溶于1000ml水中制成0. 125%濃度的水溶液加熱溶解，混合均勻后，裝入藥瓶中密封，消毒制成產(chǎn)品。
實施例3 :把Morphine (Morphine購自沈陽第一制藥廠)2500mg，溶于1000ml水中制成水溶液，加熱溶解，混合均勻后，分裝成5mg/2ml/支濃度的注射液于藥瓶密封，消毒制成產(chǎn)品。 實施例4 :把Morphine (Morphine購自沈陽第一制藥廠)1500mg，溶于1000ml水中制成水溶液，加熱溶解，混合均勻后，分裝成3mg/2ml/支濃度的注射液于藥瓶密封，消毒制成產(chǎn)品。
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實施例5 :把Morphine (Morphine購自沈陽第一制藥廠)5000mg，溶于1000ml水中制成水溶液，加熱溶解，混合均勻后，分裝成10mg/2ml/支濃度的注射液于藥瓶密封，消毒制成產(chǎn)品。 實施例6 :取100克Morphine (Morphine購自沈陽第一制藥廠)、560克微晶纖維素、380克無水乳糖、200克硬脂酸鎂、30克氧化硅，按公知的制片技術(shù)和裝備制成片劑，即取上述配方中除硬脂酸鎂外所有成分混合25-30分鐘，再篩入硬脂酸鎂，繼續(xù)混勻，爾后用12/32英寸(約1. 03cm)標(biāo)準(zhǔn)凹沖壓成片。 下面結(jié)合附圖，用本發(fā)明的試驗例來證明本發(fā)明的藥理效果，描述本發(fā)明的具體實驗方法，但并不以此來限定本發(fā)明，本發(fā)明的內(nèi)容不局限于此。通過下列實驗證明Morphine能促進PC12細(xì)胞生長和保護PC12細(xì)胞免于帕金森病毒性物損傷。
下述的試驗例所用的試劑、儀器為 細(xì)胞用PC12細(xì)胞大鼠腎上腺嗜鉻瘤細(xì)胞，購自中國科學(xué)院昆明動物所。
藥品及主要試劑 Morphine購自沈陽第一制藥廠；MPP+購自美國sigma公司；一抗Anti-mouseTrx，由日本京都大學(xué)淀井溶司教授提供；一抗Anti-mouse P-actin購自santa ;ProteinMarker購自Fermentas公司；RPMI Medium 1640購自Invitrogencorporation ;蛋白質(zhì)定量試劑盒(BCA法)購自Bio-Rad公司；Chemiluminesentsubstrate購自生物晶美公司;PVDF膜購自Millipore公司；TRIS Base購自N0V0N公司;Acrylamide購自Solarbio公司；十二焼基硫酸納購自xiamen sanlandchemicals company limited ;瓊月旨糖、考馬斯亮藍R_250、 Aprotimin、 PMSF禾口 NP_40，均購自Sanland-chem International InC ;TEMED購自HUALVYUAN BIOTECHNOLOGY ;X射線膠片購自中國樂凱膠片集團公司；二抗affinity purified antibodyperoxidase labled goat anti-mouse lgG(H+L)HSA liquidconjugate禾口 affinitypurified antibody peroxidase labled goat Miti-rabbitlgG(H+L)HSA liquidconjugate，購自美國Kirkegaard & laboratories ;四噻唑藍(MTT)購自美國Promega公司。
主要實驗儀器 BHC-1300II A/B3生物安全柜，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司生產(chǎn)；TS100生物倒置相差顯微鏡，日本NIKON公司生產(chǎn)；C02培養(yǎng)箱，美國NBS公司生產(chǎn)；TS-1脫色搖床，金紜市杰瑞爾電器有限公司生產(chǎn)；電子分析天枰，北京塞多利斯儀器系統(tǒng)有限公司生產(chǎn)；旋渦混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司生產(chǎn)；BYY-6C雙穩(wěn)定時電泳儀，北京六一儀器有限公司生產(chǎn)；酶標(biāo)儀，美國MD公司生產(chǎn)；J-25離心機，美國貝克曼公司生產(chǎn)；XJX-IIX射線攝影暗匣，上海躍進醫(yī)用光學(xué)器械廠生產(chǎn)；血球計數(shù)板，上海市求精生化試劑儀器有限公司；96孔板細(xì)胞培養(yǎng)板，BiousingBiotechnology有限公司生產(chǎn)。
試驗例1 : 四噻唑藍(MTT)法測定PC12細(xì)胞的存活率
( — )PC12細(xì)胞株的培養(yǎng) PC12細(xì)胞用含10X馬血清，5X胎牛血清、100U/mL青霉素和100 y g/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，于37°C、5% C02和95%濕度下進行貼壁培養(yǎng)。每2_3天更換培養(yǎng)液一次，細(xì)胞達約70% 80%融合時，傳代或用于實驗。
(二)PC12細(xì)胞的排板 用0. 25%的胰酶將貼壁的PC12細(xì)胞消化起來，1500rpm離心5min，除去胰酶。將細(xì)胞均勻的排在96孔板中，排板密度為1 X 10cel 1/孔，在含有10%馬血清，5%胎牛血清、100U/mL青霉素和100ii g/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，于37。C、5X C02和95%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 梯度濃度Morphine剌激 細(xì)胞培養(yǎng)過夜，換新鮮RPMI1640培養(yǎng)液，對照組不加Morphine,實驗組分別用10、20、50、100、200 ii M的濃度Morphine剌激。各組設(shè)5個平行實驗。
(四)四噻唑藍(MTT)實驗 取出待測的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加MTT溶液(5mg/ml) 10 y 1，繼續(xù)孵育4小時后，3000rpm室溫下離心15min，小心去掉上清，每孔加入150 yl 二甲基亞砜，小心混勻，用酶標(biāo)儀在波長570nm處測定吸光度值。
(五)細(xì)胞的存活率計算 存活率％ =加藥組A值/對照組A值X 100%
試驗例2 : 四噻唑藍(MTT)法測定Morphine對MPP+剌激的PC12細(xì)胞的保護作用
( — )PC12細(xì)胞株的培養(yǎng) PC12細(xì)胞用含10X馬血清，5X胎牛血清、100U/mL青霉素和100 ii g/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，于37°C、5% C02和95%濕度下進行貼壁培養(yǎng)。每2_3天更換培養(yǎng)基一次，細(xì)胞達約70% 80%融合時，傳代或用于實驗。
(二)PC12細(xì)胞的排板 用0. 25%的胰酶將貼壁的PC12細(xì)胞消化起來，1500rpm離心5min，除去胰酶。將細(xì)胞均勻的排在96孔板中，排板密度為1 X 10cel 1/孔，在含有10%馬血清，5%胎牛血清、100U/mL青霉素和100ii g/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，于37。C、5X C02和95%濕度下進行貼壁培養(yǎng)。 (三)Morphine和MPP+剌激 細(xì)胞培養(yǎng)過夜，換新鮮RPMI1640培養(yǎng)基，對照組不加Morphine,實驗組分別用100 iiM濃度的Morphine, 0. 3mM濃度的MPP+， 100 ii M的濃度Morphine力口上0. 3慮濃度1^+分別剌激剌激。各組設(shè)5個平行實驗。
(四)四噻唑藍(MTT)試驗 取出待測的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加MTT溶液(5mg/ml) 10 y 1，繼續(xù)孵育4小時后，3000rpm室溫下離心15min，小心去掉上清，每孔加入150 yl 二甲基亞砜，小心混勻，用酶標(biāo)儀在波長570nm處測定吸光度值。
(五)細(xì)胞的存活率計算 存活率％ =加藥組A值/對照組A值X 100%
試驗例3:Western Blot檢測Morphine對MPP+剌激的PC12細(xì)胞Trx蛋白表達的影響[OO53] ( — )PC12細(xì)胞株的培養(yǎng) PC12細(xì)胞用含10X馬血清，5X胎牛血清、100U/mL青霉素和100 ii g/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，于37°C、5% C02和95%濕度下進行貼壁培養(yǎng)。每2_3天更換培養(yǎng)基一次，細(xì)胞達約70% 80%融合時，傳代或用于實驗。
(二)PC12細(xì)胞的排板 用0. 25%的胰酶將貼壁的PC12細(xì)胞消化起來，1500rpm離心5min，除去胰酶。將細(xì)胞均勻的排在96孔板中，排板密度為1 X 104cel1/孔，在含有10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100 ii g/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，于37°C、5% C02和95%濕度下進行貼壁培養(yǎng)。 (三)Morphine和MPP+剌激 細(xì)胞培養(yǎng)過夜，換新鮮RPMI1640培養(yǎng)基，對照組不加Morphine,實驗組分別用實驗組分別用100 iiM Morphine, 0. 3mM MPP+， 100 ii mM Morphine加上0. 3mM MPP+剌激。各
組設(shè)三個以上平行實驗。
(四)免疫印跡
1.蛋白含量的測定 用BCA試劑盒測定將10 ii 1標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣本與200 ii 1 WR工作溶液混合，37°C孵育30min，將反應(yīng)管溫度冷卻至室溫。測定562nm光密度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算蛋白濃度。 2.蛋白免疫印跡(Western Blot) 總蛋白加樣量為6ii g，與2XSDS凝膠加樣緩沖液混合后，95t:熱變性5min，用15X的SDS-PAGE膠電泳分離后，將蛋白條帶用電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂牛奶4°〇封閉過夜；取出PVDF膜，用含0. 1% Tween-20的TPBS沖洗后，加入1000倍稀釋的一抗室溫孵育75min ;用含0. 1 % Tween-20的TPBS沖洗，加入5000倍稀釋的二抗室溫孵育75min ;用含0. 1 % Tween-20的TPBS沖洗，將PVDF膜浸入發(fā)光底物溶液中反應(yīng)lmin， X射線膠片曝光。 本發(fā)明旨在證實低濃度Morphine保護神經(jīng)細(xì)胞免于MPP+的損傷。
不同濃度的嗎啡對神經(jīng)元的作用不一樣。低濃度嗎啡可以促進神經(jīng)元增殖，相反，高濃度嗎啡則誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡。這些都提示我們Morphine的濃度不同所產(chǎn)生的作用亦不同。MPP+具有抑制PC12細(xì)胞的生長增殖并誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的凋亡的作用。PC12細(xì)胞中加入Morphine,結(jié)果表明10-100 y M的Morphine能促進PC12細(xì)胞的生長(圖1)。而且，用100 ii M的Morphine預(yù)剌激PC12細(xì)胞時，明顯保護細(xì)胞免受由MPP+所致細(xì)胞損傷作用(圖2)，并且加入Morphine后能使MPP+所致的Trx的蛋白表達有所回升(圖3)。這些結(jié)果都說明，適當(dāng)濃度的Morphine可用于促進神經(jīng)細(xì)胞增殖，保護神經(jīng)細(xì)胞免于帕金森病毒性物的損傷。 由于Morphine能促進PC12細(xì)胞的生長，保護神經(jīng)細(xì)胞免于帕金森病毒性物的損傷是首次發(fā)現(xiàn)的，因此，以適當(dāng)濃度Morphine作為促進神經(jīng)細(xì)胞生長和保護神經(jīng)細(xì)胞免于帕金森病毒性物損傷。 與對照組相比，在低濃度時，Morphine能增加PC12細(xì)胞生長繁殖并且誘導(dǎo)Trx蛋白表達水平。由于Trx具有抗凋亡、保護細(xì)胞的作用，因此，Morphine還可以保護PC12細(xì)胞免于帕金森毒性物MPP+損傷。因此，Morphine通過誘導(dǎo)Trx的表達來促進神經(jīng)細(xì)胞的生長以及保護神經(jīng)細(xì)胞。
權(quán)利要求
Morphine作為抗氧化應(yīng)激損傷劑的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及Morphine作為抗氧化應(yīng)激損傷劑在藥物中的應(yīng)用，確切地說涉及Morphine的醫(yī)藥新用途，屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明經(jīng)四噻唑藍(MTT)法，發(fā)現(xiàn)Morphine能促進大鼠腎上腺嗜鉻瘤細(xì)胞(PC12細(xì)胞)的生長。Morphine具有促進神經(jīng)細(xì)胞增殖的活性，并且抑制帕金森毒性物MPP+(1-Methyl-4-Phenylpyridiniumion)導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞的損傷；蛋白質(zhì)免疫印跡法表明，Morphine可以誘導(dǎo)PC12細(xì)胞中硫氧還蛋白的表達水平。因此，Morphine保護神經(jīng)細(xì)胞免于MPP+毒性與誘導(dǎo)硫氧還蛋白表達有關(guān)。
文檔編號A61P39/06GK101766623SQ20091021837
公開日2010年7月7日 申請日期2009年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月16日
發(fā)明者白潔, 陳妍 申請人:昆明理工大學(xué)