本發(fā)明涉及用于一種用于緩解高溫應(yīng)激的山羊精液稀釋液及其制備方法，屬于畜禽繁殖
技術(shù)領(lǐng)域：
，用于高溫氣候環(huán)境下山羊精液人工授精或常溫稀釋保存。
背景技術(shù)：
：山羊精液冷凍保存技術(shù)目前雖然已進(jìn)入生產(chǎn)應(yīng)用階段，但冷凍精液人工授精受胎率不高仍是限制山羊冷凍精液進(jìn)行生產(chǎn)和推廣的重要因素之一。在生產(chǎn)實(shí)踐中，山羊精液常溫稀釋保存和鮮精人工授精技術(shù)仍廣泛應(yīng)用。影響山羊精液常溫稀釋保存效果的因素主要包括溫度、酸堿度以及稀釋比例和稀釋方法等，其中高溫應(yīng)激對(duì)精液稀釋保存的危害尤為顯著。在高溫濕熱的環(huán)境條件，從山羊附睪射出的精液極易發(fā)生熱應(yīng)激反應(yīng)，精子的代謝和運(yùn)動(dòng)加快，消耗大量的代謝基質(zhì)；熱應(yīng)激反應(yīng)往往還伴隨著氧化應(yīng)激的發(fā)生，在山羊精液常溫保存過(guò)程中，酸性代謝產(chǎn)物和活性氧(ros)含量增加，從而導(dǎo)致有效保存時(shí)間和精子活力大大降低縮短。因此，提高精液抗應(yīng)激反應(yīng)能力，對(duì)延長(zhǎng)精液保存時(shí)間和提高精子活力有重要意義。如cn104304236b、cn103518703b分別公開(kāi)了一種翹嘴紅鲌和豬精液稀釋液。在高溫濕熱的氣候環(huán)境下，精子運(yùn)動(dòng)和代謝加強(qiáng)，精子的受精能力降低更為顯著。因此，研發(fā)一種用于緩解高溫應(yīng)激的山羊精液稀釋液及其制備方法，在延長(zhǎng)山羊精液保存時(shí)間的同時(shí)，能緩解環(huán)境應(yīng)急對(duì)山羊精液造成的不利影響，將極大限度的促進(jìn)熱區(qū)飼養(yǎng)條件下山羊精液常溫保存和鮮精人工授精的應(yīng)用和推廣。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種用于緩解高溫應(yīng)激的山羊精液稀釋液及其制備方法。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種用于緩解高溫應(yīng)激的山羊精液稀釋液，所述稀釋液的成分包括：tris45-50g/l、葡萄糖6-10g/l、檸檬酸20-25g/l、谷氨酸鈉1-2g/l、sds0.2-0.5g/l、青鏈霉素各80-100萬(wàn)單位、精氨酸1.5-2.0g/l和谷氨酰胺2.5-3.5g/l。所述的一種用于緩解高溫應(yīng)激的山羊精液稀的制備方法，所述的方法包括以下步驟：(1)無(wú)菌條件下，向850ml蒸餾水中加入tris45-50gg、葡萄糖6-10g、檸檬酸20-25g、谷氨酸鈉1-2g和sds0.2-0.5g，充分溶解并混合均勻，再加入青鏈霉素各80-100萬(wàn)單位，蒸餾水定容至1l，0.22μm孔徑無(wú)菌濾器過(guò)濾，備用；(2)無(wú)菌條件下，按比例準(zhǔn)確稱取精氨酸1.5-2.0g和谷氨酰胺2.5-3.5g溶解于8-10ml蒸餾水中，充分溶解20min以上，超聲混勻，0.22μm孔徑無(wú)菌濾器過(guò)濾，-20℃避光保存?zhèn)溆茫?3)使用時(shí)，將步驟(2)的貯液放于室溫化凍后，與步驟(1)稀釋液混合均勻，獲得所述用于緩解高溫應(yīng)激的山羊精液稀釋液。進(jìn)一步的，所述步驟(1)保存溫度為2-5℃。進(jìn)一步的，所述步驟(2)保存期限為4-6周。進(jìn)一步的，步驟(3)所述山羊精液稀釋液2-5℃保存。進(jìn)一步的，所述精液稀釋液的使用方法：將精液稀釋液預(yù)熱至35-37℃，再與山羊精液進(jìn)行混合，低倍稀釋時(shí)，按照精液與稀釋液體積比1:(1至2)混合；高倍稀釋時(shí)，先按照精液與稀釋液體積比1:(1至2)進(jìn)行第一次稀釋，平衡后再進(jìn)行第二次稀釋。本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明的用于緩解高溫應(yīng)激的山羊精液稀釋液，所述精液稀釋液包含谷氨酰胺和精氨酸，作為條件必需氨基酸不僅提供精子代謝必須的營(yíng)養(yǎng)成分，還能作為抗氧化物質(zhì)或質(zhì)膜保護(hù)劑，維持精液中抗氧化劑的儲(chǔ)備，提高精液抗應(yīng)激反應(yīng)能力，清除精液在高溫應(yīng)激環(huán)境條件下生成的酸性代謝產(chǎn)物和ros，用于緩解高溫應(yīng)激環(huán)境對(duì)山羊精液保存的不利影響。本發(fā)明的山羊精液稀釋液和現(xiàn)有的精液稀釋液相比，能更好適應(yīng)熱區(qū)高溫濕熱的氣候環(huán)境，起到延長(zhǎng)精液保存時(shí)間、提高精子活力的效果。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但本發(fā)明實(shí)施方式不局限于此。實(shí)施例一種用于緩解高溫應(yīng)激的山羊精液稀釋液，成分包括：tris45.43g/l、葡萄糖7.39g/l、檸檬酸23.83g/l、谷氨酸鈉1.69g/l、sds0.3g/l、青鏈霉素各100萬(wàn)單位、精氨酸1.74g/l和谷氨酰胺2.93g/l。所述山羊精液稀釋液的制備方法，包括以下步驟：(1)無(wú)菌條件下，向850ml蒸餾水中加入tris45.43g、葡萄糖7.39g、檸檬酸23.83g、谷氨酸鈉1.69g和sds0.3g，充分溶解并混合均勻，再加入青鏈霉素各100萬(wàn)單位，蒸餾水定容至1l，0.22μm孔徑無(wú)菌濾器過(guò)濾，備用；(2)無(wú)菌條件下，按比例準(zhǔn)確稱取精氨酸1.74g和谷氨酰胺2.93g溶解于8-10ml蒸餾水中，充分溶解20min以上，超聲混勻，0.22μm孔徑無(wú)菌濾器過(guò)濾，-20℃避光保存?zhèn)溆茫?3)使用時(shí)，將步驟(2)的貯液放于室溫化凍后，與步驟(1)稀釋液混合均勻，獲得所述用于緩解高溫應(yīng)激的山羊精液稀釋液。上述精液稀釋液的使用方法，將上述精液稀釋液預(yù)熱至37℃，再與山羊精液進(jìn)行混合，低倍稀釋時(shí)，按照精液與稀釋液體積比1:1-2混合；高倍稀釋時(shí)，先按照精液與稀釋液體積比1:1-2進(jìn)行第一次稀釋，平衡后再進(jìn)行第二次稀釋。對(duì)比例一種山羊精液稀釋液，成分包括：tris葡萄糖、檸檬酸、谷氨酸鈉、sd和青鏈霉素。無(wú)菌條件下，將tris45.43g、葡萄糖7.39g、檸檬酸23.83g、谷氨酸鈉1.69g和sds0.3g，充分溶解并混合均勻，再加入青鏈霉素各100萬(wàn)單位，蒸餾水定容至1l。將上述精液稀釋液預(yù)熱至37℃，再與山羊精液進(jìn)行混合，低倍稀釋時(shí)，按照精液與稀釋液體積比1:1-2混合；高倍稀釋時(shí)，先按照精液與稀釋液體積比1:1-2進(jìn)行第一次稀釋，平衡后再進(jìn)行第二次稀釋。對(duì)比例和實(shí)施例試驗(yàn)地點(diǎn)在海南儋州，環(huán)境溫度34℃、相對(duì)濕度98％，采用電刺激法采集5只海南黑山羊種公羊精液，均分兩份，分別將對(duì)比例和實(shí)施例的精液稀釋液預(yù)溫后按照體積比1:2的比例混合稀釋，37℃保存，比較測(cè)定保存0h、6h、12h、24h和48h測(cè)定精子活力和存活時(shí)間。精子活力檢測(cè)步驟如下：分別取不同時(shí)間點(diǎn)的稀釋精液5ul滴于37℃預(yù)熱的載玻片上，蓋上蓋玻片，10×20倍顯微鏡下進(jìn)行檢測(cè)；每份精子活力在5個(gè)不同視野中進(jìn)行評(píng)估，5個(gè)連續(xù)評(píng)估值的平均值作為最后的精子活力值，計(jì)算公式如下：精子活力＝(直線前向運(yùn)動(dòng)精子數(shù)/精子總數(shù))×100％。(2)頂體完整率的測(cè)定：分別取不同時(shí)間點(diǎn)取精液50μl制作精子涂片，自然風(fēng)干，水平擺放于染色架上，用4％的多聚甲醛固定15min→蒸餾水洗5次×3min/次→晾干→滴加吉姆薩染色液2ml/片染色90min后→水洗蒸餾水洗5次×5min/次→晾干→10×100倍顯微鏡鏡檢，精子頂體呈紫色，且包圍精子頭前部的為頂體完整的精子，計(jì)算公式如下：頂體完整率＝(體完整的精子數(shù)/精子總數(shù))×100％；將經(jīng)過(guò)稀釋后的海南黑山羊精液精子活力和頂替完整率，結(jié)果見(jiàn)表1和表2。表1精子活力和存活時(shí)間分組0h6h12h24h累計(jì)存活時(shí)間實(shí)施例90％55％23％10％>24h對(duì)比例83％30％5％0<24表2精子頂體完整率分組0h6h12h24h實(shí)施例62％38％24％10％對(duì)比例56％25％9％3％從表1和表2可以，實(shí)施例添加緩解熱應(yīng)激成分精氨酸和谷氨酰胺，在高溫濕熱的氣候條件下采精海南黑山羊精液，經(jīng)對(duì)比稀釋后精液保存時(shí)間延長(zhǎng)、精子活力提高。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)12