專利名稱：對A型流感病毒復(fù)制有抑制作用的siRNA及其編碼序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本專利涉及對流感病毒有干擾作用的siRNA序列的設(shè)計和干擾作用的鑒定
背景技術(shù)：
流行性感冒(Influenza)，簡稱流感，被稱為最古老和最致命的人類瘟疫之一。據(jù) 歷史記載，早在1510年英國就發(fā)生了由全球第一起由流感引起的流行病。如今，美國每年 有2萬人死于流感，俄羅斯每年也有1萬人死于流感，英國每年有5萬人由流感發(fā)展成肺 炎，其中約20%死亡。據(jù)估計，全球每年流感患者死亡人數(shù)高達60萬人，多于艾滋病患者死 亡的人數(shù)。美國已將流感列為繼心臟病、癌癥、中風(fēng)、肺氣腫之后的威脅生命的第五大"殺手"。
流行性感冒，是由甲(A)、乙(B)、丙(C)三型流行性感冒病毒(Influenzavirus) 分別引起的急性呼吸道傳染病。甲乙丙不僅反映了病毒被發(fā)現(xiàn)的年代及前后順序，更主要 的是反映了對人類危害程度的順序。甲型變動常以流行形式出現(xiàn)，引起世界性流感大流行， 在動物中分布廣泛，并也能在動物引起流感流行和造成大量動物死亡。
盡管由死病毒、減毒毒株或重組表面糖蛋白組成的抗流感疫苗能夠有效地保護約 70 80%的健康成年人免于患病，但是疫苗只能針對一小部分毒株，對于新的潛在爆發(fā)的 毒株可能沒有作用。而且，對于高風(fēng)險人群如嬰孩、老人、孕婦和其它各種免疫力低下的人 群，疫苗的保護作用是非常有限的，保護率低于40%。由于大部分的死亡都是發(fā)生在高風(fēng)險 人群中，疫苗對于這些最需要它們的人卻不能起到很好的保護作用。正在應(yīng)用的幾種抗流 感藥物也能夠降低流感感染的發(fā)生和減輕流感感染時的癥狀。但是，藥物的副作用、病人的 承受能力、可能出現(xiàn)的抗藥性變異限制了這些藥物的大規(guī)模使用。所以，對于預(yù)防和治療流 感病毒感染的方法仍然有很急切的需要，特別是在高風(fēng)險人群中和爆發(fā)流感時。因此，流感 的防治至少在今后50年內(nèi)仍然是一個嚴重的問題，尋找更有效的預(yù)防和治療途徑是醫(yī)學(xué) 研究的重大課題。 RNA干擾(RNA interference, RNAi)是1998年首先在線蟲發(fā)現(xiàn)的由雙鏈RNA介 導(dǎo)的序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機制。RNAi —經(jīng)發(fā)現(xiàn)，迅速成為生物學(xué)研究領(lǐng)域中最 為活躍的熱點之一，Science雜志在2001年將其列為十大科學(xué)成就之一，2002年又將其列 為十大科技之首；Nature雜志也將小RNA評為2002年度最重要的科技發(fā)現(xiàn)之一 ；Andrew Z. Fire和Craig C. Mello因RNA干擾的發(fā)現(xiàn)而獲得了 2006年諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎。隨著廣 泛深入的實驗研究的進行，人們對RNAi的機制有了更多的了解。 目前認為RNAi的主要過程為①siRNA形成階段。RNAi的誘導(dǎo)物在細胞質(zhì)內(nèi)被 RNaseIII Dicer切割成為21_23nt的小分子干擾RNA (small interferingRNA， siRNA)，siRNA的結(jié)構(gòu)特征是5'端單磷酸，3'端羥基，而且3'端有2 3_nt的堿基突出；②RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA-induced Silencing Complex, RISC)的形成階段。siRNA與RNAi 特異性酶(如Ago-2)結(jié)合，形成RISC，具有特異性的核酸內(nèi)切酶活性能特異性地降解與 siRNA同源的mRNA ;③效應(yīng)階段。RISC中siRNA變性，雙鏈解開，卸下正義RNA，反義RNA仍 結(jié)合在復(fù)合物上，并引導(dǎo)RISC與同源的靶目標mRNA結(jié)合，在核酸內(nèi)切酶的作用下，將靶目 標mRNA切斷(切割位置在siRNA的中央，距離5'端10-nt)，從而阻斷了其翻譯成蛋白質(zhì)， 表現(xiàn)為基因沉默。miRNA導(dǎo)致基因沉默的機制與此稍有不同，它們與靶mRNA 3'非編碼區(qū) (untranslated region, UTR)通過不完全互補結(jié)合，抑制翻譯過程和蛋白質(zhì)的合成。
RNAi能夠被迅速應(yīng)用于多種生物和功能的研究，得益于它的實驗方法相對簡單， 周期短，表型易于觀察。RNAi實驗中最關(guān)鍵的因素是干擾靶點的選擇、siRNA的制備和基因 導(dǎo)入方法 作為一種快速、有效、特異的抑制基因表達的工具，尤其是發(fā)現(xiàn)在哺乳動物細胞也 存在這一機制后，RNAi被廣泛用于基因功能的研究以及腫瘤、病毒性疾病和遺傳性疾病的 治療研究。 自2003年以來RNAi抗IAV的已經(jīng)有很多，有細胞水平的，也有動物水平的，有用 合成的siRNA的，也有用載體的。Ge等針對A型流感病毒病毒的八個基因設(shè)計并合成了 20 個siRNA，與H1N1共轉(zhuǎn)染MDCK細胞和十日齡雞胚，結(jié)果提示以NP和PA基因為耙點的siRNA 對A型流感病毒病毒感染有較好的抑制作用。Eric Ka-Wai Hui等通過研究指出以病毒的M 基因為靶點的化學(xué)合成siRNA能夠特異性地抑制293T細胞中流感病毒的基質(zhì)蛋白Ml的表 達，并且利用慢病毒載體來表達針對M基因的siRNAs同樣能夠特異性地抑制MDCK細胞中 Ml的表達和流感病毒的復(fù)制。我國學(xué)者郭驍才等采用自己編寫的計算機程序結(jié)合系統(tǒng)發(fā) 育重建方法，對6101個siRNA分子進行了計算機篩選，結(jié)果表明設(shè)計的siRNA的分子針對 NP和PB1應(yīng)該是最有效的。在動物水平實驗上，St印hen等證明了針對A型流感病毒HlNl 的NP和PA高度保守區(qū)域的特異的siRNA能夠抑制病毒在小鼠體內(nèi)的復(fù)制，并且能夠抑制 多種H5和H7亞型病毒的體內(nèi)復(fù)制。另外，Qing Ge等發(fā)現(xiàn)將化學(xué)合成的siRNAs和一種多 聚陽離子載體PEI —起靜脈注射到小鼠后眼窩，可以抑制病毒感染的小鼠的肺部內(nèi)的病毒 復(fù)制。同樣的結(jié)果也可見于小鼠被能夠表達siRNAs前體的慢病毒載體與PEI共注射或與 Infasurf共灌輸?shù)叫∈蠓尾俊?br>
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供3條對A型流感病毒復(fù)制有抑制作用的siRNA及其編碼 序列。所述的3條對A型流感病毒復(fù)制有抑制作用的siRNA的序列分別如序列表400〈1>、 400〈2>和400〈3>所示。 本發(fā)明所述的三條siRNA的動物水平的實驗結(jié)果表明，RNAi不但能有效抑制HINI 的病毒復(fù)制，而且能夠抑制A型流感病毒其它亞型(如H3N1)的復(fù)制，為其用于流感的治療 和預(yù)防提供了實驗依據(jù)。
具體實施例方式
以下實施例將有助于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員進一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。
實施例1 :siRNA序列的設(shè)計和靶點的選擇 設(shè)計和合成siRNA應(yīng)遵循的一般原則是①應(yīng)避免選擇5'和3'端UTR和起始密 碼區(qū)；②應(yīng)根據(jù)目的基因的mRNA，選擇其AUG起始密碼子下游50 100nt區(qū)域處的編碼序 列；③GC含量應(yīng)在30% 50%之間；④盡量避免3個同樣的核苷酸連續(xù)出現(xiàn)；⑤每條鏈的 3'端要有2個堿基(最好是TT)突出；⑥最后，選擇的DNA片段經(jīng)BLAST查詢，應(yīng)與其它人 類基因無同源性，以避免非特異性抑制。 采用這一原則，設(shè)計出序列表所述的三條siRNA序列〈400>1、 〈400>2、以及 〈400>3 ，并采用常規(guī)方法進行合成，進行以下的試驗。
實施例2 :shRNA表達載體的構(gòu)建 以129Sv/Ev小鼠基因組DNA為模板進行PCR，擴增出276bp的U6啟動子序列。PCR
產(chǎn)物經(jīng)EcoRI和Xbal雙酶切，與經(jīng)同樣雙酶切的pBluescript載體(美國Stratagene公
司)連接得到載體pU6P，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒進行測序，以
證實插入序列的正確性。 實施例3 :pU6-siHlNl載體的構(gòu)建 載體pU6P用EcoRV-Xba I雙酶切，質(zhì)粒酶切產(chǎn)物用1 %的瓊脂糖凝膠電泳分離，切 膠用膠回收試劑盒進行膠回收，與合成的siRNA寡核苷酸鏈進行連接反應(yīng)。轉(zhuǎn)化后挑取陽 性克隆。 實施例4 :雞胚實驗驗證pU6-siHlNl干擾H1NI流感病毒增殖的有效性 同時注射H1N1流感病毒(1000倍稀釋液0. lml)和pU6-siHlNl (5微克)進九日
齡雞胚氣室下尿囊腔，33t:培養(yǎng)72小時，取尿囊液，測血凝效價。 血凝試驗測定尿囊液病毒滴度，具體過程如下 (1)于微量血凝板的每孔中滴加稀釋液1 XPBS 50 ii L，根據(jù)被檢樣品數(shù)量定所加 排數(shù)。 (2)吸取被檢尿囊液分別滴加于第一列孔，每個樣品50ii L，然后由左至右順序倍
比稀釋至第ll列孔，再從第11列孔各吸取50iiL棄之。最后一列不加樣品作空白對照。 (3)于每孔中加入0. 5%紅細胞懸液50 ii L。 (4)置微型振蕩器上振蕩lmin，或手持血凝板繞圓圈混勻。 (5)放室溫下(l8 20°C ):30min，或;3rC下l5 加min，觀察結(jié)果。 經(jīng)三次重復(fù)實驗，序列表所述的三條序列〈400>1、 〈400>2、以及〈400>3對流感病
毒復(fù)制的抑制率如下
序列抑制后病毒滴度/未抑制病毒滴度
序列〈400>18/512
序列〈400>216/512
序列〈400>364/512
5
序列表〈110〉中山大學(xué)〈120〉對A型流感病毒復(fù)制有抑制作用的siRNA及其編碼序列〈160〉3〈210〉1〈211>19<212>DNA〈213〉人工序列〈400〉1aatccgaccg ctcttaata 19〈210>2<211>21〈212〉DNA〈213〉人工序列<400>2朋tctggcgc c朋gct朋te a 21〈210>3〈211〉19〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>3gaaatctcac tcagttatt 19
權(quán)利要求
一種對流感病毒復(fù)制有干擾作用的siRNA，其核苷酸序列如序列表400<3>所示。
2. 權(quán)利要求1所述的siRNA作為治療流感病毒的藥物的應(yīng)用。
3. 含有權(quán)利要求1所述的siRNA的表達載體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一條對流感病毒復(fù)制有抑制作用的siRNA；針對H1N1的shRNA表達載體pU6-siH1N1的構(gòu)建及其對A型流感病毒的干擾作用的鑒定技術(shù)。本發(fā)明首先利用分子生物學(xué)的實驗技術(shù)構(gòu)建了十幾條siRNA的表達載體；然后通過雞胚實驗測HA滴度的方法確定了siRNA對流感病毒干擾的有效性。
文檔編號A61P31/16GK101760457SQ200910205078
公開日2010年6月30日 申請日期2008年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月6日
發(fā)明者任政華, 周亮, 周俊祺, 徐安龍, 李榮輝, 謝征, 鄔明月 申請人:中山大學(xué)