專利名稱：含有不同細(xì)胞外基質(zhì)的復(fù)合結(jié)構(gòu)組織工程支架的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬高分子材料技術(shù)領(lǐng)域和生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種含有不同
細(xì)胞外基質(zhì)的復(fù)合結(jié)構(gòu)組織工程支架的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
全球每年都有大量的患有骨缺損、骨腫瘤、骨髓炎等疾病的患者等待治療。目前多 采用自體骨移植和異體骨移植等方法，然而這些方法均有明顯的不足。組織工程及組織工 程骨概念的提出提供了一種骨疾病治療的選擇方案。體外構(gòu)建理想的組織工程骨一直是組 織工程領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，目前已取得很大的進(jìn)展；同時(shí)，組織工程骨對(duì)骨缺損的修復(fù)也得到 了肯定， 一些關(guān)鍵技術(shù)逐步得到解決。但是，組織工程骨血管化一直是制約大塊組織工程骨 的構(gòu)建的關(guān)鍵問(wèn)題。 組織工程材料的血管化包括微觀血管網(wǎng)的建立和宏觀血循環(huán)的建立。理想的血供
應(yīng)由一條內(nèi)徑大于lmm的主干動(dòng)、靜脈提供，這樣才能有充足的養(yǎng)分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供給。由于
細(xì)胞只有在200iim之內(nèi)才能通過(guò)血液彌散得以存活，所以如果不能建立固有血循環(huán)，組織
工程組織的制作只能被限制在薄、小的程度，難以實(shí)現(xiàn)大塊組織工程骨的構(gòu)建。 基于以上內(nèi)容，本發(fā)明提供一種構(gòu)建含有不同細(xì)胞外基質(zhì)的復(fù)合支架的新方法，
包括綜合應(yīng)用靜電紡絲及熱壓-鹽析制備包含血管支架的復(fù)合結(jié)構(gòu)的組織工程支架，在同
一支架中構(gòu)建不同結(jié)構(gòu)形態(tài)的細(xì)胞外基質(zhì)，以期實(shí)現(xiàn)大塊骨組織以及血管化、神經(jīng)化肌肉、
肝臟等組織工程的建立。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種含有不同細(xì)胞外基質(zhì)的復(fù)合結(jié)構(gòu)組織工程支架的構(gòu) 建方法。 本發(fā)明構(gòu)建的復(fù)合結(jié)構(gòu)組織工程支架，包含通過(guò)靜電紡絲所制備的血管支架以及
孔徑分布在300 340 ii m的多孔支架，不僅可為組織工程血管化提供新途徑，同時(shí)也為組
織工程的神經(jīng)化提供了參考，可用于大塊骨組織、人工肝臟、人工肌肉等的構(gòu)建中。 本發(fā)明采用熱壓_鹽析法制備組織工程支架，將可完全生物降解的熔點(diǎn)相對(duì)較高
的聚乳酸和熔點(diǎn)相對(duì)較低的聚己內(nèi)酯以一定比例混合，在無(wú)溶劑下，將加工溫度從聚乳酸
的熔點(diǎn)降低到聚己內(nèi)酯熔點(diǎn)附近，這對(duì)保持血管支架的結(jié)構(gòu)和形狀意義重大。聚乳酸和聚
己內(nèi)酯可完全降解，最終降解產(chǎn)物為二氧化碳和水，可隨新陳代謝排出體外，無(wú)需二次手術(shù)取出。 本發(fā)明提出的含有不同細(xì)胞外基質(zhì)的復(fù)合結(jié)構(gòu)組織工程支架的構(gòu)建方法，采用靜 電紡絲制備血管支架，其結(jié)構(gòu)如圖1所示，該裝置由計(jì)量泵1、高壓發(fā)生器和馬達(dá)2以及管狀 接收裝置3構(gòu)成，計(jì)量泵1用于確定靜電紡絲溶液的流速，高壓發(fā)生器和馬達(dá)2用于產(chǎn)生電 壓，并且?guī)?dòng)接收裝置3旋轉(zhuǎn)，管狀接收裝置3用于血管支架的接收；具體步驟如下 [OOOg] (1)將聚合物溶于溶劑中，磁力攪拌溶解，溶液濃度8% 15% (g/ml)，將聚合物溶液在電壓為8-20KV，電紡距離為8-20cm，流速為0. l_5ml/h的條件下進(jìn)行靜電紡絲，采用 可在馬達(dá)帶動(dòng)下進(jìn)行轉(zhuǎn)動(dòng)的金屬棒作為管狀接收裝置制備血管支架，金屬棒直徑為0. 5 2mm (2)將步驟(1)中制備的血管支架從金屬棒上脫下，真空干燥，采用直徑比金屬棒 小0. 1 0. 2mm的棒穿入血管支架中支撐血管支架，以保證在熱壓過(guò)程中血管支架能保持 其管狀結(jié)構(gòu)； (3)用標(biāo)準(zhǔn)篩篩取粒徑為224 300iim的氯化鈉作為致孔劑； (4)稱取聚乳酸和聚己內(nèi)酯溶解于可以溶解聚合物但不能溶解致孔劑、易揮發(fā)的
溶劑，磁力攪拌使聚合物溶解，得到聚合物溶液； (5)將步驟(3)所得致孔劑加入到步驟(4)所得的聚合物溶液中，用玻璃棒攪拌使 致孔劑均勻分散在聚合物溶液中，形成含有致孔劑的具有一定流動(dòng)性的糊狀混合物；
(6)將步驟(5)所得糊狀混合物分別倒入培養(yǎng)皿中，溶劑揮發(fā)后得到含有致孔劑 的聚合物膜，所得聚合物膜放入真空烘箱中干燥，取出剪成適當(dāng)大?。?(7)將步驟(6)中所得的聚合物膜鋪于模具底層，將步驟(2)中做的穿有支撐棒的 血管支架放入在底層已鋪聚合物膜的模具中，然后再在模具中鋪入步驟(6)中所得的聚合 物膜； (8)將模具放入熱壓機(jī)中熱壓，控制壓力為6 lOMPa，溫度為60 8(TC，熱壓時(shí) 間為2. 5 4min ; (9)將熱壓后的支架從模具中取出，放入到可以溶解致孔劑但是不能溶解聚合物 的溶劑中洗鹽，每2 4小時(shí)更換一次溶劑，用硝酸銀溶液檢測(cè)無(wú)白色沉淀產(chǎn)生后，將血管 支架的支撐棒取出，干燥支架。 本發(fā)明中，步驟(1)中所述聚合物可以為聚乳酸、聚乳酸-己內(nèi)酯共聚物以及聚乳 酸、聚乳酸-己內(nèi)酯共聚物與膠原、明膠的共混物；步驟(1)中所采用溶劑可以為六氟異丙 醇或氯仿。 本發(fā)明中，步驟(2)中支撐棒可以為不銹鋼棒或不銹鋼針管等強(qiáng)度較高、在洗鹽 過(guò)程中不會(huì)生銹的棒狀材料。 本發(fā)明中，步驟(4)中所述溶劑為三氯甲烷或二氯甲烷等中任一種，三氯甲烷或
二氯甲烷是可以溶解聚合物但是不能溶解致孔劑的溶劑。 本發(fā)明中，步驟(9)中所述溶劑為去離子水。 利用本發(fā)明方法制備得到的復(fù)合結(jié)構(gòu)組織工程支架，不僅為組織工程的血管化提
供了新的參考，為大塊骨的構(gòu)建提供了可能，還在于它的應(yīng)用前景不局限于骨組織的構(gòu)建，
還可用于肌肉、肝臟等軟組織的構(gòu)建；其不僅可用于組織工程的血管化，還為組織工程的神
經(jīng)化提供了新途徑。
本發(fā)明具有以下特點(diǎn) 1、在同一支架中構(gòu)建了含有靜電紡絲制備的血管支架和多孔支架，實(shí)現(xiàn)了在同一 支架中構(gòu)建不同細(xì)胞外基質(zhì)的復(fù)合結(jié)構(gòu)支架的構(gòu)建。 2、采用熱壓_鹽析法制備復(fù)合結(jié)構(gòu)組織工程支架，通過(guò)高熔點(diǎn)聚合物與低熔點(diǎn)聚 合物的混合，在獲得高熔點(diǎn)聚合物的性能的同時(shí)，將熱壓溫度降低到低熔點(diǎn)聚合物附近。
3、該復(fù)合結(jié)構(gòu)的組織工程支架，不僅可以用于組織工程的血管化，還可以用于組織工程的神經(jīng)化，可廣泛應(yīng)用在骨、肌肉、肝臟等組織中。


圖1為靜電紡絲制備血管支架示意圖。
圖2為復(fù)合結(jié)構(gòu)組織工程支架表面環(huán)境掃描電鏡照片。 圖1中標(biāo)號(hào)1為計(jì)量泵，2為高壓發(fā)生器和馬達(dá)，3為管狀接收裝置。
具體實(shí)施例方式
下面通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式，但本發(fā)明并不限于這些實(shí)例。
實(shí)施例1 a.聚乳酸溶于氯仿中，濃度8% (g/ml)，用靜電紡絲技術(shù)制備血管支架。電紡電壓 為20KV，電紡距離12cm，流速0. lml/h，接收金屬棒直徑lmm。 b.將血管支架從金屬棒上脫下，真空干燥。采用直徑為0. 8mm的不銹鋼金屬棒穿 入血管支架中。 c.用標(biāo)準(zhǔn)篩篩取27g粒徑為224 300 y m的氯化鈉作為致孔劑。 d.按質(zhì)量比為7 : 3稱取聚乳酸和聚己內(nèi)酯共3g溶解于40ml三氯甲烷中，磁力
攪拌溶解。 e.將步驟c所得致孔劑加入到步驟d所得的聚合物溶液中，用玻璃棒攪拌使致孔
劑均勻分散在聚合物溶液中，形成含有致孔劑的具有一定流動(dòng)性的糊狀混合物。 f.將步驟e所得糊狀混合物分別倒入培養(yǎng)皿中，溶劑揮發(fā)后得到含有致孔劑的聚
合物膜，所得聚合物膜放入真空烘箱中干燥，取出剪成5*5咖大小方塊。 g.實(shí)驗(yàn)采用6X6X0. 2cm的方形不銹鋼模具。將步驟f中所得的聚合物膜鋪于模
具底層，將步驟b中做的穿有支撐棒的血管支架放入在底層已鋪聚合物膜的模具中，然后
再在模具中鋪入步驟f中所得的聚合物膜。 h.將模具放入熱壓機(jī)中熱壓，壓力6 lOMPa，溫度60 8(TC，熱壓時(shí)間2. 5 4min。 i.將熱壓后的支架從模具中取出，放入到去離子水中洗鹽。每2 4小時(shí)更換一 次溶劑，用硝酸銀溶液檢測(cè)無(wú)白色沉淀產(chǎn)生后，將血管支架的支撐棒取出，干燥支架。
從圖2中可以看出，通過(guò)該構(gòu)建方法，含有血管支架和多孔支架兩種細(xì)胞外基質(zhì) 的復(fù)合結(jié)構(gòu)支架已成功制備。圖中管狀物為靜電紡絲制備的血管支架，血管支架四周為多 孔支架，支架下面為環(huán)境掃描電鏡樣品臺(tái)。
實(shí)施例2 a.聚乳酸_己內(nèi)酯共聚物、明膠共同溶于氯仿中，濃度分別為8%、2% (g/ml)，用 靜電紡絲技術(shù)制備血管支架。電紡電壓為20KV，電紡距離12cm，流速0. lml/h，接收金屬棒 直徑0. 8mm。 b.將血管支架從金屬棒上脫下，真空干燥。采用直徑為0. 6mm的不銹鋼金屬棒穿 入血管支架中。 c.用標(biāo)準(zhǔn)篩篩取27g粒徑為224 300 y m的氯化鈉作為致孔劑。 d.按質(zhì)量比為6 : 4稱取聚乳酸和聚己內(nèi)酯共3g溶解于40ml三氯甲烷中，磁力攪拌溶解。 e.將步驟C所得致孔劑加入到步驟d所得的聚合物溶液中，用玻璃棒攪拌使致孔
劑均勻分散在聚合物溶液中，形成含有致孔劑的具有一定流動(dòng)性的糊狀混合物。 f.將步驟e所得糊狀混合物分別倒入培養(yǎng)皿中，溶劑揮發(fā)后得到含有致孔劑的聚
合物膜，所得聚合物膜放入真空烘箱中干燥，取出剪成5*5咖大小方塊。 g.實(shí)驗(yàn)采用6X6X0. 2cm的方形不銹鋼模具。將步驟f中所得的聚合物膜鋪于模
具底層，將步驟b中做的穿有支撐棒的血管支架放入在底層已鋪聚合物膜的模具中，然后
再在模具中鋪入步驟f中所得的聚合物膜。 h.將模具放入熱壓機(jī)中熱壓，壓力6 lOMPa，溫度60 80。C，熱壓時(shí)間2. 5 4min。 i.將熱壓后的支架從模具中取出，放入到去離子水中洗鹽。每2 4小時(shí)更換一
次溶劑，用硝酸銀溶液檢測(cè)無(wú)白色沉淀產(chǎn)生后，將血管支架的支撐棒取出，干燥支架。
實(shí)施例3 a.聚乳酸、膠原共同溶于六氟異丙醇中，濃度分別為8%、0.5% (g/ml)，用靜電紡 絲技術(shù)制備膠原血管支架。電紡電壓為20KV，電紡距離12cm，流速0. lml/h，接收金屬棒直 徑1. 5mm。 b.將血管支架從金屬棒上脫下，真空干燥。采用直徑為1. 3mm的不銹鋼金屬棒穿 入血管支架中。 c.用標(biāo)準(zhǔn)篩篩取27g粒徑為224 300 y m的氯化鈉作為致孔劑。 d.按質(zhì)量比為8 : 2稱取聚乳酸和聚己內(nèi)酯共3g溶解于40ml三氯甲烷中，磁力
攪拌溶解。 e.將步驟c所得致孔劑加入到步驟d所得的聚合物溶液中，用玻璃棒攪拌使致孔
劑均勻分散在聚合物溶液中，形成含有致孔劑的具有一定流動(dòng)性的糊狀混合物。 f.將步驟e所得糊狀混合物分別倒入培養(yǎng)皿中，溶劑揮發(fā)后得到含有致孔劑的聚
合物膜，所得聚合物膜放入真空烘箱中干燥，取出剪成5*5咖大小方塊。 g.實(shí)驗(yàn)采用6X6X0. 2cm的方形不銹鋼模具。將步驟f中所得的聚合物膜鋪于模
具底層，將步驟b中做的穿有支撐棒的血管支架放入在底層已鋪聚合物膜的模具中，然后
再在模具中鋪入步驟f中所得的聚合物膜。 h.將模具放入熱壓機(jī)中熱壓，壓力6 lOMPa，溫度60 8(TC，熱壓時(shí)間2. 5 4min。 i.將熱壓后的支架從模具中取出，放入到去離子水中洗鹽。每2 4小時(shí)更換一 次溶劑，用硝酸銀溶液檢測(cè)無(wú)白色沉淀產(chǎn)生后，將血管支架的支撐棒取出，干燥支架。
權(quán)利要求
一種含有不同細(xì)胞外基質(zhì)的復(fù)合結(jié)構(gòu)組織工程支架的構(gòu)建方法，其特征在于采用靜電紡絲制備血管支架，該裝置由計(jì)量泵(1)、高壓發(fā)生器和馬達(dá)(2)以及管狀接收裝置(3)構(gòu)成，計(jì)量泵(1)用于確定靜電紡絲溶液的流速，高壓發(fā)生器和馬達(dá)(2)用于產(chǎn)生電壓，并且?guī)?dòng)接收裝置(3)旋轉(zhuǎn)，管狀接收裝置(3)用于血管支架的接收；具體步驟如下(1)將聚合物溶于溶劑中，磁力攪拌溶解，溶液濃度8％～15％(g/ml)，將聚合物溶液在電壓為8-20KV，電紡距離為8-20cm，流速為0.1-5ml/h的條件下進(jìn)行靜電紡絲，采用可在馬達(dá)帶動(dòng)下進(jìn)行轉(zhuǎn)動(dòng)的金屬棒作為管狀接收裝置制備血管支架，金屬棒直徑為0.5～2mm；(2)將步驟(1)中制備的血管支架從金屬棒上脫下，真空干燥，采用直徑比金屬棒小0.1～0.2mm的棒穿入血管支架中支撐血管支架，以保證在熱壓過(guò)程中血管支架能保持其管狀結(jié)構(gòu)；(3)用標(biāo)準(zhǔn)篩篩取粒徑為224～300μm的氯化鈉作為致孔劑；(4)稱取聚乳酸和聚己內(nèi)酯溶解于可以溶解聚合物但不能溶解致孔劑、易揮發(fā)的溶劑，磁力攪拌使聚合物溶解，得到聚合物溶液；(5)將步驟(3)所得致孔劑加入到步驟(4)所得的聚合物溶液中，用玻璃棒攪拌使致孔劑均勻分散在聚合物溶液中，形成含有致孔劑的具有一定流動(dòng)性的糊狀混合物；(6)將步驟(5)所得糊狀混合物分別倒入培養(yǎng)皿中，溶劑揮發(fā)后得到含有致孔劑的聚合物膜，所得聚合物膜放入真空烘箱中干燥，取出剪成適當(dāng)大??；(7)將步驟(6)中所得的聚合物膜鋪于模具底層，將步驟(2)中做的穿有支撐棒的血管支架放入在底層已鋪聚合物膜的模具中，然后再在模具中鋪入步驟(6)中所得的聚合物膜；(8)將模具放入熱壓機(jī)中熱壓，控制壓力為6～10MPa，溫度為60～80℃，熱壓時(shí)間為2.5～4min；(9)將熱壓后的支架從模具中取出，放入到可以溶解致孔劑但是不能溶解聚合物的溶劑中洗鹽，每2～4小時(shí)更換一次溶劑，用硝酸銀溶液檢測(cè)無(wú)白色沉淀產(chǎn)生后，將血管支架的支撐棒取出，干燥支架。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的含有不同細(xì)胞外基質(zhì)的復(fù)合結(jié)構(gòu)組織工程支架的構(gòu)建方法， 其特征在于步驟(1)中所述聚合物可以為聚乳酸、聚乳酸-己內(nèi)酯共聚物以及聚乳酸、聚乳 酸_己內(nèi)酯共聚物與膠原、明膠的共混物；步驟(1)中所采用溶劑可以為六氟異丙醇或氯 仿。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的含有不同細(xì)胞外基質(zhì)的復(fù)合結(jié)構(gòu)組織工程支架的構(gòu)建方法， 其特征在于步驟(2)中支撐棒為不銹鋼棒或不銹鋼針管。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的含有不同細(xì)胞外基質(zhì)的復(fù)合結(jié)構(gòu)組織工程支架的構(gòu)建方法， 其特征在于步驟(4)中所述溶劑為三氯甲烷或二氯甲烷中任一種。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的含有不同細(xì)胞外基質(zhì)的復(fù)合結(jié)構(gòu)組織工程支架的構(gòu)建方法， 其特征在于步驟(4)中采用聚乳酸與聚己內(nèi)酯的共混物，將熱壓溫度從聚乳酸的熔點(diǎn)降到 聚己內(nèi)酯熔點(diǎn)附近。
6. —種如權(quán)利要求1所述制備方法得到的復(fù)合結(jié)構(gòu)組織工程支架，在組織工程的血管 化、神經(jīng)化，大塊骨等骨組織的構(gòu)建、肌肉、肝臟軟組織的構(gòu)建方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬高分子材料技術(shù)領(lǐng)域和生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種含有不同細(xì)胞外基質(zhì)的復(fù)合結(jié)構(gòu)組織工程支架的構(gòu)建方法。本發(fā)明通過(guò)靜電紡絲法制備血管支架；通過(guò)熱壓-鹽析法，采用聚乳酸和聚己內(nèi)酯的共混物制備多孔支架部分，并將血管支架引入至多孔支架中。本發(fā)明構(gòu)建的復(fù)合結(jié)構(gòu)的組織工程支架實(shí)現(xiàn)了在同一支架中構(gòu)建不同細(xì)胞外基質(zhì)。
文檔編號(hào)A61L27/40GK101693123SQ20091019669
公開日2010年4月14日 申請(qǐng)日期2009年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月29日
發(fā)明者任天斌, 宋 瑩, 曹春紅, 李蘭, 王安 申請(qǐng)人:同濟(jì)大學(xué);