專利名稱：以羊毛固醇及茯苓萃取物治療惡病質(zhì)的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明系關(guān)于一種用于預(yù)防及治療消耗性疾病(諸如惡病質(zhì)及厭食)，尤其是癌癥引起的惡病質(zhì)，之醫(yī)藥組合物。本發(fā)明之醫(yī)藥組合物包含羊毛固醇化合物作為有效成分。 此羊毛固醇化合物的一合適來源為茯苓萃取物。此外，冬蟲夏草、樟芝及靈芝亦為可能之羊 毛固醇化合物的來源。
背景技術(shù)：
惡病質(zhì)(Cachexia)表示處于一種不好的虛弱的狀態(tài)，常源自于疾病造成厭食和 內(nèi)分泌及免疫系統(tǒng)改變，而出現(xiàn)疲勞，肌肉及內(nèi)臟蛋白減少，最終造成體重減輕。惡病質(zhì)在慢性病患或重癥病患是常見的癥狀，在癌癥病患尤其常見于胃癌和胰臟 癌病患之中，約有百分之七十的病患會出現(xiàn)這樣的癥狀。在癌癥末期，不論是何種癌癥，約 有百分之八十的病患會出現(xiàn)惡病質(zhì)的癥狀，其特征為就算病患增加進(jìn)食的量或提高營養(yǎng)的 攝取，也無法預(yù)防或阻止患者體重的持續(xù)下降。在治療上常使用荷爾蒙食欲促進(jìn)劑(如 Megestrol, medroxyprogesterone acetate)，但實際上有些人認(rèn)為是暫停性體重增力口(只 是水分及脂肪增加)，身體肌肉量并沒有增加，活動能力、體能也未見改善。相反的，一些藥 物副作用如血栓、水腫、出血、高血糖、高血壓會出現(xiàn)。分解代謝性(catabolic)消耗或惡病質(zhì)是一種特征為不自主進(jìn)行性消耗脂肪及 骨骼肌、頑固性體重減輕以增加營養(yǎng)輸入、靜態(tài)能量消耗(REE)增加、蛋白質(zhì)合成降低、碳 水化合物代謝改變(柯氏循環(huán)(Cori cycle)活性增加)、肌肉透過蛋白質(zhì)溶解之ATP-泛 素(ubiquitin)-依賴型蛋白酶體路徑過度分解代謝、及脂肪組織透過脂肪溶解過度分解 代謝之癥候群(Body JJ, Curr Opin Oncol 11 :255_60，1999，Muscaritoli M, et al =Eur J Cancer 42 =311-41, 2006) 0通常，在病患已減輕至少5%或5磅的罹病前體重后才被診 斷為惡病質(zhì)。大約一半的所有癌癥病患經(jīng)歷某種程度的分解代謝性消耗，較高發(fā)生率見于 肺、胰及胃腸道惡性疾病之病例(Dewys WD, et al =Am J Med 69 :491_7，1980)。該癥候群 亦可見于免疫不全疾病諸如AIDS之病患以及罹患細(xì)菌性及寄生蟲性疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié) 炎及腸、肝、腎、肺和心之慢性疾病的病患中。惡病質(zhì)亦與厭食有關(guān)，其可為老化所表現(xiàn)之狀 況或因為身體傷害及燒傷造成。惡病質(zhì)癥候群降低病患之功能性能力及生活質(zhì)量，使?jié)撛?狀況惡化并降低對藥物之耐受性。惡病質(zhì)之程度與病患存活時間呈反比，其通常代表預(yù)后 不良。近年來，老化相關(guān)疾病與失能已經(jīng)成為主要的健康關(guān)注及重要性。厭食(表示食欲喪失之醫(yī)學(xué)名詞)系許多惡性疾病之惡化表現(xiàn)，可見于癌癥、感染 性疾病、慢性器官衰竭及創(chuàng)傷病患。厭食是一種嚴(yán)重的癥候群，因為它導(dǎo)致卡洛里攝取降低 及營養(yǎng)不良。厭食之表現(xiàn)包括對食物之味覺及嗅覺降低、早飽、饑餓感降低及甚至完全厭惡 食物，也可能出現(xiàn)惡心及嘔吐之癥狀。對厭食的原因了解不多；而有效的治療選擇有限。有 些研究指出荷爾蒙、社會及心理因素之組合可能是該癥候群發(fā)生及進(jìn)展之重要因素。雖然事實上惡病質(zhì)經(jīng)常與癌癥有關(guān)，但尚未證實惡病質(zhì)之發(fā)生與腫瘤大小、疾病 階段及惡性疾病之種類或時期之間具有一致關(guān)系。然而，癌癥惡病質(zhì)經(jīng)常與卡洛里攝取減少、靜態(tài)能量消耗增加、及蛋白質(zhì)、脂肪及碳水化合物代謝改變有關(guān)。舉例來說，一些在碳水 化合物代謝上之顯著異常包括總葡萄糖轉(zhuǎn)換率增加、肝臟糖質(zhì)新生上升、葡萄糖不耐及血 糖上升。也經(jīng)常發(fā)現(xiàn)脂肪溶解增加、游離脂肪酸及甘油轉(zhuǎn)換增加、高脂血癥、及脂蛋白脂酶 活性下降。重要的是，與癌癥惡病質(zhì)有關(guān)之體重減輕不僅是因為身體脂肪儲存減少所致，也 與身體總蛋白質(zhì)質(zhì)量減少及廣泛骨骼肌消耗有關(guān)。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換增加及胺基酸氧化調(diào)節(jié)不良 亦可能是該癥候群惡化之重要因素。此外，因應(yīng)癌癥所產(chǎn)生之特定宿主源性因素，例如，發(fā) 炎前細(xì)胞激素(腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、介白素-1、介白素-6、及Y-干擾素)、急性期 蛋白質(zhì)(諸如C反應(yīng)蛋白)、及特定前列腺素似乎亦與癌癥惡病質(zhì)有關(guān)。在傳統(tǒng)中國醫(yī)學(xué)中建議給老年人天天食用茯苓中藥，則老年人除了不容易生病 外，且有助于延緩老化而長壽。本案申請人于E P 1535619A 1揭示了一種用以提升人體免疫力之醫(yī)藥組合物，此 組合物含羊毛固醇(lanostane)化合物作為有效成分，能提升免疫力，用于病毒感染預(yù)防 及治療。另一方面，茯苓萃取物及其純化物(lanostanes)能抑制免疫力，用于IgE引起過 敏(氣喘)之預(yù)防及治療，此抑制作用揭示于我國第97123189號及PCT/CN 2008/001218專 利申請案。從這兩篇專利申請案顯示茯苓萃取物及其羊毛固醇成分(lanostanes)可調(diào)節(jié) 免疫力。本案申請人另于我國第97111791號及P C T/CN 2008/000749專利申請?zhí)柦沂救?之腸細(xì)胞可受茯苓萃取物及其純化物羊毛固醇(lanostanes)作用而增強(qiáng)吸收營養(yǎng)素；葡 萄糖、胺基酸、維他命(葉酸)之吸收。因此我們認(rèn)為茯苓萃取物成分，特別是羊毛固醇化合物(lanostanes)有可能有 助于與營養(yǎng)及免疫有關(guān)之惡病質(zhì)的改善或治療。于本發(fā)明中以人肺癌細(xì)胞移植于小鼠進(jìn)行 實驗來證明茯苓萃取物成分及羊毛固醇化合物是否能對惡病質(zhì)有治療效果，觀察人肺癌細(xì) 胞移植小鼠是否與正常小鼠一樣有正常食欲而且體重也正常并無日漸減輕現(xiàn)象。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明之主要目的即在提供一種用于治療預(yù)防及治療消耗性疾病(諸如惡病質(zhì) 及厭食)，尤其是癌癥引起的惡病質(zhì)，之醫(yī)藥組合物。本發(fā)明之另一目的即在提供一種從茯苓制備的茯苓萃取物用于治療預(yù)防及治療 消耗性疾病(諸如惡病質(zhì)及厭食)，尤其是癌癥引起的惡病質(zhì)，之用途。本發(fā)明之另一目的即在提供一種羊毛固醇(lanostane)用于治療預(yù)防及治療消 耗性疾病(諸如惡病質(zhì)及厭食)，尤其是癌癥引起的惡病質(zhì)，的新用途。本發(fā)明揭示一種預(yù)防及治療哺乳類動物(例如人類)之消耗性疾病(諸如惡病質(zhì) 及厭食)的醫(yī)藥組合物，包含一預(yù)防及治療消耗性疾病有效量作為有效成分的具下列化學(xué) 式(I)的羊毛固醇或其醫(yī)藥容許鹽 其中隊為11或CH3;R2 為 0C0CH3，= 0或OH ;R3 為 H或OH ;R4S-C( = CH2)-C(CH3)2Ra， 其中 Ra 為 H 或 OH，或-CH = C (CH3) _Rb，其中 Rb 為 CH3 或 CH20 H ;R5 為 H 或 OH ；及 R6 為 CH3 或 CH20H。較佳的，該羊毛固醇(I)具有具下列化學(xué)式 較佳的，本發(fā)明的組合物其含有0. 1-60重量％的羊毛固醇(I)或其醫(yī)藥容許鹽。較佳的，本發(fā)明的組合物為口服的。本發(fā)明的又一目的系使用一茯苓萃取物作為該羊毛固醇(I)的來源，該茯苓萃取 物包含1-60重量％的具前述式(I)的羊毛固醇且實質(zhì)上不含開環(huán)羊毛固醇。較佳的，該茯苓萃取物系由包含下列步驟的方法所制備a)以一水，甲醇，乙醇或它們的混合溶劑萃取茯苓菌的代謝物，茯苓菌的酸酵產(chǎn)物 或茯苓菌菌絲；b)濃縮步驟a)萃取所獲得的液體；c)將步驟a)所獲得的濃縮物導(dǎo)入一硅膠管柱；d)以一低極性沖提劑(eluent)沖提該硅膠管柱，及收集所產(chǎn)生的溶離液 (eluate)；及e)濃縮步驟d)的溶離液。較佳的，從步驟e)所獲得的溶離液的濃縮物以硅膠薄層層析法分析具有一層析 值(Rf)彡0.1，其中以紫外光燈及碘作檢側(cè)，展開液為二氯甲烷甲醇=96 4。較佳的，步驟a)的萃取所使用的溶劑為95%酒精。較佳的，步驟a)包含以沸水萃取茯苓菌的代謝物，茯苓菌的酸酵產(chǎn)物或茯苓菌菌 絲；加入一堿至該萃取水溶液至其P H值9-11 ；分離出該堿性水溶液；加入一酸至該堿性水 溶液至其PH值4-7，以產(chǎn)生沈淀物；分離出該沈淀物；再以酒精萃取該沈淀物，并分離出萃 取液體。較佳的，步驟b)的濃縮物被進(jìn)一步以一體積比為1 1的95% v/v甲醇水溶液及 正己烷的兩相溶劑萃??；分離出甲醇層；及濃縮該甲醇層，所獲得的濃縮物被用作為步驟 c)的硅膠管柱的進(jìn)料。較佳的，步驟d)的低極性沖提劑為體積比為96. 5 3. 5的二氯甲烷及甲醇的混 合溶劑。較佳的，該茯苓萃取物包含5-35重量％的羊毛固醇(I)。較佳的，本發(fā)明的組合物進(jìn)一步包含一營養(yǎng)素，例如葡萄糖、胺基酸、維生素或其 組合。較佳的，本發(fā)明的消耗性疾病系指惡病質(zhì)；更佳的，該惡病質(zhì)系因癌癥而引起，例 如肺癌、胃癌、胰臟癌、直腸癌、乳癌、口腔癌或鼻咽癌。較佳的，本發(fā)明的消耗性疾病系指因癌癥、厭食、老化、因為身體傷害或燒傷而引起。較佳的，本發(fā)明醫(yī)藥組合物對人的投予劑量為該羊毛固醇(I)每日的投予劑量不 低于8. 4mg。較佳的，本發(fā)明的醫(yī)藥組合物進(jìn)一步包含一醫(yī)藥容許載體或稀釋劑。本發(fā)明以具式(I)的羊毛固醇或其醫(yī)藥容許鹽，或前述茯苓萃取物作為癌癥患者 食欲不振、體重嚴(yán)重下降的治療。與惡病質(zhì)有關(guān)之疾病除癌癥外，尚有艾滋病、老化、類風(fēng)濕 性關(guān)節(jié)炎、肺結(jié)核、纖維囊腫、克隆氏癥、感染疾病等所引起之惡病質(zhì)。手術(shù)或癌癥病人(接 受化療或放射療法)造成身體虛弱，急需要補充營養(yǎng)素(胺基酸、葡萄糖、維他命)來改善。 本發(fā)明的有效成分可以被添加在奶粉、飲料、食品作為營養(yǎng)補充目的，也可作成醫(yī)藥品，如 錠劑、膠囊、顆粒劑、液劑、注射劑等形式出現(xiàn)，用于醫(yī)療目的。


圖1顯示實施例七的第一次試驗的每一組小鼠之體重變化，其中+代表正常組 (blank)；黑圓點代表控制組(control)；菱形、方形及三角形分別代表給藥組PC_A、PC_B及 PC-C，小鼠每公斤體重被分別施予羊毛固醇17. 6mg，8. 8mg及4. 4mg。圖2顯示實施例七的第二次試驗的每一組小鼠之體重變化，其中菱形代表正常組 (blank)；方形代表控制組(control)；及三角形代表給藥組PC-D，小鼠每公斤體重被施予 羊毛固醇8. 8mg。圖3顯示實施例七的第二次試驗的每一組小鼠之?dāng)z食量變化，其中菱形代表正常 組(blank)；三角形代表控制組(control)；及圓形代表給藥組PC-D，小鼠每公斤體重被施 予羊毛固醇8. 8mg。圖4顯示實施例七的第一次試驗的每一組小鼠之小鼠于第22天之血中白蛋白濃度。圖5顯示實施例七的第二次試驗的每一組小鼠之小鼠于第22天之血中白蛋白濃度。圖6為實施例八的第一組癌癥患者(化療+茯苓萃取物膠囊1顆)之整體營養(yǎng) 狀況之評估，其是依據(jù)臨床醫(yī)生使用之PG-SGA評量表(Patient-Generated Subjective Global Assessment)進(jìn)行評估。圖7為實施例八的第二組癌癥患者(化療+茯苓萃取物膠囊2顆)之整體營養(yǎng)狀 況之評估，其是依據(jù)臨床醫(yī)生使用之PG-SGA評量表進(jìn)行評估。圖8為實施例八的對照組癌癥患者(化療)之整體營養(yǎng)狀況之評估，其是依據(jù)臨 床醫(yī)生使用之PG-SGA評量表。實施方式惡病質(zhì)(Caclexia)表示人體處于一種衰弱狀態(tài)，造成惡病質(zhì)之原因，有多種不同 說法，但無一個確切之機(jī)轉(zhuǎn)。目前所能知道的是以癌癥而言，癌細(xì)胞釋放因子或人體對癌細(xì) 胞之免疫反應(yīng)釋放各種因子直接或間接造成厭食，體內(nèi)之內(nèi)分泌及免疫系統(tǒng)發(fā)生改變。因 而使得人體之脂肪及肌肉中之蛋白質(zhì)逐漸減少而導(dǎo)致患者不喜歡飲食，身體日漸虛弱及體 重日漸減輕的現(xiàn)象。與惡病質(zhì)有關(guān)之疾病有癌癥、感染疾病(如肺結(jié)核、艾滋病)，自體免疫病(類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)，老年人，纖維囊腫、克隆氏病。在癌癥病患，尤其常見于胃癌和胰臟癌病患之中， 約有百分之七十的病患會出現(xiàn)這樣癥狀。另外，在癌癥末期，不論是何種癌癥，約有百分之 八十病患會出現(xiàn)惡病質(zhì)癥狀。在治療上如增加進(jìn)食或其它經(jīng)由灌食或靜脈注射營養(yǎng)素，也 無法預(yù)防或阻止患者體重的持續(xù)下降。在治療上常使用荷爾蒙食欲促進(jìn)劑(如Megestrol， medoxyprogesterone)，但實際上有些人認(rèn)為是暫停性體重增加(只是水分及脂肪增加)， 身體肌肉量并沒有增加，活動能力也未見改善。相反的，一些藥物副作用如血栓、水腫、出 血、高血糖、高血壓會出現(xiàn)。本發(fā)明所揭示之從茯苓制備具有治療惡病質(zhì)的有效成分的一合適方法例如為前 述EP 1535619 A1所揭示的方法，包括利用傳統(tǒng)萃取法萃取茯苓得到一粗萃取物，再經(jīng)由層 析法，分成極性小之羊毛固醇(lanostane)類部位(以二氯甲烷甲醇(96 4)為沖提 液)和極性大之開環(huán)羊毛固醇(secolanostane)類部位(以二氯甲烷甲醇(90 10或 0 100)為沖提液)，其中，利用硅膠薄層層析法，顯示出羊毛固醇(lanostane)類部位之 所在位置，即展開溶媒為二氯甲烷-甲醇(96 4)時，層析值(Rf)為彡0.1;至于開環(huán)羊 毛固醇(secolanostane)類成分，則層析值小于0. 1。用硅膠管柱層析法可進(jìn)一步分離該羊 毛固醇類部位，其中沖提液使用二氯甲烷甲醇(97 3至95 5)，分離出數(shù)種羊毛固醇 (lanostane)類化合物。下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但不以此限制本發(fā)明。實施例一云南產(chǎn)茯苓26公斤，以260升含75%酒精，加熱萃取三次，合并酒精萃取液，經(jīng) 減壓濃縮后可得225. 2克萃取物。萃取物經(jīng)定量分析知道每一克萃取物可得76. 27毫克 t $ € @ 酉享(lanostanes)，胃巾 K1 (Pachymic acid) 33.Kl-1 (dehydropachymic acid) 9. 59 亳克，K2-1 (Tumulosic acid) 19. 01 亳克，K2-2 (dehydrotumulosic acid) 6. 75 毫克，K3 (Poylporenic acid C) 5. 06mg, K4 (3-epidehydrotumulosic acid) 2. 46 毫克。實施例二實施例一酒精萃取物125克以1. 3升二氯甲烷萃取6次，合并二氯甲烷萃取 液，經(jīng)濃縮后可得22. 26克之萃取物。以95%熱酒精溶解二氯甲烷萃取物，放冷后過濾 不溶物，濾液以水少量加入直到酒精含量為45%為止，此時會有沉淀產(chǎn)生，用離心方式取 沉淀物，可得17. 4克沉淀物。經(jīng)定量分析可得知每克沉淀物含有264. 78毫克羊毛固醇 (lanostanes)，其中 Kl-1 (pachymic acid) 159. 7 毫克，Kl-2 (dehydropachymic acid) 56. 96 m K2-1 (Tumulosic acid) 24. 43 m K2-2 (dehydrotumulosic acid) 8. 8 m 胃， K3 (polyporenic acid)9.84 毫克，K4(3-印idehydrotumulosicacid) 5. 05 毫克。該沉淀物 經(jīng)硅膠薄層層析法檢測證明其不含有開環(huán)羊毛固醇。實施例三茯苓藥材100公斤以800公斤水煮沸3小時后，靜置冷卻至50°C，以5N NaOH調(diào)節(jié) 溶液至PH11，再攪拌溶液3小時。接著以離心機(jī)分離液體和固體，固體再以800公斤水加 入，同上述方法，以NaOH調(diào)至pHll、攪拌和離心機(jī)分離，去掉固體。合并兩次液體，在50°C 將液體真空濃縮至100公斤溶液，再加入3N HC1至pH 6. 5，產(chǎn)生沈淀物。分離出該沈淀物， 再以40L H20清洗，接著以離心機(jī)分離出沈淀物，加入8L水噴霧干燥(spray dry)，得到約 380g粉末。再以4L之酒精萃取該粉末三次，合并萃取液并濃縮可得238. 9克酒精萃取物。該萃取物經(jīng)硅膠薄層層析法(TLC)檢測證明其不含有開環(huán)羊毛固醇。該萃取物再經(jīng)過HPLC 分離，每克該萃取物可得主成分為K2214mg，K 323mg,K424mg及少量成分K14. 52mg,即萃取 物每克約含265mg羊毛固醇(lanostanes)?；蛞?L之50%酒精水溶液萃取該粉末，去除50%酒精水溶液部份收取不溶之粉 末，重復(fù)三次可得245. 7克之50%酒精水溶液不溶物，經(jīng)TLC法檢測顯示該不溶物不含開環(huán) 羊毛固醇，再經(jīng)過HPLC純化分離該不溶物，每克可得主成分為K2214mg，K323mg, K424mg及 少量成分K14. 52mg,即萃取物每克約含261mg羊毛固醇(lanostanes)。實施例四以云南產(chǎn)茯苓30公斤，磨成粉后，利用120L酒精(濃度95%)萃取24小時， 及過濾分離。再重復(fù)前述萃取及固液分離三次。合并濾液，并將之濃縮后得干燥萃取物 265. 2克。再利用一兩相萃取劑(己烷95%甲醇=1 1)對該干燥萃取物進(jìn)行分配萃 取。取出甲醇層并加予濃縮后得到干燥固體246. 9克。利用硅膠管柱層析對該干燥固體 進(jìn)行分離，該硅膠管柱填充有該干燥固體重量10-40倍的硅膠，系購自Merck公司，Silica gel60，70-230mesh。以二氯甲烷/甲醇混合液作為沖提劑(eluent)，依序以96 4、 90 10、0 100比例的混合液進(jìn)行沖提，溶離液(eluate)以硅膠薄層層析法(Thin Layer Chromatography)(紫外光燈及碘作檢測，展開液為二氯甲烷甲醇=96 4)檢測成分，將 相同成分合并。以二氯甲烷-甲醇(96 4)混合液進(jìn)行硅膠管柱層析，可得到屬本發(fā)明的茯苓萃 取物之PCM部份78克。PCM部份依上述硅膠薄層層析法可明顯看到6個跡點。以二氯甲 烷甲醇(90 10)及(0 100)沖提液層析合并可得到PCW部份168克。PCM部份進(jìn)一步以二氯甲烷甲醇(96.5 3.5)作為沖提劑進(jìn)行硅膠管柱層 析(同上述硅膠管柱)，進(jìn)一步分離可得純化之羊毛固醇(lanostane)類成分K1 (Kl_l及 K1-2)，K2 (K2-1及K2-2)，K3，K4，K4a，K4b，K5，K6a及K6b。詳細(xì)分離步驟及鑒定分析數(shù)據(jù) 請參見 EP1535619 A1。上述之K1至K6b化合物，其結(jié)構(gòu)如下 K2-1 :R2 = 0H(tumulosic acid) (dehydropachymic acid)K2-2 :R2 = OH (微量)(dehydrotumulosic acid) K4a :R6 = CH20H R5 = H K4b :R2 = 3 _0C0CH3 R5 = OHK6a :R6 = CH3 R5 = OH 從PCM部份分離出來羊毛固醇化合物K1至K6b的產(chǎn)量如下表所示。PCM部份含有 約15重量％的羊毛固醇化合物K1至K6b。 實施例五膠囊制備依下列組成制備含有實施例四所制得的茯苓萃取物PCM成份的膠囊 將茯苓萃取物PCM與硅鋁酸鈉分別以#80目(mesh)篩網(wǎng)過篩，馬鈴薯淀粉以#60 目篩網(wǎng)過篩，硬脂酸鎂以#40目篩網(wǎng)過篩后，置入混合機(jī)攪拌均勻，接著填充入壹號空膠 囊，每顆膠囊含有約1. 68mg(0. 42wt% )的有效成份K1-K6。實施例六以本發(fā)明之實施例二及實施例三所制備的茯苓萃取物分別調(diào)配如表一的藥劑做 為試驗物質(zhì)，來評估動物因癌癥引起之體重、攝食情況與血清中蛋白質(zhì)量之改變，以及癌癥 引起之惡病質(zhì)病人服用茯苓萃取物萃取物之整體營養(yǎng)狀況。表一試驗物質(zhì)所含茯苓萃取物的劑量 *茯苓萃取物含26 %羊毛固醇化合物實施例七本實施例為以表一的藥劑來治療癌癥引起之惡病質(zhì)的動物試驗。以人肺癌細(xì)胞移 植于小鼠進(jìn)行實驗來證明茯苓萃取物是否能對惡病質(zhì)有治療效果，觀察人肺癌細(xì)胞移植小 鼠與正常小鼠的體重、攝食量及血清白蛋白濃度變化，來評估其治療癌癥惡病質(zhì)的藥效。實驗動物試驗用老鼠分別自臺大動物中心購進(jìn)六至八周齡CB-17SCID小鼠，分別飼養(yǎng)于不銹鋼籠中。室溫控制于25士2°C，濕度范圍40-70%，12小時光照/黑暗交替，飲水不限制。 購入后于動物房先給予適應(yīng)期，逢機(jī)秤重后，以隨機(jī)數(shù)方式將相近體重者編為同一組后，以 統(tǒng)計分析確認(rèn)各組間之體重?zé)o顯著性差異。人體肺癌細(xì)胞株H460培養(yǎng)自液態(tài)氮筒取出保存之H460細(xì)胞株，在37°C水浴槽內(nèi)解凍，并在操作臺內(nèi)加入8m 1之10%FBS DMEM媒介液，并以1200rpm離心10分鐘后，取出上清液后將細(xì)胞加入8m 1 培養(yǎng)液，培養(yǎng)于37°C、5% C02的培養(yǎng)箱中，直到所需的細(xì)胞量。小鼠原位(orthotopic)棺入肺癌細(xì)胞株H460將小鼠以戊巴比妥(pentobarbital)深度麻醉后，用29號(gauge)O. 5ml胰島素 (insulin)針，于小鼠胸肋腔內(nèi)植入H460細(xì)胞株0. lml(lX106/m 1)，植入細(xì)胞后，將小鼠 置回原小鼠籠，讓其自行恢復(fù)。藥物處理實施例二制備的茯苓萃取物精稱67. 7mg以加入無菌水定量至10ml，使用超音波 處理使該萃取物成懸浮狀態(tài)存在于溶液中即成PC-A藥劑，定量5ml PC-A藥劑以無菌水定 量至10ml,即成PC-B藥劑，定量5ml PC-B藥劑以無菌水定量至10ml,即成PC-C藥劑。小 鼠依各別體重進(jìn)行喂食，每小鼠體重25gm管喂0. 25CC之藥劑，完成表一的劑量。分兩次進(jìn) 行試驗；正常小鼠組(blank)以蒸餾水喂食正常小鼠(用培養(yǎng)液PBS替代H460注入胸腔之 小鼠)。對照組(control)，則以蒸餾水喂食肺癌小鼠。喂食方式是以注射針筒(lcc)接上 18號(長5公分)鋼管，管喂時以左手握開鼠雙口腔，再輕將管喂鋼管小心置入胃部，再管 喂藥劑或蒸餾水，每次體積以不超過0. 3cc為限。第一次試驗分正常組(blank)，對照組(control)及三組給藥組(給予不同羊毛固 醇劑量)，共計五組，每組9只小鼠。給藥組三組分別為喂食實施例二制備的茯苓萃取物的 藥劑PC-A、PC-B及PC-C給予肺癌小鼠，小鼠每公斤體重被分別施予羊毛固醇17. 6mg，8. 8mg 及4. 4mg，如表一所示。第二次試驗分正常組(blank)，對照組(control)及給藥組一組，共計三組，每組3 只小鼠。給藥組為喂食實施例三制備的茯苓萃取物的藥劑PC-D給予肺癌小鼠，小鼠每公斤 體重被施予羊毛固醇8. 8mg，如表一所示。血清白蛋白血樣品收集于第22天從小鼠眼角采集全血，血樣于室溫靜置1小時。以3，OOOrpm速度離心 2次，收集血清，儲存于-20°C，待日后測定血清白蛋白之含量分析。血清白蛋白濃度測定使用鼠血蛋白ELISA(Mouse albumin ELISA)試劑套組(Bethyl Laboratories Inc. ,Texas,US)進(jìn)行分析試劑套組分析。抗鼠血蛋白(Anti-mouse albumin)以TBS稀釋 100倍，被覆100 u 1/well井于微滴盤中，在室溫下作用1小時。以TBST清洗3次后，以1 % BSA 200 iil/well井做阻擋(blocking)，在室溫下作用1小時，再以TBST清洗3次。加入 樣品及標(biāo)準(zhǔn)液，在室溫下作用1小時，以TBST清洗5次，再加入100 u 1/well井的羊抗血蛋 白-HRP 共軛(Goatanti-mouse albumin-HRPconjugate)稀釋液(以含 BSA 及 0. 05% Tween 20之TBS稀釋10，000倍)于室溫下作用1小時。以TBST清洗5次，加入100 yl的基 質(zhì)液TMB (3，3‘ ,5,5' -tetramethylbenzidine)，在室溫下避光反應(yīng) 15 分鐘，加入 100 u 1/well井的2N HC1終止反應(yīng)，測定A45(lnm之吸光值。統(tǒng)計方法數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值土標(biāo)準(zhǔn)差來表示。統(tǒng)計原則首先以單向變異分析(one-way AN0VA)來檢定組間變異，若P < 0. 05，再以Dunnett，s multiple range t-test來進(jìn)行各 組間之差異比，此種方式則是各組與控制組分別進(jìn)行比較為原則。體重及攝食量變化觀察第一次及第二次試驗的每一組小鼠之?dāng)z食量的變化及體重變化情形。MM小鼠之體重變化第一次試驗，肺癌小鼠在進(jìn)行管喂茯苓萃取物過程中，體重變化情形如圖1所示。 對照組(control)小鼠在植入H460肺癌細(xì)胞之后，體重明顯下降，相較于植入肺癌細(xì)胞小 鼠，再給予茯苓萃取物低劑量PC-C(4. 4m g/k g)及PC-B(8.8mg/kg)，二者并無區(qū)別，即無改 善惡病質(zhì)癥狀。但如加大劑量至17. 6m g/kg(PC-A)則可看到小鼠對體重之下降有明顯趨 緩之現(xiàn)象，因此茯苓成分能改善植入H460肺癌細(xì)所引起體重下降之現(xiàn)象。使用不同茯苓萃 取物進(jìn)行第二次試驗，萃取物PC_D(8. 8mg/kg)，對肺癌小鼠體重變化如圖2所示。如同圖 1，對照組(control)小鼠在植入H460細(xì)胞后，體重明顯下降，而正常老鼠(Blank)(不植入 H460細(xì)胞)則體重略加而已，而給予茯苓萃取物的PC-D組則發(fā)現(xiàn)能夠持續(xù)維持在試驗起始 時之體重，因此茯苓能治療惡病質(zhì)癥，應(yīng)該可以由此得到證明。罹癌小鼠之?dāng)z食量變化肺癌小鼠在進(jìn)行管喂茯苓萃取物后，食物攝取量變化情形如圖3所示。對照組 (control)小鼠在植入H460肺癌細(xì)胞之后，食物攝取量逐漸下降。相較于植入肺癌細(xì)胞小 鼠再給予茯苓萃取物(PC-D)的給藥組小鼠，攝取食物不會呈現(xiàn)逐漸下降情形，反而與正常 組(black)小鼠一樣(未植入H460肺癌細(xì)胞)，二組小鼠的攝取食物量并無區(qū)別。因此茯 苓萃取物能改善或治療惡病質(zhì)引起攝食不佳之病癥。肺癌小鼠血清中白蛋白含量變化第一次及第二次試驗的每一組小鼠之血清中白蛋白含量變化情形如圖4及圖5所 示。對照組(control)之植入肺癌細(xì)胞H460)的小鼠相對于正常組(Blank)小鼠(不接種 H460)具有血清中白蛋白有下降的趨勢。在喂食茯苓萃取物的給藥組(PC-A、B、C)可觀察 到隨著羊毛醇劑量增加會增加小鼠的血中之白蛋白含量，在給予PC-A 17.6mg/kg之劑量 可觀察到有顯著之增加。在給予茯苓萃取物的給藥組PC-D (8. 8mg/kg劑量)，也得到相同顯 著效果。由于動物體對肺癌細(xì)胞會產(chǎn)生發(fā)炎反應(yīng)，此反應(yīng)會改變肝細(xì)胞蛋白質(zhì)制造情形， 有些蛋白質(zhì)會減少制造，有些蛋白(或誘導(dǎo)出蛋白質(zhì))的制造會增加。因此，惡病質(zhì)除觀 察老鼠體重及攝食量變化外，另外一個方式可測量血中白蛋白，血中白蛋白如下降，顯示動 物受肺癌細(xì)胞影響使肝細(xì)胞所制造的白蛋白減少，故釋放到血中白蛋白減少。如圖4及圖 5所示，惡病質(zhì)小鼠其血中白蛋白含量減少，但施予茯苓萃取物的惡病質(zhì)小鼠其血中白蛋白 含量并不會減少，茯苓萃取物顯然具有治療惡病質(zhì)之作用。實施例八茯苓萃取物治療癌癥引起之惡病質(zhì)的人體臨床研究
(一)觀察病人整體營養(yǎng)狀況改善。(二)觀察病人體重改善。(A)癌癥病人分組及給藥15個癌癥病人體重持續(xù)性減輕，分屬于胃癌(3人)、胰臟癌(3人)、直腸癌(3 人)、乳癌(4人)、口腔癌(1人)及鼻咽癌(1)，隨機(jī)分成3組，每組各5人，第一組給予低 劑量茯苓萃取物(萃取物源自實施例三，16. 8m g/每顆)，每日一顆膠囊。第二組給予較高 劑量茯苓萃取物，每日二顆膠囊。第三組不給予茯苓萃取物僅服用化療藥物作對照目的。(B)治療過程15個病人化療6周，第一 / 二組病人服用茯苓且服用4周(5/6周 僅化療)，每周記錄.體重/營養(yǎng)狀況評估表。(C)治療結(jié)果(一)癌癥患者體重改善，治療結(jié)束后(第六周或42天后)將病人 體重與治療第1天體重作比較結(jié)果如下 從治療結(jié)果可以看出給予化療藥物與茯苓萃取物組(一 / 二組)其對于體重維持 不變或改善體重優(yōu)于對照之第三組(僅給予化療而不給予茯苓)，此組體重可以觀察到體 重會減輕，仍低于治療第1天之體重。(D)治療結(jié)果(二)病人整體營養(yǎng)狀況改善癌癥患者整體營養(yǎng)狀況之評估是依據(jù)臨床醫(yī)生使用之PG-SGA評量表 (Patient-Generated Subjective Global Assessment), if f^Hii^lA^ (1)(2) 飲食改善(3)癥狀困擾改善及(4)體能改善所得綜合分?jǐn)?shù)，如下列圖6、圖7及圖8所示，圖 6為第一組患者(化療+茯苓萃取物膠囊1顆)，圖7為第二組患者(化療+茯苓萃取物膠 囊2顆)，圖8為對照組患者(化療)。PG-SGA分?jǐn)?shù)愈低病人改善程序愈佳，整體趨向于健 康。從治療結(jié)果來看，給予茯苓萃取物并用化療藥物治療對于惡病質(zhì)患者之健康/生 活質(zhì)量改善遠(yuǎn)遠(yuǎn)超越僅給予化療惡病質(zhì)患者，而且在統(tǒng)計學(xué)上呈現(xiàn)顯著意義從本實施例的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)茯苓萃取物與化療藥物并用能阻止癌癥病人體重減 輕，同時病人整體營養(yǎng)狀況改善，很顯著優(yōu)于只給予化療的癌癥病人。
權(quán)利要求
一種使用具下列化學(xué)式(I)的羊毛固醇或其醫(yī)藥容許鹽作為活性成分在制備預(yù)防及治療哺乳類動物的消耗性疾病的用途于式中R1為H或CH3；R2為OCOCH3，＝O或OH；R3為H或OH；R4為-C(＝CH2)-C(CH3)2Ra，其中Ra為H或OH，或-CH＝C(CH3)-Rb，其中Rb為CH3或CH2OH；R5為H或OH；及R6為CH3或CH2OH。F2009101405625C0000011.tif
2.如權(quán)利要求1的用途，其中該羊毛固醇(I)具有具下列化學(xué)式
3.如權(quán)利要求1的用途，其中該藥物含有0.1-60重量％的羊毛固醇。
4.如權(quán)利要求1的用途，其中該藥物為口服的。
5.如權(quán)利要求1的用途，其中的消耗性疾病為惡病質(zhì)。
6.如權(quán)利要求1的用途，其中該哺乳類動物為人類。
7.如權(quán)利要求1的用途，其中包含使用一茯苓萃取物作為該活性成分，該茯苓萃取物 包含1-60重量％的具申請專利范圍第1項的羊毛固醇(I)且實質(zhì)上不含開環(huán)羊毛固醇。
8.如權(quán)利要求7的用途，其中該茯苓萃取物包含5-35重量％的羊毛固醇(I)。
9.如權(quán)利要求7的用途，其中該羊毛固醇(I)具有具下列化學(xué)式
10.如權(quán)利要求5的用途，其中該惡病質(zhì)系因癌癥而引起。
11.如權(quán)利要求10的用途，其中該癌癥為肺癌、胃癌、胰臟癌、直腸癌、乳癌、口腔癌或鼻咽癌。
12.如權(quán)利要求1的用途，其中該消耗性疾病系因癌癥、厭食、老化、因為身體傷害或燒 傷而引起。
13.如權(quán)利要求6的用途，其中該羊毛固醇⑴每日的投予劑量不低于8.4mg。
全文摘要
一種用于治療惡病質(zhì)，尤其是癌癥引起的惡病質(zhì)，之醫(yī)藥組合物，其包含羊毛固醇化合物作為有效成分。此羊毛固醇化合物的一合適來源為茯苓萃取物，其包含1-60重量％的羊毛固醇類化合物且實質(zhì)上不含開環(huán)羊毛固醇類化合物。該萃取物系萃取自多孔菌科植物茯苓菌(Porea cocos(Schw)Wolf)之代謝產(chǎn)物或酦酵產(chǎn)物或茯苓菌菌絲。
文檔編號A61P43/00GK101874807SQ20091014056
公開日2010年11月3日 申請日期2009年5月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月2日
發(fā)明者林漢欽 申請人:杏輝天力(杭州)藥業(yè)有限公司