專利名稱：：表沒食子兒茶素沒食子酸酯在制備防治高脂性脂肪肝藥物中的應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種表沒食子兒茶素沒食子酸酯在制備防治高脂性脂肪肝藥物中的應用。
背景技術：
：脂肪肝是由多種原因引起的肝臟脂肪代謝紊亂，脂類物質(zhì)動態(tài)平衡失調(diào)，肝細胞攝取脂肪增加而脂肪氧化減少，導致肝細胞內(nèi)脂肪蓄積過多的一種病理狀態(tài)。近年來，隨著人們生活方式和飲食結構的改變以及臨床B超技術的進步和廣泛應用，脂肪肝的檢出率不斷提髙，發(fā)病率和發(fā)病人數(shù)明顯增加。我國脂肪肝的發(fā)病率占平均人口的10/。，在肥胖、嗜酒和糖尿病患者中可髙達50%-60%。并且隨著年齡的增長而上升，發(fā)病年齡也有年輕化趨勢。雖然脂肪肝被認為是良性病變，但它是許多慢性肝臟疾病的早期階段，不經(jīng)治療的脂肪肝會逐漸發(fā)展為炎癥細胞浸潤、壞死、纖維化，并可能引起肝細胞癌變。因此，如何在早期阻止脂肪肝的進一步發(fā)展是目前研究的焦點。脂肪肝的病因比較復雜，常見如肥胖、糖尿病、營養(yǎng)不良等，特別是與髙脂血癥有密切關系。通常根據(jù)病因的不同，將脂肪肝分為酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪肝，而髙脂血癥所致的脂肪肝，是屬于非酒精性脂肪肝中的一種類型。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechingallate,EGCG)是綠茶提取物茶多酚中含量最多的一種生物活性成分，諸多研究表明EGCG具有多種生物學功能，包括抗腫瘤、抗氧化、抗菌、抗紫外輻射等。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是提供一種表沒食子兒茶素沒食子酸酯在制備防治髙脂性脂肪肝藥物中的應用。本發(fā)明的技術方案是通過脂肪乳劑灌胃的方法建立高脂性脂肪肝大鼠模型，首次選用EGCG作為治療藥物，研究高脂性脂肪肝大鼠肝組織的病理學改變，觀察EGCG對髙脂性脂肪肝大鼠模型的治療作用，從而為EGCG治療髙脂性脂肪肝提供實驗依據(jù)。本發(fā)明所說的EGCG,其提取方法可參見現(xiàn)有技術，也可商業(yè)購得。本發(fā)明的優(yōu)點是EGCG可以明顯降低髙脂性脂肪肝大鼠的肝臟系數(shù)和血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白-膽固醇(LDL-C)、游離脂肪酸(FFA)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)以及肝組織中TC、TG和肝組織中MDA的含量升髙血清髙密度脂蛋白-膽固醇(HDL-C)和肝組織中超氧化物歧化酶(SOD)的含量。病理組織學檢查結果顯示，給予EGCG治療的大鼠肝細胞脂肪變性程度和超微結構改變明顯減輕。下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步描述其中圖1為EGCG治療6周后對高脂性脂肪肝大鼠病理形態(tài)的影響(HEX200);A:正常對照組；B:模型組C-E:分別為EGCG10、20和40mg/kg治療組；F:陽性藥(非諾貝特)對照組。圖2為EGCG治療6周后對髙脂性脂肪肝大鼠病理形態(tài)的影響(X8000);A:正常對照組模型組；C-E:分別為EGCG10、20和40mg/kg治療組；F:陽性藥(非諾貝特)對照組。具體實施例方式下面結合實施例對本發(fā)明作進一步描述，下列實施例僅用于證明本發(fā)明的實用性，便于對本發(fā)明的技術方案的理解，而并不限制本發(fā)明的保護范圍實施例一、表沒食子兒茶素沒食子酸酯對大鼠髙脂性脂肪肝的治療作用研究1材料與方法1.1實驗動物SD大鼠，雄性，體重160~180g，清潔級，蘇州大學實驗動物中心供應，實驗動物生產(chǎn)許可證號XCYK(蘇)2002-0008,實驗動物使用許可證號SYXK(蘇)2002-0037。實驗期間飼養(yǎng)室溫度20±2*C。1.2藥品和主要試劑EGCG，純度95%，由杭州未田生物技術有限公司提供，批號20071123S。非諾貝特膠襄(陽性對照藥)，由法國利博福尼制藥有限公司提供，批號90052，規(guī)格為200mg/粒，進口藥品注冊證號H20050004,臨用時用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配制1%的藥物濃度。膽固醇和3號膽鹽，由上?？笊锛夹g有限公司提供，批號20070712。丙基硫氧嘧啶，由蘇州東瑞制藥有限公司提供，批號071011004。各指標檢測試劑盒，均由南京建成生物工程研究所提供。1.3實驗方法[16]將SD大鼠隨機分為2組，即正常對照組和造模組，造模組大鼠每天上午8:00-9:30灌服脂肪乳劑(內(nèi)含豬油15%,膽固醇6%,3號膽鹽2。/。，丙基硫氧嘧啶0.2%,丙二醇20%,吐溫-8016。/<)，1ml/100g體重，l次/日，正常對照組灌服等體積的蒸餾水。連續(xù)灌服脂肪乳劑4周后隨機取大鼠3只，病理檢查見肝組織中充滿彌散性脂質(zhì)空泡時，提示高脂性脂肪肝已經(jīng)形成(見Figl和Fig2)。此后繼續(xù)灌服脂肪乳劑2周，并將已形成的脂肪肝大鼠隨機分成EGCG10mg/kg、20mg/kg和40mg/kg三個劑量組，非諾貝特20mg/kg組和脂肪肝模型組，每組大鼠10只，并開始給藥，各給藥組于每天下午2:00-3:30按不同劑量以0.2ml/100g體重灌胃，正常對照組和脂肪肝模型組給予等體積蒸餾水。連續(xù)給藥6周后，于處理前12h禁食，不禁水，然后以4%水合氯醛1ml/100g體重腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，檢測各項指標，取肝臟稱重后分別用冰生理鹽水和三氯甲垸甲醇(1:1)混合液制成10%勻槳，供肝組織SOD、MDA和肝脂質(zhì)測定，另取同一部位兩塊肝臟分別以10%福爾馬林溶液和4%戊二醛溶液固定，分別用光鏡和電鏡檢查肝組織的形態(tài)學改變。1.4血清指標和肝系數(shù)測定按試劑盒提供的方法測定，即血清TC采用膽固醇氧化酶-PAP法測定，TG采用磷酸甘油氧化酶-PAP法測定，HDL-C采用磷鎢酸鎂(PTA-Mg++)沉淀法測定，LDL-C按下列公式計算，LDL-C-TC-(TG/2.2+HDL-C),ALT采用賴氏法測定，AST和FFA采用比色法測定。肝系數(shù)-肝重(g)/鼠重(100g)。1.5肝脂質(zhì)測定每鼠稱取肝組織500mg,加三氯甲烷甲醇(1:1)混合液至5ml后勻漿，勻漿液置4r24h后離心，取上清20jxL置另一試管中，室溫放置12h以上，待三氯甲烷和甲醇揮發(fā)后，分別采用膽固醇氧化酶-PAP和磷酸甘油氧化酶-PAP法測定肝中的TC和TG含量。1.6肝組織中SOD、MDA和蛋白含量測定稱取肝組織200mg,加冰生理鹽水2ml后勻漿，離心取上清，分別按試劑盒方法測定SOD、MDA和蛋白含量。1.7統(tǒng)計學處理實驗數(shù)據(jù)以x士s表示，顯著性檢驗采用one-wayANOVA檢驗，對肝臟的病理學檢査結果采用等級資料的秩和檢驗。2結果2.1對高脂性脂肪肝大鼠體重、肝重和肝系數(shù)的影響與正常對照組相比較，高脂性脂肪肝模型組大鼠肝重和肝系數(shù)明顯升髙(P<0.01)。連續(xù)給藥6周后，EGCG能顯著地降低高脂性脂肪肝大鼠肝重和肝系數(shù)(P<0.05或P^.01)，并呈劑量依賴性趨勢，但非諾貝特明顯升高商脂性脂肪肝大鼠的肝重和肝系數(shù)(P<0.01〉。給藥各組的大鼠體重未見明顯影響(見表l)。表1對髙脂性脂肪肝大鼠體重、肝重和肝臟系數(shù)的影響(11=只數(shù)；mean士S，D.)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>##戶<0,01，與正常對照組比較；承PO.05,"PO.01，與模型組比較2.2對高脂性脂肪肝大鼠血脂影響與正常對照組相比較，脂肪肝模型組大鼠血清TC、TG和LDL-C顯著升髙(P<0.05或P<0.01)。連續(xù)給藥6周后，EGCG能顯著地降低高脂性脂肪肝大鼠血清TC、TG、LDL-C、FFA的水平(P〈0.05或P<0.01),同時對血清HDL-C有一定的升髙作用(P〈0.05)。非諾貝特也能明顯降低高脂性脂肪肝大鼠血清TC、TG、LDL-C和FFA含量(P<0.05或P<0.01),但對HDL-C未見明顯升高作用(見表2)。表2對髙脂性脂肪肝大鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C和FFA的影響(11=只數(shù)；mean士S.D.)組別nTC(mmol/L)TG(mmol/L)HDL-C(mmol/L)LDL-C(mmol/L)FFA(umol/L)正常對照組102.19±0.380.95±0.150.86±0,140.90±0.45465±101模型組102.88±0.37##1.27±0.29##0.81±0.161.50±0.46##557±123EGCG10mg/kg102.47±0.51*1.04±0.19*0.93±0.151.07±0.42*425±152*EGCG20mg/kg102.40±0.54*0.96±0.]7**0.95土0.14*1.01±0.57*403±156*EGCG40mg/kg10102.23土0.46**0.88±0.24**0.97±0.14*0.86±0.47"391士121**非諾貝特20mg/kg2.04±0.43**0.80±0.14**0.88±0.090.80土0.48"438±117*PO.Ol，與正常對照組比較；*P<0.05,**尸<0.01，與模型組比較2.3對髙脂性脂肪肝大鼠肝功能指標的影響與正常對照組相比較，脂肪肝模型組大鼠血清ALT和AST水平明顯升高(P<0.05)。連續(xù)給藥6周后，EGCG可以降低大鼠血清ALT和AST水平(P<0.05或P<0.01)，但非諾貝特對ALT和AST未見有明顯影響(見表3)。表3對高脂性脂肪肝大鼠肝功能指標的影響(11=只數(shù)；ineaniS.D.)組別nALT(KarU/L)AST(KarU/L)]f.常對照組1024.4±6.882.1±11.1模型組1033.0±8.7#93.8±〗2.2EGCG10mg/kg1026.0±9.49I.4±11.2EGCG20mg/kgEGCG40mg/kg非諾貝特20mg/kg10101023.6±6.6*21.6±4.8**27.7±7.381.1±12.8*78.3±10.2**86.6±11.3#^<0.05,與正常對照組比較；*尸<0.05,**尸<0.01，與模型組比較2.4對髙脂性脂肪肝大鼠肝組織中TC、TG、SOD和MDA的影響與正常對照組相比較，高脂性脂肪肝模型組大鼠肝組織中TC、TG和MDA顯著增加(P<0.05或P<0.01),SOD明顯降低(P<0.05)。連續(xù)給藥6周后，EGCG能顯著地降低髙脂性脂肪肝大鼠肝組織中TC、TG和MDA含量7(P<0.05或P<0.01)，升高SOD水平(P<0.05或P<0.01)。非諾貝特顯著地降低肝組織中TC、TG和MDA含量(P<0.05或P<0.01),但是對SOD未見明顯影響(見表4)。表4對髙脂性脂肪肝大鼠肝組織中TC、TG、SOD和MDA的影響(n^只數(shù)；mean士S.D.)#P<0.05,##P<0.01,與正常對照組比較*P<0.05，**P<0.01,與模型組比較脂質(zhì)變性程度正常對照組模型組EGCG非諾貝特20mg/kg10mg/kg20mg/kg40mg/kg—100023+027667++08211+++000000<0.01<0.01<0.01<0.01<0.012.5對高脂性脂肪肝大鼠肝臟的病理組織學觀察大鼠肝臟經(jīng)石蠟切片并行HE染色，光鏡下觀察其病理組織學變化。正常對照組肝細胞排列呈索狀結構，結構正常。模型組可見彌漫性的脂質(zhì)空泡，并有融合現(xiàn)象，給予EGCG10-40mg/kg后，肝細胞脂質(zhì)變性的程度明顯減輕，肝細胞結構趨于正常(見表5、圖1)。電子顯微鏡下觀察可見正常對照組肝細胞結構正常，而高脂性脂肪肝模型組大鼠肝細胞超微結構明顯改變，肝細胞線粒體腫脹、染色質(zhì)邊聚和空泡變性，并且充滿大小不等的脂滴等。連續(xù)給藥6周后，EGCG能顯著地改善肝細胞的線粒體腫脹、染色質(zhì)邊聚、空泡變性和脂滴。非諾貝特對肝細胞超微結構的影響基本上與EGCG作用相似(見圖2)。表5對高脂性脂肪肝大鼠肝臟的病理組織學觀察組別nTC(mg/'gwettissue)TG〔mg/gwettissue)SOD(U/mgprot)MDA('nmol/mgprot)正常對照組107.53±1.7137.0±7.311S.1±14.03.70=0.62模頓09.82±.53#*5.8土4.9##101.2±14.9#4.27=0.52#EGCG10mg/kg108.33±.29*46.3±6.2*111.2±13.93.67二0.7PEGCG20mg/kgEGCG40mg/kg非諾貝特20mg/kg1010108.02±1.03**7.71±〗.52**7.74±1.54**45.4±4.5**43.2±5.0**4(5.3±fi.4*115.8±]5.2*]20.4±10.9**101.3±12.03.51=0.61**3.45士0.53"3.41±0.64**小結1、給藥6周后，EGCG可顯著降低高脂性脂肪肝大鼠肝重和肝臟系數(shù)。2、光鏡和電鏡結果顯示，給予EGCG治療6周后，高脂性脂肪肝大鼠肝細胞脂肪變性程度和超微結構改變明顯減輕。3、給予EGCG治療6周后，髙脂性脂肪肝大鼠血清TC、TG、LDL-C、FFA明顯降低，并且肝組織中的TC和TG也顯著下降。這些結果表明，EGCG通過降低血脂以及肝臟脂質(zhì)的含量可能對髙脂性脂肪肝大鼠具有一定的治療作用。4、給予EGCG治療6周后，髙脂性脂肪肝大鼠血清ALT和AST水平明顯降低。此結果表明，EGCG不僅對髙脂性脂肪肝大鼠肝臟沒有毒性作用，反而具有一定的保肝作用。5、給予EGCG治療6周后，高脂性脂肪肝大鼠肝臟中SOD含量明顯升高以及MDA含量明顯降低，表明EGCG可能通過其抗氧化的作用對髙脂性脂肪肝大鼠肝臟具有一定的保護作用實施例二一種用于治療脂肪肝的制劑，由純度為》90。/。的表沒食子兒茶素沒食子酸酯構成，通過添加通用的藥用輔助成份，可以制成片劑、膠囊劑、沖劑、滴劑、顆粒劑或針劑。權利要求1.一種表沒食子兒茶素沒食子酸酯在制備防治高脂性脂肪肝藥物中的應用。全文摘要本發(fā)明公開了一種表沒食子兒茶素沒食子酸酯在制備防治高脂性脂肪肝藥物中的應用，通過灌服脂肪乳劑復制大鼠高脂性脂肪肝模型，首次選用表沒食子兒茶素沒食子酸酯作為治療藥物，觀察高脂性脂肪肝大鼠肝組織的病理學改變，研究表沒食子兒茶素沒食子酸酯對高脂性脂肪肝大鼠模型的治療作用，從而為表沒食子兒茶素沒食子酸酯治療高脂性脂肪肝提供依據(jù)。文檔編號A61K31/352GK101461802SQ200910114868公開日2009年6月24日申請日期2009年1月16日優(yōu)先權日2009年1月16日發(fā)明者周文軒,斌葛,謝梅林,郭次儀,顧振綸申請人:蘇州中藥研究所