專利名稱：水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白及其制備方法以及其在制藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及一種生物免疫制品，特別是涉及一種水痘和治療帶狀皰 疹的特異免疫球蛋白及其制備方法，以及其在制藥物中的應用。
背景技術：
水痘-帶狀皰疹病毒(英文縮寫VZV)屬于人類單純皰疹病毒3型，其原發(fā)感染為水痘。水痘是兒童常見的一種急性、高傳染性，可經呼吸道和接觸傳播的感染性疾病， 一般預后良好，但某些人群(長期應用放、化療病人，外科手術病人，器官移植病人等)及成人感染VZV 后癥狀甚為嚴重， 一旦在易感人群中出現水痘病人，就很難預防水痘在該群體中爆發(fā)。VZV 潛伏后再激活則引起帶狀皰疹。近年來，帶狀皰疹(英文縮寫HZ)的發(fā)病率明顯增高，且引起的后遺神經痛(英文縮寫P麗)用抗病毒藥物治療無明顯療效。水痘-帶狀皰疹及相關性后遺癥逐漸成為重要的公共衛(wèi)生問題而日益受到國家重視。目前我國水痘的預防主要是應用水痘疫苗進行主動免疫，但個體水痘的預防接種不能改 變水痘的爆發(fā)及流行病學特征。目前治療帶狀皰疹常用的抗病毒藥物一般為化學合成藥、中 草藥以及干擾素等生物制劑，但其特異性差，療效也不能充分肯定。特異性免疫球蛋白是由病毒等病原體感染機體或主動接種疫苗后，在機體內產生的具有 特異性、高活性及中和作用的球蛋白。使用特異性免疫球蛋白可針對性的預防病毒等病原體 的感染及其感染后所發(fā)生疾病的治療，這種方法稱為被動免疫。被動免疫是控制感染性疾病 暴發(fā)及治療的有效途徑。發(fā)明內容本發(fā)明要解決的技術問題是針對目前人免疫球蛋白對水痘-帶狀皰疹病毒無特異性的缺 點，提供一種療效好的高效價水痘-帶狀皰疹病毒人免疫球蛋白，并提供一種簡單方便成本低 的制備方法，以及其在制備用于預防水痘的發(fā)生和治療帶狀皰疹后遺神經痛藥治療的藥物中 的應用。為解決上述技術問題，本發(fā)明采用如下技術方案3，其中，水痘-帶狀皰疹病毒中和抗體效價大于等于 50IU/mL，其免疫球蛋白純度大于等于總蛋白的90%，蛋白質含量小于等于180g/L。 本發(fā)明所述的水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白，其中，僅與抗人血清產生沉淀線。 本發(fā)明所述的水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白，其中，與正常人血清比較，主要沉淀線為IgG。本發(fā)明所述的水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白，其中IgG單體與二聚體含量之和大于等于90%。本發(fā)明所述的水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白，其中劑型為液體針劑型或凍干劑型，規(guī)格 為125 IU/2. 5 mL/瓶、250 IU/5. 0 mL/瓶。本發(fā)明所述水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白的制造方法，其中，按以下步驟制備a. 檢測符合國家采血標準的供血漿者的血槳或血清，取其中水痘-帶狀皰疹病毒中和抗 體IgG，選擇中和抗體效價大于等于2IU/mL者的血槳為水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白的制備 原料血漿，并將所得血漿混合；b. 將a步驟所得的混合原料血漿按低溫乙醇或層析法蛋白分離工藝，分離提取免疫球蛋 白組分，經超濾、層析、病毒滅活、配制、除菌、分裝等工序制成。本發(fā)明所述水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白的制造方法，其中，步驟a的方法為選擇符合國家采血標準的供血漿者，接種國家批準的水痘疫苗，接種15天-20日時，以 固相酶聯免疫法(ELISA)定量檢測供血漿者血漿或血清的水痘-帶狀皰疹病毒中和抗體IgG， 中和抗體效價大于等于2IU/mL的血漿為水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白的合格原料血漿，所述 符合國家采血標準包括以下項目以雙縮脲法檢測蛋白質含量大于等于55g/L，丙氨酸氨基轉 移酶(賴氏法)不高于25單位，乙型肝炎表面抗原陰性，梅毒陰性，HIV-1/HIV-2抗體陰性， HCV抗體陰性者。本發(fā)明所述水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白的制造方法，其中，每批次的混合原料血槳由 不少于IOO名供血漿者的原料血漿混合而成，測定混合原料血漿中的水痘-帶狀皰疹病毒中和 抗體效價，留中和抗體效價大于等于4IU/mL的混合原料血漿用以制備水痘-帶狀皰疹人免疫 球蛋白，如所得血漿的水痘-帶狀皰疹病毒中和抗體效價小于4IU/mL，則該批次血漿不能使用， 只能另作它用。本發(fā)明所述的水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白在制造預防易感人群患水痘的藥中的應用， 其使用量為10 15IU/kg體重，且最大給藥劑量為625IU，最小給藥劑量125IU。本發(fā)明所述的水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白在制造治療帶狀皰疹及其后遺神經痛藥物中的應用，其使用劑量為1000 5000IU每天。本發(fā)明的優(yōu)點為提供了一種水痘-帶狀皰疹病毒中和抗體效價大于等于50IU/mL，其免 疫球蛋白純度大于等于總蛋白的90%，蛋白質含量小于等于180g/L的人免疫球蛋白，因為其 中的水痘-帶狀皰疹病毒中和抗體效價大于等于50IU/mL，故此其可以用以防治水痘病和治療 帶狀皰疹后遺神經痛，并取得良好的效果。為了得到水痘-帶狀皰疹病毒中和抗體效價大于等 于50IU/mL的人免疫球蛋白，發(fā)明人在采集血漿的時候，有目的的篩選水痘-帶狀皰疹病毒中 和抗體效價大于2IU/mL的獻血者的血漿，該方法在不提高制造成本的情況下，提升了最終 產品中水痘-帶狀皰疹病毒抗體的濃度，提高了藥效且簡單方便。
具體實施方式
實施例11、 供血漿者的免疫2008年8月1日至2008年9月7日選擇身體健康的符合國家采血標準的供血漿者254 名，同一名供血者在O、 25天分別接種水痘減毒活疫苗(疫苗生產廠家為中國生物技術集團 公司上海生物制品研究所，批號為20080803， 0.5ml/支)各1支。所述符合國家采血標準包括 以下項目以雙縮脲法檢測蛋白質含量大于等于55g/L,丙氨酸氨基轉移酶(賴氏法)不高于25單位，乙型肝炎表面抗原陰性，梅毒陰性，HIV-l/HIV-2抗體陰性，HCV抗體陰性者。2、 供血漿者的血漿篩選采集2008年9月21起選擇固相酶聯免疫法分別定量檢測已接種水痘疫苗供血漿者254人血 漿中水痘-帶狀皰疹病毒抗體IgG，水痘-帶狀皰疹病毒酶聯免疫試劑盒為中國藥品生物制品 檢定所生產,批號為20090424，共檢出中和抗體效價大于2IU/mL的供血漿者分別為158人， 將該158人的血漿低溫冰凍儲存。3、 水痘、帶狀皰疹人免疫球蛋白的制備(1) 將水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白合格原料血漿158份融化混合，得混合原料血漿90000 毫升，用固相酶聯免疫法，水痘-帶狀皰疹病毒酶聯免疫試劑盒為中國藥品生物制品檢定所生 產，批號為20090424,定量檢測混合后混合原料血漿水痘-帶狀皰疹病毒中和抗體效價為 6.7IU/mL;(2) 將(1)步驟所得的無菌混合原料血漿，在2'C下離心去除冷沉淀7. 6Kg;(3) 將(2)步驟中去除冷沉淀后得到血漿83L，用8. 3L生理鹽水稀釋，用256mlPH4. 0醋酸 緩沖溶液調節(jié)反應液pH值至6.5，加95%乙醇19.2L至反應液中，最終乙醇濃度為20%，反應液終體積為110L,使用冷媒控制反應液溫度至-4. 5'C并保持，板框壓濾分離得沉淀14kg;(4) 將步驟(3)的沉淀用(TC 0. 01mol/L NaCl溶液126L攪拌溶解，終體積為140L;(5) 在步驟(4)中得到的上清液中加50%乙醇47. 6L至反應液中，最終乙醇濃度為度為17%， 用PH4. 0醋酸緩沖溶液365ml調節(jié)反應液pH值至5.1，反應液終體積為188L，使用冷媒控制 反應液溫度至-4.5'C并保持，板框壓濾分離去除沉淀，收集上清液為178L;(6) 將步驟(5)中得到的上清液進行超濾透析四遍后上DEAE-S印harose-Fast Flow弱陰離 子交換層析，反應液溫度為10 'C，收集流出液為150L;(7) 將步驟(6)所得的流出液進行再超濾，用2mol/L的冰醋酸780ml調節(jié)流出液pH值為4. 0， 溫度至l(TC,透析8遍后濃縮至10L，測蛋白含量為8.7%、 pH為3.90;(8) 將步驟(7)所得的濃縮液用2mol/L的冰醋酸12ml調pH至3. 85，加入30%麥芽糖5L 使最終濃度在10%，蛋白含量剛好為5. 8%;(9) 將上述步驟(8)所得原液經24 25'C孵放21天之后用納米膜過濾的病毒滅活處理；21 天后將所得的液體再返回經超濾、脫醇、脫鹽、濃縮，得到原液3520 ml，用固相酶聯免疫 法，定量檢測水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白中和抗體效價為120IU/ml，水痘-帶狀皰疹病毒酶 聯免疫試劑盒為中國藥品生物制品檢定所生產，批號為20090424;(10) 加入lmol/L的碳酸氫鈉溶液600ml調節(jié)步驟(9)所得原液pH值至6. 8,并加入30%葡萄 糖溶液740ml至原液中，使葡萄糖終濃度為4。/f),補加生理鹽水800inl，用固相酶聯免疫法，定 量檢測水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白中和抗體效價為75IU/ml，，水痘-帶狀皰疹病毒酶聯免疫 試劑盒為中國藥品生物制品檢定所生產，批號為20090424，再經0.45um濾膜過濾得半成品 5560 ml。(1D除菌分裝為2.5 ml/瓶成品，共計1780瓶，取樣25瓶交質量檢定部檢定。 4、成品檢定(1) 活性以酶聯免疫法檢測，使用中國藥品生物制品檢定所的酶聯免疫免疫試劑盒，批號為 20090424，水痘-帶狀皰疹病毒中和抗體效價為76.2IU/ml，以中和蝕斑法檢測效價為74.8 IU/ml。(2) 鑒別免疫雙擴散法與抗人的血清反應，抗人血清的生產廠家為中國藥品生物制品檢定所， 批號20060216，產生沉淀線，與抗馬、抗牛、抗豬、抗羊的血清未產生沉淀線。免疫電泳法DYY-2C型電泳儀，瓊脂糖凝膠，100V恒壓電泳2小時，與正常人血清反應，主要沉淀線為IgG。(3) 蛋白質含量 定氮法檢測126. 7g/L。(4) 純度檢測方法全自動電泳掃描法 免疫球蛋白純度為98.5%。(5) 分子大小分布 檢測方法高壓液相色譜檢測 IgG單體與二聚體含量之和97. 4%。(6) 外觀為無色澄清液體，無渾濁。(7) 熱穩(wěn)定性57°〇水浴中保溫4小時后，無凝膠化及絮狀物。(8) pH值用生理氯化鈉溶液將供試品蛋白質含量稀釋成10g/L， pH值為6. 9。(9) 無菌檢査 無雜菌生長；合格。 卿異常毒性觀察7天，用10只小白鼠和4只豚鼠(sps級，從安徽醫(yī)科大學購得)，取0. 5ml腹腔注 射健存，體重平均增加4g;合格。(ll)熱原檢查使用成年兔子(普通級，從安徽醫(yī)科大學購得)3只，按0.45ml/Kg靜脈 注射實施例1所得的免疫球蛋白，升溫總和為0. 87°C;個別升溫分別為0. 28°C、 0. 39°C、 0. 20 °C;合格。(1加CV抗體檢查為陰性；合格。(13)HIVL2抗體檢查，酶聯試劑盒，北京華大吉比愛生物公司，批號為20071001，為陰性；合格。實施例2 預防水痘7在水痘高發(fā)區(qū)某小學，隨機選擇三年級4個班共262人。實驗組126人，平均年齡9. 8歲， 其中男65人，女61人；均應用實例1制備的水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白肌肉注射125IU / 人，僅注射1次，觀察4個月，無一例發(fā)生水痘，發(fā)病率為0%?？瞻讓φ战M136人，平均年 齡IO. l歲，其中男69人，女67人；觀察4個月，31例發(fā)生水痘，發(fā)病率為22.8%。實施例3 帶狀皰疹的治療實驗組選擇帶狀皰疹病人55例，男35例，女20例，平均年齡51.7歲，應用實例1 制備的水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白肌肉注射3500IU每人/天，連續(xù)7天，全部病例均疼痛消 失，皰疹面積減少50%以上，有效率100%。對照組選擇帶狀皰疹病人35例，男20例，女15例，平均年齡52.5歲，均應用靜注 人免疫球蛋白10g/天及一般對癥治療，連續(xù)觀察7天，疼痛消失，皰疹面積減少50%以上16 例，有效率45.7%。上面所述的實施例僅僅是對本發(fā)明的優(yōu)選實施方式進行描述，并非對本發(fā)明的范圍進行 限定，在不脫離本發(fā)明設計精神前提下，本領域普通工程技術人員對本發(fā)明技術方案作出的 各種變形和改進，均應落入本發(fā)明的權利要求書確定的保護范圍內，如未接種水痘疫苗的供 血漿者血清或血漿中水痘-帶狀皰疹病毒抗體IgG效價也可以大于2IU/mL,該人群的血漿也 可以作為原料血漿。
權利要求
1、水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白，其特征在于，水痘-帶狀皰疹病毒中和抗體效價大于等于50IU/mL，其免疫球蛋白純度大于等于總蛋白的90％，蛋白質含量小于等于180g/L。
2、 根據權利要求l所述的水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白，其特征在于，僅與抗人血清產生沉淀線。
3、 根據權利要求l所述的水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白，其特征在于，與正常人血清比 較，主要沉淀線為IgG。
4、 根據權利要求l所述的水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白，其特征在于IgG單體與二聚體 含量之和大于等于90%。
5、 根據權利要求l所述的水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白，其特征在于劑型為液體針劑型 或凍干劑型，規(guī)格為125 IU/2.5 mL/瓶、250 IU/5. 0 mL/瓶。
6、 根據權利要求l至5任意一項所述水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白的制造方法，其特征 在于，按以下步驟制備a. 在符合國家采血標準的供血中，取其中水痘-帶狀皰疹病毒中和抗體IgG效價大于等于 2IU/mL者的血漿為水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白的制備原料血槳，并將所得血漿混合；b. 將a步驟所得的混合原料血漿按低溫乙醇或層析法蛋白分離工藝，分離提取免疫球蛋 白組分，經超濾、層析、病毒滅活、配制、除菌、分裝等工序制成。
7、 根據權利要求6所述水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白的制造方法，其特征在于，步驟a 的方法為選擇符合國家采血標準的供血漿者，接種國家批準的水痘疫苗，接種后15天-90天時， 以固相酶聯免疫法定量檢測供血漿者血漿或血清的水痘-帶狀皰疹病毒中和抗體效價,大于等 于2IU/mL者的血漿為水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白的原料血漿。
8、 根據權利要求6或7所述水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白的制造方法，其特征在于，將 大于等于100名供血漿者的原料血漿混合成每批次的混合原料血漿，測定混合原料血漿中的 水痘-帶狀皰疹病毒中和抗體效價，留中和抗體效價大于等于4IU/mL的混合原料血漿用以制 備水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白。
9、 根據權利要求1所述的水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白在制造預防易感人群患水痘的藥 中的應用。
10、 根據權利要求1所述的水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白在制造治療帶狀皰疹及其后遺神經痛藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白，其中，水痘-帶狀皰疹病毒中和抗體效價大于等于50IU/mL，其免疫球蛋白純度大于等于總蛋白的90％，蛋白質含量小于等于180g/L。其制造方法為在符合國家采血標準的供血漿者中，取其中水痘-帶狀皰疹病毒中和抗體IgG效價大于等于2IU/mL，蛋白質含量大于等于55g/L者的血漿為水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白的制備原料血漿，并將所得血漿混合；再將所得的原料血漿按低溫乙醇或層析法蛋白分離工藝，分離提取免疫球蛋白組分，經加壓過濾、層析、離心、超濾、病毒滅活、調配、除菌、分裝等工序制成。其可用于制備預防水痘和治療帶狀皰疹后遺神經痛藥物的制備。
文檔編號A61K39/42GK101591389SQ200910088040
公開日2009年12月2日 申請日期2009年6月30日 優(yōu)先權日2009年6月30日
發(fā)明者孫思才, 張振湖, 胡輝恒 申請人:同路生物制藥有限公司