專(zhuān)利名稱：Orf7缺陷型水痘病毒株、含有該毒株的疫苗及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病毒學(xué)和生物藥學(xué)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明提供了缺陷型水痘病毒株、 含有該毒株的疫苗及其應(yīng)用，為水痘-帶狀皰疹病毒的治療和預(yù)防提供良好的候選疫苗藥 物
背景技術(shù)：
水痘-帶狀皰疹病毒(Varicella zoster virus :VZV，簡(jiǎn)稱“水痘病毒”或“VZV”) 是嚴(yán)格種屬特異性的病毒，是導(dǎo)致人患水痘或帶狀皰疹的致病因子。美國(guó)專(zhuān)利3985615中 公開(kāi)了 P-Oka株通過(guò)豚鼠胚胎組織(GPEC)多次傳代，產(chǎn)生減毒的V-Oka病毒，制備預(yù)防水 痘的V-Oka活疫苗。美國(guó)專(zhuān)利4000256中敘述了用人胚成纖維細(xì)胞WI-38株傳代培養(yǎng)VZV病 毒10-80次生產(chǎn)VZV減毒疫苗。迄今為止，只有P-Oka株經(jīng)細(xì)胞傳代獲得的“水痘病毒減毒 岡株”(特公昭53-41202號(hào)公報(bào))；Lancet 2 1288-1290,1974)為WHO批準(zhǔn)的唯一用于預(yù)防 水痘或帶狀皰疹疫苗制備的毒株，該毒株制備的疫苗在全球得到了廣泛使用[Requirement for Varicella Vaccine (Live)Adopted 1984 :WH0Technical Report Series, No. 725, pp.102-104，1985]。水痘病毒減毒R株鑒定的專(zhuān)利CN1163604C，從分子水平上揭示該毒株是由多個(gè)不 同序列組成的混合株。野毒株可能存在于其中，源于V-Oka疫苗接種者產(chǎn)生V-Oka株的帶 狀皰疹已有報(bào)道。故該減毒株的潛在危害性還是存在的，但是，現(xiàn)在還沒(méi)有其它抗VZV的疫 苗株上市。該病毒具有嚴(yán)格種屬特異性，人是其唯一的自然宿主，病毒基因的功能研究難度 較大；再者該病毒對(duì)細(xì)胞具有強(qiáng)烈的依賴性，獲得可用于轉(zhuǎn)化的VZV病毒DNA非常困難，故 該病毒的研究進(jìn)展較為緩慢。隨著分子遺傳學(xué)研究的飛速發(fā)展，基因操作手段的不斷革新，基因插入或刪除成 為發(fā)現(xiàn)新基因或研究基因功能的重要手段，突破了 VZV基因研究的瓶頸。1993年Jeffrey I.等在 “Generation of varicella-zoster virus (VZV) and viral mutants from cosmid DNA s :VZV thymidylate synthetase is not essential for replication invitro，， 一文中通過(guò)科斯質(zhì)粒(Cosmid)實(shí)現(xiàn)對(duì)腺苷合成酶基因的操作，揭示將終止密碼子引入腺 苷合成酶基因?qū)е略撁覆槐磉_(dá)，但不影響病毒生長(zhǎng)速率和對(duì)阿昔洛韋的敏感性。這項(xiàng)研 究開(kāi)創(chuàng)了體外VZV基因操作方法，為基因功能研究奠定了基礎(chǔ)。2000年George W等在 “OpenReading Frame S/L of Varicella-Zoster Virus Encodes aCytoplasmic Protein Expressed in Infected Cells” 一文中描述了通過(guò)基因部分結(jié)構(gòu)刪除的方法發(fā)現(xiàn)了 VZV 新基因，即ORF S/L。隨著細(xì)菌人工染色體(BAC)在研究中的應(yīng)用，組織培養(yǎng)技術(shù)的進(jìn) 步，異種生物間器官移植屏障的突破(聯(lián)合免疫缺陷型小鼠的開(kāi)發(fā))，拓寬了種屬特異 的VZV基因功能研究的空間，可以在體外或動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行VZV基因功能研究。2004年 Kazuhiro N.等在"Cloning of thevarieel la-zoster virus genome as aninfectious bacterialartif icial chromosome in Escherichia coli，，一文中揭不被克隆到 BAC 載體 上的VZV Oka株全基因組，可以在大腸桿菌和人胚肺細(xì)胞中增殖，BAC可被一同轉(zhuǎn)化到人胚肺細(xì)胞中的Cre酶精確切除，產(chǎn)生的重組VZV病毒具有ρ-Oka同樣結(jié)構(gòu)，完全具有親本病毒的特性。BAC的應(yīng)用為VZV的功能研究帶來(lái)了極大便利，加速了 VZV基因功能研究進(jìn)程。 2007年Zhang Ζ.等利用BAC載體和基因同源重組技術(shù)揭示多個(gè)基因的體內(nèi)外功能。

發(fā)明內(nèi)容
本申請(qǐng)人以含P-Oka全基因組的BAC(VZV-BAC)為基礎(chǔ)，通過(guò)基因重組手段，獲得 0RF7缺失的病毒株VZV-7D，保藏號(hào)為CGMCC3207，保藏日期為2009年7月28日，保藏單位 名稱為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏單位地址為北京市 朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所(郵編100101)，該保藏的病毒株VZV-7D的分類(lèi)命 名為水痘病毒。體內(nèi)外證實(shí)該病毒株不感染皮膚和感覺(jué)神經(jīng)節(jié)，故不存在再活化產(chǎn)生帶狀 皰疹的潛在危害；該毒株可在MRC-5、Mewo細(xì)胞上生長(zhǎng)，且同P-Oka株生長(zhǎng)一致；該毒株保 留了 P-Oka株的所有糖蛋白，其免疫原性理應(yīng)同P-Oka株的免疫力相同；該毒株是通過(guò)Karf 篩選到的單一克隆株，不存于混合型V-Oka株的潛在危害；由于整個(gè)0RF7刪除，VZV-7D株 不可能產(chǎn)生回復(fù)突變，因而，以VZV-7D株制備減毒活疫苗更為安全和有效。而且，VZV-7D至 少可以克隆IOkb的外源基因而不影響其本身生長(zhǎng)和增殖，故可以用作外源基因表達(dá)載體， 制備用于診斷、預(yù)防和治療的生物制品。申請(qǐng)人:如下進(jìn)行了 P-Oka株0RF7缺失株(VZV-7D)的制備。因?yàn)樗?帶狀皰疹 病毒(VZV)的0RF7位于病毒基因組的8607-9386bp之間，編碼一個(gè)29kDa的蛋白，可能位 于皮層結(jié)構(gòu)中，它的功能仍不清楚。VZV 0RF7蛋白與單純皰疹病毒(HSV)中的UL51為同源 蛋白。HSV UL51基因編碼一個(gè)磷酸化蛋白，分子量約為27，29和30kDa，在感染后期表達(dá)， 與病毒出細(xì)胞體有關(guān)(Daikoku，Ikenoya et al，1998)。一項(xiàng)研究報(bào)告指出HSV UL51蛋白 定位于感染細(xì)胞的高爾基體標(biāo)志蛋白上，UL51蛋白通過(guò)N-端第9位的半胱氨酸鉚釘?shù)礁?爾基體上(Nozawa，Daikoku，et al，2003)。UL-51無(wú)效突變揭示其在HSV復(fù)制循環(huán)中的作 用。最近的研究顯示突變株病斑較小，最大滴度比野生株降了 100倍。電子顯微鏡顯示核 衣殼的形成不受UL51刪除影響，但是，病毒出核周質(zhì)腔受到嚴(yán)重影響，這現(xiàn)象揭示UL51蛋 白涉及到HSV病毒顆粒的成熟和出核(Nozawa，Kawaguchi et al. 2005)。通過(guò)偽狂犬病毒 (PrV)UL51缺失突變揭示此基因表達(dá)產(chǎn)物也具有相似的功能。一步生長(zhǎng)曲線揭示PrV-De It aUL51F不僅滴度稍有下降，而且病斑減小明顯，只有野生株大小的30%。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的衣殼 大量存在，病毒無(wú)包被或處于包被不同階段，所以，研究結(jié)果推斷UL51蛋白參與病毒的外 出，對(duì)病毒復(fù)制不是必需的(Klupp，Granzow et al. 2005)。本發(fā)明以來(lái)自斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院Dr. Ann Arvin實(shí)驗(yàn)室的P-Oka臨床分離株為材 料，以VZV-BAC(P-Oka)為框架，應(yīng)用細(xì)菌同源重組原理產(chǎn)生重組克隆。全長(zhǎng)0RF7被Kanlr基 因取代而產(chǎn)生7D-VZVBAC。7D-VZVBAC與含Cre酶的重組質(zhì)粒一同電轉(zhuǎn)MRC-5細(xì)胞，產(chǎn)生無(wú) 0RF7的水痘病毒(VZV-7D)克隆株。VZV 0RF7刪除突變體構(gòu)建基于Iuc VZV BAC (Zhang et al. 2007)。操作過(guò)程見(jiàn) 圖1。A.大腸桿菌DY380株提供高效同源重組系統(tǒng)，所需同源序列短至40bp。同源重組酶 受溫度控制，32°C抑制/42°C激活。B.刪除0RF7，設(shè)計(jì)的兩條引物包含20bp的卡那霉素抗 性基因同源核苷酸序列和0RF7刪除區(qū)起始或終止密碼子相連的40bp同源序列。上游引物(F)
GAT TTA TCC ATA GTT CAA TAC GTT GGA AAG CCA GTC MT CGC TCT TGTTGG CTA GTG CGT A(SEQ ID NO :1)，下游引物(R):AM CAT ACA CCA GAA ACG TTT TTA GTT TTT ATT TCA ATA TTC TGC CAGTGT TAC AAC CAA(SEQ ID NO :2)?？敲顾乜剐曰驈馁|(zhì)粒pGEM-or iV/kanl上擴(kuò)增(Netterwald，Yang etal. 2005)，PCR產(chǎn)物用DpnI酶進(jìn)行消化，用Qiagen凝膠提取試劑盒進(jìn)行回收。C.以 1. 6ky，250 μ F 的 BioRad Gene Pulser II 電轉(zhuǎn)儀將大約 200ng 的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)進(jìn)載有 VZVLuc BAC的DY380菌體中。D.利用重組酶42°C激活/32°C抑制的特性，完成Kanlr基因與0RF7 的同源重組，0RF7被Karf基因取代，在32°C下從含有30 μ g/ml卡那霉素的瓊脂板上選擇 單克隆的重組子，從大腸桿菌中分離水痘病毒突變株(0RF7缺失)VZV-BAC的DNA。E.所 得病毒基因組完整性由HindIII酶切檢驗(yàn)，重組DNA經(jīng)PCR檢驗(yàn)。F. 7D-BA⑶NA在DY380 中增殖并被純化提取。G.所得的7D-BA⑶NA單獨(dú)電轉(zhuǎn)染至(Marchini，Liu et al. 2001) MRC-5細(xì)胞，產(chǎn)生7D-BAC，BAC上帶的GFP可以用于病毒在細(xì)胞中生長(zhǎng)增殖研究或與Cre表 達(dá)載體一同電轉(zhuǎn)染至(Marchini，Liu et al. 2001)MRC_5細(xì)胞，BAC被Cre酶從其兩端的 IoxP酶切位點(diǎn)完全切除，產(chǎn)生VZV-7D病毒。VZV-7D在Mewo細(xì)胞或MRC-5細(xì)胞中的生長(zhǎng) 特性同P-Oka —致，也沒(méi)有改變病毒在胸腺組織的生長(zhǎng)增殖特性，但是，缺失突變的VZV-7D 不感染皮膚、神經(jīng)瘤細(xì)胞和感覺(jué)神經(jīng)節(jié)，這為疫苗的開(kāi)發(fā)帶來(lái)了希望。含有熒光素酶基因的 VZV-7D (VZV-7DLuc)按照 Zhang 等(Journal of Virology, S印t，2007，p，9024-9033)描述 的方法進(jìn)行構(gòu)建。VZVIDui?？捎糜隗w內(nèi)VZV-7D功能研究的監(jiān)測(cè)。目前尚無(wú)任何VZV-7D的 學(xué)術(shù)報(bào)道。據(jù)此完成了本發(fā)明。


圖1 水痘0RF-7缺陷型(7D)病毒制備。圖2 :0RF7缺失的VZV病毒鑒定。圖3、水痘0RF-7回復(fù)突變(VZV-7R)病毒制備。圖4、VZV_7D在人體MeWo細(xì)胞中生長(zhǎng)曲線。圖5、7D在人胸腺組織培養(yǎng)(TOC)系統(tǒng)中的生長(zhǎng)曲線分析。圖6、VZV-7D在人皮膚組織培養(yǎng)(SOC)系統(tǒng)中的生長(zhǎng)曲線分析。圖7、VZV-7D的背根神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)。圖8、BAC-VZV構(gòu)建及Mewo細(xì)胞中培養(yǎng)。
具體實(shí)施方案實(shí)施例1 :VZV_7D的鑒定VZV-7D感染長(zhǎng)成單層的MRC-5細(xì)胞，用含2%牛血清的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，約80% 細(xì)胞病變發(fā)生時(shí)，棄培養(yǎng)基，收獲病變細(xì)胞，提取DNA，以P-Oka為對(duì)照進(jìn)行試驗(yàn)。PCR擴(kuò)增 0RF-10 和 0RF-7 基因，用 HindIII 消化 VZV-7D 和 P-Oka 株的 DNA。PCR 產(chǎn)物和 HindIII 消 化產(chǎn)物用0. 5 %的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電泳產(chǎn)物見(jiàn)圖2。VZV-7D對(duì)0RF-10的PCR產(chǎn)物 同P-Oka—致，但在0RF-7上沒(méi)有條帶，證實(shí)0RF-7缺失。HindIII對(duì)病毒的酶切圖譜上，VZV-7D和P-Oka間看不出差別實(shí)施例2 :VZV-7D的回復(fù)突變體(VZV-7R)制備0RF7缺失正確與否不僅可以用HindIII酶切鑒定，而且可以通過(guò)基因的同源重 組獲得完整的VZV加以驗(yàn)證。即應(yīng)用細(xì)菌同源重組機(jī)理拯救出完整的VZV，見(jiàn)圖3。利 用Invitrogen的高保真Taq DNA聚合酶試劑盒PCR擴(kuò)增0RF7片段，并將其克隆到質(zhì)粒 pGEM-lox-zeo的NotI和Bgl 11位點(diǎn)之間，從而形成pGEM-zeo_0RF7質(zhì)粒。該克隆片段 通過(guò)測(cè)序分析鑒定正確，且通過(guò)PCR擴(kuò)增沒(méi)有錯(cuò)誤密碼子被引入0RF7編碼框中。之后以 pGEM-zeo-0RF7質(zhì)粒為模板用下述引物PCR擴(kuò)增zeoR_0RF7編碼框正向引物GAT TTA TCCATA GTTCAA TAC GTT GGA AAG CCA GTC AAT CAT GCA GAC GGT GTG TGC CAG(SEQ ID NO 3)；反向引物AM CAT ACA CCA GAA ACG TTT TTA GTT TTT ATT TCA ATA TGG ATG GAT CCATM CTT CGT(SEQ IDNO 4)，得到的PCR產(chǎn)物是兩端各含一段40bp大小與水痘病毒基因組同源的基因，與 kanR編碼框順序相連，位于0RF7缺失的位點(diǎn)。將得到的這段嵌合PCR產(chǎn)物按上文提到 的方法電轉(zhuǎn)化到攜帶有0RF7D BAC的DY380菌體中。重組體要通過(guò)含有50 μ g/ml的 zeocin (Invitrogen)和12. 5 μ g/ml的氯霉素的瓊脂平板32°C培養(yǎng)篩選。正確的VZV克隆 通過(guò)它們對(duì)抗生素的敏感狀況而篩選獲得。正確的克隆應(yīng)該是氯霉素抗性、潮霉素抗性、 zeoc in抗性、卡那霉素敏感性以及氨芐霉素敏感性。這些克隆進(jìn)一步被酶切消化和PCR分 析確證正確。鑒定正確的克隆(即攜帶有0RF7缺失或者Iuc VZV BAC拯救子的大腸桿菌 DY 380)接種于含12. 5 μ g/ml的氯霉素的500mlLB培養(yǎng)基中32°C培養(yǎng)20小時(shí)。VZVBAC的 DNA通過(guò)BAC DNA大量提取試劑盒(BD Biosciences, Palo Alto, CA)分離得到，并且利用 轉(zhuǎn)染試劑FuGene6 (Roche, Indi anapolis，IN)按照使用說(shuō)明轉(zhuǎn)染到MRC-5細(xì)胞。6孔板中 的一孔(35-mm)在轉(zhuǎn)染時(shí)DNA與轉(zhuǎn)染試劑的使用比例為1. 5 μ g :6 μ 1。一般情況轉(zhuǎn)染后3 天可見(jiàn)水痘病毒病斑。為從水痘病毒基因組中去除BAC載體(兩側(cè)有IoxP酶切位點(diǎn))，可 將Cre表達(dá)載體與VZV BAC DNA—起共轉(zhuǎn)染(Marchini，Liu et al. 2001)MRC_5細(xì)胞，利用 Cre酶的特性而精確切除BAC，產(chǎn)生完整的VZV。水痘0RF-7回復(fù)突變病毒具有同P-Oka病毒相同的生長(zhǎng)和增殖特性。說(shuō)明0RF-7 的功能可以通過(guò)回復(fù)突變手段得到恢復(fù)。實(shí)施例3 :VZV-7D病毒的Mewo細(xì)胞培養(yǎng)六孔板中長(zhǎng)成單層的Mewo細(xì)胞分別用VZV_7D、VZV_7R和P-Oka株感染，以未感染 的Mewo細(xì)胞作對(duì)照，Mewo細(xì)胞在37°C下用含2%牛血清的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。感染24小時(shí) 后，D-Iuciferin加到培養(yǎng)的細(xì)胞孔中，終濃度為150 μ g/ml，37°C培養(yǎng)10分鐘，不同孔的 生物熒光用體內(nèi)成像系統(tǒng)IVIS(50Series ；Xenogen Corporation, Alameda, CA)同時(shí)測(cè)量 光子數(shù)，每天測(cè)量3孔感染細(xì)胞，測(cè)量后，細(xì)胞用病毒培養(yǎng)液取代D-Iuciferin物質(zhì)繼續(xù)培 養(yǎng)。病毒熒光量每24小時(shí)測(cè)量一次，連續(xù)測(cè)量7天。用3孔測(cè)量的數(shù)據(jù)均值對(duì)時(shí)間繪制 生長(zhǎng)曲線。結(jié)果見(jiàn)圖4。人MeWo細(xì)胞不被感染或者被水痘-帶狀皰疹病毒野生株(IucVZV)或者7D突變株或者7D回復(fù)株(luc 7R)感染、培養(yǎng)7天。感染后每天用IVIS系統(tǒng)測(cè)量光子數(shù)，用3孔 測(cè)量的均值對(duì)時(shí)間繪制生長(zhǎng)曲線，圖中標(biāo)出3孔測(cè)量數(shù)據(jù)的誤差線。本試驗(yàn)表明VZV-7D和 VZV-7R和野生株一樣都可以在MeWo細(xì)胞中正常生長(zhǎng)。實(shí)施例4、7D病毒在人胸腺組織的培養(yǎng)人胸腺-肝臟聯(lián)合移植體異體移植到雄性的CB- 17SCID/beige鼠內(nèi)。人胸腺-肝 臟聯(lián)合移植體構(gòu)建和使用按 Jennifer F. MQournal of Virology, Sept. 1995, p. 5236 5242)描述的方法進(jìn)行。移植3月后，人胸腺-肝臟移植體經(jīng)外科手術(shù)暴露后，直接注射 2 X IO3至4 X IO3PFU的Mewo培養(yǎng)的含有熒光素酶的VZV-7D和P_0ka，10-20 μ 1細(xì)胞懸液， 每種病毒感染3只小鼠，以未感染鼠為對(duì)照，感染后每天測(cè)量熒光量。腹腔注射250μ 1熒 光素酶底物，即D-IuciferinlO分鐘后，用生物熒光體內(nèi)成像系統(tǒng)IVIS在移植區(qū)按實(shí)施例 3的方法測(cè)量熒光量，每種病毒測(cè)量3只小鼠。結(jié)果見(jiàn)圖5。培養(yǎng)的人胸腺組織不受病毒感染或者受VZV野生株或者VZV-7D株感染，培養(yǎng)7 天。感染后每天用IVIS系統(tǒng)測(cè)量光子數(shù)。用3只鼠測(cè)量的光子數(shù)均值對(duì)時(shí)間繪制生長(zhǎng)曲 線。圖中顯示3只測(cè)量數(shù)據(jù)的誤差線。本試驗(yàn)表明7D缺陷株像野生株一樣能在胸腺組織 (Τ-細(xì)胞)中生長(zhǎng)。實(shí)施例5 :7D病毒的皮膚培養(yǎng)人胚胎皮膚完整結(jié)構(gòu)按Jennifer F. MQournal of Virology, Sept. 1995, p. 5236 5242)描述的方法，異體移植到聯(lián)合免疫缺陷(SC ID)小鼠皮下。移植4周后，三種含熒光 素酶的VZV-7D、VZV-7R和P-Oka株感染皮膚，每種病毒感染3只小鼠，以未感染鼠為對(duì)照， 感染后每天測(cè)量熒光量。腹腔注射250 μ 1熒光素酶底物，即D-IuciferinlO分鐘后，用生物 熒光體內(nèi)成像系統(tǒng)IVIS在移植區(qū)按實(shí)施例3的方法測(cè)量熒光量，每種病毒測(cè)量3只小鼠。 結(jié)果見(jiàn)圖6。培養(yǎng)的人皮膚組織被病毒野生株或者7D缺失株或者7D回復(fù)突變株感染、以不被 感染的鼠為對(duì)照，培養(yǎng)7天。感染后每天用IVIS系統(tǒng)測(cè)量光子數(shù)，用3只測(cè)量的光子均值 對(duì)時(shí)間繪制生長(zhǎng)曲線。圖中標(biāo)出3只測(cè)量數(shù)據(jù)的誤差線。實(shí)驗(yàn)證實(shí)VZV-7D在皮膚中有嚴(yán) 重生長(zhǎng)缺陷，這種功能缺陷在VZV-7D株回復(fù)突變后可以被恢復(fù)。 實(shí)施例6 :VZV-7D病毒的背根神經(jīng)節(jié)培養(yǎng) 用無(wú)菌的外科剪刀和鑷子分離妊娠20周胚胎的宮頸段和胸段脊骨的背根神經(jīng)節(jié) (DRG)，分離的背根神經(jīng)節(jié)用含青霉素/鏈霉素的冰浴IXPBS瞬時(shí)洗滌，然后轉(zhuǎn)到冰浴 的培養(yǎng)基(DEM，含15%熱滅活的胎牛血清和青霉素/鏈霉素)，將每個(gè)背根神經(jīng)節(jié)單獨(dú) 放到六孔板中膠原覆蓋的蓋玻片上，加0. 5ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)5天，其間換培養(yǎng)基一次。六孔 細(xì)胞板中制備50% Mewo細(xì)胞培養(yǎng)物，用于滴度檢測(cè)和生長(zhǎng)曲線分析。第6天收獲P_0ka， VZV-7D和VZV-7R新近感染的Mewo細(xì)胞，于培養(yǎng)基懸浮至1ml。每個(gè)背根神經(jīng)節(jié)單獨(dú)飼養(yǎng) 在六孔板中膠原包被的蓋玻片上。10 μ 1懸液用于病毒滴度檢測(cè)，2 μ 1用于Mewo細(xì)胞感染 的生長(zhǎng)曲線。其余細(xì)胞懸液用力通過(guò)27針管20次，細(xì)胞碎片通過(guò)4000rpm離心IOmin沉 淀。上清均分，用于感染背根神經(jīng)節(jié)，_120μ 1/樣品，另外，2滴(20μ 1)細(xì)胞懸液用于感染 另一個(gè)背根神經(jīng)節(jié)，37°C 5% CO2下培養(yǎng)3小時(shí)后，背根神經(jīng)節(jié)用IXPBS洗滌，再補(bǔ)加新鮮 培養(yǎng)基。每24小時(shí)檢測(cè)一次熒光素酶活性。樣品用含150 μ g/ml的D-luciferin 37°C培 養(yǎng)10分鐘后，用IVIS儀器和軟件分析光子數(shù)。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖7，結(jié)果表明VZV-7D在Mewo上生長(zhǎng)正常，而在背根神經(jīng)節(jié)中幾乎不生長(zhǎng)。VZV-7D不感染背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，這為開(kāi)發(fā)安全的減毒活疫苗奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。實(shí)施例7 :VZV-7D病毒可作為外源基因的表達(dá)載體細(xì)菌人工染色體載體(BAC)PUSF-6，含有原核生物的Ori、i^pE、parA、pa rB基因， Camr基因，gfp基因，兩個(gè)500bp分別與0RF60和0RF61同源的VZV片段a和b，圖A灰框， 還有兩個(gè)IoxP位點(diǎn)(圖A白框)，全長(zhǎng)約為10kb。用BamHI消化BAC pUSF_6，產(chǎn)生用于重 組的線性片段。P-Oka遺傳物質(zhì)由125kb個(gè)核苷酸組成，包括UL、US和末端及中間重復(fù) 序 列。由P-Oka全基因組構(gòu)建的4個(gè)具有重疊區(qū)段的科斯質(zhì)粒，pVFsp73、pVSpel4、pVPmel9、 pvSpe23。pUSF-6電轉(zhuǎn)至含pvSpe23的DY380菌體，通過(guò)同源重組插入pvSpe23的0RF60和 0RF61 之間，形成 pvSpe23-pUSF-6，提取 pvSpe23-pUSF_6 的 VZV-BAC DNA 與其它 3 個(gè)科斯 質(zhì)粒的VZV片段共轉(zhuǎn)染Mewo細(xì)胞，同源重組產(chǎn)生VZV-BAC。重組VZV-BAC病毒在Mewo細(xì)胞 中復(fù)制，產(chǎn)生綠色熒光斑點(diǎn)。見(jiàn)圖8C，其生長(zhǎng)繁殖速度同p-Oka—致，見(jiàn)圖8D。BAC的插入 沒(méi)有影響病毒本身的生長(zhǎng)特應(yīng)，而且BAC上載的GFP可以表達(dá)。故VZV-7D可以作為其他生 物遺傳物質(zhì)的表達(dá)載體。
權(quán)利要求
水痘病毒ORF7全部或部分缺失、插入終止密碼子、堿基取代等結(jié)構(gòu)改變引起的功能喪失。
2.水痘缺陷性病毒7D研制方法a)通過(guò)BAC手段克隆水痘病毒DNA全序列，在通過(guò)細(xì)菌內(nèi)重組獲得0RF7缺失的水痘缺 陷型病毒(7D-BAC)；b)通過(guò)Cre酶的作用在Mewo細(xì)胞或MRC-5細(xì)胞中刪除BAC，產(chǎn)生用于疫苗生產(chǎn)的 VZV-7D 株；c)在水痘病毒0RF-7缺失基礎(chǔ)上的聯(lián)合缺失突變的水痘缺陷性病毒。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水痘缺陷型病毒7D制備的活疫苗a)預(yù)防水痘的7D活疫苗，b)預(yù)防帶狀皰疹的7D活疫苗。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的VZV-7D培養(yǎng)的細(xì)胞株包括a)Mewo細(xì)胞、MRC-5細(xì)胞、2BS細(xì)胞、WI-38細(xì)胞和Vero細(xì)胞b)但不僅限于a)所列的細(xì)胞株。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以7D為載體的生物制品a)外源基因插入位點(diǎn)為0RF7所在的位置；b)外源基因插入位點(diǎn)為0RF7之外的位點(diǎn)；c)插入的外源基因大小可以為IOkb或更大的DNA片段；d)插入的外源基因可以為熒光蛋白等基質(zhì)蛋白；e)插入的外源基因可以為HBsAg、HIV、HCV等病毒的衣殼蛋白；f)插入的外源基因也可以為細(xì)菌的膜蛋白或鞭毛或菌毛蛋白等。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以7D為載體表達(dá)的生物活性物質(zhì)a)所述的生物活性物質(zhì)為用于診斷的蛋白；b)所述的生物活性物質(zhì)可以為預(yù)防水痘外的預(yù)防其他疾病的疫苗；c)所述的生物活性物質(zhì)可以為包括含預(yù)防水痘的其他治療性生物原料。
全文摘要
本發(fā)明涉及病毒學(xué)和生物藥學(xué)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明提供了缺陷型水痘病毒株、含有該毒株的疫苗及其應(yīng)用，為水痘-帶狀皰疹病毒的治療和預(yù)防提供良好的候選疫苗藥物。
文檔編號(hào)C12R1/19GK101967466SQ20091015738
公開(kāi)日2011年2月9日 申請(qǐng)日期2009年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月28日
發(fā)明者葉祥忠, 張雅麗, 朱樺, 李益民, 程通 申請(qǐng)人:新澤西醫(yī)學(xué)院;北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)股份有限公司;廈門(mén)大學(xué)