專利名稱：：結(jié)核分枝桿菌WhiB3基因的新功能及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于微生物基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種結(jié)核分枝桿菌WhiB3基因功能及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：動物傳染病嚴(yán)重威脅著人類健康，給國民經(jīng)濟(jì)和社會穩(wěn)定造成沖擊，尤其是結(jié)核病(TB)。迄今為止，全球大約有三分之一的人口感染了潛伏狀態(tài)的結(jié)核分枝桿菌。此夕卜，結(jié)核分枝桿菌(M.tb)合并人類免疫缺陷病毒(HIV)感染及多重耐藥結(jié)核菌株的出現(xiàn)，對人類公共衛(wèi)生事業(yè)的威脅更為嚴(yán)峻。正是由于結(jié)核分枝桿菌可以適應(yīng)人體內(nèi)各種不利環(huán)境才導(dǎo)致結(jié)核病很難治療，該病原菌主要通過調(diào)控其自身的基因表達(dá)來適應(yīng)宿主細(xì)胞中的不禾丨J環(huán)境(RamanetalTranscriptionregulationbytheMycobacteriumtuberculosisalternativesigmafactorSigDanditsroleinvirulence.JBacteriol.20040ct；186(19)6605-16)，而許多這種調(diào)控發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平(ColeetalDecipheringthebiologyofMycobacteriumtuberculosisfromthecompletegenomesequenceNature.1998Jun11；393(6685):537_44)。目前有很多針對治療結(jié)核病的藥物，有些抗結(jié)核藥物的作用機(jī)制都是直接或間接地影響結(jié)核分枝桿菌重要基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致細(xì)菌死亡。因此找到結(jié)核分枝桿菌的重要基因的轉(zhuǎn)錄因子，通過藥物抑制轉(zhuǎn)錄因子可以為治療結(jié)核病提供新的可能。結(jié)核分枝桿菌的WhiB3基因(由Rv3416編碼)是屬于WhiB家族的一個轉(zhuǎn)錄因子，該基因首先在天藍(lán)色鏈霉菌(S.coelicolor)中被發(fā)現(xiàn)，與氣生菌絲的孢子形成有關(guān)。結(jié)核分枝桿菌WhiB家族含有7個成員(WhiBl到WhiB7)，WhiB3是第一個被鑒定出來的。WhiB家族基因廣泛存在于放線菌中而其它菌中沒有，推測WhiB編碼與細(xì)菌休眠有^WSSM(IssarSmithetalCellularsignalingpathwaysandtranscriptionalregulationinMycobacteriumtuberculosis:Stresscontrolandvirulence.CURRENTSCIENCE.2004January；VOL.86.NO.1)。目前結(jié)核分枝桿菌得7個WhiB基因的功能尚不清楚，但是它們的功能存在一定的互補(bǔ)作用(HutterBandDickTMoleculargeneticcharacterisationofwhiB3,amycobacterialhomologueofaStreptomycessporulationfactorResMicrobiol.1999Jun;150(5):295_301)。有研究表明WhiB3基因影響宿主對結(jié)核分枝桿菌的免疫反應(yīng)但不影響該菌的生長(SteynAJetalMycobacteriumtuberculosisWhiB3interactswithRpoVtoaffecthostsurvivalbutisdispensableforinvivogrowthProcNatlAcadSciUSA.2002Mar5；99(5)3147-52)。并且WhiB3含有Fe-S簇，可以感受外界信號，調(diào)節(jié)結(jié)核分枝桿菌的代謝(SinghAetalMycobacteriumtuberculosisWhiB3respondsto02andnitricoxideviaits[4Fe_4S]clusterandisessentialfornutrientstarvationsurvivalProcNatlAcadSciUSA.2007Jul10；104(28))0到目前為止WhiB3的功能尚不清楚，但我們知道該基因是結(jié)核分枝桿菌的一個很重要的基因。因此為了弄清WhiB3基因如何重要，本發(fā)明希望通過找到與WhiB3基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)相互結(jié)合的基因啟動子序列來幫助我們弄清該基因究竟調(diào)控哪些基因的轉(zhuǎn)錄。從而能夠進(jìn)一步了解WhiB3對結(jié)核分枝桿菌的影響，為尋找治療結(jié)核病的潛在藥物靶點提供新的目標(biāo)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌WhiB3基因的新功能。本發(fā)明采用細(xì)菌單雜交的方法篩選得到與WhiB3基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)相互作用的22個啟動子序列，同時利用表面等離子共振技術(shù)(SPR)和瓊脂糖凝膠阻滯實驗(EMSA)對其中的2個啟動子序列進(jìn)行了體外驗證。在啟動子序列0467R上找到了一段長為60bp的核苷酸片段，它對啟動子0467R與WhiB3基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)相互作用起到重要影響。由此揭示了WhiB3基因的新的功能，即該基因作為轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控結(jié)核分枝桿菌22個操縱子基因的轉(zhuǎn)錄，它們與結(jié)核分枝桿菌的壓力反應(yīng)和脂肪酸代謝有關(guān)。說明WhiB3基因的重要性，把WhiB3基因作為抗治療結(jié)核病的藥物靶點通過抑制該基因?qū)Y(jié)核分枝桿菌的一系列重要基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，從而達(dá)到抑制結(jié)核分枝桿菌的效果。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的一種結(jié)核分枝桿菌WhiB3基因的應(yīng)用，本發(fā)明的應(yīng)用包括以下特征(1)所述的結(jié)核分枝桿菌WhiB3基因能夠與結(jié)核分枝桿菌的22個啟動子序列結(jié)合，調(diào)控這些啟動子下游系列操縱子的轉(zhuǎn)錄；其中所述的22個啟動子是序列表SEQIDNO1~22所示的核苷酸序列1)結(jié)核分枝桿菌基因Rv0058的啟動子序列，該序列被命名為0058R，它是序列表SEQIDNO1所示的核苷酸序列；2)結(jié)核分枝桿菌基因Rv0244c的啟動子序列，該序列被命名為0244cR，它是序列表SEQIDNO2所示的核苷酸序列；3)結(jié)核分枝桿菌基因Rv0350的啟動子序列，該序列被命名為0350R，它是序列表SEQIDNO3所示的核苷酸序列；4)結(jié)核分枝桿菌基因Rv0467的啟動子序列，該序列被命名為0467R，它是序列表SEQIDNO:4所示的核苷酸序列；5)結(jié)核分枝桿菌基因Rv0469的啟動子序列，該序列被命名被為0469R，它是序列表SEQIDNO5所示的核苷酸序列；6)結(jié)核分枝桿菌基因Rv0551c的啟動子序列，該序列被命名為0551cR，它是序列表SEQIDNO6所示的核苷酸序列；7)結(jié)核分枝桿菌基因Rv0757的啟動子序列，該序列被命名為0757R，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO7所示，其堿基對數(shù)為256bp；8)結(jié)核分枝桿菌基因Rvl094的啟動子序列，該序列被命名為1094R，它是序列表SEQIDNO8所示的核苷酸序列；9)結(jié)核分枝桿菌基因Rvl460的啟動子序列，該序列被命名為1460R，它是序列表SEQIDNO9所示的核苷酸序列；10)結(jié)核分枝桿菌基因Rvl908的啟動子序列，該序列被命名為1908cR，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO10所示，其堿基對數(shù)為202bp；11)結(jié)核分枝桿菌基因Rv2031的啟動子序列，該序列被命名為2031R，它是序列表SEQIDNO11所示的核苷酸序列；12)結(jié)核分枝桿菌基因Rv2737的啟動子序列，該序列被命名為2737cR，它是序列表SEQIDNO12所示的核苷酸序列；13)結(jié)核分枝桿菌基因Rv2875的啟動子序列，該序列被命名為2875R，它是序列表SEQIDNO13所示的核苷酸序列；14)結(jié)核分枝桿菌基因Rv2930的啟動子序列，該序列被命名為2930R，它是序列表SEQIDNO14所示的核苷酸序列；15)結(jié)核分枝桿菌基因Rv3197a的啟動子序列，該序列被命名為3197aR，它是序列表SEQIDNO15所示的核苷酸序列；16)結(jié)核分枝桿菌基因Rv3417的啟動子序列，該序列被命名為3417cR，它是序列表SEQIDNO16所示的核苷酸序列；17)結(jié)核分枝桿菌基因Rv3504的啟動子序列，該序列被命名為3504R，它是序列表SEQIDNO17所示的核苷酸序列；18)結(jié)核分枝桿菌基因Rv3537的啟動子序列，該序列被命名為3537R，它是序列表SEQIDNO18所示的核苷酸序列；19)結(jié)核分枝桿菌基因Rv3543c的啟動子序列，該序列被命名為3543cR，它是序列表SEQIDNO19所示的核苷酸序列；20)結(jié)核分枝桿菌基因Rv3550的啟動子序列，該序列被命名為3550R，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO20所示；21)結(jié)核分枝桿菌基因Rv3870的啟動子序列，該序列被命名為3870R，它是序列表SEQIDNO:21所示的核苷酸序列；22)結(jié)核分枝桿菌基因Rv3877的啟動子序列，該序列被命名為3877R，它是序列表SEQIDNO:22所示的核苷酸序列。(2)該基因能夠作為治療結(jié)核病的藥物靶點，通過抑制WhiB3基因與步驟(1)所述的啟動子結(jié)合抑制該基因?qū)Y(jié)核分枝桿菌的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。本發(fā)明的制備步驟如下(一)載體pBXcmT的制備1)以起始載體pBT(購于Stratagene公司)為材料，切除該載體pBT中λCI基因和lac-UV5啟動子；2)在步驟1)所述的切除了載體pBT中λcI基因和lac-UV5啟動子的切入點位置上定向插入HiS3-aadA雙報告基因片段；3)消除HiS3-aadA雙報告基因片段內(nèi)部的BamHI位點，得到初始載體pRpb；4)在步驟3)的HiS3-aadA雙報告基因序列上游插入一段能夠抑制自激活的間隔核苷酸序列；5)在載體pRpb中消除XhoI、EcoRI和1542bp處的BamHI酶切位點，保留2524bp處的BamHI位點，得到中間載體pRpb_S7；6)將包含有兩個XcmI位點的核苷酸序列弓丨入到中間載體pRpb_S7的多克隆位點，得到載體PBXcmT，該載體pBXcmT結(jié)構(gòu)如圖1所示，其分子量為3794563Da，它的核苷酸序列如SEQIDNO24所示。(二)與結(jié)核分枝桿菌WhiB3基因相互作用的啟動子1-22的制備1)從30個結(jié)核分枝桿菌重要基因的啟動子序列PCR產(chǎn)物直接克隆到經(jīng)XcmI充分消化的PBXcmT線性載體中，得到pBXcmT文庫；將經(jīng)過EcoRI和XbaI雙酶切的WhiB3基因的PCR產(chǎn)物克隆到經(jīng)EcoRI和XbaI雙酶切后的線性載體pTRG(購自Stratagene公司)中，得到PTRG重組質(zhì)粒；2)將步驟1)構(gòu)建的pBXcmT文庫與pTRG重組質(zhì)粒一起共轉(zhuǎn)化到報告菌株XLl-BlueMRF'Kan(購自Stratagene公司)中，再將共轉(zhuǎn)化菌株涂于篩選平板(共轉(zhuǎn)化方法及篩選平板的制備方法見Stratagene公司的細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)操作手冊BacterioMatchIITwo-HybridSystemLibraryConstructionKit)，待菌液吸收后，將平板倒置與30°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)3-4天；3)將步驟2)所述的平板上生長出來的單菌落分別接種至LB液體培養(yǎng)基(30μg/mL卡那霉素+34μg/mL氯霉素+12.5μg/mL四環(huán)素)，37°C培養(yǎng)16h后將菌液收集并測序(由Invetrogen公司完成)得到22個與WhiB3相互作用的啟動子序列。更詳細(xì)的技術(shù)方案及其應(yīng)用參見《具體實施方式》。序列表SEQIDNO:1_23是本發(fā)明得到的啟動子的核苷酸序列；序列表SEQIDNO24是本發(fā)明制備的細(xì)菌單雜交載體pBXcmT的核苷酸序列；圖1.本發(fā)明所用到的細(xì)菌單雜交載體pBXcmT的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2.獲得啟動子序列所需的引物序列；圖3.瓊脂糖凝膠組織檢測WhiB3和啟動子2031R、WhiB3和啟動子0467R的相互作用結(jié)果，圖3A表示W(wǎng)hiB3和啟動子2031R的相互作用結(jié)果，圖3B表示W(wǎng)hiB3和啟動子0467R的相互作用結(jié)果，圖中1-8泳道為樣品該樣品的順序與表1中1-8號樣品的順序相對應(yīng)；圖4.用表面等離子共振實驗驗證WhiB3和啟動子2031R、WhiB3和啟動子0467R的相互作用結(jié)果，圖4A表示W(wǎng)hiB3和啟動子203IR的相互作用結(jié)果，圖4B表示W(wǎng)hiB3和啟動子0467R的相互作用結(jié)果，圖中Heated表示熱變性后的WhiB3純化產(chǎn)物與核苷酸片段相互作用；30nM表示濃度為30nM的WhiB3純化產(chǎn)物與核苷酸片段相互作用；60nM表示濃度為60nM的WhiB3純化產(chǎn)物與核苷酸片段相互作用；90nM表示濃度為90nM的WhiB3純化產(chǎn)物與核苷酸片段相互作用；圖5.是啟動子0467R的截短片段(即序列表SEQIDNO23所示的序列)示意圖；圖6.用表面等離子共振實驗驗證WhiB3和Rl、WhiB3和R2的相互作用結(jié)果，其中圖6A表示W(wǎng)hiB3和Rl的相互作用結(jié)果，圖6B表示W(wǎng)hiB3和R2的相互作用結(jié)果，圖中Heated表示熱變性后的WhiB3純化產(chǎn)物與核苷酸片段相互作用；20nM表示濃度為20nM的WhiB3純化產(chǎn)物與核苷酸片段相互作用；30nM表示濃度為30nM的WhiB3純化產(chǎn)物與核苷酸片段相互作用；40nM表示濃度為40nM的WhiB3純化產(chǎn)物與核苷酸片段相互作用。圖7.WhiB3基因所結(jié)合的啟動子序列所在的操縱子示意圖，圖中箭頭表示操縱子內(nèi)的基因，箭頭前面的粗線條表示啟動子序列。具體實施例方式實施例1與結(jié)核分枝桿菌WhiB3基因相互作用的啟動子序列的獲得本實施例所使用的試劑均購自Stratagene公司。1、以結(jié)核分枝桿菌(H37Rv)總基因組DNA(由湖北省武漢市結(jié)核病防治所惠贈，地址湖北省武漢市漢口寶豐路28號；該基因組的測序見文獻(xiàn)S.T.ColeetalDecipheringthebiologyofMycobacteriumtuberculosisfromthecompletegenomesequenceNATUREVOL39311JUNE1998)為模板，用圖1中所示的引物分別擴(kuò)增出30個啟動子序列的PCR產(chǎn)物，將擴(kuò)增出的核苷酸片段直接克隆到經(jīng)XcmI充分消化的pBXcmT線性載體中；PCR過程如下反應(yīng)體系反應(yīng)程序2XGCBufferI37.5μ196°C4min；2.5mMdNTP8μ196°CImin；Rpb-f2μ158°CImin；Rpb-r2μ172°C2min；基因組H372μ130個循環(huán)；ExTaq聚合酶0.6μ172°CIOmin；加水補(bǔ)至70μ1。2、以結(jié)核分枝桿菌總基因組Η37為模板，以F:ATATGAATTCATGCCACAGCCGGAGCAGCT和R:AGATTCTAGATTAAGCTGTGCGGCGGATGC為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(擴(kuò)增條件同步驟1)，獲得長度為300bp的WhiB3基因片段，將該片段經(jīng)過EcoRI和XbaI雙酶切后克隆到同樣經(jīng)過EcoRI和XbaI雙酶切的pTRG線性載體中；3、將步驟1構(gòu)建的pBXcmT文庫與步驟2構(gòu)建的pTRG重組質(zhì)粒一起共轉(zhuǎn)化到報告菌株XLl-BlueMRF'Kan(購于Stratagene公司)中(共轉(zhuǎn)化方法見Stratagene公司的細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)操作手冊BacterioMatchIITwo-HybridSystemLibraryConstructionKit)，再將共轉(zhuǎn)化菌株涂于篩選平板，待菌液吸收后，將平板倒置與30°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)3-4天；4、將步驟3所述的平板上生長出來的單菌落分別接種至LB液體培養(yǎng)基(30μg/mL卡那霉素+34μg/mL氯霉素+12.5μg/mL四環(huán)素)，37°C培養(yǎng)16h后將菌液收集并測序(由Invetrogen公司測序)得到如序列表SEQIDNO1_22所示的22個啟動子序列。這22個啟動子序列分別都能夠與WhiB3基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)相互結(jié)合。實施例2用瓊脂糖凝膠組織驗證WhiB3和2031R、WhiB3和0467R的相互作用實驗瓊脂糖凝膠組織實驗(EMSA)是驗證蛋白質(zhì)與核苷酸片段相互作用的體外實驗方法(其方法及原理參見GarnerandRevzinAgelelectrophoresismethodforquantifyingthebindingofproteinstospecificDNAregions!applicationtocomponentsoftheEscherichiacolilactoseoperonregulatorysystemNucleicAcidsRes.1981Jul10；9(13):3047_60)，具體步驟如下l、WhiB3的表達(dá)與純化將WhiB3基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoRI和XbaI雙酶切后克隆到同樣經(jīng)過EcoRI和XbaI雙酶切的pET28a線性載體(購自Novagen公司)中，再轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)菌株中。將轉(zhuǎn)化得到的菌株接種于3mlLB(34μg/mL氯霉素)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)16h后轉(zhuǎn)接該菌液Iml到IOOmlLB培養(yǎng)基中，待菌液OD值達(dá)到0.8后加入IPTG至終濃度0.5mM,培養(yǎng)3h后離心菌液收集菌體。收集得到的菌體經(jīng)超聲波破碎(超聲波破碎儀購自寧波新芝科技有限公司，型號JY88-II，破碎功率200W，時間2min，次數(shù)8次)后在用鎳親和層析柱進(jìn)行純化(購自卓冠科技有限公司)，得到WhiB3基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)純化產(chǎn)物。2、瓊脂糖凝膠組織實驗將啟動子序列203IR和0467R的PCR產(chǎn)物分別與步驟1所得到的WhiB3純化產(chǎn)物按照表1所示的比例混合(10X反應(yīng)緩沖液，內(nèi)含20MmTris-ClpH7.5，IOOmMNaCl,2mMEDTA,0.5mMMgCl2)。將混合物置于冰上20min后上樣于1.5%瓊脂糖凝膠，120V電泳lh?？梢钥闯鯳hiB3與啟動子2031R、WhiB3與啟動子0467R均能發(fā)生相互結(jié)合并使核苷酸條帶滯后(見圖3)。表1實施例2所采用的混合體系組成<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實施例3用表面等離子共振驗證WhiB3與啟動子2031R、WhiB3和0467R的相互作用實驗表面等離子共振實驗(SPR)是近年來新興的一種用來研究蛋白質(zhì)核苷酸片段相互作用的體外實驗方法(本發(fā)明所使用的儀器及試劑購于GE公司，實驗方法及原理參見GE公司Biacore3000說明書)，具體步驟如下1、將啟動子序列固定在芯片上將經(jīng)過生物素標(biāo)記(由Invetrogen公司合成)的啟動子序列2031R和0467R的PCR產(chǎn)物稀釋至20nM，再將稀釋好的啟動子序列2031R和0467R核苷酸片段分別流過SA芯片(購于GE公司)，流速為20μ1/min,至響應(yīng)值為200RU。2、將WhiB3純化產(chǎn)物流過芯片將WhiB3純化產(chǎn)物稀釋成3個濃度30nM、60nM和90nM。再取一份90nM的WhiB3純化產(chǎn)物置于100°c熱變性IOmin用于作負(fù)對照。將熱變性后的WhiB3純化產(chǎn)物和30nM、60nM、90nM的WhiB3純化產(chǎn)物分別流過固定有2031R和0467R的SA芯片，觀察響應(yīng)值變化(見圖4)。響應(yīng)值的高低反應(yīng)蛋白質(zhì)與核苷酸片段相互作用的強(qiáng)弱，表面等離子共振實驗表明WhiB3和2031R、WhiB3和0467R都有相互作用。實施例4用表面等離子共振實驗找到0467R上的重要區(qū)域本發(fā)明設(shè)計了0467R的兩個截短片段，分別命名為Rl和R2(見圖5)。以Rl-F:ATATTCTAGATCGATCCGTGGGTTTACCTG禾ΠRl-R:ATCGGCGCAGCTTCACTGGTGTGCTAA為引物擴(kuò)增出Rl片段，以R2-F:ATATTCTAGATCGATCCGTGGGTTTACCTG和R2-RGCCCATTTCACTTGCGAATTTCGGCAA為引物擴(kuò)增出R2片段。將Rl和R2按照實施例3中的方法固定到SA芯片上，至響應(yīng)值200RU。在將稀釋20nM、30nM、40nM濃度的WhiB3純化產(chǎn)物按照實施例3中的方法流過固定有Rl和R2的芯片，觀察響應(yīng)值變化(見圖6)。PCR過程如下反應(yīng)體系反應(yīng)程序2XGCBufferI37.5μ196°C4min；2.5mMdNTP8μ196°CImin；Rpb-f2μ158°CImin；Rpb-r2μ172°C2min；基因組H372μ130個循環(huán)；ExTaq聚合酶0.6μ172°CIOmin；加水補(bǔ)至70μ1。結(jié)果表明WhiB3和0467R與WhiB3和Rl的相互作用強(qiáng)弱相同，但是WhiB3和R2的相互作用明顯弱于前兩個，說明從Rl到R2之間的這長度為60bp的核苷酸片段對于WhiB3和0467R的相互作用起著重要的作用。實施例5:ffhiB3基因可以調(diào)控的操縱子分類將得到的可以與WhiB3基因結(jié)合的22個啟動子序列進(jìn)行分類，WhiB3基因可以和這些啟動子序列結(jié)合說明該基因作為轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控這22個啟動子序列下游的操縱子轉(zhuǎn)錄。該系列操縱子所包括的基因如圖7所示，這些基因與結(jié)核分枝桿菌的脂肪酸代謝和壓力反應(yīng)有關(guān)，是結(jié)核分枝桿菌生長和存活的重要基因(S.T.ColeetalDecipheringthebiologyofMycobacteriumtuberculosisfromthecompletegenomesequenceNATUREVOL39311JUNE1998)。WhiB3基因可以調(diào)控這些基因的轉(zhuǎn)錄揭示了WhiB3作為治療結(jié)核病的藥物靶點的可能性，通過抑制WhiB3基因與這些啟動子序列的結(jié)合可以抑制該基因?qū)Y(jié)核分枝桿菌的一系列重要基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，使這些基因不能正常發(fā)揮功能，從而達(dá)到抑制結(jié)核分枝桿菌的目的。如上述所公開和證明的，本發(fā)明主要獲得以下幾方面的創(chuàng)新性成果1、找到了與結(jié)核分枝桿菌WhiB3基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)相互作用的啟動之序列，證明WhiB3可能調(diào)控這些啟動子下游的基因；2、用體外實驗驗證了WhiB3和0467R、WhiB3和2031R間的相互作用，證明WhiB3確實可以調(diào)控Rv0467和Rv2031；3、在0467R中找到了對于WhiB3和0467R相互作用起重要作用的長度為60bp的區(qū)域，進(jìn)一步闡明了結(jié)核分枝桿菌的WhiB3的功能。4、基于結(jié)核分枝桿菌WhiB3基因可以調(diào)控一系列重要基因的新功能，提出可以將WhiB3基因作為抑制結(jié)核分枝桿菌的藥物靶標(biāo)，通過抑制通過抑制WhiB3基因與這些啟動子序列的結(jié)合可以抑制該基因?qū)Y(jié)核分枝桿菌的一系列重要基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，從而達(dá)到抑制結(jié)核分枝桿菌的目的。序列表<110>華中農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>結(jié)核分枝桿菌WhiB3基因的新功能及應(yīng)用<130><141>2009-02-16<160>24<170>PatentInversion3.1<210>1<211>220<212>DNA<213>結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)<220><221>gene<222>(1)..(220)<223><220><221>promoter<222>(1)..(220)<223><400>1atctgttcgcgataggcctcgccgttcgcgacactgacattgcgcacacgacacgccgcg60gatcgtcgcaccgggttaagcctggagtgcggtggtgcctggtcggcattttcgcagtcg120agggctctcgtgtagcctgggcgagttgccgacgcaggcgaccctcctgccacggatcga180ccgtggccgcacacgaccacaggaggtgatgaggttccta220<210>2<211>356<212>DNA<213>^WM^PfM(Mycobacteriumtuberculosis)<220><221>gene<222>(1)..(356)<223><220><221>promoter<222>(1)..(356)<223><400>2ctagagccgaggacgtagttttcgcatccgaccctactcgccggacatccgcgcgcatgt60ccgtaccaagaggccgcatccgcgtgagccgatgatctacgctgccaggcgctgccgccc120tagactccgcatattcttcatttgatcgctatcgccgcaggtgagaggaccgacacggcc180aggatcaccgctaacccaaccggttggttagttagttggtgcaatgtagctcacatcaac240ttgcattgacctatgcaacggatatattttgacggtgttactggtgggtaacttggtttc300gagtacccaaccctacccaaccctgaggtggcactctcaacgaggaggatcggcag356<210>3<211>298<212>DNA<213>^WM^tfM(Mycobacteriumtuberculosis)<220><221>gene<222>(1)..(298)<223><220><221>promoter<222>(1)..(298)<223><400>3accgtcagcacgccagttcaatacggcgagaagcgc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ttatttcattatggtgaaagttggaacctcttacgtgccgatcaacgtc6000tcatttt600權(quán)利要求一種結(jié)核分枝桿菌WhiB3基因的應(yīng)用，其特征在于(1)所述的WhiB3基因能夠與結(jié)核分枝桿菌的22個啟動子序列結(jié)合，調(diào)控這些啟動子下游系列操縱子的轉(zhuǎn)錄；所述的22個啟動子是SEQIDNO1-22所示的核苷酸序列1)結(jié)核分枝桿菌基因Rv0058的啟動子序列，該序列被命名為0058R，它是序列表SEQIDNO1所示的核苷酸序列；2)結(jié)核分枝桿菌基因Rv0244c的啟動子序列，該序列被命名為0244cR，它是序列表SEQIDNO2所示的核苷酸序列；3)結(jié)核分枝桿菌基因Rv0350的啟動子序列，該序列被命名為0350R，它是序列表SEQIDNO3所示的核苷酸序列；4)結(jié)核分枝桿菌基因Rv0467的啟動子序列，該序列被命名為0467R，它是序列表SEQIDNO4所示的核苷酸序列；5)結(jié)核分枝桿菌基因Rv0469的啟動子序列，該序列被命名被為0469R，它是序列表SEQIDNO5所示的核苷酸序列；6)結(jié)核分枝桿菌基因Rv0551c的啟動子序列，該序列被命名為0551cR，它是序列表SEQIDNO6所示的核苷酸序列；7)結(jié)核分枝桿菌基因Rv0757的啟動子序列，該序列被命名為0757R，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO7所示，其堿基對數(shù)為256bp；8)結(jié)核分枝桿菌基因Rv1094的啟動子序列，該序列被命名為1094R，它是序列表SEQIDNO8所示的核苷酸序列；9)結(jié)核分枝桿菌基因Rv1460的啟動子序列，該序列被命名為1460R，它是序列表SEQIDNO9所示的核苷酸序列；10)結(jié)核分枝桿菌基因Rv1908的啟動子序列，該序列被命名為1908cR，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO10所示，其堿基對數(shù)為202bp；11)結(jié)核分枝桿菌基因Rv2031的啟動子序列，該序列被命名為2031R，它是序列表SEQIDNO11所示的核苷酸序列；12)結(jié)核分枝桿菌基因Rv2737的啟動子序列，該序列被命名為2737cR，它是序列表SEQIDNO12所示的核苷酸序列；13)結(jié)核分枝桿菌基因Rv2875的啟動子序列，該序列被命名為2875R，它是序列表SEQIDNO13所示的核苷酸序列；14)結(jié)核分枝桿菌基因Rv2930的啟動子序列，該序列被命名為2930R，它是序列表SEQIDNO14所示的核苷酸序列；15)結(jié)核分枝桿菌基因Rv3197a的啟動子序列，該序列被命名為3197aR，它是序列表SEQIDNO15所示的核苷酸序列；16)結(jié)核分枝桿菌基因Rv3417的啟動子序列，該序列被命名為3417cR，它是序列表SEQIDNO16所示的核苷酸序列；17)結(jié)核分枝桿菌基因Rv3504的啟動子序列，該序列被命名為3504R，它是序列表SEQIDNO17所示的核苷酸序列；18)結(jié)核分枝桿菌基因Rv3537的啟動子序列，該序列被命名為3537R，它是序列表SEQIDNO18所示的核苷酸序列；19)結(jié)核分枝桿菌基因Rv3543c的啟動子序列，該序列被命名為3543cR，它是序列表SEQIDNO19所示的核苷酸序列；20)結(jié)核分枝桿菌基因Rv3550的啟動子序列，該序列被命名為3550R，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO20所示；21)結(jié)核分枝桿菌基因Rv3870的啟動子序列，該序列被命名為3870R，它是序列表SEQIDNO21所示的核苷酸序列；22)結(jié)核分枝桿菌基因Rv3877的啟動子序列，該序列被命名為3877R，它是序列表SEQIDNO22所示的核苷酸序列；(2)該基因能夠作為治療結(jié)核病的藥物靶點，通過抑制WhiB3基因與步驟(1)所述的啟動子結(jié)合抑制該基因?qū)Y(jié)核分枝桿菌的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。全文摘要本發(fā)明屬于微生物基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種結(jié)核分枝桿菌WhiB3基因的新功能的發(fā)掘及應(yīng)用。利用細(xì)菌單雜交方法篩選得到能夠與結(jié)核分枝桿菌WhiB3基因結(jié)合的22個啟動子系列，所述的啟動子具有如SEQIDNO1-22所示的核苷酸序列。其應(yīng)用包括所述的WhiB3基因能夠與所述的結(jié)核分枝桿菌22個啟動子結(jié)合，調(diào)控這些啟動子下游系列操縱子的轉(zhuǎn)錄；或利用該基因能夠作為治療結(jié)核病的藥物靶點，通過抑制WhiB3基因與所述的啟動子結(jié)合抑制該基因?qū)Y(jié)核分枝桿菌的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。文檔編號A61P31/06GK101812464SQ200910060839公開日2010年8月25日申請日期2009年2月23日優(yōu)先權(quán)日2009年2月23日發(fā)明者何正國,郭曼曼申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)