專利名稱：RGDfK修飾的冬凌草甲素聚乳酸載藥納米粒及其制備方法
RGDfK修飾的冬凌草甲素聚乳酸載藥納米粒及其制備方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于化學(xué)制藥領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及RGDH(修飾的冬凌草甲素聚乳酸載藥 納米粒及其制備方法。
背景技術(shù)：
在納米粒(nanoparticles，NP)表面進(jìn)行修飾，連接特定的配基，通過(guò)配體-受體 相互作用，使納米粒與靶部位表達(dá)的受體特異性結(jié)合，可以達(dá)到主動(dòng)靶向。常用的配體、受 體等包括特定的表面活性劑、糖類、葉酸、低密度脂蛋白受體、尿激酶受體、腫瘤壞死因子受 體家族、轉(zhuǎn)鐵蛋白和多肽等。目前研究較多的多肽類介導(dǎo)的靶向給藥系統(tǒng)多為單抗、轉(zhuǎn)鐵蛋 白、谷胱甘肽、RGD多肽及其類似物等。其中RGD多肽及其類似物作為腫瘤靶向介導(dǎo)的配體 是近年研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。
整合素(integrin)是一類細(xì)胞膜表面糖蛋白受體家族分子，由a、β兩個(gè)亞基 通過(guò)非共價(jià)鍵連接而成的異二聚體蛋白質(zhì)，主要介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞之間及細(xì)胞與細(xì)胞外間質(zhì) (ECM)之間的黏附。目前研究發(fā)現(xiàn)受體家族包括至少18個(gè)a亞單位和9個(gè)β亞單位，共 同組成超過(guò)25種不同的整合素。a、β兩種亞基均由長(zhǎng)的胞外段(氨基端)、跨膜段、短的 胞內(nèi)段(羧基端)三部分組成。a亞基的胞外段識(shí)別ECM的R⑶序列(Arg-Gly-Asp，精氨 酸-甘氨酸-天冬氨酸)介導(dǎo)細(xì)胞與ECM之間的黏附；β亞基的胞內(nèi)段與細(xì)胞骨架相連。 整合素參與構(gòu)成的ECM，廣泛影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、生存、增殖、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為。
整合素在腫瘤血管新生的過(guò)程中起著不可缺少的作用。在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中， B1 β 整合素均影響血管生成。3整合素的作用最為重要且研究最多。在腫瘤血管生成中的作用主要表現(xiàn)在參與內(nèi)皮細(xì)胞的激活和遷移、介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增 殖、抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、參與bFGF誘導(dǎo)的血管生成、參與VEGF誘導(dǎo)的血管生成、誘導(dǎo)環(huán)加氧 酶的產(chǎn)生等。
整合素主要是通過(guò)識(shí)別配體分子中特定的氨基酸短肽序列“精氨酸-甘氨酸-天 冬氨酸”(RGD)而介導(dǎo)細(xì)胞的各種生理作用。R⑶序列是多種生物細(xì)胞外基質(zhì)和血漿蛋白結(jié) 構(gòu)中常見(jiàn)的基本成分，也是廣泛存在于細(xì)胞間識(shí)別系統(tǒng)的基本單位，能與細(xì)胞表面整合素 特異性結(jié)合，從而介導(dǎo)許多重要的生命活動(dòng)。外源性RGD肽可與體內(nèi)含RGD序列的物質(zhì)競(jìng) 爭(zhēng)結(jié)合，從而競(jìng)爭(zhēng)性抑制RGD-整合素介導(dǎo)的各種生命活動(dòng)。
研究證明，整合素家族中3的配體即含有RGD序列的多肽及其類似物對(duì)腫瘤 血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附和遷移有明顯的抑制作用；R⑶肽還可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中caspase-3和 caspase-7表達(dá)的增高，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。整合素av β 3在多種腫瘤細(xì)胞表面和新 生血管內(nèi)皮細(xì)胞上有高表達(dá)，但在成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞和絕大多數(shù)正常器官系統(tǒng)中不 表達(dá)或者很少量的表達(dá)。因此，是理想的腫瘤靶向治療靶點(diǎn)，其配體RGD肽可以作為 靶向載體，攜帶效應(yīng)分子，抑制腫瘤生長(zhǎng)和新生血管的形成，使腫瘤組織供養(yǎng)系統(tǒng)中斷，細(xì) 胞萎縮、凋亡。
RGD用于介導(dǎo)納米給藥系統(tǒng)的主動(dòng)靶向和抗腫瘤研究，已成為近年來(lái)藥物新型給藥系統(tǒng)研究的前沿領(lǐng)域。
主動(dòng)靶向給藥系統(tǒng)通過(guò)載體結(jié)構(gòu)修飾或生物識(shí)別作用將藥物定向運(yùn)送至病變部 位發(fā)揮藥效，而不損傷周圍的正常細(xì)胞、組織和器官。在納米粒表面進(jìn)行修飾，連接特定的 配基，通過(guò)配體一受體相互作用，使NP與靶部位表達(dá)的受體特異性結(jié)合，可達(dá)到主動(dòng)靶向。 常用的配體、受體等包括特定的表面活性劑、糖類、葉酸、低密度脂蛋白受體、尿激酶受體、 腫瘤壞死因子受體家族、轉(zhuǎn)鐵蛋白和多肽等。多肽類物質(zhì)多數(shù)源于內(nèi)源性肽或其他天然肽， 其具有活性高、劑量小、毒副作用低、代謝終產(chǎn)物為氨基酸等突出特點(diǎn)。其中RGD多肽及其 類似物是近幾年國(guó)際上研究較為熱點(diǎn)的領(lǐng)域。
冬凌草甲素(Oridonin，0RI)，是我國(guó)首先從冬凌草中分離的抗癌活性成分，屬 于貝殼杉烯二萜類化合物，具有抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、抑制癌細(xì)胞DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合 成、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抗突變和β受體阻斷作用；對(duì)體外培養(yǎng)的Hela細(xì)胞、人體食管癌細(xì) 胞、肝癌細(xì)胞及白血病細(xì)胞等多種人體癌細(xì)胞有明顯的細(xì)胞毒作用。由于其良好的抗腫瘤 效果和較小的毒副作用，近年來(lái)得到廣泛關(guān)注，已有環(huán)糊精包合物、固態(tài)類脂納米粒、 PCL-PE0-PCL載藥納米粒和聚乳酸納米粒的研究報(bào)道。目前臨床用藥主要有冬凌草片劑、冬 凌草糖漿劑，由于冬凌草甲素水溶性不好、穩(wěn)定性差、生物半衰期短、口服后血藥濃度和腫 瘤細(xì)胞周圍的藥物濃度低，生物利用度低，限制了其療效的發(fā)揮；另有冬凌草素注射劑，但 是注射時(shí)有局部有刺激性、可發(fā)生靜脈炎等副作用，限制了其使用。冬凌草甲素固態(tài)類脂納 米粒、PCL-PE0-PCL載藥納米粒等納米給藥系統(tǒng)，僅能達(dá)到被動(dòng)靶向，限制了其在非網(wǎng)狀內(nèi) 皮系統(tǒng)腫瘤上的應(yīng)用，且存在藥物易泄漏等問(wèn)題。
RGDfK (精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-L-苯丙氨酸-賴氨酸，分子式C27H43N9O8，分子 量621)是一種含有R⑶序列的五肽，易吸潮，呈白色結(jié)晶粉末或片狀，-20°C冰箱存放。其 中RGD序列用于識(shí)別癌細(xì)胞膜上的整合素3受體；f作為穩(wěn)定肽鏈空間結(jié)構(gòu)的基團(tuán)。
權(quán)利要求
1.一種RGDfK修飾的冬凌草甲素聚乳酸載藥納米粒的制備方法，其特征是，該方法包 括如下步驟冬凌草甲素與聚乳酸PLA共溶于丙酮-乙醇混合液中，在攪拌下與質(zhì)量濃度為0. 5-2 % 的F-68水溶液混合，持續(xù)攪拌2-lOmin，60°C以下減壓除去有機(jī)溶劑，0. 8 μ m以下微孔濾膜 濾過(guò)，制得冬凌草甲素聚乳酸載藥納米粒ORI-NP溶液；在ORI-NP溶液中加入5-15倍PLA摩爾濃度的1-乙基_3_( 二甲基胺丙基)碳化二 亞胺鹽酸鹽EDC -HCl和N-羥基硫代琥珀酰亞胺sulfo-NHS，用2- (N-嗎啡啉)乙磺酸MES 調(diào)pH = 5-6，攪拌使活化，活化溫度為0°C _25°C，活化時(shí)間為4h-24h，過(guò)凝膠柱，保持溫度 IO0C以下，除去過(guò)量的EDC · HC1、sulfo-NHS、MES和反應(yīng)副產(chǎn)物；收集納米粒膠體溶液，加 入RGDfK，RGDfK和PLA的摩爾比為0. 1:1-2: 1，置冰浴中攪拌4_Mh，上凝膠柱除去過(guò) 量的RGDfK和副產(chǎn)物，收集帶乳光的膠體溶液，即得ORI-NP-RGDfK膠體溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，丙酮-乙醇混合液中丙酮和乙醇的體積比為
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征是，RGDfK和PLA的摩爾比為0.5 1。
4.權(quán)利要求1或2或3所述方法制得的RGDfK修飾的冬凌草甲素聚乳酸載藥納米粒。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的RGDfK修飾的冬凌草甲素聚乳酸載藥納米粒，其特征是，90% 的納米粒子的粒徑分布在50-190nm。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種RGDfK修飾的冬凌草甲素聚乳酸載藥納米粒的制備方法。本發(fā)明在用改良自乳化溶劑擴(kuò)散法制備冬凌草甲素聚乳酸納米粒的基礎(chǔ)上，選擇復(fù)合多肽縮合劑EDC·HCl和NHS-sulfo，采用兩步縮合反應(yīng)，制備ORI-NP-RGDfK。本發(fā)明制備的ORI-NP-RGDfK具有明顯的緩釋特征，對(duì)腫瘤具有良好的選擇性分布；對(duì)小鼠移植性肝癌具有良好的抑瘤作用，腫瘤壞死明顯，生存期顯著延長(zhǎng)，生存質(zhì)量得到改善，ORI-NP-RGDfK抗腫瘤效果顯著優(yōu)于ORI組和ORI-NP組(P＜0.05)。
文檔編號(hào)A61K31/352GK102028951SQ20091005798
公開(kāi)日2011年4月27日 申請(qǐng)日期2009年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月29日
發(fā)明者于燕燕, 馮年平, 劉穎, 許潔, 趙繼會(huì) 申請(qǐng)人:上海中醫(yī)藥大學(xué)