專(zhuān)利名稱(chēng)：通過(guò)調(diào)節(jié)gat-1表達(dá)促進(jìn)肝再生的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過(guò)調(diào)節(jié)GAT-I表達(dá)促進(jìn)肝再生。
背景技術(shù)：
人類(lèi)和哺乳動(dòng)物的肝臟在物理、化學(xué)、感染或缺血性損傷后具有很強(qiáng)的再生能力。 在某些條件下(如外科因腫瘤或移植手術(shù)切除部分肝臟或肝葉；移植一個(gè)小的供體肝臟到 一個(gè)大的受體；因化學(xué)藥物、病毒等引起肝細(xì)胞破壞等)，肝臟的體積發(fā)生變化，觸動(dòng)肝臟 再生。自20世紀(jì)以來(lái)，肝臟疾病的發(fā)病率的逐漸攀升成為嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的疾病之一。 我國(guó)各型肝病患者正在呈上升趨勢(shì)，每年有近40萬(wàn)人死于肝臟疾病。目前，肝臟切除手術(shù) 已被許多醫(yī)院廣泛應(yīng)用于治療多種肝臟疾病。當(dāng)部分肝臟切除后，肝臟面臨著剩余肝臟功 能的代償問(wèn)題。剩余肝臟功能若能代償，則會(huì)引起肝再生而逐漸康復(fù)。反之，則會(huì)走向急性 肝功能衰竭，導(dǎo)致患者死亡。研究表明對(duì)肝再生的人為誘導(dǎo)可能會(huì)提高肝切除導(dǎo)致的急性 肝衰竭患者的生存率和縮短其康復(fù)時(shí)間。如何有效地提高及促進(jìn)肝臟再生、肝功能恢復(fù)成 為目前亟待解決的問(wèn)題。研究肝再生最常用的動(dòng)物模型是小鼠或大鼠的部分肝切除(約70%肝臟切除)模 型。在肝臟切除后的短短幾分鐘之內(nèi)，肝細(xì)胞的活化即被觸動(dòng)。在這一過(guò)程中，多種細(xì)胞因 子、生長(zhǎng)因子、神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)因子等均參與調(diào)節(jié)激酶的活化、轉(zhuǎn)錄因子的激活以及肝細(xì)胞 的增殖和肝功能的恢復(fù)。評(píng)價(jià)肝再生的指標(biāo)有肝臟重量的變化、肝細(xì)胞有絲分裂指數(shù)等。γ -氨基丁酸(GABA)作為重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，與興奮型神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸相互 平衡維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能。由神經(jīng)元釋放至突觸間隙的GABA部分與位于突觸后 膜的GABA受體結(jié)合，而大部分GABA則通過(guò)突觸前膜的GABA轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)。GAT-I 作為抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的主要轉(zhuǎn)運(yùn)體之，最早被科學(xué)家們所發(fā)現(xiàn)，目前認(rèn)為其主要表達(dá)在嗅 球、神經(jīng)皮質(zhì)、小腦、上丘、基質(zhì)核，并且主要分布在突觸前膜末端、神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞，對(duì)于 維持體內(nèi)較低濃度的GABA起著重要的作用。目前有研究證明，GABA可以負(fù)向調(diào)節(jié)肝再生， 但是對(duì)于GAT-I是否參與這一過(guò)程尚不清楚。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明利用肝再生的動(dòng)物模型，證明了 GAT-I的表達(dá)在肝切后的24小時(shí)明顯上 升。利用GAT-I基因缺陷小鼠，首次發(fā)現(xiàn)GAT-I缺失后小鼠肝再生能力明顯下降，證實(shí)了 GAT-I在肝再生病理生理機(jī)制中發(fā)揮重要作用。進(jìn)一步的研究顯示，利用RNAi技術(shù)干擾小 鼠肝臟中GAT-I表達(dá)后，小鼠肝再生能力明顯減弱。因此，本發(fā)明提供Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞型1或其編碼序列在制備促進(jìn)肝再生 用的物質(zhì)中的用途。在一優(yōu)選實(shí)施例中，所述物質(zhì)是含有所述編碼序列的表達(dá)載體。在另一優(yōu)選實(shí)施例中，所述物質(zhì)是Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞型1的激動(dòng)劑。在其它優(yōu)選實(shí)施例中，所述物質(zhì)為用于促進(jìn)肝再生用的藥劑。在優(yōu)選實(shí)施例中，所
3述藥劑含有本發(fā)明所述的供Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞型1、其編碼序列或含有所述編碼序 列的表達(dá)質(zhì)粒。在其它優(yōu)選實(shí)施例中，所述藥劑含有Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞型1的激動(dòng) 劑。本發(fā)明提供Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞型1的激動(dòng)劑在制備促進(jìn)肝再生用的藥物中 的用途。在一優(yōu)選實(shí)施例中，所述的Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞型1的激動(dòng)劑選自(但不限 于)雌激素、蛋白酶C激動(dòng)劑、磷脂酶抑制劑。在其它優(yōu)選實(shí)施例中，所述藥劑含有有效促進(jìn)肝再生的量的所述Y-氨基丁酸轉(zhuǎn) 運(yùn)蛋白亞型1的激動(dòng)劑。在其它實(shí)施例中，所述藥劑還含有藥學(xué)上可接受的載體和/或賦 形劑。本發(fā)明提供含Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞型1的編碼序列的表達(dá)載體在制備促進(jìn)肝 再生用的藥物中的用途。本發(fā)明提供一種篩選用于促進(jìn)肝再生的潛在物質(zhì)的方法，所述的方法包括(1)將候選物質(zhì)與表達(dá)Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞型1的體系接觸；(2)檢測(cè)候選物質(zhì)對(duì)Y -氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞型1的影響；若所述候選物質(zhì)可提高Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞型1的表達(dá)、活性或分泌，則表明 該候選物質(zhì)是可用于促進(jìn)肝再生的潛在物質(zhì)。在一優(yōu)選實(shí)施例中，所述步驟(1)包括在測(cè)試組中，將候選物質(zhì)加入到組成性表 達(dá)或誘導(dǎo)性表達(dá)Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞型1的體系中；和/或步驟(2)包括檢測(cè)測(cè)試組的體系中Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞型1的表達(dá)或活性， 并與對(duì)照組比較，其中所述的對(duì)照組是不添加所述候選物質(zhì)的表達(dá)Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 亞型1的體系；如果測(cè)試組中Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞型1的表達(dá)、活性或分泌在統(tǒng)計(jì)學(xué)上高于 對(duì)照組，就表明該候選物質(zhì)是可用于促進(jìn)肝再生的潛在物質(zhì)。在一優(yōu)選實(shí)施例中，所述體系選自細(xì)胞體系、亞細(xì)胞體系、溶液體系、組織體系、 器官體系或動(dòng)物體系。在一優(yōu)選實(shí)施例中，所述方法還包括對(duì)獲得的潛在物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 和/或動(dòng)物試驗(yàn)，以從候選物質(zhì)中進(jìn)一步選擇和確定對(duì)于促進(jìn)肝再生有用的組合物。


圖1顯示在肝切后的不同時(shí)間點(diǎn)，GAT-I在肝臟中的表達(dá)情況。C57BL/6小鼠(每 個(gè)時(shí)間點(diǎn)3-4只)，通過(guò)給小鼠在第0天進(jìn)行肝臟切除術(shù)(約70%肝臟切除)，觸動(dòng)剩余肝 臟再生。在肝切后的第0小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)，處死小鼠，取出小鼠的肝臟抽取 RNA。通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測(cè)GAT-I的表達(dá)水平。所示數(shù)據(jù)代表3次試驗(yàn)的結(jié)果。圖2顯示肝切后，GAT-I-/-小鼠肝臟再生明顯下降。對(duì)照組(野生型)和實(shí)驗(yàn)組 (GAT-1-/-)，每組9-10只小鼠，通過(guò)給小鼠在第0天進(jìn)行肝臟切除術(shù)(約70%肝臟切除)， 以觸動(dòng)剩余肝臟再生。在肝切后的第24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)，分別稱(chēng)量小鼠體重，處死 小鼠，取出小鼠的肝臟并稱(chēng)其重量。根據(jù)小鼠肝臟重量/小鼠的體重X 100計(jì)算每只小鼠 的肝臟與體重比率。所示數(shù)據(jù)代表3次試驗(yàn)的結(jié)果。
圖3顯示通過(guò)RNAi技術(shù)干擾GAT-I表達(dá)后，小鼠肝臟再生明顯下降。對(duì)照組和實(shí) 驗(yàn)組(GAT-1 siRNA)，每組3-4只小鼠，在第0天，給小鼠尾靜脈注射2ml的0.9%生理鹽水 或GAT-I siRNA。48小時(shí)后，給小鼠實(shí)施肝臟切除術(shù)(約70%肝臟切除)，觸動(dòng)小鼠肝再生。 肝切后48小時(shí)，處死小鼠，按照?qǐng)D2所述的方法計(jì)算每只小鼠的肝臟與體重比率。圖4顯示利用分子生物學(xué)技術(shù)上調(diào)肝臟中GAT-I表達(dá)后，小鼠肝臟再生明顯增加。 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組(GAT-1質(zhì)粒)，每組3-4只小鼠，在第0天，給小鼠尾靜脈注射2ml的空質(zhì) 粒或GAT-I的表達(dá)質(zhì)粒。48小時(shí)后，給小鼠實(shí)施肝臟切除術(shù)(約70%肝臟切除)，觸動(dòng)小鼠 肝再生。肝切后48小時(shí)，處死小鼠，按照?qǐng)D2所述的方法計(jì)算每只小鼠的肝臟與體重比率。圖5顯示GAT-I質(zhì)粒圖譜。
具體實(shí)施例方式γ -氨基丁酸(GABA)作為重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，與興奮型神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸相互 平衡維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能。由神經(jīng)元釋放至突觸間隙的GABA部分與位于突觸后 膜的GABA受體結(jié)合，而大部分GABA則通過(guò)突觸前膜的GABA轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)。Y -氨 基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞型I(GAT-I)作為抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的主要轉(zhuǎn)運(yùn)體之一，最早被科學(xué)家們 所發(fā)現(xiàn)，目前認(rèn)為其主要表達(dá)在嗅球、神經(jīng)皮質(zhì)、小腦、上丘、基質(zhì)核，并且主要分布在突觸 前膜末端、神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞，對(duì)于維持體內(nèi)較低濃度的GABA起著重要的作用。本發(fā)明利用GAT-I基因缺失動(dòng)物，首次發(fā)現(xiàn)GAT-I缺失后小鼠肝再生能力明顯下 降，證實(shí)了 GAT-I在肝再生病理生理機(jī)制中發(fā)揮重要作用。進(jìn)一步的研究顯示，利用RNAi 技術(shù)干擾小鼠肝臟中GAT-I表達(dá)后，小鼠肝再生能力明顯減弱。因此，本發(fā)明一方面涉及促進(jìn)對(duì)象肝再生的方法，該方法包括促進(jìn)該對(duì)象GAT-I 基因的表達(dá)。GAT-I基因的核苷酸序列的GenBank登錄號(hào)為NM_178703，氨基酸序列的GenBank 登錄號(hào)為NP_848818。所述對(duì)象包括各種哺乳動(dòng)物，例如人、各種馴養(yǎng)動(dòng)物、寵物等等。促進(jìn)GAT-I基因表達(dá)的方法包括采用生物技術(shù)向?qū)ο蠹?xì)胞中轉(zhuǎn)入含有該GAT-I基 因的表達(dá)載體，該表達(dá)載體能夠在所述對(duì)象細(xì)胞中表達(dá)GAT-I蛋白。或者，通過(guò)給予GAT-I 基因表達(dá)的激動(dòng)劑來(lái)促進(jìn)細(xì)胞中GAT-I基因的表達(dá)。本發(fā)明另一方面涉及促進(jìn)對(duì)象肝再生的方法，該方法包括向該對(duì)象提供GAT-I蛋 白或GAT-I的激動(dòng)劑。所用的GAT-I蛋白可以是天然存在的，比如其可被分離或純化自哺乳動(dòng)物。此外， 所述的GAT-I蛋白也可以是人工制備的，比如可以根據(jù)常規(guī)的基因工程重組技術(shù)來(lái)生產(chǎn)重 組GAT-I蛋白。優(yōu)選的，本發(fā)明可采用重組的GAT-I蛋白。任何適合的GAT-I蛋白均可用于本發(fā)明。所述的GAT-I蛋白包括全長(zhǎng)的GAT-I蛋 白或其生物活性片段。優(yōu)選的，所述的GAT-I蛋白的氨基酸序列可以與GenBank登錄號(hào) NP_848818所示的序列基本上相同。經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)(例如幾個(gè))氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的GAT-I蛋 白的氨基酸序列也包括在本發(fā)明中。GAT-I蛋白或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸 的替代序列，所述經(jīng)氨基酸替換的序列并不影響其活性或保留了其部分的活性。適當(dāng)替換
5氨基酸是本領(lǐng)域公知的技術(shù)，所述技術(shù)可以很容易地被實(shí)施并且確保不改變所得分子的生 物活性。這些技術(shù)使本領(lǐng)域人員認(rèn)識(shí)到，一般來(lái)說(shuō)，在一種多肽的非必要區(qū)域改變單個(gè)氨 基酸基本上不會(huì)改變生物活性。見(jiàn)Watson等，Molecular Biology of The Gene，第四版， 1987, TheBenjamin/Cummings Pub.Co.P224。具體而言，氨基酸一般被分成四類(lèi)(1)酸性——天冬氨酸和谷氨酸；(2)堿 性——賴(lài)氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)非極性——丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、 苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；(4)無(wú)電荷的極性——甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨 酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。有時(shí)將苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸歸為芳族氨基酸。例如，有 理由預(yù)測(cè)單獨(dú)用異亮氨酸或纈氨酸取代亮氨酸、用谷氨酸取代天冬氨酸、用絲氨酸取代蘇 氨酸，或者用結(jié)構(gòu)上相關(guān)的氨基酸取代類(lèi)似的保守的氨基酸，這樣的替代將不會(huì)對(duì)生物活 性有重要影響。例如，本發(fā)明的GAT-I蛋白可包括多達(dá)約5-10個(gè)保守的或不保守的氨基酸 取代，甚至多達(dá)約15-25個(gè)保守的或不保守的氨基酸取代，或2-25之間任何整數(shù)，只要該 分子的所需功能仍維持完整。本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員可結(jié)合本領(lǐng)域熟知的Hopp/Woods和 Kyte-Doolittle曲線圖，容易地測(cè)定感興趣的分子中可耐受改變的區(qū)域。任何一種GAT-I蛋白的生物活性片段都可以應(yīng)用到本發(fā)明中。在這里，GAT-I蛋白 的生物活性片段的含義是指作為一種多肽，其仍然能保持全長(zhǎng)的GAT-I蛋白的全部或部分 功能。通常情況下，所述的生物活性片段至少保持50%的全長(zhǎng)GAT-I蛋白的活性。在更優(yōu) 選的條件下，所述活性片段能夠保持全長(zhǎng)GAT-I蛋白的60%、70%、80%、90%、95%、99%、 或100%的活性。本發(fā)明也可采用經(jīng)修飾或改良的GAT-I蛋白，比如，可采用為了促進(jìn)其半衰期、有 效性、代謝、和/或蛋白的效力而加以修飾或改良的GAT-I蛋白。所述經(jīng)過(guò)修飾或改良的 GAT-I蛋白可以是一種GAT-I蛋白的共軛物，或其可包含被取代的或人工的氨基酸。所述經(jīng) 過(guò)修飾或改良的GAT-I蛋白可以是與天然存在的GAT 1蛋白具有較小的共同點(diǎn)，但也能促 進(jìn)肝再生，且不會(huì)帶來(lái)其它不良影響或毒性。也就是說(shuō)，任何不影響GAT-I蛋白的生物活性 的變化形式都可用于本發(fā)明中。根據(jù)GAT-I蛋白的氨基酸序列可以方便地得出其相應(yīng)的核苷酸編碼序列。優(yōu)選 的，所述的GAT-I蛋白的核苷酸序列可以與GenBank登錄號(hào)NM_178703所示的序列基本上 相同。因此，本發(fā)明的蛋白質(zhì)包括(1)如GenBank登錄號(hào)NP_848818所示的蛋白質(zhì)；和 (2)在GenBank登錄號(hào)NP_848818所示的氨基酸序列中，經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè) 氨基酸且具有GenBank登錄號(hào)NP_848818所示蛋白的活性的由GenBank登錄號(hào)NP_848818 衍生的蛋白質(zhì)?？刹捎酶鞣N方法制備本發(fā)明的蛋白質(zhì)。通常用重組方法制備本發(fā)明的蛋白質(zhì)?？?以用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法制備編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的多核苷酸。例如，用重組方法可以獲得 編碼上述分子的多核苷酸序列，例如通過(guò)從表達(dá)該基因的細(xì)胞篩選cDNA和基因組文庫(kù)，或 通過(guò)從已知的包括該基因的載體衍生該基因。也可合成而非克隆制備感興趣的基因?？捎?適當(dāng)?shù)奶囟ㄐ蛄械拿艽a子消化該分子。然后將用標(biāo)準(zhǔn)方法制備的重疊的寡核苷酸裝配完 整的序列，并裝配入完整的編碼序列中。參見(jiàn)如Edge (1981)Nature 292 :756 ;Nambair等 (1984)Science223 1299 ；和 Jay 等(1984) J. Biol. Chem. 259 :6311。
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因此，從攜帶所需序列的載體可獲得具體的核苷酸序列，或用本領(lǐng)域已知的各 種寡核苷酸合成方法，如定位誘變和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，完全或部分合成。參見(jiàn)如 Sambrook，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Molecular Cloning :aLaboratory Manual)，第二版， 1989。具體說(shuō)，獲得編碼所需序列的核苷酸序列的方法是用常規(guī)的自動(dòng)多核苷酸合成儀制 備的退火補(bǔ)集的重疊的合成的寡核苷酸，然后用適當(dāng)?shù)腄NA連接酶連接，并用PVR擴(kuò)增連接 的核苷酸序列。參見(jiàn)如 Jayaraman 等(1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4084-4088。另 外，在本發(fā)明中也可使用寡核苷酸定向的合成(Jones等，(1986)Nature 54:75-82)、先有 核苷酸區(qū)域的寡核苷酸定向誘變(Riechmann等，(1988)Nature 332 :323_327和Verhoeyen 等(1988) Science 239 1534-1536)和用T4DNA聚合酶進(jìn)行的酶促補(bǔ)平帶缺口的寡核苷酸 合成(Queen 等(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA86 10029-10033)。一旦制備或分離了編碼序列，就可將這些序列克隆入任何合適的載體或復(fù)制子 中。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，各種克隆載體是已知的，且適當(dāng)?shù)目寺≥d體的篩選只是選擇問(wèn) 題。合適的載體包括(但并非限制于)質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、粘粒、染色體或當(dāng)與適當(dāng)?shù)?控制元件結(jié)合時(shí)能復(fù)制的病毒。然后將克隆序列置于合適的控制元件的控制下，這取決于用于表達(dá)的系統(tǒng)。因此， 可以將編碼序列置于啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)(用于細(xì)菌表達(dá))和任選地操縱子的控制下， 從而由合適的轉(zhuǎn)化體將感興趣的DNA序列轉(zhuǎn)錄到RNA中。該編碼序列可以包含或不包含 信號(hào)肽或前導(dǎo)序列(隨后可由宿主在翻譯后加工除去)。參見(jiàn)如美國(guó)專(zhuān)利No. 4，431，739; 4，425，437 ；4，338，397。除了控制序列外，可以添加調(diào)節(jié)序列，從而可以相對(duì)于宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)序列 的表達(dá)。調(diào)節(jié)序列是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，其實(shí)例包括那些能導(dǎo)致應(yīng)答化學(xué)或物理刺激 (包括調(diào)節(jié)化合物的存在)啟動(dòng)或關(guān)閉基因表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。載體中還可存在其它類(lèi)型的 調(diào)節(jié)元件。例如，可以使用增強(qiáng)子元件以增加構(gòu)建物的表達(dá)水平。實(shí)例包括SV40早期基因 增強(qiáng)子(Dijkema等(1985) EMB0J. 4 :761)；從Rous肉瘤病毒的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)衍生 的增強(qiáng)子 / 啟動(dòng)子(Gorman 等(1982)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 6777)；和從人 CMV 衍 生的元件(Boshart等，(1985) Cell 41 :521)，如CMV內(nèi)含子A序列中包括的元件(美國(guó)專(zhuān) 利No. 5，688，688)。表達(dá)盒中還可包括在合適的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)、一種或多 種可選擇的標(biāo)記物、一個(gè)或多個(gè)限制酶切位點(diǎn)、高拷貝數(shù)量的勢(shì)能和強(qiáng)啟動(dòng)子。構(gòu)建表達(dá)載體，使具體的編碼序列位于該具有適合調(diào)節(jié)序列的載體中，與控制序 列有關(guān)的編碼序列的位置和取向使編碼序列在控制序列的“控制”下轉(zhuǎn)錄(即，結(jié)合于控制 序列中DNA分子的RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄該編碼序列)?？赡苄枰獙?duì)編碼感興趣分子的序列進(jìn)行 修飾來(lái)實(shí)現(xiàn)此目的。例如，在一些情況中可能需要修飾該序列，從而使其連接于適合取向的 控制序列，即維持讀框。在插入到載體之前，控制序列和其它調(diào)節(jié)序列可能連接于編碼序 列?；蛘?，可以將編碼序列直接克隆入已包含控制序列和合適的限制酶切位點(diǎn)的表達(dá)載體 中。通過(guò)缺失一部分編碼感興趣的多肽的序列、插入序列、和/或替代該序列內(nèi) 的一個(gè)或多個(gè)核苷酸，可以制備用于分析的本發(fā)明蛋白的突變體或類(lèi)似物。修飾核 苷酸序列的方法，如定向誘變等是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。參見(jiàn)如Sambrook等， 上述；Kunkel，T. A. (1985)Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1985)82 448 ；Geisselsoder 等(1987)BioiTechniques 5 :786 ;Zoller 禾口 Smith(1983)Methods Enzymol.100 468 ； Dalbie-McFarland 等(1982)Proc. Natl. Acad. SciUSA79 :6409。這種分子可以在各種系統(tǒng)中表達(dá)，包括本領(lǐng)域熟知的昆蟲(chóng)、哺乳動(dòng)物、細(xì)菌、病毒 和酵母表達(dá)系統(tǒng)。例如，昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)如桿狀病毒系統(tǒng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，描述于如 Summers 禾口 Smith，Texas Aguricultural Experiment Station BulletinNo. 1555 (1987)。 用于桿狀病毒/昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的材料和方法都是可以試劑盒形式購(gòu)得的，尤其是 Invitrogen, San Diego CA(" MaxBac"試劑盒)。類(lèi)似地，細(xì)菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) 也是本領(lǐng)域熟知的，其描述見(jiàn)如Sambrook等，如上。酵母表達(dá)系統(tǒng)也是本領(lǐng)域熟知的，其描 述見(jiàn)如《酵母遺傳工程》(YeastGenetic Engineering) (Barr 等編輯，1989)Butterworths， London。許多用于上述系統(tǒng)的適合的宿主細(xì)胞也是已知的。例如，哺乳動(dòng)物細(xì)胞系是本 領(lǐng)域已知的，其包括可從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得的無(wú)限增殖化的細(xì)胞系， 如(但并非限制于)中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CH0)、Hela細(xì)胞、幼倉(cāng)鼠腎(BHK)細(xì)胞、猴腎細(xì) 胞(COS)、人胚腎細(xì)胞、人肝細(xì)胞癌細(xì)胞(如H印G2)、Madin-Darby牛腎(〃 MDBK")細(xì) 胞等。類(lèi)似地，在本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建物中也可使用細(xì)菌宿主，如大腸桿菌、枯草桿菌和鏈 球菌。在本發(fā)明中還可用酵母宿主，特別包括釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、 麥芽糖假絲酵母(Candidamaltosa)、白色念珠菌(Candida albicans)、多形漢遜酵 母(Hansenulapolymorpha)、脆壁克魯維酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克魯 維酵母(Kluyveromyces lactis)、季也蒙氏畢赤酵母(Pichia guillerimondii)、巴 斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomycespombe)和 yarrowia lipolytic^?？膳c桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)一起使用的昆蟲(chóng)細(xì)胞特別包括埃及伊 岐(Aedes aegypti)、苜猜丫 紋夜蛾(Autographacalifornica)、家香(Bombyx mori)、黑
(Drosophila melanogaster) >(Spodoptera frugiperda)禾口D"!^*.
(Trichoplusia ni)。用本領(lǐng)域熟知的各種基因送遞的方法，可將包含感興趣的核苷酸序列的核酸分子 穩(wěn)定地整合入宿主細(xì)胞基因組中或在合適的宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定的附加型元件上維持。參見(jiàn) 如美國(guó)專(zhuān)利No. 5，399，346。根據(jù)所選用的表達(dá)系統(tǒng)和宿主，在表達(dá)蛋白質(zhì)的條件下，培養(yǎng)用如上所述的表達(dá) 載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞制備該分子。然后從宿主細(xì)胞分離出表達(dá)的蛋白質(zhì)并純化。如果表達(dá) 系統(tǒng)將蛋白質(zhì)分泌到培養(yǎng)基中，則直接從培養(yǎng)基純化產(chǎn)物。如果不是分泌的，則從細(xì)胞裂解 液分離。適合的培養(yǎng)條件和回收方法的選擇都是在本領(lǐng)域技術(shù)人員能力之內(nèi)。因此，本發(fā)明也包括編碼本發(fā)明GAT-1蛋白質(zhì)的核苷酸序列和含有該核苷酸序列 的表達(dá)載體，以及使用這類(lèi)核苷酸序列或其表達(dá)載體促進(jìn)肝再生。本發(fā)明還涉及所述GAT-1蛋白、其編碼序列以及含有所述編碼序列的表達(dá)載體在 制備促進(jìn)肝再生用的物質(zhì)中的用途。所述制備也包括基于所述GAT-1蛋白、其編碼序列以 及含有所述編碼序列的表達(dá)載體而篩選能夠促進(jìn)肝再生的物質(zhì)。因此，再一方面，本發(fā)明提供一種篩選用于促進(jìn)肝再生的潛在物質(zhì)的方法，該方法 包括
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(1)將候選物質(zhì)與表達(dá)、_氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞型1的體系接觸；(2)檢測(cè)候選物質(zhì)對(duì)、_氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞型1的影響；若所述候選物質(zhì)可提高氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞型1的表達(dá)、活性或分泌，則表明 該候選物質(zhì)是可用于促進(jìn)肝再生的潛在物質(zhì)。在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，在進(jìn)行篩選時(shí)，為了更易于觀察到GAT-1的表達(dá)或活性 的改變，還可設(shè)置對(duì)照組，所述的對(duì)照組可以是不添加所述候選物質(zhì)的表達(dá)GAT-1的體系。所述的表達(dá)GAT-1的體系例如可以是細(xì)胞(或細(xì)胞培養(yǎng)物)體系，所述的細(xì)胞可 以是內(nèi)源性表達(dá)GAT-1的細(xì)胞；或可以是重組表達(dá)GAT-1的細(xì)胞。所述的表達(dá)GAT-1的體 系還可以是(但不限于)亞細(xì)胞體系、溶液體系、組織體系、器官體系或動(dòng)物體系(如動(dòng)物 模型)等。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，所述的體系是表達(dá)GAT-1的細(xì)胞體系。較佳地，表達(dá) GAT-1的免疫細(xì)胞可來(lái)源于以下3種制備方法①來(lái)源于正常哺乳動(dòng)物的單個(gè)核細(xì)胞取正常哺乳動(dòng)物單個(gè)核細(xì)胞(淋巴結(jié)、外周血、脾臟)經(jīng)過(guò)，例如(但不限于) anti-⑶3和anti-⑶28或佛波脂和離子酶素刺激后，該細(xì)胞可表達(dá)GAT-1蛋白。將該種細(xì) 胞作為用于篩選促進(jìn)肝再生的藥物的細(xì)胞模型。②T淋巴細(xì)胞系，選自(但不限于)0VA-特異性T細(xì)胞系、M0G-特異性T細(xì)胞系、 MBP-特異性T細(xì)胞系、Jurkat細(xì)胞系、YAC-1細(xì)胞系、人T淋巴細(xì)胞系(H9)、Hut-102等。取T淋巴細(xì)胞系經(jīng)過(guò)抗原或anti-⑶3和anti-⑶28或佛波脂和離子酶素刺激后， 該細(xì)胞可表達(dá)GAT-1蛋白。將該種細(xì)胞作為用于篩選促進(jìn)肝再生的藥物的細(xì)胞模型。③來(lái)源于抗原免疫后或疾病狀態(tài)的哺乳動(dòng)物的單個(gè)核細(xì)胞取抗原免疫后或疾病狀態(tài)的哺乳動(dòng)物的單個(gè)核細(xì)胞(外周血、淋巴結(jié)、脾臟、病灶 部位等)經(jīng)過(guò)刺激(抗原、anti-⑶3和anti-⑶28、佛波脂和離子酶素)活化后，該細(xì)胞可 表達(dá)GAT-1蛋白。將該種細(xì)胞作為用于促進(jìn)肝再生的藥物的細(xì)胞模型。作為本發(fā)明的另一種優(yōu)選方式，所述的體系是動(dòng)物模型體系。較佳地，可采用具有 致病性的抗原或致病性的免疫細(xì)胞來(lái)制備致病的動(dòng)物模型。所述的動(dòng)物包括但不限于小 鼠、大鼠、豚鼠、兔等。誘導(dǎo)方法可如下經(jīng)抗原免疫主動(dòng)誘導(dǎo)致?。唤?jīng)被動(dòng)轉(zhuǎn)移致病性(但 不限于)T細(xì)胞或B細(xì)胞或免疫因子(如抗體等)誘導(dǎo)致病。所述的動(dòng)物模型也可以是自 發(fā)性的發(fā)病的動(dòng)物模型。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的方法還包括對(duì)獲得的潛在物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的細(xì) 胞實(shí)驗(yàn)和/或動(dòng)物試驗(yàn)，以進(jìn)一步選擇和確定對(duì)于促進(jìn)肝再生真正有用的物質(zhì)。本發(fā)明對(duì)于GAT-1蛋白的表達(dá)、活性、存在量或分泌情況的檢測(cè)方法沒(méi)有特別 的限制?？梢圆捎贸Ｒ?guī)的蛋白定量或半定量檢測(cè)技術(shù)，例如(但不限于)SDS_PAGE法， Western-Blot 法，ELISA 等。因此，本發(fā)明還提供了采用所述篩選方法獲得的可用于促進(jìn)肝再生的潛在物質(zhì)。 這些初步篩選出的物質(zhì)可構(gòu)成一個(gè)篩選庫(kù)，以便于人們最終可以從中篩選出能夠?qū)τ诖龠M(jìn) 肝再生真正有用的物質(zhì)，從而用于臨床。因此，本發(fā)明再一方面還包括GAT-1的激動(dòng)劑及其在制備促進(jìn)肝再生用的藥物方 面的用途。
如本文所用，所述的GAT-1的激動(dòng)劑包括促進(jìn)劑、上調(diào)劑等。任何可提高GAT-1蛋 白的活性、維持GAT-1蛋白的穩(wěn)定性、促進(jìn)GAT-1蛋白的表達(dá)、促進(jìn)GAT-1蛋白的分泌、延長(zhǎng) GAT-1蛋白有效作用時(shí)間、或促進(jìn)GAT-1的轉(zhuǎn)錄和翻譯的物質(zhì)均可用于本發(fā)明，作為可用于 促進(jìn)肝再生的有效物質(zhì)。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的GAT-1的激動(dòng)劑包括(但不限于)雌激素、蛋白 酶C激動(dòng)劑(佛波脂、(-)-Indolactam V等)、磷脂酶抑制劑(環(huán)胞酶素A、Okadaic Acid
寸J <>作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的GAT-1蛋白的激動(dòng)劑包括(但不限于)在轉(zhuǎn)入細(xì) 胞后可表達(dá)(優(yōu)選過(guò)表達(dá))GAT-1的表達(dá)載體或表達(dá)構(gòu)建物。通常，所述表達(dá)載體包含一基 因盒，所述的基因盒含有編碼GAT-1的基因及與之操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列。所述的“操 作性相連”或“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠調(diào)節(jié)或控 制同一線性DNA序列其它部分的活性。例如，如果啟動(dòng)子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它就是可操 作地連于編碼序列。本發(fā)明中，GAT-1多核苷酸序列可插入到重組表達(dá)載體中。只要能在宿主體內(nèi)復(fù) 制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用于本發(fā)明。表達(dá)載體的一個(gè)重要特征是通常含有復(fù)制 起點(diǎn)、啟動(dòng)子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。如前文所述，本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含GAT-1的DNA序列和合 適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體 內(nèi)重組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合 成。轉(zhuǎn)化載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。本發(fā)明還提供了一種組合物，它含有有效量(如0.000001-50wt% ；較佳的 0. 00001-20襯％;更佳的，0. 0001-10wt% )的所述的GAT-1蛋白或其激動(dòng)劑，以及藥學(xué)上可 接受的載體。本發(fā)明的組合物可直接用于促進(jìn)肝再生。此外，還可同時(shí)與其它治療劑或輔劑聯(lián) 合使用。通常，可將這些物質(zhì)配制于無(wú)毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其 中pH通常約為5-8，較佳地，pH約為6-8。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“含有”表示各種成分可一起應(yīng)用于本發(fā)明的混合物或組合物 中。因此，術(shù)語(yǔ)“主要由...組成”和“由...組成”包含在術(shù)語(yǔ)“含有”中。如本文所用，術(shù) 語(yǔ)“有效量”或“有效劑量”是指可對(duì)人和/或動(dòng)物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和/或動(dòng)物 所接受的量。如本文所用，“藥學(xué)上可接受的”的成分是適用于人和/或哺乳動(dòng)物而無(wú)過(guò)度不良 副反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))的，即具有合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比的物質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上 可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。本發(fā)明的組合物含有安全有效量的GAT-1蛋白以及藥學(xué)上可接受的載體。這類(lèi)載 體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。通常藥物制劑應(yīng)與 給藥方式相匹配，本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄 糖和其他輔劑的水溶液通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。所述的藥物組合物宜在無(wú)菌條件下制造。 活性成分的給藥量是治療有效量。本發(fā)明的藥物制劑還可制成緩釋制劑。
本發(fā)明所述的GAT-1蛋白或其激動(dòng)劑的有效量可隨給藥的模式和待處理的肝損 傷的嚴(yán)重程度等而變化。優(yōu)選的有效量的選擇可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)各種因素來(lái) 確定(例如通過(guò)臨床試驗(yàn))。所述的因素包括但不限于所述的GAT-1蛋白或其激動(dòng)劑的 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)例如生物利用率、代謝、半衰期等；患者所要治療的疾病的嚴(yán)重程度、患者 的體重、患者的免疫狀況、給藥的途徑等。通常，當(dāng)本發(fā)明的GAT-1蛋白或其激動(dòng)劑每天以 約0. 00001mg-50mg/kg動(dòng)物體重(較佳的0. 0001mg-10mg/kg動(dòng)物體重)的劑量給予，能得 到令人滿意的效果。例如，由治療狀況的迫切要求，可每天給予若干次分開(kāi)的劑量，或?qū)?量按比例地減少。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的激動(dòng)劑是雌激素，當(dāng)每天以0. 1-800 yg/kg動(dòng)物 體重給藥時(shí)，具有較好的效果；優(yōu)選地每天以0. 5-300 u g/kg動(dòng)物體重給藥；更優(yōu)選地每天 以1-200 u g/kg動(dòng)物體重給藥。本發(fā)明還提供了一種促進(jìn)肝再生的方法，包括給予受試者有效量的GAT-1蛋白或 其激動(dòng)劑。本發(fā)明的GAT-1蛋白或其激動(dòng)劑的給藥方式?jīng)]有特別的限制，可以是全身的或局 部的。例如，本發(fā)明的GAT-1蛋白或其激動(dòng)劑可通過(guò)腹腔注射、靜脈注射、口服、皮下注射、 皮內(nèi)注射等的方式給予動(dòng)物，較為優(yōu)選的是靜脈注射。在得知了所述的GAT-1蛋白的用途后，可以采用本領(lǐng)域熟知的多種方法來(lái)將所述 的GAT-1蛋白或其編碼基因、或其藥物組合物給藥于哺乳動(dòng)物。優(yōu)選的，可采用基因治療的 手段進(jìn)行，比如可直接將GAT-1蛋白通過(guò)諸如注射等方法給藥于受試者；或者，可通過(guò)一定 的途徑將攜帶GAT-1基因的表達(dá)單位(比如表達(dá)載體或病毒等)遞送到靶點(diǎn)上，并使之表 達(dá)活性的GAT-1蛋白。作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，可將所述的GAT-1蛋白直接給藥于哺乳動(dòng)物(比如 人)，或者，可將編碼GAT-1蛋白的基因通過(guò)常規(guī)的方法克隆到適當(dāng)?shù)妮d體(如常規(guī)原核或 真核表達(dá)載體、或病毒載體如皰疹病毒載體或腺病毒載體)中，將所述的載體導(dǎo)入到可表 達(dá)所述GAT-1蛋白的細(xì)胞中，使所述的細(xì)胞表達(dá)GAT-1蛋白。可通過(guò)將適量的所述細(xì)胞引 入到哺乳動(dòng)物身體的適當(dāng)部位，實(shí)現(xiàn)GAT-1蛋白的表達(dá)。GAT-1蛋白的激動(dòng)劑的給藥方式主要取決于所述激動(dòng)劑的類(lèi)型和特性，這是本領(lǐng) 域人員可以評(píng)估的。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件如 Sambrook 等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和 份數(shù)按重量計(jì)算。實(shí)施例1實(shí)施例中實(shí)驗(yàn)所用材料及試劑1.動(dòng)物:C57BL/6小鼠、GAT-l-/-小鼠的構(gòu)建方法參考Cai YQ等，Journalof Neuroscience Research, 2006,84 :255_67。2.試劑GAT_1和0 -actin引物合成于上海英駿生物技術(shù)有限公司；RNA抽 提試劑盒、RNA 逆轉(zhuǎn)試劑盒購(gòu) Invitrogen ;SYBR Green PCR master mix 購(gòu)自 Applied
11Biosystems ；自GAT-1 siRNA合成于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。3.測(cè)試方法實(shí)時(shí)定量PCR1)RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄①RNA的提取使用Qiagen公司Rneasy Mini Kit，按照說(shuō)明書(shū)操作，簡(jiǎn)述如下從-80°C取出裝有350 u 1細(xì)胞裂解液的EP管，等待其融化|加入等體積350 ill 70 %乙醇，顛倒混勻數(shù)次|全部轉(zhuǎn)移至Rneasy mini colume，放在2ml收集管上|>= 8000g( >= 10000轉(zhuǎn)/分鐘)，常溫離心約15秒，倒去收集管內(nèi)液體(如果樣品超過(guò)700 ill，再重復(fù)一次)|加入 350 ill RW1 溶液，>=8000g( >= 10000 轉(zhuǎn) / 分鐘)，常溫離心約15秒，倒去收集管內(nèi)液體，置換新2ml收集管|加入80 ill DNA酶(盡量直接加到膜上)，室溫作用15分鐘|加入 350 ill RW1 溶液，>=8000g( >= 10000 轉(zhuǎn) / 分鐘)，常溫離心約15秒，倒去收集管內(nèi)液體，置換新2ml收集管|加入 500 u 1 RPE 溶液(工作濃度)，>=8000g( > = 10000 轉(zhuǎn) / 分鐘)，常溫離心約15秒，倒去收集管內(nèi)液體|加入 500 u 1 RPE 溶液(工作濃度)，>=8000g( > = 10000 轉(zhuǎn) / 分鐘)，常溫離心約2分鐘，倒去收集管內(nèi)液體|將Rneasy mini colume放在新的1. 5ml收集管上|加入 30-50 ii 1 RNAse-free 水，>=8000g( >= 10000 轉(zhuǎn) / 分鐘)，常溫離心約1分鐘，收集管內(nèi)液體，測(cè)0D值|如果 RNA > 30u g,重復(fù)加入 30-50 u 1 RNAse-free 水，>= 8000g( >= 10000轉(zhuǎn)/分鐘)，常溫離心約1分鐘，收集管內(nèi)液體，測(cè)0D值|紫外分光光度儀檢測(cè)RNA濃度|分裝并標(biāo)記，于_80°C保存
②逆轉(zhuǎn)錄使用Qiagen公司的Sensiscript RT Kit，按照說(shuō)明書(shū)操作，簡(jiǎn)述如下(合成cDNA的引物為核苷酸的隨機(jī)六聚體)
權(quán)利要求
γ 氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞型1或其編碼序列在制備促進(jìn)肝再生用的物質(zhì)中的用途。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述物質(zhì)是含有所述編碼序列的表達(dá)載體。
3.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述物質(zhì)是Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞型1的 激動(dòng)劑。
4.Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞型1的激動(dòng)劑在制備促進(jìn)肝再生用的藥物中的用途。
5.如權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于，所述的Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞型1的激動(dòng) 劑選自雌激素、蛋白酶C激動(dòng)劑、和磷脂酶抑制劑。
6.含Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞型1的編碼序列的表達(dá)載體在制備促進(jìn)肝再生用的藥物 中的用途。
7.一種篩選用于促進(jìn)肝再生的潛在物質(zhì)的方法，其特征在于，所述的方法包括(1)將候選物質(zhì)與表達(dá)Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞型1的體系接觸；(2)檢測(cè)候選物質(zhì)對(duì)Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞型1的影響；若所述候選物質(zhì)可提高Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞型1的表達(dá)、活性或分泌，則表明該候 選物質(zhì)是可用于促進(jìn)肝再生的潛在物質(zhì)。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，步驟(1)包括在測(cè)試組中，將候選物質(zhì)加 入到組成性表達(dá)或誘導(dǎo)性表達(dá)Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞型1的體系中；和/或步驟(2)包括檢測(cè)測(cè)試組的體系中Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞型1的表達(dá)或活性，并與 對(duì)照組比較，其中所述的對(duì)照組是不添加所述候選物質(zhì)的表達(dá)Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白業(yè)型 1的體系；如果測(cè)試組中Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞型1的表達(dá)、活性或分泌在統(tǒng)計(jì)學(xué)上高于對(duì)照 組，就表明該候選物質(zhì)是可用于促進(jìn)肝再生的潛在物質(zhì)。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的體系選自細(xì)胞體系、亞細(xì)胞體系、溶 液體系、組織體系、器官體系或動(dòng)物體系。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法還包括對(duì)獲得的潛在物質(zhì)進(jìn)行 進(jìn)一步的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和/或動(dòng)物試驗(yàn)，以從候選物質(zhì)中進(jìn)一步選擇和確定對(duì)于促進(jìn)肝再生有 用的組合物。
全文摘要
本發(fā)明提供γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞型1(GAT-1)的編碼序列或γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞型1在制備促進(jìn)肝再生用的物質(zhì)中的用途。本發(fā)明還涉及基于所述GAT-1基因或GAT-1蛋白制備或篩選促進(jìn)肝再生用的物質(zhì)的方法。
文檔編號(hào)A61K45/00GK101935673SQ20091005435
公開(kāi)日2011年1月5日 申請(qǐng)日期2009年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月3日
發(fā)明者徐凌云, 王瑩 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院