專利名稱：殼聚糖或海藻酸鈉改性碳納米管靶向緩釋載體的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及的是一種納米藥物技術領域的制備方法，具體是一種殼聚糖或海 藻酸鈉改性碳納米管靶向緩釋載體的制備方法。
背景技術：
碳納米管(Carbon Nanotube，簡稱CNT)是近年來被發(fā)現(xiàn)的一種新型碳結 構(S. Iijima，yVa^;re1991,354,56)，是由碳原子形成的石墨烯片層巻曲而成的 無縫中空碳管，兩端各有半個富勒烯分子封端，是一種具有高度離域化n電子 共軛體系的一維量子材料。碳納米管分為單壁碳納米管(Single-wall Nanotube, SWCNT)和多壁碳納米管(Multi-wall Nanotube，麗CNT)。其制備方法主要有催 化熱解、電弧放電、模板法、化學氣相沉積法等。自碳納米管問世以來，以其獨 特的電子和力學性質及準一維管狀分子結構和潛在的巨大應用價值，迅速成為物 理、化學、材料研究的熱點。
癌癥是現(xiàn)代社會威脅人類健康的一大頑疾，目前的治療方法主要有手術、放 療和化療，但無論哪種方法都不能達到完全根治的效果。靶向藥物被人們視為未 來可能提高患者生活質量、實現(xiàn)帶瘤生存的一柄利器。開發(fā)抗腫瘤藥物的多功能 新型靶向載體系統(tǒng)成為目前全球腫瘤臨床研究的攻堅課題。近年來，人們發(fā)現(xiàn)碳 納米管具有常規(guī)藥物載體不具備的良好的跨膜性，這使得研究者將目光轉向構建 和開發(fā)碳納米管基的抗癌靶向藥物載體系統(tǒng)。但由于碳納米管管壁光滑且高度可 極化，在強的范徳華力作用下容易團聚成束，幾乎不溶于水和各種有機溶劑，難 以分散，因此需要對碳納米管進行適當改性以提高其水溶性。另一方面，要在碳 納米管上實現(xiàn)靶向和載藥兩方面功能，也需要對碳納米管進行功能化改性。
經(jīng)過對現(xiàn)有技術的文獻檢索發(fā)現(xiàn)，Hanene Ali-Boucetta等在《Chem. Commun.》(《化學通訊》)(2008， 4， 459)上發(fā)表的文章"Multiwalled carbon nanotube - doxorubicin supramolecular complexes for cancer therapeutics" 使用了聚氧丙烯嵌段共聚物Pluronic F127對多壁碳納米管進行修飾以提高其水 溶性，隨后以非共價的方式將阿霉素吸附于多壁碳納米管上，得到的碳管阿霉素復合物具有較純阿霉素更大的毒性，但不足之處在于制備出的碳納米管載體不具 有靶向性。殼聚糖(Chitosan， CHI)和海藻酸鈉(Alginate sodium， ALG)是 自然界中廣泛存在的兩種多糖，由于其出色的生物相容性，近來被廣泛的應用于 生物醫(yī)藥領域的研究。利用這兩種多糖對碳納米管進行非共價的物理包覆， 一方 面可以提高碳納米管在水中的分散性，另一方面殼聚糖表面的氨基官能團可以使 我們對其進一步改性實現(xiàn)靶向和載藥功能的結合。
發(fā)明內容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術存在的上述不足，提供一種殼聚糖或海藻酸鈉改性碳納 米管靶向緩釋載體的制備方法，即用殼聚糖和海藻酸鈉對碳納米管進行非共價的 物理包覆，并將具有靶向性功能的葉酸連接至多糖表面，得到的碳納米管藥物載 體兼具靶向和緩釋的功能。
本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的，本發(fā)明包括以下步驟
步驟(a):將1重量份碳納米管原料和1 100重量份的氧化性混合酸混合，， 依次通過超聲處理和攪拌處理后抽濾，然后用去離子水反復洗滌至pH值為7， 真空干燥后得到截短碳納米管；
所述的碳納米管原料是指通過催化熱解、電弧放電、模板法或化學氣相沉積 法方法制備得到的單壁或多壁碳納米管；
所述的氧化性混合酸是指1 5mol/L的硝酸、0. 1 100%重量酸濃度硫酸、 1/100 100/1摩爾比硝酸和硫酸的混合溶液、1/100 100/1摩爾比高錳酸鉀和 硫酸混合溶液或1/100 100/1摩爾比HA和硫酸混合溶液中的一種；
所述的超聲處理是指采用20kHz 100kHz頻率的超聲波處理1 100min;
所述的攪拌處理是指在0 2(TC的環(huán)境下攪拌反應1 50h;
所述的抽濾是指以4)0.22 um聚四氟乙烯微孔濾膜進行抽濾。
歩驟(b):將所得的截短碳納米管水溶液通過超聲處理后加入海藻酸鈉或殼 聚糖水溶液，然后再進行超聲處理和攪拌處理后依次進行抽濾和水洗后真空千 燥，得到改性碳納米管；
所述的截短碳納米管水溶液的濃度為1 100mg/mL;
所述的海藻酸鈉或殼聚糖溶液的濃度為1 10mg/mL，該海藻酸鈉或殼聚糖
水溶液與截短碳納米管水溶液的體積比為1: 1 1: 10;
歩驟(C):將改性碳納米管配置成碳納米管磷酸緩沖液經(jīng)過超聲處理后依次加入葉酸和多肽縮合劑，然后再通過通過超聲處理和攪拌處理，并經(jīng)抽濾水洗， 室溫下真空干燥，得到改性碳納米管靶向緩釋載體；
所述的碳納米管磷酸緩沖液的濃度為1 50mg/mL;
所述的葉酸用量為1 50mg，多肽縮合劑用量為1 50mg;
步驟(d):將改性碳納米管靶向緩釋載體配置成改性碳納米管靶向緩釋載體 磷酸緩沖液溶液并經(jīng)超聲處理后加入蒽環(huán)類抗癌藥物水溶液，最后經(jīng)超聲處理和 攪拌處理，并經(jīng)抽濾水洗，室溫下真空干燥，得到加載藥物后的殼聚糖或海藻酸 鈉改性碳納米管靶向緩釋載體。
所述的改性碳納米管靶向緩釋載體磷酸緩沖液溶液的濃度為1 20mg/mL;
所述的蒽環(huán)類抗癌藥物是指阿霉素(Doxorubicin, D0X)或表阿霉素 (Epirubicin， EPB)。
所述的蒽環(huán)類抗癌藥物磷酸緩沖液溶液的濃度為1 100mg/mL，該蒽環(huán)類抗 癌藥物水溶液與改性碳納米管耙向緩釋載體磷酸緩沖液溶液的體積比為1:1 1: 10。
本發(fā)明提供的制備方法簡單易行，可控性強。所得碳納米管載體水溶性好， 可實現(xiàn)對阿霉素等蒽環(huán)類抗癌藥物的酸性pH下緩釋效果，并具有對癌細胞的靶 向功能，對癌細胞的毒性作用遠大于純藥物效果，對用于癌癥治療的納米靶向載 藥系統(tǒng)的構建有著重要的指導意義。
圖la為截短碳納米管的透射電子顯微鏡照片；
圖lb為葉酸靶向殼聚糖或海藻酸鈉改性碳納米管載體裝載阿霉素后的透射 電子顯微鏡照片；
圖2為加載阿霉素后的葉酸靶向殼聚糖或海藻酸鈉改性的碳納米管在不同 pH環(huán)境中的藥物緩釋示意曲線圖3為人類子宮癌細胞經(jīng)過葉酸耙向殼聚糖或海藻酸鈉改性碳納米管載體 (FA-CHI/ALG -SWCNTs)，載藥的葉酸靶向殼聚糖或海藻酸鈉改性碳納米管(DOX-FA-CHI/ALG-SWCNTs)和純阿霉素(D0X)處理lh后繼續(xù)培養(yǎng)24 h、 48 h和72 h 后的存活率示意圖4為葉酸耙向殼聚糖或海藻酸鈉改性碳納米管載體進入癌細胞的作用機 制示意圖。
具體實施例方式
下面對本發(fā)明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發(fā)明技術方案為前提下 進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限 于下述的實施例。
實施例l、以化學氣相沉積法方法制備的單壁碳納米管(SWCNTs)為最初原 料，經(jīng)過酸化截短后，通過非共價的物理包覆將殼聚糖或海藻酸鈉及葉酸功能化 到單壁碳納米管表面，并采用阿霉素(D0X)為模型藥物，得到葉酸靶向的殼聚 糖或海藻酸鈉改性單壁碳納米管阿霉素耙向藥物載體，具體步驟如下
步驟(a):在300 mL體積比為3: 1的98% H2S0^[1 65% HMV混酸中加入單 壁碳納米管原料500 mg， 0° C冰水浴下超聲24 h，用$ 0.22 um孔徑的聚四 氟乙烯微孔濾膜抽濾，并用大量去離子水反復洗滌多次至中性，5(TC真空干燥 24h后得到截短的單壁碳納米管；
步驟(b):在已裝有磁力攪拌轉子的單頸圓底燒瓶中，加入40mL 2mg/mL步 驟(a)所得截短后的單壁碳納米管水溶液，用40kHz超聲波處理20min后，加入 80mL 2mg/mL海藻酸鈉的水溶液，用40kHz超聲波處理lh后，室溫下攪拌12h，用 (J)0.22ym聚四氟乙烯微孔濾膜抽濾，用大量去離子水反復洗滌，室溫下干燥得 到海藻酸鈉改性的單壁碳納米管；隨后在已裝有磁力攪拌轉子的單頸圓底燒瓶 中，加入30mL2mg/mL所得海藻酸鈉改性的單壁碳納米管水溶液，用40kHz超聲波 處理20min后，加入60raL 2mg/mL殼聚糖的醋酸(0.05 M)水溶液，用40kHz超聲 波處理lh后，室溫下攪拌12h，用4 0.22ym聚四氟乙烯微孔濾膜抽濾并用大量去 離子水洗滌，得到殼聚糖或海藻酸鈉改性的單壁碳納米管；
歩驟(c):將20mL 2mg/mL歩驟(b)所得殼聚糖或海藻酸鈉修飾的單壁碳 納米管磷酸緩沖液溶液用40kHz超聲波處理20min后，加入60mg的葉酸和50mg 的多肽縮合劑(EDC)，用40kHz超聲波處理20min，室溫下攪拌12h，經(jīng)抽濾水 洗，室溫下真空干燥，得到葉酸耙向的殼聚糖或海藻酸鈉改性的單壁碳納米管抗 癌藥物靶向緩釋載體；
歩驟(d):將15mL lmg/mL步驟(c)所得葉酸靶向的殼聚糖或海藻酸鈉修 飾的單壁碳納米管的磷酸緩沖液溶液用40kHz超聲波處理10min后，加入15mL 3mg/tnL阿霉素的磷酸緩沖液溶液，用40kHz超聲波處理20min，室溫下避光攪拌' 12h，經(jīng)抽濾水洗，室溫下真空干燥，得到加載阿霉素后的殼聚糖或海藻酸鈉的
7改性單壁碳納米管抗癌藥物靶向緩釋載體。
如圖1所示，為單壁碳納米管和殼聚糖或海藻酸鈉改性單壁碳納米管靶向載 體的結構特點。如圖la可以看出單壁碳納米管清晰的管壁結構，如圖lb所示， 由于阿霉素、殼聚糖或海藻酸鈉吸附層的覆蓋和屏蔽，已經(jīng)不能清楚看到碳管的 管壁。同時經(jīng)測算殼聚糖或海藻酸鈉改性單壁碳納米管靶向載體對阿霉素的載藥 率可達(156±5%)。
如圖2所示，為殼聚糖或海藻酸鈉單壁碳納米管靶向載體負載抗癌藥物后在 不同PH值下的藥物釋放特點。在pH7. 4的中性環(huán)境中阿霉素與碳管的結合較為 穩(wěn)定而當pH降至5. 5后阿霉素呈現(xiàn)出隨時間不斷緩慢釋放的特點。
如圖3所示，為殼聚糖或海藻酸鈉改性單壁碳納米管葉酸抗癌藥物載體 (FA-CHI/ALG-SWCNTs )本身沒有明顯細胞毒性，其載帶抗癌藥物后 (DOX-FA-CHI/ALG-SWCNTs)比純阿霉素能更顯著的抑制人類子宮癌細胞的生長。
如圖4所示，為殼聚糖或海藻酸鈉改性單壁碳納米管葉酸抗癌藥物載體進入 癌細胞的作用機制示意圖。
實施例2、以化學氣相沉積法方法制備的單壁碳納米管(SWCNTs)為最初原 料，經(jīng)過酸化截短后，通過非共價的物理包覆將殼聚糖或海藻酸鈉及葉酸功能化 到單壁碳納米管表面，并采用表阿霉素(EPB)為模型藥物，得到葉酸靶向的殼 聚糖或海藻酸鈉改性單壁碳納米管阿霉素靶向藥物載體，具體步驟如下
步驟(a):在300 mL體積比為3: 1的98% H2SO^[] 65% HN(V混酸中加入單 壁碳納米管原料500 mg， 0° C冰水浴下超聲24 h，用O 0.22 y m孔徑的聚四 氟乙烯微孔濾膜抽濾，并用大量去離子水反復洗滌多次至中性，50'C真空干燥 24h后得到截短的單壁碳納米管；
歩驟(b):在已裝有磁力攪拌轉子的單頸圓底燒瓶中，加入40mL 2mg/mL歩 驟(a)所得截短后的單壁碳納米管水溶液，用40kHz超聲波處理20min后，加入 80mL 2mg/mL海藻酸鈉的水溶液，用40kHz超聲波處理lh后，室溫下攪拌12h，用 ci)0.22um聚四氟乙烯微孔濾膜抽濾，用大量去離子水反復洗滌，室溫下干燥得 到海藻酸鈉改性的單壁碳納米管；隨后在已裝有磁力攪拌轉子的單頸圓底燒瓶 中，加入30mL2mg/mL所得海藻酸鈉改性的單壁碳納米管水溶液，用40kHz超聲波 處理20min后，加入60mL 2mg/mL殼聚糖的醋酸(0.05 M)水溶液，用40kHz超聲 波處理lh后，室溫下攪拌12h，用(t)0.22um聚四氟乙烯微孔濾膜抽濾并用大量去離子水洗滌，得到殼聚糖或海藻酸鈉改性的單壁碳納米管；
步驟(c):將20mL 2mg/mL步驟(b)所得殼聚糖或海藻酸鈉修飾的單壁碳 納米管磷酸緩沖液溶液用40kHz超聲波處理20min后，加入60mg的葉酸和50mg 的多肽縮合劑(EDC)，用40kHz超聲波處理20min,室溫下攪拌12h，經(jīng)抽濾水 洗，室溫下真空干燥，得到葉酸靶向的殼聚糖或海藻酸鈉改性的單壁碳納米管抗 癌藥物靶向緩釋載體；
步驟(d):將15mL lmg/mL步驟(c)所得葉酸靶向的殼聚糖或海藻酸鈉修 飾的單壁碳納米管的磷酸緩沖液溶液用40kHz超聲波處理10min后，加入15mL 3mg/mL表阿霉素的磷酸緩沖液溶液，用40kHz超聲波處理20min，室溫下避光攪 拌12h，經(jīng)抽濾水洗，室溫下真空干燥，得到加載表阿霉素后的殼聚糖或海藻酸 鈉的改性單壁碳納米管抗癌藥物靶向緩釋載體。
實施例2得到的加載表阿霉素后的殼聚糖或海藻酸鈉的改性單壁碳納米管 載體具有較好的水溶性，載藥率也可達到144±6%。
實施例3、以化學氣相沉積法方法制備的多壁碳納米管(MWCNTs)為最初原 料，經(jīng)過酸化截短后，通過非共價的物理包覆將殼聚糖或海藻酸鈉及葉酸功能化 到多壁碳納米管表面，并采用阿霉素(DOX)為模型藥物，得到葉酸靶向的殼聚 糖或海藻酸鈉改性多壁碳納米管阿霉素耙向藥物載體，具體步驟如下
步驟(a):在300 mL體積比為3: 1的98%跳和65% HN(V混酸中加入多 壁碳納米管原料500 mg， 0° C冰水浴下超聲24 h，用①0.22 ixm孔徑的聚四 氟乙烯微孔濾膜抽濾，并用大量去離子水反復洗滌多次至中性，5(TC真空干燥 24h后得到截短的多壁碳納米管；
歩驟(b):在己裝有磁力攪拌轉子的單頸圓底燒瓶中，加入40raL 2mg/mL步 驟(a)所得截短后的多壁碳納米管水溶液，用40kHz超聲波處理20min后，加入 80mL 2mg/mL海藻酸鈉的水溶液，用40kHz超聲波處理lh后，室溫下攪拌12h，用 4 0.22um聚四氟乙烯微孔濾膜抽濾，用大量去離子水反復洗滌，室溫下干燥得 到海藻酸鈉改性的多壁碳納米管；隨后在已裝有磁力攪拌轉子的單頸圓底燒瓶 中，加入30niL2mg/mL所得海藻酸鈉改性的多壁碳納米管水溶液，用40kHz超聲波 處理20min后，加入60tnL 2tng/mL殼聚糖的醋酸(0.05 M)水溶液，用40kHz超聲 波處理lh后，室溫下攪拌12h，用(J)0.22ym聚四氟乙烯微孔濾膜抽濾并用大量去 離子水洗滌，得到殼聚糖或海藻酸鈉改性的多壁碳納米管；步驟(c):將20mL 2mg/mL步驟(b)所得殼聚糖或海藻酸鈉修飾的多壁碳 納米管磷酸緩沖液溶液用40kHz超聲波處理20min后，加入60mg的葉酸和50mg 的多肽縮合劑(EDC)，用40kHz超聲波處理20min，室溫下攪拌12h，經(jīng)抽濾水
洗，室溫下真空干燥，得到葉酸耙向的殼聚糖或海藻酸鈉改性的多壁碳納米管抗 癌藥物靶向緩釋載體；
步驟(d):將15mL lmg/mL步驟(c)所得葉酸耙向的殼聚糖或海藻酸鈉修飾 的多壁碳納米管的磷酸緩沖液溶液用40kHz超聲波處理10min后，加入15mL 3nig/niL表阿霉素的磷酸緩沖液溶液，用40kHz超聲波處理20fflin，室溫下避光攪拌 12h，經(jīng)抽濾水洗，室溫下真空干燥，得到加載表阿霉素后的殼聚糖或海藻酸鈉 的改性多壁碳納米管抗癌藥物靶向緩釋載體。
實施例3得到的加載表阿霉素后的殼聚糖或海藻酸鈉的改性多壁碳納米管抗 癌藥物靶向緩釋載體具有較好的水溶性，載藥率較單壁碳納米管載體稍大，可達 172±5% 。
權利要求
1、一種殼聚糖或海藻酸鈉改性碳納米管靶向緩釋載體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟步驟(a)將1重量份碳納米管原料和1～100重量份的氧化性混合酸混合，，依次通過超聲處理和攪拌處理后抽濾，然后用去離子水反復洗滌至pH值為7，真空干燥后得到截短碳納米管；步驟(b)將所得的截短碳納米管水溶液通過超聲處理后加入海藻酸鈉或殼聚糖水溶液，然后再進行超聲處理和攪拌處理后依次進行抽濾和水洗后真空干燥，得到改性碳納米管；步驟(c)將改性碳納米管配置成碳納米管磷酸緩沖液經(jīng)過超聲處理后依次加入葉酸和多肽縮合劑，然后再通過通過超聲處理和攪拌處理，并經(jīng)抽濾水洗，室溫下真空干燥，得到改性碳納米管靶向緩釋載體；步驟(d)將改性碳納米管靶向緩釋載體配置成改性碳納米管靶向緩釋載體磷酸緩沖液溶液并經(jīng)超聲處理后加入蒽環(huán)類抗癌藥物水溶液，最后經(jīng)超聲處理和攪拌處理，并經(jīng)抽濾水洗，室溫下真空干燥，得到加載藥物后的殼聚糖或海藻酸鈉改性碳納米管靶向緩釋載體。
2、 根據(jù)權利要求1所述的殼聚糖或海藻酸鈉改性碳納米管靶向緩釋載體的制備方法，其特征是，所述的碳納米管原料是指通過催化熱解、電弧放電、模板法或化學氣相沉積法方法制備得到的單壁或多壁碳納米管。
3、 根據(jù)權利要求1所述的殼聚糖或海藻酸鈉改性碳納米管靶向緩釋載體的制備方法，其特征是，所述的氧化性混合酸是指1 5mol/L的硝酸、0. 1 100%重量酸濃度硫酸、1/100 100/1摩爾比硝酸和硫酸的混合溶液、1/100 100/1摩爾比高錳酸鉀和硫酸混合溶液或1/100 100/1摩爾比HA和硫酸混合溶液中的一種。
4、 根據(jù)權利要求1所述的殼聚糖或海藻酸鈉改性碳納米管靶向緩釋載體的制備方法，其特征是，所述的超聲處理是指采用20kHz 100kHz頻率的超聲波處理1 100min。
5、 根據(jù)權利要求1所述的殼聚糖或海藻酸鈉改性碳納米管靶向緩釋載體的制備方法，其特征是，所述的攪拌處理是指在0 2(TC的環(huán)境下攪拌反應1 50h。
6、 根據(jù)權利要求1所述的殼聚糖或海藻酸鈉改性碳納米管靶向緩釋載體的制備方法，其特征是，所述的抽濾是指以(^0.22ym聚四氟乙烯微孔濾膜進行抽濾。
7、 根據(jù)權利要求1所述的殼聚糖或海藻酸鈉改性碳納米管靶向緩釋載體的制備方法，其特征是，所述的截短碳納米管水溶液的濃度為1 100mg/mL。
8、 根據(jù)權利要求1所述的殼聚糖或海藻酸鈉改性碳納米管靶向緩釋載體的制備方法，其特征是，所述的海藻酸鈉或殼聚糖溶液的濃度為1 10mg/mL，該海藻酸鈉或殼聚糖水溶液與截短碳納米管水溶液的體積比為1: 1 1: 10。
9、 根據(jù)權利要求1所述的殼聚糖或海藻酸鈉改性碳納米管靶向緩釋載體的制備方法，其特征是，所述的碳納米管磷酸緩沖液的濃度為1 50mg/mL。
10、 根據(jù)權利要求1所述的殼聚糖或海藻酸鈉改性碳納米管靶向緩釋載體的制備方法，其特征是，所述的改性碳納米管靶向緩釋載體磷酸緩沖液溶液的濃度為1 20mg/mL。
全文摘要
一種納米材料技術領域的殼聚糖或海藻酸鈉改性碳納米管靶向緩釋載體的制備方法，包括制備截短碳納米管；制備改性碳納米管；制備改性碳納米管靶向緩釋載體以及加入蒽環(huán)類抗癌藥物水溶液，最后經(jīng)超聲處理和攪拌處理，并經(jīng)抽濾水洗，室溫下真空干燥，得到加載藥物后的殼聚糖或海藻酸鈉改性碳納米管靶向緩釋載體。本發(fā)明經(jīng)測算對阿霉素的載藥率可達156±5％。
文檔編號A61K47/48GK101590242SQ20091005431
公開日2009年12月2日 申請日期2009年7月2日 優(yōu)先權日2009年7月2日
發(fā)明者孟令杰, 張曉科, 林高鋒, 路慶華 申請人:上海交通大學